专利名称：在琼脂培养基上分离或计数微生物的方法
在琼脂培养基上分离或计数微生物的方法本发明的领域为复杂样品中靶微生物的分析。更特别地，本发明涉及一种用于在琼脂培养基上从待分析的液体样品或从微生物的悬浮液分离或者甚至计数微生物方法。在琼脂培养基上从待分析的液体样品或者从微生物的悬浮液分离微生物是对于许多微生物学分析方法常常必不可少的步骤。该步骤特别用于进行鉴定、检测样品的微生物纯度或者还通过计数所得的分离菌落来进行细菌计数。该细菌分离步骤的一个主要问题涉及待涂布的微生物量和可利用的表面积之间的比例。这是因为大部分琼脂培养基支持体的表面积使其仅可分离15-300CFU(菌落形成单位)之间的细菌量，在生长之后也仅给出如此多的菌落。在大部分情况下，待分析的样品含有不确定量的微生物，其范围可以从0至多于 IO8细菌/毫升(ml)。因此，为了确保有效的分离，在琼脂培养基上涂布之前，必须进行一系列级联稀释(通常为10倍)，以便通过相继的阶段消耗样品的微生物负荷。然后将如此制备的给定体积的每个稀释液涂布在琼脂培养基上。然后将对应每个稀释液的培养皿在恒温室中温育。在微生物生长之后，可以选择皿上的微生物负荷低到足以区分以及任选地传代培养分离的菌落的琼脂培养基培养皿。从进行微生物计数的角度来看，必须要使用仅包含分离的菌落的培养皿。当其包含15-300个分离的菌落时，以这种方式获得的结果被认为是可靠的。虽然有效，此前所述的常规分离方法的实施具有非常费力和消耗大量试剂(培养皿、稀释剂管、环等)产生大量废物(高压灭菌、处理的费用)的缺点。凭借设备发展的益处，一些手动方法已被自动化。例如，在文件EP-O 242 114 中即是这种情况，其描述了用样品接种培养基的装置和方法。所述方法包括产生从接种物开始的几个涂布区段。这些区段为圆弧的形式并且通过4个不同的涂布头(^tes d'etalement)的工具(moyen)来产生。通过随后区段的部分重叠而获得样品的稀释效果。 该文件中所述的方法实际上与参考手动分离方法非常相似，所述参考手动分离方法包括从单个接种物产生几个具有区段重叠的涂布区段，以便使接种工具负荷细菌并在随后的区段涂布过程中使细菌的消耗。文件FR-A-2694570描述了通过在流体交流中以口针(stylet)的手段在培养基上沉积细菌溶液的方法和系统，其经由管道且具有液压泵(Wrin)驱动的细菌溶液分布器 (distributeur)。通过在将细菌溶液倒入培养基的同时旋转专用平台上的培养基，使细菌溶液以螺旋或点的形式沉积。这样的方法不能被认为是分离方法，因为细菌溶液在整个培养基旋转过程中被倒出。确切地说，没有细菌溶液的消耗以及由此而来的细菌的消耗。最近，新的分离方法已出现，其通过利用优化的涂布器使得可以提高细菌的消耗 (W0-A-2005071055)。对于申请人以参考PREVI Isola销售的自动装置中所用的接种方法尤其是这样的。该新分离方法的实施使得可以从待分析初始样品中更广范围的微生物负荷来获得分离的菌落。尽管使用该优化的涂布器提供了改善，涉及微生物负荷/琼脂表面积比例的约束仍然存在，并且使用该技术可以发现其具有非常高污染样品的限制。此外，目前该技术不可以进行初始样品的微生物负荷的精确估算，因为菌落接近难以计数。
考虑到现有技术没有出现用于分离或甚至计数微生物的方法，所述方法易于在单一琼脂培养基上从待分析的样品或从细菌悬浮液进行，并且使得可以在有限的琼脂表面积上获得分离的菌落，不论所述样品或所述悬浮液的初始细菌负荷如何。因此本发明的第一个目的是提供用于分离微生物的比现有技术方法更有效的方法。本发明的第二个目的是提供比现有技术方法更有效的计数方法。本发明的第三个目的是提供用于分离或甚至计数微生物的方法，其使得可以从非常广范围的微生物负荷获得分离的菌落。本发明的第四个目的是提供用于分离或甚至计数微生物的方法，其使得可以获得初始样品或初始悬浮液的微生物负荷的可靠估算。本发明的第五个目的是提供用于分离或甚至计数微生物的方法，其可以在减少的琼脂培养基表面积上进行。