产乙醇细菌及它们在乙醇生产中的应用的制作方法

专利名称：产乙醇细菌及它们在乙醇生产中的应用的制作方法
产こ醇細菌及它们在こ醇生产中的应用相关_请
本申请要求2009年3月5日提交的美国临时申请系列号61/209，334的优先权，其整个公开内容通过引用并入本文。政府资助的研究
本发明在美国政府支持下完成，美国能源部授予的合同号为DE-FG02-96ER20222、DE-FG36-08G088142和DE-FC36-G017058。美国政府具有本发明的某些权利。
背景技术：
使用来自木质纤维素生物质的糖类作为底物，可以做出多种发酵产物(Hahn-Hagerdal 等人 2006. Trends Biotechnol. 24:549-556; Jarboe 等人 2007 Adv. Biochem. Engin/Biotechnol. 108:237-261, Katahira 等人 2006 Appl. Microbiol.Biotechnol. 72:1136-1143，Tokiwa 等人 2008. Can. J. Chem. 86:548-555)。但是，在发酵之前，必须使用化学和酶方法的组合，将糖聚合物纤维素和半纤维素转化成可溶的糖类(Um 等人 2003 Appl Biochem Biotechnol. 105-108:115-125; Wyman 等人 2005.96:2026-2032)。化学方法伴有副反应，其产生小量产物(诸如醇类、酸类和醛类)的混合物，它们对微生物生物催化剂的代谢具有负面效应。已经证实，醇类(儿茶酚、丁香酚(syringol)等)通过透化细胞膜起作用，且毒性与分子的疏水性非常相关(Zaldivar等人
2000Biotechnol. Bioeng. 68:524-530)。认为有机酸(こ酸盐、甲酸盐等)以中性形式穿过细胞膜，并在细胞质内离子化，通过瓦解质子原动カ来抑制生长(Palmqvist等人2000.Bioresour. Technol. 74:25-33， Zaldivar 等人 1999. Biotechnol. Bioeng. 66:203-210)。醛类的抑制机理更复杂。除了直接的物理和代谢效应以外，醛类可以与许多细胞组分反应，形成产物(Modig 等人 2002 Biochem. J. 363:769-776, Singh 等人 1995Mutat. Res 337:9_17)。这些来自化学预处理的小量产物一起可以延迟细胞生长，并减慢生物质-衍生的糖类的发酵(Horvath 等人 2001. Biotechnol. Bioeng. 75:540-549，Palmqvist 等人 2000. Bioresour. Technol. 74:17-24)。糠醛(戊糖的脱水产物)是特别重要的。糠醛是木质纤维素分解的天然产物。纤维素生物质在酸性条件下解聚过程中，通过戊糖的脱水，也形成糠醛(Martinez等人
2001Biotechnol. Prog. 17:287-293)。该化合物是半纤维素糖浆的毒性的重要贡献因子，并增加其它化合物的毒性(Zaldivar 等人 1999. Biotechnol. Bioeng. 65: 24-33)。已经将半纤维素的稀酸水解物中的糠醛含量与毒性相关联(Martinez等人，2000.Biotechnol. Bioengin. 69(5): 526-536)。通过添加石灰(pH 10)来去除糠醒,会使水解物可容易地发酵，而糠醒的重新加入会恢复毒性(Martinez等人2001. BiotechnolProg 17: 287-293)。还已经证实，糠醛会增强已知在半纤维素的酸水解物中存在的其它化合物的毒性(Zaldivar 等人 1999. Biotechnol. Bioeng. 65: 24-33; Zaldivar等人 1999 Biotechnol. Bioeng. 66: 203-210; Zaldivar 等人 2000 Biotechnol.Bioeng. 68:524-530)。已经报道,糖醒会改变DNA结构和序列(Barciszewski等人1997FEBS letters. 414:457-460，Khan 等人，1995 Cancer Lett. 89:95-99)，抑制糖酵解酶(Gorsich 等人 2006 Appl. Microbiol. Biotechnol. 71:339-349),并减慢糖代谢(Hristozova 等人 2006. Enzyme Microbiol. Technol. 39:1108-1112)。木质纤维素生物质代表着向可更新燃料和化学试剂的微生物转化的潜在原料。在发酵之前，必须使用酸、酶或其组合，将碳水化合物组分(纤维素和半纤维素)转化成可溶的糖类(Cheng 等人 2008 Biochem. Eng J 38:105-109; Wyman 等人 2005 BioresourTechnol. 96:2026-2032; Um 等人 2003 Appl Biochem Biotechnol 105:115-125)。在用无机酸进行蒸汽预处理的过程中，生成小量的5-羟甲基糠醛(5-HMF)和糠醛，但是分别从己糖和戍糖的脱水生成有毒的副产物(Martinez等人2000a Biotechnol Bioeng69:526-536; Palmqvist 和 Hahn-Hagerdal 2000b Bioresour Technol 74:25-33)。已经证实，5-HMF会延迟产こ醇的大肠杆菌(Zaldivar等人1999 Biotechnol Bioeng)和 酿酒酵母(Almeida 等人 2008 Appl Microbiol Biotechnol 78:939-945; Palmqvist和 Hahn-Hagerdal 2000a Bioresour Technol 74: 17-24; Taherzadeh 等人 2000 ApplMicrobiol Biotechnol 53:701-708)的生长和发酵。通过在高温加入过量石灰至pH 10,可以从半纤维素水解物去除呋喃(Martinez等人2000a Biotechnol Bioeng 69:526-536)。该方法需要水解物糖浆与纤维素纤维的有效分离、用于石灰混合的专门设备、糖浆与不溶性钙盐的分离，并产生需要处理的固体废物。呋喃-抗性的生物催化剂的开发，可以很大地消除该方法的复杂性。已经证实，几个肠细菌属(克雷伯菌属、肠杆菌属、埃希氏菌属、柠檬酸杆菌属、爱德华菌属、变形杆菌属)以及酵母会将5-HMF转化成5-羟甲基糠醇，即ー种更低毒性的化合物(Boopathy等人1993 J Indus Microbiol 11:147-150; Palmqvist 和 Hahn-Hagerdal 2000a BioresourTechnol 74:17-24; Zaldivar 等人 1999 Biotechnol Bioeng 65:24-33)。已经证实，酿酒酵母会产生多种氧化还原酶(YGL157W、ADH6和突变的ADH1)，它们可以将5-HMF和糠醛还原为更低毒性的产物(Almeida 等人 2008 Appl Microbiol Biotechnol 78:939-945;Almeida 等人 2009 Appl Microbiol Biotechnol 82: 625-638; Heer 等人 2009 ApplEnviron Microbiol doi : 10. 1128/AEM. 01649-9; Liu 等人 2009 Gene 446: 1-10) 已经证实，这些基因的増加的表达对于5-HMF耐受性的某些方面是有益的，尽管尚未证实所述基因会增加糠醒的最小抑制浓度。Gorisch等人(2006 Appl Microbiol Biotechnol 71:339-349)在酿酒酵母中鉴别出了许多基因失活，它们会増加对糠醛和5-HMF的灵敏度。一个基因ZWFl (6-磷酸葡萄糖脱氢酶)的过表达会增加对糠醛的耐受性。已经广泛研究了发酵生物体在有这些抑制剂存在下起作用的能力。已经证实，将酿酒酵母包囊在海藻酸盐中是保护性的，并提高半纤维素在酸性水解物中的发酵(Talebnia等人2006 J Biotechnol. 125:377-384)。以前已经描述酿酒酵母株具有提高的对水解物抑制剂的抗性(Almeida等人2007. J. Chem. Technol. Biotechnol.82:340-349, Martin 等人 2007. Bioresour. Technol. 98:1767-1773， Nilsson 等人2005. Appl. Environ. Microbiol 71:7866-7871)。已经证实，大肠杆菌(Guti6rrez 等人2006 J. Bacteriol. 121:154-164)、酿酒酵母(Almeida 等人 2008 Appl. Microbiol.Biotechnol. 78:939-945)和其它微生物(Boopathy 等人 1993 J. Indust. Microbiol.11:147-150)含有催化糠醛还原为更低毒性的产物糠醇的酶(Zaldivar等人，2000Biotechnol. Bioeng. 