其中这些目的通过本发明来实现，其首先涉及用于在琼脂培养基上分离微生物的方法，包括以下步骤 在所述琼脂培养基上沉积预定体积的任选含有所述微生物的待分析的样品或所述微生物的悬浮液， 将接种工具应用于所述琼脂培养基，与所述体积的样品或悬浮液接触， 移动所述接种工具以便将所述体积的样品或悬浮液全部或部分地涂布在所述琼脂培养基的表面上，所述接种工具的水平移动是不连续的，从而在此移动过程中，所述接种工具和琼脂培养基表面之间的接触被中断并重建至少一次，产生相继的涂布区段并导致所述接种工具在样品或悬浮液方面的消耗，以及 在使微生物可以生长的条件下温育所述琼脂培养基。本发明的第二个目的涉及用于在琼脂培养基上计数微生物的方法，其包括以下步骤 在所述琼脂培养基上沉积预定体积的任选含有所述微生物的待分析的样品或所述微生物的悬浮液， 将接种工具应用于所述琼脂培养基，与所述体积的样品或悬浮液接触， 移动所述接种工具以便将所述体积的样品或悬浮液全部或部分地涂布在所述琼脂培养基的表面上，所述接种工具的水平移动是不连续的，从而在此移动过程中，所述接种工具和琼脂培养基表面之间的接触被中断并重建至少一次，产生相继的涂布区段并导致所述接种工具在样品或悬浮液方面的消耗， 在使微生物可以生长的条件下温育所述琼脂培养基，以及·计数在所述琼脂培养基表面出现的微生物菌落。根据本发明，在所述工具移动过程中接种工具和琼脂培养基之间接触的中断和重建可以比作所述工具的跳跃。此跳跃使得接种工具在样品或悬浮液方面消耗。这是因为， 只要接种工具与琼脂培养基接触，其通过毛细管引流而带走液体。当接种工具与琼脂培养基之间的接触中断时，所述接种工具从培养基的表面移走，直至从液体脱离。然后不再带走液脉(veine liquide)。在该脱离过程中，接种工具带走了保持吸附至所述接种工具的样品或悬浮液的部分。当接种工具不与培养基接触时，接种工具继续沿着与所述培养基表面基本上平行的方向移动。该移动必须充分，这样当接种工具和琼脂培养基之间的接触重建时，该新接触点距离中断之前的最后接触点足够远，以避免接种工具和前面涂布之间的任何接触。这是因为这样的接触可以导致来自第一次涂布的样品或悬浮液以及相关细菌转移至接种工具， 因此限制了消耗的现象。此外，这实际上是进行常规分离，其中在涂布过程中，接种工具与前面的涂布相交以便进行再负荷。当接触重建时，接种工具在琼脂培养基上再次水平移动，通过毛细管引流带走了保持附着的样品或悬浮液的部分，并且允许该部分的新的涂布。可以进行接种工具的几次连续跳跃，这样在接触的每个中断出现液体的脱离，加剧接种工具在样品或悬浮液方面的消耗。影响接触中断过程中保留在接种工具上的样品或悬浮液量的因素是必不可少的-琼脂培养基的可湿性，-样品或悬浮液的表面张力。这两个参数影响样品或悬浮液的液体部分和培养基表面之间接触的角度以及因此的中断液脉所必需的力量。这两个参数本质上可变，取决于所用琼脂培养基的类型以及待分析的样品或悬浮液的类型。有利的是，在根据本发明的方法中，所述接种工具具有许多与所述培养基接触的表面。这样的接种工具可以为，例如，如专利申请W0-A-2005071055中所保护的与PREVI Isola系统一起使用的涂布器。或者，所述接种工具具有单一的与所述培养基接触的表面。例如，这样的工具可以为环、白金丝环或拭子。有利的接种工具的移动可以为直线移动。术语“直线移动”是为了表示单一的或几个直线区段，任选地朝不同方向。这样的移动常规用于通过环或白金丝环分离的常规方法中。或者，接种工具的移动为曲线移动。这样的移动在PREVI Isola系统中使用。具体地说，当培养皿为圆皿时接种工具的移动沿着培养皿的边缘。此外，当接种工具具有几个与培养基接触的表面时，该曲线移动使得可以增加涂布的长度。有利的是，根据本发明的方法可以通过自动系统实现。特别合适的系统为申请人所售的PREVI Isola系统。根据一个优选的实施方案，中断和重建所述接种工具和琼脂培养基表面之间的接触的次数为2-6次之间。根据另一个优选的实施方案，沉积在琼脂培养基上的样品或悬浮液的体积为 10-1000 μ 1 之间。根据一个特别优选的实施方案，涂布区段的长度可变。这是因为，对于相同的分离，产生不同长度的连续涂布区段可能有利。对于怀疑过度负荷微生物的样品尤其是这样的。几个有限长度的涂布区段使得在非常小的培养基表面积上可以使接种工具非常迅速地消耗。另一方面，随后涂布区段的长度更大，以便可以获得分离的菌落。当阅读随后的详细描述连同其中的图时，根据本发明的方法的目的和优点会更清晰地显现