68:524-530)。在大肠杆菌中，糠醛还原酶活性似乎是NADPH-依赖性的(Guti6rrez等人2006. J. Bacteriol. 121:154-164)。从大肠杆菌中纯化出了NADPH-依赖性的糠醛还原酶，尽管其它酶也可能存在。已经在酿酒酵母中表征了能够还原5_羟甲基糠醛(己糖的脱水产物)的NADPH-依赖性的酶，并鉴别为ADH6基因(Petersson等人 2006. YEA ST. 23:455-464)。以前已经证实，yqhD基因编码NADPH-依赖性的醒氧化还原酶(Sulzenbacher等人2004. J. Mol. Biol. 342:489-502)，该酶可以用于生产丙ニ醇(Nakamura等人 2003. Current Opinion in Biotechnology. 14:454-459， Zhang 等人 2006 WorldJournal of Microbiology & Biotechnology. 22:945-952)。还已经证实，该基因会赋予对氧反应性物质的破坏的抗性(P6rez等人2008. J. Biol. Chem. 283:7346-7353)。已经证实，dkgA基因会催化2，5- ニ酮-D-葡糖酸的还原，即抗坏血酸生产中的ー个关键步骤(Habrych 等人 2002. Biotechnol. Prog. 18:257-2， Yum 等人 1999 Appl. Environ.Microbiol. 65:3341-3346)。还认为，该酶在甲基こニ醒的还原中起作用(Jeudy等人.2006. Proteins 62:302-307， Ko 等人 2005. J. Bacteriol 187:5782-5789)。 yqfA 基因的功能是未知的，但是认为是氧化还原酶的膜亚基(Karp等人2007 Nucleic AcidsRes. 35:7577-7590)，其可能參与脂肪酸代谢(McCue 等人 2001. Nucleic Acids Res.29:774-782)。大肠杆菌yqhC基因(b3010)是属于AraC/XylS家族的DNA-结合蛋白的一种预测的转录调节剂。迄今为止关于yqhC的可能功能的推论,仅仅基于推论的蛋白序列和AraC/XylS家族的成员之间的相似性。yqhC在大肠杆菌基因组中邻近yqhD和dkgA基因，它们ニ者以与yqhC相反的方向转录。本发明的方法允许鉴别这样的酶，所述酶在有糠醛和/或5-HMF存在下，调节微生物的生长和こ醇生产。因此，对于替代能源的生产而言，制备能够在有糠醛存在下生长和生产こ醇的微生物的能力是极其重要的。

发明内容
本发明涉及一种分离的细菌，其中所述细菌与參照细菌相比，具有増加的对糠醛的抗性。在一个实施方案中，所述分离的细菌是产こ醇的。在另ー个实施方案中，所述细菌与參照细菌相比，具有増加的こ醇生产。在另ー个实施方案中，与參照细菌相比，yqhD基因的表达降低。在另ー个实施方案中，与參照细菌中的表达相比，yqhD基因和dkgA基因的表达降低。在另ー个实施方案中，与參照细菌中的表达相比，降低yqhC基因的表达。在另ー个实施方案中，不表达yqhD基因。在另ー个实施方案中，不表达yqhD基因和dkgA基因。在另ー个实施方案中，不表达yqhC基因。在另ー个实施方案中，与參照细菌相比，降低yqhC基因的表达。在另ー个实施方案中，yqhC基因被删除。
在另ー个实施方案中，与參照细菌相比，YqhD蛋白的活性降低。在另ー个实施方案中，与參照细菌相比，YqhD蛋白的活性和DkgA蛋白的活性降低。在另ー个实施方案中，与參照细菌相比，YqhC蛋白的活性降低。在另ー个实施方案中，与參照细菌相比，yqhD基因的表达的调节被改变。在另ー个实施方案中，与參照细菌中的表达相比，yqhD基因的表达和dkgA基因的表达的调节被改变。在另ー个实施方案中，与參照细菌中的表达相比，yqhC基因的表达的调节被改变。在另ー个实施方案中，与參照细菌相比，降低yqhC基因的表达。在另ー个实施方案中，yqhC基因被删除。在另ー个实施方案中，存在yqhD基因启动子的活性的变化。在另ー个实施方案中，存在dkgA基因启动子的活性的变化。在另ー个实施方案中，由于反义RNA的添加，YqhD、DkgA和/或YqhC蛋白的水平降低。在另ー个实施方案中，由于siRNA的添加，YqhD、DkgA和/或YqhC蛋白的水平降低。本发明也涉及ー种分离的细菌，其具有降低的NADPH-依赖性的糠醛还原酶活性的表达，其中所述细菌能够生产こ醇，且其中所述细菌通过包含下述步骤的方法制备在有糠醛存在下，培养细菌的候选突变株；并选择在有糠醛存在下生产こ醇的突变株。本发明也涉及ー种分离的细菌，其具有降低的NADPH-依赖性的糠醛还原酶活性的表达，其中所述细菌能够生产こ醇，且其中所述细菌通过包含下述步骤的方法制备在有递增浓度的糠醛存在下，培养细菌的候选突变株；并选择在有糠醛存在下生产こ醇的细菌。
在另ー个实施方案中，所述NADPH-依赖性的糠醛还原酶是YqhD或DkgA。在另ー个实施方案中，所述NADPH-依赖性的糠醛还原酶是YqhD和DkgA。本发明也涉及ー种分离的细菌，其中yqhD基因表达与參照细菌相比降低，其中所述细菌能够生产こ醇，且其中所述细菌通过包含下述步骤的方法制备在有糠醛存在下，培养细菌的候选株；并选择在有糠醛存在下生产こ醇的细菌。本发明也涉及ー种分离的细菌，其中yqhD基因表达与參照细菌相比降低，其中所述细菌能够生产こ醇，且其中所述细菌通过包含下述步骤的方法制备在有递增浓度的糠醛存在下，培养细菌的候选株；并选择在有糠醛存在下生产こ醇的细菌。本发明也涉及ー种分离的细菌，其中yqhD基因和dkgA基因的表达与參照细菌相比降低，其中所述细菌能够生产こ醇，且其中所述细菌通过包含下述步骤的方法制备在有糠醛存在下，培养细菌的候选株；并选择在有糠醛存在下生产こ醇的细菌。本发明也涉及ー种分离的细菌，其中yqhD基因和dkgA基因的表达与參照细菌相比降低，其中所述细菌能够生产こ醇，且其中所述细菌通过包含下述步骤的方法制备在有递增浓度的糠醛存在下，培养细菌的候选株；并选择在有糠醛存在下生产こ醇的细菌。在一个实施方案中，降低yqhC基因的表达。在另ー个实施方案中，yqhC基因被删除。本发明也涉及ー种分离的细菌，其中yqhC基因的表达与參照细菌相比降低，其中所述细菌能够生产こ醇，且其中所述细菌通过包含下述步骤的方法制备在有糠醛存在下，培养细菌的候选株；并选择在有糠醛存在下生产こ醇的细菌。本发明也涉及ー种分离的细菌，其中yqhC基因的表达与參照细菌相比降低，其中所述细菌能够生产こ醇，且其中所述细菌通过包含下述步骤的方法制备在有递增浓度的糠醛存在下，培养细菌的候选株；并选择在有糠醛存在下生产こ醇的细菌。
本发明也涉及ー种分离的细菌，其具有降低的NADPH-依赖性的糠醛还原酶活性的表达，其中所述细菌生产こ醇，其中所述细菌通过包含下述步骤的方法制备降低yqhD基因的表达；在有糠醛存在下，培养细菌的候选株；并选择在有糠醛存在下生产こ醇的细菌。本发明也涉及ー种分离的细菌，其具有降低的NADPH-依赖性的糠醛还原酶活性的表达，其中所述细菌生产こ醇，其中所述细菌通过包含下述步骤的方法制备降低yqhD基因和dkgA基因的表达；在有糠醛存在下，培养细菌的候选株；并选择在有糠醛存在下生产こ醇的细菌。在一个实施方案中，降低yqhC基因的表达。在另ー个实施方案中，yqhC基因被删除。本发明也涉及ー种分离的细菌，其具有降低的NADPH-依赖性的糠醛还原酶活性的表达，其中所述细菌生产こ醇，其中所述细菌通过包含下述步骤的方法制备降低yqhC基因的表达；在有糠醛存在下，培养细菌的候选株；并选择在有糠醛存在下生产こ醇的细菌。本发明也涉及ー种分离的细菌，其具有降低的yqhD基因的表达，其中所述细菌能够生产こ醇，且其中所述细菌如下制备降低yqhD基因的表达；在有糠醛存在下，培养细菌的候选株；并选择在有糠醛存在下生产こ醇的细菌。本发明也涉及ー种分离的细菌，其具有降低的yqhD基因和dkgA基因的表达，其中所述细菌能够生产こ醇，且其中所述细菌如下制备降低yqhD基因和dkgA基因的表达；在有糠醛存在下，培养细菌的候选株；并选择在有糠醛存在下生产こ醇的细菌。在一个实施方案中，降低yqhC基因的表达。在另ー个实施方案中，yqhC基因被删除。本发明也涉及ー种分离的细菌，其具有降低的yqhC基因的表达，其中所述细菌能够生产こ醇，且其中所述细菌如下制备降低yqhC基因的表达；在有糠醛存在下，培养细菌的候选株；并选择在有糠醛存在下生产こ醇的细菌。本发明也涉及ー种分离的细菌，其中与參照细菌相比，YqhD蛋白的活性降低或消除，其中所述细菌能够生产こ醇，其中所述细菌如下制备在有糠醛存在下，培养细菌的候选株；并选择在有糠醛存在下生产こ醇的细菌。本发明也涉及ー种分离的细菌，其中与參照细菌相比，YqhD蛋白的活性降低，其中所述细菌能够生产こ醇，其中所述细菌如下制备在有递增浓度的糠醛存在下，培养细菌的候选株；并选择在有糠醛存在下生产こ醇的细菌。本发明也涉及ー种分离的细菌，其中与參照细菌相比，YqhD蛋白和DkgA蛋白的活性降低或消除，其中所述细菌能够生产こ醇，其中所述细菌如下制备在有糠醛存在下，培养细菌的候选株；并选择在有糠醛存在下生产こ醇的细菌。
本发明也涉及ー种分离的细菌，其中与參照细菌相比，YqhD蛋白和DkgA蛋白的活性降低，其中所述细菌能够生产こ醇，其中所述细菌如下制备在有递增浓度的糠醛存在下，培养细菌的候选株；并选择在有糠醛存在下生产こ醇的细菌。在一个实施方案中，降低yqhC基因的表达。在另ー个实施方案中，yqhC基因被删除。本发明也涉及ー种分离的细菌，其中与參照细菌相比，YqhC蛋白的活性降低或消除，其中所述细菌能够生产こ醇，其中所 述细菌如下制备在有糠醛存在下，培养细菌的候选株；并选择在有糠醛存在下生产こ醇的细菌。本发明也涉及ー种分离的细菌，其中与參照细菌相比，YqhC蛋白的活性降低，其中所述细菌能够生产こ醇，其中所述细菌如下制备在有递增浓度的糠醛存在下，培养细菌的候选株，并选择在有糠醛存在下生产こ醇的细菌。在一个实施方案中，与參照细菌相比，所述细菌在有糠醛存在下具有増加的こ醇生产。在另ー个实施方案中，与參照细菌相比，所述细菌在有5-羟甲基糠醛(5-HMF)存在下具有増加的こ醇生产。在另ー个实施方案中，与參照细菌相比，所述细菌在有选自下述的醛存在下具有増加的こ醇生产こ醛、丙醛、丁醛和肉桂醛。在另ー个实施方案中，与參照细菌相比，所述细菌在有甲基こニ醛存在下具有增加的こ醇生产。在另ー个实施方案中，与參照细菌相比，当糠醛的还原性去除水平降低时，所述细菌具有増加的こ醇生产。在另ー个实施方案中，与參照细菌相比，所述细菌具有降低的糠醛代谢。在另ー个实施方案中，所述细菌不具有可检测的糠醛代谢。在另ー个实施方案中，与參照细菌相比，所述细菌具有增加的生长。在另ー个实施方案中，与參照细菌相比，所述细菌在有糠醛存在下具有增加的生长。在另ー个实施方案中，与參照细菌相比，所述细菌在有糠醛存在下具有增加的生长和增加的こ醇生产。在另ー个实施方案中，与參照细菌相比，所述细菌在有5-HMF存在下具有増加的生长。在另ー个实施方案中，与參照细菌相比，所述细菌在有5-HMF存在下具有増加的生长和增加的こ醇生产。在另ー个实施方案中，与參照细菌相比，所述细菌具有降低的糠醛还原酶活性。在另ー个实施方案中，所述细菌具有降低的5-HMF依赖性的NADPH氧化速率。在另ー个实施方案中，由于ISlO在yqhC基因中的插入，yqhC基因的表达降低。在另ー个实施方案中，与參照细菌相比，所述细菌在有水解物存在下具有增加的生长。在另ー个实施方案中，所述水解物源自生物质、半纤维素生物质、木质纤维素生物质或纤维素生物质。
在另ー个实施方案中，所述细菌生成こ醇作为主要发酵产物。在另ー个实施方案中，本发明的分离的细菌在缺氧条件下生产こ醇。在另ー个实施方案中，在微氧条件下生产こ醇。在另ー个实施方案中，所述细菌是非重组的。在另ー个实施方案中，所述细菌是重组的。在另ー个实施方案中，所述细菌是革兰氏阴性的。在另ー个实施方案中，所述细菌是革兰氏阳性的。在另ー个实施方案中，所述革兰氏阴性细菌选自不动杆菌属、葡糖杆菌属、发酵单胞菌属、埃希氏菌属、土杆菌属、希瓦氏菌属、沙门菌属、肠杆菌属和克雷伯菌属。 在另ー个实施方案中，所述革兰氏阳性细菌选自芽孢杆菌属、梭菌属、棒杆菌属、乳杆菌属、乳球菌属、酒球菌属、链球菌属和真杆菌属。在另ー个实施方案中,所述细菌是大肠杆菌。在另ー个实施方案中，本发明的分离的细菌是产酸克雷伯菌oxytoca j。在另ー个实施方案中，所述细菌是大肠杆菌株EMFR9。本发明也涉及从生物质、半纤维素生物质、木质纤维素生物质、纤维素生物质或寡糖源生产こ醇的方法，所述方法包括，使生物质、半纤维素生物质、木质纤维素生物质、纤维素生物质或寡糖接触本发明的分离的细菌，从而从生物质、半纤维素生物质、木质纤维素生物质、纤维素生物质或寡糖源生产こ醇。本发明也涉及在有糠醛存在下从生物质、半纤维素生物质、木质纤维素生物质、纤维素生物质或寡糖源生产こ醇的方法，所述方法包括，使生物质、半纤维素生物质、木质纤维素生物质、纤维素生物质或寡糖接触本发明的分离的细菌，从而从生物质、半纤维素生物质、木质纤维素生物质、纤维素生物质或寡糖源生产こ醇。本发明也涉及试剂盒，其包含本发明的任一种分离的细菌。本发明也涉及由指定为保藏号NRRL B-50239的农业研究培养物保藏中心(Agricultural Research Culture Collection)的保藏物代表的大肠杆菌株 LY180。本发明也涉及通过本发明的こ醇生产方法生产的こ醇。本发明也涉及包含基因的微阵列，所述基因在没有yqhC基因存在下表现出表达的增加或降低。本发明也涉及ー种分离的yqhD启动子，其包含图28所示的序列及其片段和突变体或变体。本发明也涉及yqhD启动子在有糠醛、5-HMF、こ醛、丙醛、丁醛、肉桂醛和甲基こニ醛中的至少ー种存在下，与參照细菌相比，调节基因表达的应用。ー种分离的细菌，其中所述细菌与參照细菌相比，具有增加的对糠醛的抗性，且其中与參照细菌相比，NADPH-依赖性的氧化还原酶的表达和/或活性降低。在一个实施方案中，在所述分离的细菌中，NADPH-依赖性的氧化还原酶的Km小于或等于YqhD的Km和/或DkgA的Km。本发明也提供了通过降低NADPH-依赖性的氧化还原酶的表达和/或活性，增加细菌对糠醛或5-HMF的抗性或耐受性的方法。
本发明也提供了鉴别NADPH-依赖性的氧化还原酶的方法，所述酶通过降低NADPH-依赖性的氧化还原酶的表达和/活性，增加细菌对糠醛或5-HMF的抗性或耐受性。本发明也涉及通过降低NADPH-依赖性的氧化还原酶的表达和/或活性，增加细菌在有糠醛或5-HMF存在下的生长。本发明也涉及通过降低NADPH-依赖性的氧化还原酶的表达和/或活性，增加细菌在有糠醛或5-HMF存在下的こ醇生产。根据所述方法,NADPH-依赖性的氧化还原酶的Km小于或等于YqhD或DkgA的Km。在一个实施方案中，NADPH-依赖性的氧化还原酶的优选底物是NADPH，不是NADH。在另ー个实施方案中，NADPH-依赖性的氧化还原酶的底物是NADPH，不是NADH。本发明也涉及由指定为保藏号NRRL B-50240的农业研究培养物保藏中心的保藏物代表的大肠杆菌株EMFR9。本发明也涉及由指定为保藏号NRRL B-50241的农业研究培养物保藏中心的保藏物代表的大肠杆菌株EMFR17。本发明也涉及由指定为保藏号NRRL B-50242的农业研究培养物保藏中心的保藏物代表的大肠杆菌株EMFR26。本发明也涉及由指定为保藏号NRRL B-50243的农业研究培养物保藏中心的保藏物代表的大肠杆菌株EMFR35。


图I.在LY180的构建中使用的线性DNA片段。图2A-C.糠醛对100 g/升木糖的pH-控制的发酵的影响。含有O. 4 g/升糠醛的发酵(A、B和C)。含有1.0 g/升糠醛的发酵(D、E和F)。为了清楚，分别用实线和虚线连接EMFR9和LY180的数据。所有的符号:_，LY180和糠醛；A,EMFR9和糠醛；D,LY180且没有糠醛；和Λ，EMFR9且没有糠醛。图3Α-Β.糠醛还原活性的对比。Α.发酵过程中完整细胞的体内活性。LY180和删除的衍生物显示为空心条。表达yqhD的糠醛-抗性的突变体EMFR9和EMFR9 (pL0I4301)显示为阴影条。B.携带表达克隆的基因(正向，用O. I mM IPTG诱导)的质粒的EMFR9的无细胞提取物中体外糠醛还原活性的对比。图4A-C.培养基组成对糠醛耐受性(MIC)的影响。A.含有木糖(50 g/升)的AMl培养基；B.含有葡萄糖的AMl培养基；C.含有木糖和酵母提取物(I. O g/升)的AMl培养基；所有的符号·，LY180 (虚线)；和^,EMFRg (实线)，在温育48小时以后。图5A-D. EMFR9的基因表达对糠醛耐受性的影响。A. dkgA的表达；B. yqhD的表达；C. yqfA的表达；D. yjjN的表达。所有的符号·，没有插入物的pCR2. I对照；ロ，未诱导的表达；Λ，用O. I mM IPTG诱导的表达。图6. LY180中的基因删除对在有I. O g/升糠醛耐受性存在下的生长的影响(48