图1示出了用约108CFU/ml的细菌悬浮液根据常规方法进行的分离和根据本发明的方法的不同步骤进行的分离之间比较分析的图像。图2示出了用约107CFU/ml的细菌悬浮液根据常规方法进行的分离和根据本发明的方法的不同步骤进行的分离之间比较分析的图像。图3示出了用具有可变细菌负荷的悬浮液根据常规方法进行的分离和根据本发明的方法进行的分离之间比较分析，然后计数细菌菌落的图片。图4示出了根据常规方法进行的细菌菌落计数和根据本发明的方法进行的细菌菌落计数之间比较分析的图片，以及每次重新接触之后细菌悬浮液体积分布系数的估算。
实施例实施例1 在减少的琼脂表面积上从高度污染的溶液获得分离的菌落步骤将100 μ 1高度负荷金黄色葡萄球菌Staphylococcus aureus)的溶液(IO7或 108CFU/ml)沉积在琼脂培养基皿的边缘。然后利用组成与专利申请W0-A-2005071055所保护的PREVI Isola系统一起使用的涂布器的涂布工具以直线方式手动涂布该体积。用涂布器进行对照涂布，不进行任何跳跃。利用与对照条件相同的沉积，平行进行各种涂布，在涂布过程中加入增加的跳跃数。-图IA无跳跃(约108CFU/ml的悬浮液)-图IB 5次跳跃(约108CFU/ml的悬浮液)-图IC:6次跳跃(约108CFU/ml的悬浮液)-图ID 7次跳跃(约108CFU/ml的悬浮液)-图2A无跳跃(约107CFU/ml的悬浮液)-图2B:3次跳跃(约107CFU/ml的悬浮液)-图2C:6次跳跃(约107CFU/ml的悬浮液)培养之后，寻找分离的菌落并测量获得这些菌落所需的涂布长度。结果对于108CFU/ml的悬浮液，培养皿的宽度(IOcm)不足以允许用常规方法的涂布获得分离的菌落，即移动涂布工具不进行跳跃(图1A)。当在培养基上以常规方式进行涂布工具的5次跳跃时，第一个分离的菌落在 7. 5cm的涂布长度之后出现。当在培养基上以常规方式进行涂布工具的6次跳跃时，第一个分离的菌落在 4. 5cm的涂布长度之后出现。当在培养基上以常规方式进行涂布工具的7次跳跃时，第一个分离的菌落在 1.5cm的涂布长度之后出现。对于107CFU/ml的悬浮液，通过常规方法的涂布，第一个分离的菌落在7. 2cm的涂布长度之后出现(图2A)。当在培养基上以常规方式进行涂布工具的3次跳跃时，第一个分离的菌落在3cm的涂布长度之后出现。当在培养基上以常规方式进行涂布工具的6次跳跃时，第一个分离的菌落在4cm 的涂布长度之后出现。所得的结果显示，当在培养基上涂布样品的过程中用接种工具进行跳跃时，在细菌方面的消耗更有效，因此使得可以在减少的琼脂培养基表面积上获得分离的菌落。此外， 应该注意到，跳跃数越高，获得分离的菌落所需的样品涂布长度越短。实施例2 用于产生琼脂培养基上样品的微生物负荷的可靠计数的模型的跳跃涂布的优点步骤将通过相继的10倍稀释获得的负荷不同浓度金黄色葡萄球菌的100 μ 1溶液沉积在琼脂培养基的边缘。然后利用PREVI Isola系统所用的涂布器以直线方式手动涂布该体积。用涂布器进行对照涂布，不进行跳跃。利用与对照条件相同的沉积，平行进行包含 4次相继跳跃的涂布，这4次跳跃定义了 5个不同区，表示为1区至5区。获得的结果如图3所示，其中左列对应对照涂布而右列对应根据本发明的方法的有相继跳跃的涂布。此外，A行对应用80000-130 000CFU之间的细菌负荷所得的结果。B行对应用8000-13 000CFU之间的细菌负荷所得的结果。C行对应用800-1300 CFU之间的细菌负荷所得的结果。D行对应用80-130CFU之间的细菌负荷所得的结果。在培养基培养之后，在涂布过程中进行的梳子跳跃所划定的每个区进行分离的菌落的计数。结果