h温育)。图7A-B.半纤维素水解物对生长(A)和こ醇生产(B)的影响。所有的符号LY180 (虚线)；和^,EMFRg (实线)，在温育48小时以后。图8A-C.大肠杆菌基因组中yqhC、yqhD和dkgA基因的排列和yqhC中天然存在的突变的位置。A，LY180 (糠醛-敏感的，野生型)。B，EMFR9和EMFR17 (糠醛-耐受性的)。C，丽205 (糠醛-耐受性的，选择为水解物-耐受性的)。图9.通过RNA的微阵列分析测得的yqhD和dkgA的表达水平。在y_轴上的表达水平是Iog2规模。LY180 O和EMFR9 0，在加入糠醛之前的表达水平。LY180 15和EMFR915，在加入糠醛之后15分钟的表达水平。图10A-D.在有糠醛存在下，LY180和LY180AyqhC生长。显示了细胞密度(光密度)相对于按小时计算的温育时间的图。A。在含有0、0. 5、I、I. 5和2 g/L糠醛的AM1_5%木糖培养基中，LY180的生长。B. LY180 AyqhC0C.携带单拷贝质粒pYqhC的LY180 Λ yqhC，野生型yqhC基因在它的天然启动子下。D.携带空载体pCCl的LY180 Δ yqhC。图11. LY180和LY180 AyqhC的糠醛消耗速率。图12.质粒pPyqhD-luc的结构，yqhD基因的启动子克隆在萤火虫萤光素酶报告基因的上游。 图13.在加入糠醛之前和之后，萤光素酶的表达。将萤光素酶报告质粒pPyqhD-luc转入LY180、EMFR9和EMFR17。在即将加入糠醛之前和在加入糠醛之后15分钟，测定萤光素酶水平。在y_轴上的值是相对发光单位(RLU)。图14.在LY180和LY180AyqhC中来自yqhD启动子的萤光素酶的表达。图15.该模型显示了推测的YqhC在从YqhD启动子的转录中的调节作用。图16A-B.显示了 YqhD氨基酸⑷和核酸⑶序列。图17A-B.显示了 DkgA氨基酸⑷和核酸⑶序列。图18A-B.显示了 YqhC氨基酸⑷和核酸⑶序列。图19. LY180和EMFR9中yqhC-yqhD_dkgA基因和周围区域的排列。显示了 yqhC、yqhD和dkgA的编码区在产乙醇株LY180中(上线)和在糠醛抗性的衍生物EMFR9中(下线)的位置和方向。显示了 LY180在yqhC左侧(metC和yghB)和在dkgA右侧(yqhG、yqhH和ygiQ)的侧接基因。ISlO存在于EMFR9的yqhC基因内。基于在EcoCyc处可得到的信息(Keseler 等人 2009 Nucleic Acids Res. 37: D464-D470),用箭头(实线)显不已知的启动子。用虚线箭头显示在yqhD上游的启动子。图20A-B.在加入糠醛以后，来自 1^18041\^1 9和1^180八79}1(的7911(19110-(11^八区域中的转录物的表达。通过总RNA针对大肠杆菌K12微阵列的表达杂交，测定转录物水平。在即将加入糠醛之前，或在加入O. 5 g/升糠醛之后15 min，收获细胞。显示了选择的基因的标准化的表达值，从在芯片上存在的每个探针的5个副本，计算SEM误差棒。(A)未经处理或用O. 5 g/升糠醛处理15 min的菌株LY180和EMFR9的基因yqhC、yqhD和dkgA以及侧接基因yghB和yqhG的表达水平。(B)在用糠醛处理之前和之后，菌株LY180和LY180 Δ yqhC的yqhC、yqhD和dkgA以及侧接基因的表达水平。图21A-D. yqhC删除对在有糠醛存在下的生长的影响。在含有50 g/升木糖且含有0、0. 5、1、1.5或2 g/升糠醛的AMl培养基中培养菌株。在48 h时段内，在30分钟间隔，监测光密度。测试的菌株是LY180 (A)，LY180 Λ yqhC (B)，含有携带yqhC+的单拷贝质粒 pL0I4901 的 LY180 Δ yqhC (C)，和含有空载体 pCCl 的 LY180 Δ yqhC (D)。图22A-C.使用萤火虫萤光素酶报告基因，测量yqhD启动子活性。(A) 质粒PL0I4900的结构，该质粒携带与在yqhD上游的启动子区域融合的萤火虫萤光素酶基因。(B)糠醛添加对来自LY180的yqhD启动子的萤火虫萤光素酶表达的影响。在AMI-50 g/升木糖中，培养携带PL0I4900的LY180培养物至OD55tl = O. 4，并在即将加入糠醛之前(t =0)，和在加入0、0. 1、0. 5和I g/升糠醛之后5、15和30分钟，取出样品。将萤光素酶活性表示为每O. 4 OD550单位的相对发光单位(RLU)。误差棒指示SEM。(C)来自LY180 Δ yqhC/PL0I4900中的yqhD启动子的萤火虫萤光素酶表达。条件和符号参见图22B。图23.选择的细菌的基因组中yqhC直系同源物的排列。关于大肠杆菌K12 (下线)，和关于含有yqhC直系同源物的属的选择，显示了在yqhC周围的基因的排列。在每个基因组中的yqhC直系同源物具有加粗的轮廓和剖面线。用在基因上面的括弧中的“yqhD”，指示YqhD直系同源物(当存在时)，并用(dkgA)指示dkgA直系同源物。在基因下面的数字代表在基因组中的坐标。使用EcoCyc多基因组浏览器，进行基因组的比对和直系同源物的检测。
图24A-F. 5-HMF对厌氧生长和发酵的影响。在含有木糖(100 g/Ι木糖)的AMl矿物盐培养基中培养细胞。A.在I. O g/1 5-HMF下生长期间的细胞质量；B.在I. O g/I 5-HMF下发酵期间的乙醇生产；C.发酵期间5-HMF (1.0 g/1)的降低；D.在2. 5 g/15-HMF下生长期间的细胞质量；E。在2. 5 g/1 5-HMF下发酵期间的乙醇生产；F.发酵期间5-HMF (2.5 g/1 5-HMF)的降低。为了对比，在图A和B中包括了不含5-HMF的平行发酵(虚线)。将所有数据绘制为平均值与标准差(n=3)。所有的符号D，LY180 ;和·，EMFR9。图25A-C. YqhD和DkgA对5-HMF的体外还原和5-HMF耐受性的影响。A. 5-HMF体外还原比活。在裂解的细胞提取物中测量活性(2 mM NADPH, 20 mM 5-HMF)。B.来自质粒的yqhD和dkgA表达对EMFR9 (抗性突变体)的细胞产率的影响。使用含有50 g/Ι木糖和I. O g/1 5-HMF的AMl培养基，在试管培养物中进行实验(48 h温育)。应当指出，为了维持质粒而包含卡那霉素，会降低5-HMF耐受性。使用O. I mM IPTG，培养诱导型(Ind)。C. yqhD和dkgA删除对LY180 (亲代)的细胞产率的影响。使用含有50 g/Ι木糖和2. 5g/1 5-HMF的AMl培养基，在试管培养物中进行实验(48 h温育)。将所有数据绘制为平均值与标准差(n=4)。图26A-C.来自质粒的pntAB表达对5-HMF耐受性的影响。使用指示的含有50 g/Ι木糖和5-HMF的AMl培养基，使用Bioscreen C生长曲线分析仪进行实验。将所有数据绘制为平均值与标准差(n=10)。为了清楚，已经省略了连接点。A.没有补充物；B.补充了 O. 9 g/1 5-HMF -M C.补充了 L 8 g/1 5-HMF。所有的符号Λ，LY180(pTrc99a-对照)；〇，未诱导的 LY180 (pTrc99a_pntAB) ; ·，用 O. 01 mM IPTG 诱导的LYI80 (pTrc99a-pntAB)。图27. L-半胱氨酸对LY180的5-HMF耐受性的影响。使用含有50 g/Ι木糖和5-HMF的AMl培养基，在试管培养物中进行实验(24 h温育)。给培养物添加了过滤除菌的指示的L-半胱氨酸。将所有数据绘制为平均值与标准差(n=4)。A. 1.0 g/1 5-HMF ;B.
2.0g/1 5-HMF。图28. yqhD和dkgA的启动子朝向和比对。图29.显示了来自 LY180 ⑷和 EMFR9 (B)的 yqhC-yqhD-dkgA 区域。
具体实施方式
I.定义
本文使用的“分离的”是指部分地或完全地不含有其它细菌的污染。在有小量不干扰分离的细菌的性质和功能的其它细菌存在下，分离的细菌可以存在。分离的细菌通常是至少30%、40%、50%、60%、70%、80%、85%、90%、95%、98%或99%纯的。优选地，根据本发明的分离的细菌是至少98%或至少99%纯的。本文使用的“细菌”可以包括“非重组细菌”、“重组细菌”和“突变型细菌”。本文使用的“非重组细菌”包括这样的细菌细胞，其不含有异源多核苷酸序列，且适合使用本发明的组合物和方法进一步修饰，例如适合遗传操作，例如，其可以掺入异源多核苷酸序列，例如，其可以被转染。该术语意在包括最初转染的细胞的后代。在具体实施方案中，所述细胞是革兰氏阴性细菌细胞或革兰氏阳性的细胞。本文使用的“重组的”当表示细菌时，是指这样的细菌细胞，其含有异源多核苷酸序列，或其已经被处理，使得天然的多核苷酸序列已经被突变或被删除。 本文使用的“突变型”当表示细菌时，是指与下文定义的参照细菌不同的细菌细胞。“突变型”细菌包括“重组的”细菌。本文使用的“产乙醇的”是指细菌从碳水化合物生产乙醇作为主要发酵产物的能力。该术语意在包括天然存在的产乙醇的生物体、和具有天然存在的或诱导的突变的产乙醇的生物体、或具有遗传改变的产乙醇的生物体。术语“不产乙醇的”是指细菌不能从碳水化合物生产乙醇作为主要发酵产物。该术语意在包括这样的微生物，其生成乙醇作为次要发酵产物，占总非气发酵产物的小于约40%。本文使用的“乙醇生产”是指从碳水化合物生产乙醇作为主要发酵产物。本文使用的“能够生产乙醇”是指能够实现本文定义的“乙醇生产”。术语“发酵”是指复合糖的降解或解聚和该糖残基向乙醇、乙酸盐和琥珀酸盐的生物转化。该术语意在包括从碳水化合物生产乙醇的酶过程(例如细胞的或无细胞的，例如裂解物或纯化的多肽混合物)，具体地，所述乙醇作为主要发酵产物。术语“主要发酵产物”和“主要的发酵产物”在本文可互换使用，意在包括发酵的非气产物，其占总非气产物的大于约50%。主要发酵产物是最丰富的非气产物。在本发明的某些实施方案中，主要发酵产物是乙醇。本文使用的术语“次要发酵产物”意在包括这样的发酵非气产物，其占总非气产物的小于40%。在本发明的某些实施方案中，次要发酵产物是乙醇。术语“糖”意在包括包含糖分子的任意碳水化合物源。这样的糖是根据本发明的产物和方法解聚(如果需要)并通过发酵随后向乙醛、再向乙醇生物转化的潜在糖来源。糖的来源包括淀粉(大部分植物中的主要燃料储藏形式)、半纤维素和纤维素(坚硬的细胞壁的主要胞外结构组分)和植物的纤维和木质组织。该术语意在包括单糖(monosaccharide)(也称作单糖(simple sugar))、寡糖和多糖。在某些实施方案中，糖包括，例如，葡萄糖、木糖、阿拉伯糖、甘露糖、半乳糖、蔗糖和乳糖。在其它实施方案中，糖是葡萄糖。本文使用的“YqhD”是指NADPH-依赖性的醛氧化还原酶。yqhD表示NADPH-依赖性的醛氧化还原酶基因，而术语YqhD表示yqhD基因产物。yqhD基因和YqhD多肽的核酸和氨基酸序列如图16所示。本文使用的“DkgA”是指催化2，5- 二酮-D-葡糖酸的还原的酶。DkgA也表示在甲基乙二醛的还原中起作用的酶。dkgA表示与催化2，5-二酮-D-葡糖酸的还原的酶相对应的基因，而术语DkgA表不dkgA基因广物。dkgA基因和DkgA多妝的核酸和氣基酸序列如图17所示。本文使用的“YqhC”是指转录调节剂、转录调节剂蛋白或从转录调节剂基因表达的基因产物。yqhC表示与转录调节剂相对应的基因，而术语YqhC表示yqhC基因产物。yqhC基因和YqhC多肽的核酸和氨基酸序列如图18所示。本文使用的“突变型核酸分子”或“突变型基因”意在包括这样的核酸分子或基因，其具有包含至少一个改变(例如，置换、插入、删除)的核苷酸序列，使得由该突变型编码的多肽表现出的活性或性质不同于由野生型核酸分子或基因编码的多肽，或其中所述突变型基因不产生多肽。
本文使用的“突变”当表示核酸分子或基因时，是指核酸或基因的删除，或核酸或基因的表达水平的降低，其中表达的删除或降低导致可以由核酸分子或基因编码的多肽的表达的删除或降低。突变也表示这样的核酸分子或基因，其具有包含至少一个改变(例如，置换、插入、删除)的核苷酸序列，使得由该突变型编码的多肽表现出的活性或性质不同于由野生型核酸分子或基因编码的多肽。本文使用的“突变型蛋白”或“突变型蛋白或氨基酸序列”意在包括这样的氨基酸序列，其包含至少一个改变(例如，置换、插入、删除)，使得由该突变型氨基酸序列编码的多肽表现出的活性或性质不同于由野生型氨基酸序列编码的多肽。本文使用的“突变”当表示蛋白或氨基酸序列时，是指氨基酸序列的氨基酸删除，氨基酸序列的表达水平的降低，其中表达的删除或降低导致可以由氨基酸序列编码的多肽的表达的删除或降低。突变也表示这样的蛋白或氨基酸序列，其具有包含至少一个改变(例如，置换、插入、删除)的氨基酸序列，使得由该突变型编码的多肽表现出的活性或性质不同于由野生型氨基酸序列编码的多肽。本文使用的“片段”或“子序列”意在包括亲代或参照核酸序列或氨基酸序列的一部分，或编码或保留亲代或参照序列、多肽或基因的生物功能或性质的多肽或基因的一部分。本文使用的“一部分”是指，表现出亲代或参照核酸序列、氨基酸序列、多肽或基因的功能或性质的参照核酸、氨基酸序列、多肽或基因的至少50% (例如，50、55、60、65、70、75、80、85、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99 或 100%)。本文使用的“保留”(例如保留生物功能或性质)是指表现出亲代或参照序列、多肽或基因的功能或性质的至少50% (例如，50、55、60、65、70、75、80、85、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99 或 100%)。“突变型”细菌包括含有上文定义的“突变”的细菌。本文使用的“参照”或“参照细菌”至少包括野生型细菌或亲代细菌。本文使用的“野生型”是指生物体或菌株的典型形式，例如在没有突变的情况下在自然界中存在的细菌、基因或特征。“野生型”表示在天然群体中最常见的表型。野生型是基因型和表型的参照标准。
本文使用的“亲代的”或“亲代的细菌”表示产生目标细菌的细菌。本文使用的“基因”是可以指导酶或其它多肽分子的合成的核酸，例如，可以包含编码序列，例如，编码多肽的连续开放读码框(ORF)、其子序列或片段，或它自身在生物体中可以是有功能的。生物体中的基因可以簇集在本文定义的操纵子中，其中所述操纵子与其它基因和/或操纵子被基因间DNA隔开。在操纵子中包含的单个基因可以没有基因间DNA地在单个基因之间重叠。另外，术语“基因”意在包括用于选定的目的的特定基因。基因可以是宿主细胞的内源基因，或可以重组地导入宿主细胞中，例如，作为游离地维持的质粒或稳定地整合进基因组中的质粒(或其片段)。异源基因是导入细胞中的、对于该细胞而言非天然的基因。术语“核酸”意在包括核酸分子，例如，多核苷酸，其包括编码多肽、其子序列或片段的开放读码框，且可以另外包括非编码的调节序列和内含子。另外，该术语意在包括一个或更多个与功能基因座映射(map)的基因。另外，该术语意在包括用于选定的目的的特定基因。在一个实施方案中，术语基因包括编码糠醛还原酶(例如NADPH-依赖性的糠醛还原酶)的任意基因，包括但不限于yqhD和dkgA。在一个实施方案中，基因或多核苷酸片段参 与碳水化合物向乙醇的生物转化的至少一个步骤。生物体中的基因可以簇集在本文定义的操纵子中，其中所述操纵子与其它基因和/或操纵子被基因间DNA隔开。本文使用的“增加”或“增加的”表示，增加了至少5%，例如，5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、99、100% 或更多，例如，与参照细菌相t匕，与糠醛抗性的细菌中yqhD、dkgA和/或yqhC基因的表达水平相比。本文使用的“增加”或“增加的”也表示增加了至少I-倍，例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、30、40、50、60、70、80、90、100、200、500、1000-倍或更多，例如，与参照细菌相t匕，与糠醛抗性的细菌中yqhD、dkgA和/或yqhC基因的表达水平相比。本文使用的“降低的”或“降低”或“减少”或“减少的”表示降低或减少了至少5%,例如，5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、99 或100%，例如，与参照细菌相比，与糠醛抗性的细菌中yqhD、dkgA和/或yqhC基因的表达水平相比。本文使用的“降低的”或“降低”或“减少”或“减少的”也表示降低或减少了至少 I-倍，例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、30、40、50、60、70、80、90、100、200、500、1000-倍或更多，例如，与参照细菌相比，与糠醛抗性的细菌中yqhD、dkgA和/或yqhC基因的表达水平相比。“降低的”或“减少的”也表示消除，使得不存在可检测的活性、表达水平等，例如不存在可检测的yqhD、dkgA和/或yqhC基因的表达水平,或不存在可检测的YqhD、DkgA和/或YqhC蛋白的活性。
本文使用的“活性”表示基因的活性，例如基因的转录水平。“活性”也表示mRNA的活性，例如，mRNA的翻译水平。“活性”也表示蛋白(例如YqhD或DkgA或YqhC)的活性。“活性的增加”包括活性的速率和/或水平的增加。本文使用的“表达”，如在“yqhD的表达”或“dkgA的表达”或“yqhC的表达”中，分别表不yqhD基因、dkgA基因和yqhC基因的蛋白广物的表达。本文使用的“表达”，如在“yqhD的表达”或“dkgA的表达”或“yqhC的表达”中，也分别表示与yqhD基因、dkgA基因和yqhC基因相对应的mRNA转录物的可检测水平的表达。当表示表达水平时，“改变”是指基因、mRNA或目标蛋白(例如yqhD、dkgA或yqhC)的降低的或增加的表达。当表示活性时，“改变”是指目标蛋白(例如YqhD、DdkgA或YqhC)的降低的或增加的活性。本文使用的“不表达”是指，不存在可检测的目标基因或mRNA (例如，yqhD、dkgA或yqhC)的产物水平。本文使用的“消除”是指降低至不可检测的水平。本文使用的“对糠醛的抗性”是指，突变型产乙醇细菌在有糠醛存在下生长或生产乙醇的能力，例如糠醛在O. I g/升或更高(例如O. 1、0·2、0·3、0·4、0·5、0·6、0·7、0·8、
0.9、I. O、I. I、I. 2、I. 3、I. 4、I. 5、I. 6、I. 7、I. 8、I. 9、2. O、2. 5、3. O、3. 5、4、4. 5、5、5. 5、6、6. 5、7、7. 5、8、8. 5、9、9. 5、10 g/升或更高)的浓度。对糠醛的抗性也表示产乙醇的细菌在
有糠醛存在下生长或生产乙醇的能力，其水平与野生型细菌或亲代细菌的生长或乙醇生产水平相比增加。当应用于糠醛存在时，本文使用的“在有……存在下”是指，在有至少O. I g/升或更高(例如 O. 1,0. 2,0. 3,0. 4,0. 5,0. 6,0. 7,0. 8,0. 9,1. 0,1. 1、1· 2,1. 3,1. 4,1. 5,1. 6、