首先，因为未分离菌落的接近，看来某些区不可以计数。对照结果(无跳跃)显示，用常规涂布，仅可以在用最低细菌负荷(约100CFU)时进行计数。因此可以看到，在图3D行左列中，约80个菌落被分离。用相同的初始负荷，有跳跃的涂布的优化(在本实施例中4次)使得可以清楚地划分几个区，其中一些仅显示分离的菌落，因此可以计数。因此，在A行右列中，4和5区分别显示67和34个分离的菌落的计数。在B行中，3、4和5区分别显示116J4和6个分离的菌落的计数。在C行中，2、3和5区分别显示113、11和2个分离的菌落的计数。4区不含有菌落。在D行中，1、2和3区分别显示115个分离的菌落、14个分离的菌落和1分离的菌落的计数。因为负荷很低，4和5区不含有任何细菌。在本实施例中，因此观察到悬浮液的细菌负荷和第一个可计数区之间的密切关系。当微生物负荷10倍增加时，实际上出现第一个可计数区的转移。分布如以下表1所示
权利要求
1.用于在琼脂培养基上分离微生物的方法，包括以下步骤 在所述琼脂培养基上沉积预定体积的任选含有所述微生物的待分析的样品或者所述微生物的悬浮液，眷将接种工具应用于所述琼脂培养基，与该体积的样品或悬浮液接触， 移动所述接种工具以便将所述体积的样品或悬浮液全部或部分地涂布在所述琼脂培养基的表面上，所述接种工具的移动是不连续的，从而在此移动过程中，所述接种工具和琼脂培养基表面之间的接触被中断并重建至少一次，产生相继的涂布区段并导致所述接种工具在样品或悬浮液方面的消耗，以及 在使微生物能够生长的条件下温育所述琼脂培养基。
2.用于在琼脂培养基上计数微生物的方法，包括以下步骤 在所述琼脂培养基上沉积预定体积的任选含有所述微生物的待分析的样品或所述微生物的悬浮液，眷将接种工具应用于所述琼脂培养基，与所述体积的样品或悬浮液接触， 移动所述接种工具以便将所述体积的样品或悬浮液全部或部分地涂布在所述琼脂培养基的表面上，所述接种工具的移动是不连续的，从而在此移动过程中，所述接种工具和琼脂培养基表面之间的接触被中断并重建至少一次，产生相继的涂布区段并导致所述接种工具在样品或悬浮液方面的消耗， 在使微生物可以生长的条件下温育所述琼脂培养基，以及 计数在所述琼脂培养基表面出现的微生物菌落。
3.如权利要求1或2中所述的方法，其中所述接种工具具有许多与所述培养基接触的表面。
4.如权利要求1或2中所述的方法，其中所述接种工具具有单一的与所述培养基接触的表面。
5.如前述权利要求中一项所述的方法，其中所述接种工具的移动为直线移动。
6.如权利要求1-4中一项所述的方法，其中所述接种工具的移动为曲线移动。
7.如前述权利要求中一项所述的方法，通过自动化的系统来执行。
8.如前述权利要求中一项所述的方法，其中所述接种工具和琼脂培养基表面之间的接触被中断和重建的次数为2-6次之间。
9.如前述权利要求中一项所述的方法，其中沉积在所述琼脂培养基上的体积为 10-1000 μ 1 之间。
10.如前述权利要求中一项所述的方法，其中所述涂布区段的长度可变。
全文摘要
本发明涉及在琼脂培养基上分离微生物的方法，包括以下步骤-在所述琼脂培养基上沉积预定量的待分析并任选含有所述微生物的样品或所述微生物的悬浮液；-将接种工具应用于琼脂培养基，与所述体积的样品或悬浮液接触；-移动所述接种工具以便将所述体积的样品或悬浮液全部或部分地涂布在所述琼脂培养基的表面上，所述接种工具的移动是不连续的，从而在所述移动过程中，所述接种工具和琼脂培养基表面之间的接触被中断并重建至少一次，从而创造了涂布区段并导致所述接种工具在样品或悬浮液方面的消耗；以及-在使微生物可以生长的条件下培养所述琼脂培养基。
文档编号C12Q1/04GK102300999SQ201080006128
公开日2011年12月28日 申请日期2010年1月29日 优先权日2009年1月30日
发明者A·科斯塔, B·科兰 申请人:生物梅里埃公司