1.7、1· 8、1· 9、2· 0、2· 5、3· 0、3· 5、4、4· 5、5、5· 5、6、6· 5、7、7· 5、8、8· 5、9、9· 5、10 g/ 升或更
高)的糠醛存在下维持细菌。当应用于糠醛不存在时，本文使用的“在没有……存在下”是指，在含有O. I g/升或更少(包括没有可检测水平)的糠醛的培养基中维持细菌。本文使用的“糠醛的还原性去除”是指，通过糠醛还原酶(例如NADPH-依赖性的糠醒还原酶，包括但不限于YqhD和DkgA)的作用，去除糠醒。这也可以通过加入编码YqhD或DkgA的核酸来实现。本文使用的“糠醛代谢”是指糠醛分解为糠醇、糠酸、2-酮戊二酸和醋酸中的任一种。 本文使用的“5-HMF”是指5-羟甲基糠醛。本文使用的“对5-HMF的抗性”是指突变型产乙醇细菌在有5-HMF存在下生长或生产乙醇的能力，例如5-HMF在O. I g/升或更高(例如O. 1、0· 5、1· 0、1· 5、2· 0、2· 5、3· O、3· 5、4、4· 5、5、5· 5、6、6· 5、7、7· 5、8、8· 5、9、9· 5、10 g/升或更高)的浓度。对 5-HMF 的抗性也表示产乙醇的细菌在有5-HMF存在下生长或生产乙醇的能力，其水平与野生型细菌或亲代细菌的生长或乙醇生产水平相比增加。当应用于5-HMF存在时，本文使用的“在有……存在下”是指，在有至少O. I g/升或更闻(例如 O. I、O. 5、I. O、I. 5、2. O、2. 5、3. O、3. 5、4、4. 5、5、5. 5、6、6· 5、7、7. 5、8、8· 5、9、
9.5,10 g/升或更高)的5-HMF存在下维持细菌。当应用于5-HMF不存在时，本文使用的“在没有……存在下”是指，在含有O. I g/升或更少(例如，· I、.09、.08. .07、. 06、. 05、. 01、. 005、. 001 g/升或更少)(包括没有可检测水平)的5-HMF的培养基中维持细菌。本文使用的“生长”是指，细菌的数目或质量随时间的增加(如本文所定义)。本文使用的“糠醛还原酶”是指将有毒的糠醛转化成更低毒性的糠醇的酶，例如NADPH-依赖性的糠醛还原酶，包括但不限于YqhD和DkgA。本文使用的“半纤维素水解物”包括但不限于源自生物质、半纤维素生物质、木质纤维素生物质或纤维素生物质的水解物。本文使用的“源自”是指来源于。
术语“革兰氏阴性细菌”意在包括本领域公认的该术语的定义。示例性的革兰氏阴性细菌包括不动杆菌属、葡糖杆菌属、发酵单胞菌属、埃希氏菌属、土杆菌属、希瓦氏菌属、沙门菌属、肠杆菌属和克雷伯菌属。术语“革兰氏阳性细菌”意在包括本领域公认的该术语的定义。示例性的革兰氏阳性细菌包括芽孢杆菌属、梭菌属、棒杆菌属、乳杆菌属、乳球菌属、酒球菌属、链球菌属和真杆菌属。术语“氨基酸”意在包括在蛋白中常规出现的20种α-氨基酸。碱性的带电荷的氨基酸包括精氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、组氨酸和赖氨酸。中性的带电荷的氨基酸包括丙氨酸、半胱氨酸、甘氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、色氨酸、酪氨酸和缬氨酸。酸性氨基酸包括天冬氨酸和谷氨酸。本文使用的“选择”表示，确定鉴别的细菌在有糠醛存在下生产乙醇的过程。本文使用的“鉴别”表示评估细菌并确定所述细菌在有糠醛存在下生产乙醇的过程。本文使用的“递增的糠醛的浓度”是指从O至5 g/L的增量，例如I μ g/升增量、Img/升增量或lg/L增量。本文使用的“选择”表示，确定鉴别的细菌在有5-HMF存在下生产乙醇的过程。本文使用的“鉴别”表示评估细菌并确定所述细菌在有5-HMF存在下生产乙醇的过程。本文使用的“递增的5-HMF的浓度”是指从O至5 g/L的增量，例如I μ g/升增量、I mg/升增量或lg/L增量。本文使用的“启动子的调节”表示启动子活性的增加或降低(如本文所定义)。本文使用的“删除”或“敲除”或“灭活”是指降低至不可检测的水平。当表示基因时，“删除”或“敲除”或“灭活”是指，去除基因，使得该基因通过本领域已知的试验(例如，PCR或DNA印迹分析)不再可检出，或使得与该基因相对应的mRNA通过本领域已知的试验(例如，PCR或RNA印迹分析)不再可检出，或使得编码的蛋白通过本领域已知的试验(例如，蛋白印迹分析、SDS-PAGE或酶试验)不再可检出或不再是有功能的。如本文使用的，“删除的”或“敲除的”或“无活性的”基因是指，根据本领域已知的方法，不具有可检测的表达水平的基因。基因灭活方法包括,使用siRNA或反义方法的RNA干扰。本文使用的术语“siRNA”表示双链核酸，其中每条链包括RNA、RNA类似物或RNA和DNA。通常，siRNA的反义链与目标基因/RNA的靶序列充分互补，以降低或灭活该基因的表达。“反义”是指具有与靶核酸序列的互补性的核苷酸序列。RNA是基因的直接产物，这些小RNA可以结合特定的靶RNA，并增加或降低它们的活性。具体地，反义链会结合互补的mRNA，从而阻止蛋白生成。
在本公开内容中，“包含”、“含有”和“具有”等具有在美国专利法中赋予它们的开放式含义，并表示“包括”等。II. 细菌
本发明涉及对糠醛和/或5-HMF抗性的细菌。本发明提供了非重组的和重组的细菌。本发明提供了分离的细菌，其与参照细菌相比，具有增加的对糠醛和/或5-HMF的抗性。本发明的细菌包括，产乙醇的细菌，和/或与参照细菌相比表现出增加的乙醇生产的细菌。、在一个方面，与参照细菌中的表达相比，本发明的细菌中yqhD、yqhC和/或dkgA的表达被降低或消除。通过本领域已知的方法，降低表达，包括但不限于与参照细菌相比，改变调节yqhD、yqhC和/或dkgA表达的启动子。例如,通过本领域接受的方法,改变启动子,所述方法包括但不限于删除启动子、用不同的启动子替换启动子、修饰启动子(例如通过插入、置换或去除核酸,或通过插入或去除调控元件或启动子中的基序)。在一个实施方案中，通过改变或删除yqhC基因，降低或消除表达。在另一个方面，与参照细菌中YqhD、YqhC和/或DkgA蛋白的活性相比，在本发明的细菌中，YqhD、YqhC和/或DkgA蛋白的活性被降低或改变。通过本领域已知的方法，降低或改变活性，所述方法包括但不限于修饰yqhD、yqhC和/或dkgA基因(例如通过在编码该基因的序列中插入、置换或去除核酸或氨基酸)。本发明也提供了一种细菌，其中与参照细菌中yqhD、yqhC和/或dkgA基因的表达相比，yqhD、yqhC和/或dkgA基因的表达降低，且与参照细菌中yqhD或yqhD和dkgA基因的调节相比，yqhD、yqhC和/或dkgA基因的调节被改变。通过本领域已知的方法，降低或改变表达，所述方法包括但不限于修饰yqhD、yqhC和/或dkgA基因(例如通过在编码该基因的序列中插入、置换或去除核酸或氨基酸)。本发明提供了一种细菌，其中与参照细菌相比，yqhD、yqhC和/或dkgA基因被灭活或敲除。通过本领域已知的任意机理，可以改变基因表达，所述机理包括但不限于反义抑制或反义转录的机理。本发明提供了改变yqhD、yqhC和/或dkgA基因的调节的方法,这通过本领域已知的方法来实现，所述方法包括但不限于与参照细菌相比，将yqhD、yqhC和/或dkgA基因置于不同启动子控制下，或置于额外启动子控制下。本发明提供了改变yqhD、yqhC和/或dkgA基因的调节的方法，这通过本领域已知的方法来实现，所述方法包括但不限于与参照细菌相比，将yqhD、yqhC和/或dkgA基因置于不同调节蛋白控制下，或置于额外调节蛋白控制下。在一个实施方案中，所述调节蛋白是阻遏物。在一个替代实施方案中，所述调节蛋白是诱导物。本发明也提供了调节或改变yqhD或yqhD和dkgA基因的调节的方法,这通过与参照细菌相比改变或删除yqhC基因来实现。本发明也提供了一种细菌，其与参照细菌相比，具有增加的对糠醛和/或5-HMF的抗性，且其中所述细菌与参照细菌相比，在有糠醛和/或5-HMF存在下具有增加的乙醇生产。在一个方面，与参照细菌相比在降低或没有糠醛的还原性去除下，本发明的细菌与参照细菌相比具有增加的乙醇生产。在另一个方面，本发明的细菌与参照细菌相比具有降低的或消除的糠醛代谢。本发明提供了一种细菌，其具有增加的对糠醛的抗性，并另外表现出下述的至少一种1)在有或没有糠醛存在下，与参照细菌相比增加的生长；2)与参照细菌相比，增加的生长和增加的乙醇生产；3)在有糠醛存在下，与参照细菌相比增加的生长和增加的乙醇生产；4)与参照细菌相比，降低的糠醛还原酶活性；和5)在有水解物存在下，与参照细菌相比增加的生长；和6)与参照细菌相比，增加的乙醇生产。本发明提供了一种细菌，其具有增加的对5-HMF的抗性，并另外表现出下述的至少一种1)在有或没有5-HMF存在下，与参照细菌相比增加的生长；2)与参照细菌相比，增加的生长和增加的乙醇生产；3)在有5-HMF存在下，与参照细菌相比增加的生长和增加的乙醇生产；4)与参照细菌相比，降低的5-HMF还原酶活性；和5)在有水解物存在下，与参照细菌相比增加的生长；和6)与参照细菌相比，增加的乙醇生产。本发明提供了多种水解物，包括但不限于源自生物质、半纤维素生物质、木质纤维素生物质或纤维素生物质的水解物。本发明也提供了一种具有增加的对糠醛的抗性的细菌，其中所述细菌能够生产乙醇作为主要发酵产物，其中任选地，所述主要发酵产物在缺氧或微氧条件下生产。本发明也提供了一种细菌,其中与参照细菌中的表达相比,yqhD、yqhC和/或dkgA基因的表达降低，且其中所述细菌能够在有或没有糠醛存在下生产乙醇。通过本领域已知的方法，降低yqhD或yqhD和dkgA基因的表达,所述方法包括但不限于与所述参照细菌相比，改变调节基因表达的启动子，或通过与参照细菌相比，改变或删除yqhC基因。本发明也提供了一种细菌，其中与参照细菌中的表达相比，yqhC基因的表达降低，且其中所述细菌能够在有或没有糠醛存在下生产乙醇。在一个方面，本发明提供了一种分离的细菌，其中yqhD、yqhC和/或dkgA基因表达被降低或不表达，且其中所述细菌在有或没有糠醛存在下生产乙醇。本发明的细菌也可以表现出下述的至少一种1)在有糠醛存在下，与参照细菌相比增加的乙醇生产和增加的生长；2)在有糠醛存在下，与参照细菌相比增加的乙醇生产和增加的生长；3)生产乙醇作为主要发酵产物，其中任选地，所述主要发酵产物在缺氧或微氧条件下生产；和4)生产乙醇作为主要发酵产物，其中任选地，所述主要发酵产物在缺氧或微氧条件下生产。在一个方面，本发明提供了一种分离的细菌，其中yqhC基因表达被降低或消除。
本发明也提供了一种细菌，其中与参照细菌中的活性相比，YqhD或YqhD和DkgA蛋白的活性被降低或消除，且其中所述细菌能够在有糠醛存在下生产乙醇。本发明也提供了一种细菌，其中与参照细菌中的活性相比，YqhC的活性被降低或消除，且其中所述细菌能够在有糠醛存在下生产乙醇。在另一个方面，本发明提供了一种细菌，其中与参照细菌中yqhD或yqhD和dkgA基因的表达相比，yqhD或yqhD和dkgA基因的表达被降低，且其中所述细菌能够在有糠醛
存在下生产乙醇。
本发明也提供了一种分离的细菌，其中与参照细菌中的调节相比，yqhD或yqhD和dkgA基因的调节被改变，且其中所述细菌能够在有糠醛存在下生产乙醇。本发明 也提供了一种分离的细菌，其中与参照细菌相比，yqhD、yqhC和/或dkgA基因被灭活或敲除，且其中所述细菌可以在有或没有糠醛存在下生产乙醇。本发明也提供了一种分离的细菌，其中与参照细菌相比，yqhC基因被灭活或敲除，且其中所述细菌可以在有或没有糠醛存在下生产乙醇。本发明也提供了一种分离的细菌，其中与参照细菌相比，yqhD或yqhD和dkgA基因的调节被改变，且其中所述细菌能够生产乙醇，其中任选地，乙醇的生产是在有糠醛存在下。本发明也提供了一种分离的细菌，其中与参照细菌相比，yqhC基因的调节被改变，且其中所述细菌能够生产乙醇，其中任选地，乙醇的生产是在有糠醛存在下。在一个实施方案中，如下改变yqhD或yqhD和dkgA基因的调节与参照细菌相比，将yqhD或yqhD和dkgA基因置于不同启动子控制下,或置于额外启动子控制下,或通过改变或删除yqhC基因。在一个实施方案中，如下改变yqhD或yqhD和dkgA基因的调节与参照细菌相比，将yqhD或yqhD和dkgA基因置于不同调节蛋白控制下，或置于额外调节蛋白控制下，或通过改变或删除yqhC基因。在一个实施方案中，所述调节蛋白是阻遏物。在一个替代实施方案中，所述调节蛋白是诱导物。还通过反义抑制或反义转录的方法，降低表达。通过多种方法，生产本发明的细菌。通过包含下述步骤的方法，制备一种分离的细菌，其具有降低的NADPH-依赖性的糠醛还原酶活性的表达，其中所述细菌能够在有糠醛存在下生产乙醇在有或没有糠醛存在下，培养细菌的候选突变株；并选择在有糠醛存在下生产乙醇的突变株。或者，如下制备一种分离的细菌，其具有降低的NADPH依赖性的糠醛还原酶活性的表达，其中所述细菌能够在有或没有糠醛存在下生产乙醇在有递增浓度的糠醛存在下，培养细菌的候选突变株；并选择在有糠醛存在下生产乙醇的细菌。所述NADPH-依赖性的糠醛还原酶可以是任意NADPH-依赖性的糠醛还原酶，包括但不限于YqhD或YqhD和DkgA。通过包含下述步骤的方法,制备一种分离的细菌,其中yqhD或yqhD和dkgA基因的表达与参照细菌相比降低，其中所述细菌能够在有或没有糠醛存在下生产乙醇在有糠醛存在下，培养细菌的候选突变株；并选择在有糠醛存在下生产乙醇的突变株；或者，在有递增浓度的糠醛存在下，培养细菌的候选株；并选择在有糠醛存在下生产乙醇的细菌。本发明也提供了生产细菌的方法，所述方法包括下述步骤其中yqhC基因的表达降低，或其中yqhC基因被改变或删除。通过包含下述步骤的方法，制备一种分离的细菌，其具有降低的NADPH-依赖性的糠醛还原酶活性的表达，其中所述细菌能够在有或没有糠醛存在下生产乙醇降低yqhD或yqhD和dkgA的表达；在有糠醛存在下，培养细菌的候选株；并选择在有糠醛存在下生产乙醇的细菌。通过包含下述步骤的方法，制备一种分离的细菌，其具有降低的yqhD基因表达或降低的yqhD和dkgA基因表达，其中所述细菌能够在有糠醛存在下生产乙醇降低yqhD或yqhD和dkgA基因的表达；在有糠醛存在下，培养细菌的候选株；并选择在有糠醛存在下生产乙醇的细菌。通过包含下述步骤的方法，制备一种分离的细菌，其中与参照细菌中的活性相比，YqhD或YqhD和DkgA蛋白的活性被降低或消除，其中所述细菌能够在有或没有糠醛存在下生产乙醇在有糠醛存在下，培养细菌的候选突变株；并选择在有糠醛存在下生产乙醇的突变株；或在有递增浓度的糠醛存在下，培养细菌的候选株；并选择在有糠醛存在下生产乙醇的细菌。
通过本领域已知的方法，降低基因的表达，所述方法包括但不限于基因敲除或基因沉默。通过包含下述步骤的方法，制备一种分离的细菌，其中与参照细菌相比，yqhD或yqhD和dkgA基因被灭活或敲除，其中所述细菌能够在有或没有糠醛存在下生产乙醇在有糠醛存在下，培养细菌的候选突变株；并选择在有糠醛存在下生产乙醇的突变株；或在有递增浓度的糠醛存在下，培养细菌的候选突变株；并选择在有糠醛存在下生产乙醇的细菌。通过包含下述步骤的方法，制备一种分离的细菌，其中与参照细菌相比，yqhD或yqhD和dkgA基因的调节被改变，其中所述细菌能够在有或没有糠醛存在下生产乙醇在有糠醛存在下，培养细菌的候选突变株；并选择在有糠醛存在下生产乙醇的突变株；或在有递增浓度的糠醛存在下，培养细菌的候选株；并选择在有糠醛存在下生产乙醇的细菌。根据本发明的方法，通过本领域已知的多种方法，改变调节，所述方法包括但不限于与参照细菌相比，将yqhD或yqhD和dkgA基因置于不同启动子控制下,或置于额外启动子控制下。根据本发明的方法，通过本领域已知的多种方法，改变调节，所述方法包括但不限于与参照细菌相比，将yqhD或yqhD和dkgA基因置于不同调节蛋白控制下，或置于额外的调节蛋白控制下。在一个实施方案中，所述调节蛋白是阻遏物。在一个替代实施方案中，所述调节蛋白是诱导物。本发明也提供了通过与参照细菌相比改变或删除yqhC基因，调节yqhD 或 yqhD 和 dkgA 基因。本发明也提供了制备本发明的细菌的方法，其中借助于本领域已知的任意方法，包括但不限于反义转录，沉默yqhD或yqhD和dkgA基因。本发明的细菌是非重组的或重组的。在一个实施方案中，所述细菌能够生产乙醇作为主要发酵产物，其中任选地，所述主要发酵产物在缺氧或微氧条件下生产。本发明的细菌选自革兰氏阴性细菌和革兰氏阳性细菌，其中所述革兰氏阴性细菌选自不动杆菌属、葡糖杆菌属、发酵单胞菌属、埃希氏菌属、土杆菌属、希瓦氏菌属、沙门菌属、肠杆菌属和克雷伯菌属，且所述革兰氏阳性细菌选自芽孢杆菌属、梭菌属、棒杆菌属、乳杆菌属、乳球菌属、酒球菌属、链球菌属和真杆菌属。在一个方面，本发明的细菌是大肠杆菌。在另一个方面，本发明的细菌是产酸克雷伯菌。在另一个方面，本发明的细菌是大肠杆菌株EMFR9。在另一个方面，本发明的细菌是由指定为保藏号NRRL B-50240的农业研究培养物保藏中心的保藏物代表的大肠杆菌株EMFR9。
在另一个方面，本发明的细菌是由指定为保藏号NRRL B-50239的农业研究培养物保藏中心的保藏物代表的大肠杆菌株LY180。在另一个方面，本发明的细菌是由指定为保藏号NRRL B-50241的农业研究培养物保藏中心的保藏物代表的大肠杆菌株EMFR17。在另一个方面，本发明的细菌是由指定为保藏号NRRL B-50242的农业研究培养物保藏中心的保藏物代表的大肠杆菌株EMFR26，或由指定为保藏号NRRL B-50243的农业研究培养物保藏中心的保藏物代表的大肠杆菌株EMFR35。III. 生产乙醇的方法
在另一个方面，本发明提供了从寡糖源生产乙醇的方法。所述方法包括，使寡糖接触上述的本发明的非重组细菌或宿主细胞，由此从寡糖源生产乙醇。在所述方法的一个具体实施方案中，所述寡糖选自木质纤维素、半纤维素、纤维素、果胶及其任意组合。在另一个方面，本发明提供了从生物质、半纤维素生物质、木质纤维素生物质、纤维素生物质或寡糖源生产乙醇的方法，所述方法包括，使生物质、半纤维素生物质、木质纤维素生物质、纤维素生物质或寡糖接触本发明的分离的细菌，从而从生物质、半纤维素生物质、木质纤维素生物质、纤维素生物质或寡糖源生产乙醇。在另一个方面，本发明提供了在有糠醛存在下从生物质、半纤维素生物质、木质纤维素生物质、纤维素生物质或寡糖源生产乙醇的方法，所述方法包括，使生物质、半纤维素生物质、木质纤维素生物质、纤维素生物质或寡糖接触本发明的分离的细菌，从而从生物质、半纤维素生物质、木质纤维素生物质、纤维素生物质或寡糖源生产乙醇。本发明也提供了通过本发明的方法生产的乙醇。本发明的宿主细胞的特征在于，在缺氧条件下低乙醇生产水平。野生型大肠杆菌在缺氧生长过程中以1:1的比例生产乙醇和乙酸盐。在生长的静止期，野生型大肠杆菌生产乳酸盐作为主要产物，且总发酵产物中乙醇的分数是约20%。在所有这样发酵中的产物包含各种酸，因而产生术语混合酸发酵。通常，选择提供最佳pH和温度的发酵条件，用于促进最佳的生产宿主细胞株的生长动力学和培养物生产的酶的催化条件(Doran攀乂，(1993) Biotechnol. Progress.9:533-538)。例如，对于克雷伯菌属，例如，P2菌株，确定的最佳条件是35_37°C和pH 5. 0-PH 5.4。在这些条件下，甚至外源地加入的真菌内切葡聚糖酶和外切葡聚糖酶是非常稳定的，并继续长时间地发挥功能。在实施例中讨论了其它条件。此外，技术人员会理解，使用本领域已知的技术，仅需要例行试验，即可优化本发明的给定的发酵反应。参见，例如，美国专利号5，424，202和5，916，787，它们特别地通过引用并入本文。在另一个方面，本发明提供了试剂盒，其包含上述的本发明的非重组细菌或宿主细胞，和根据本文所述的方法和工艺生产乙醇的说明书。在一个实施方案中，所述试剂盒包含糖源。本发明也提供了通过降低NADPH-依赖性的氧化还原酶的表达和/或活性，增加细菌对糠醛或5-HMF的抗性或耐受性的方法。本发明也提供了鉴别NADPH-依赖性的氧化还原酶的方法，所述酶通过降低NADPH-依赖性的氧化还原酶的表达和/活性，增加细菌对糠醛或5-HMF的抗性或耐受性。本发明也涉及通过降低NADPH-依赖性的氧化还原酶的表达和/或活性，增加细菌在有糠醛或5-HMF存在下的生长。本发明也涉及通过降低NADPH-依赖性的氧化还原酶的表达和/或活性，增加细菌在有糠醛或5-HMF存在下的乙醇生产。根据所述方法,NADPH-依赖性的氧化还原酶的Km小于或等于YqhD或DkgA的Km。在一个实施方案中，NADPH-依赖性的氧化还原酶的优选底物是NADPH，不是NADH。在另一个实施方案中，NADPH-依赖性的氧化还原酶的底物是NADPH，不是NADH。YqhD 的 Km 是大约 2-32 μ M，例如 2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、31 或 32μ M0在一个实施方案中，所述YqhD的Km是大约4-24。在另一个实施方案中，所述YqhD的Km是大约6-16 μ Μ。在另一个实施方案中，所述YqhD的Km是8 μ Μ。DkgA 的 Km 是大约 6-92 μΜ，例如 6、7、8、9、10、15、20、25、30、35 40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、91或92 μ M0在一个实施方案中，DkgA的Km是大约12-70。在另一个实施方案中，DkgA的Km是大约18-50 μ Μ。在另一个实施方案中，YqhD的Km是23 μ Μ。IV. 使用方法
本发明提供了一种具有增加的对糠醛和/或5-HMF的抗性的细菌。所述细菌可以用于生产乙醇，具体地，用于在有或没有糠醛存在下从寡糖源生产乙醇，其中使寡糖接触本发明的细菌，从而从寡糖源生产乙醇。本发明也提供了试剂盒，其用于在有或没有糠醛存在下从寡糖源生产乙醇，其中所述试剂盒包含使用说明书和任选的包装工具。V. 例证
下面的实施例进一步例证了本发明，它们不应当解释为限制性的。在实施例中，使用下面的材料和方法，除非另有说明。材料和方法
菌株、培养基和生长条件
在表I中列出了在该研究中使用的菌株和质粒。使用Luria肉汤(Miller 1992 Ashort course in bacterial genetics. CSHL Press. Plainview, New York),进行质粒和菌株构建。在适当时，包含抗生素。在30°C培养温度条件性的质粒；在37°C培养所有其它质粒。在发酵实验所用的AMl矿物盐培养基(Martinez等人2007 Biotechnol. Lett.29:397-404)中，维持产乙醇的菌株，所述培养基添加了 20 g/升木糖(对于固体培养基)和50 g/升木糖或更高(对于液体培养基)。菌株大肠杆菌株LY168 (Jarboe等人2007. Adv.Biochem. Engin/Biotechnol. 108:237-261)是KOll的衍生物，并用作该研究的起点。应当指出，大肠杆菌W (ATCC 9637)是菌株KOll的亲代，最初被报道为大肠杆菌B的衍生物(Ohta 等人 1991. Appl. Environ. Microbiol. 57:893-900)。表I.细菌菌株、质粒和引物
权利要求
1.一种分离的细菌，其中所述细菌与参照细菌相比，具有增加的对糠醛的抗性。
2.如权利要求I所述的分离的细菌，其中所述细菌是产乙醇的。
3.如权利要求I所述的分离的细菌，其中所述细菌与参照细菌相比，具有增加的乙醇生产。
4.如权利要求I所述的分离的细菌，其中与参照细菌相比，yqhD基因的表达降低。
5.如权利要求I所述的分离的细菌，其中与参照细菌中的表达相比，yqhD基因和dkgA基因的表达降低。
6.如权利要求I所述的分离的细菌，其中与参照细菌中的表达相比，yqhC基因的表达降低。
7.如权利要求I所述的分离的细菌，其中不表达yqhD基因。
8.如权利要求I所述的分离的细菌，其中不表达yqhD基因和dkgA基因。
9.如权利要求I所述的分离的细菌，其中不表达yqhC基因。
10.如权利要求4、5、7或8中任一项所述的分离的细菌，其中与参照细菌相比，yqhC基因的表达降低。
11.如权利要求4、5、7或8中任一项所述的分离的细菌，其中yqhC基因被删除。
12.如权利要求I所述的分离的细菌，其中与参照细菌相比，YqhD蛋白的活性降低。
13.如权利要求I所述的分离的细菌，其中与参照细菌相比，YqhD蛋白的活性和DkgA蛋白的活性降低。
14.如权利要求I所述的分离的细菌，其中与参照细菌相比，YqhC蛋白的活性降低。
15.如权利要求I所述的分离的细菌，其中与参照细菌相比，yqhD基因的表达的调节被改变。
16.如权利要求I所述的分离的细菌，其中与参照细菌中的表达相比，yqhD基因的表达的调节和dkgA基因的表达的调节被改变。
17.如权利要求I所述的分离的细菌，其中与参照细菌中的表达相比，yqhC基因的表达的调节被改变。
18.如权利要求12、13、15或16中任一项所述的分离的细菌，其中与参照细菌相比，yqhC基因的表达降低。
19.如权利要求12、13、15或16中任一项所述的分离的细菌，其中yqhC基因被删除。
20.如权利要求12或13所述的分离的细菌，其中存在yqhD基因启动子或调节蛋白的活性的变化。
21.如权利要求13所述的分离的细菌，其中存在dkgA基因启动子或调节蛋白的活性的变化。
22.如权利要求I所述的分离的细菌，其中由于反义RNA的添加，YqhD、DkgA和/或YqhC蛋白的水平降低。
23.如权利要求I所述的分离的细菌，其中由于SiRNA的添加，YqhD、DkgA和/或YqhC蛋白的水平降低。
24.一种分离的细菌，其具有降低的NADPH-依赖性的糠醛还原酶活性的表达，其中所述细菌能够生产乙醇，且其中所述细菌通过包含下述步骤的方法制备 a)在有糠醛存在下，培养细菌的候选突变株；和b)选择在有糠醛存在下生产乙醇的突变株。
25.一种分离的细菌，其具有降低的NADPH-依赖性的糠醛还原酶活性的表达，其中所述细菌能够生产乙醇，且其中所述细菌通过包含下述步骤的方法制备 a)在有递增浓度的糠醛存在下，培养细菌的候选株；和 b)选择在有糠醛存在下生产乙醇的细菌。
26.如权利要求24或25所述的分离的细菌，其中所述NADPH-依赖性的糠醛还原酶是YqhD 或 DkgA0
27.如权利要求24或25所述的分离的细菌，其中所述NADPH-依赖性的糠醛还原酶是YqhD 和 DkgA0
28.一种分离的细菌，其中yqhD基因表达与参照细菌相比降低，其中所述细菌能够生产乙醇，且其中所述细菌通过包含下述步骤的方法制备 a)在有糠醛存在下，培养细菌的候选株；和 b)选择在有糠醛存在下生产乙醇的细菌。
29.—种分离的细菌，其中yqhD基因表达与参照细菌相比降低，其中所述细菌能够生产乙醇，且其中所述细菌通过包含下述步骤的方法制备 a)在有递增浓度的糠醛存在下，培养细菌的候选株；和 b)选择在有糠醛存在下生产乙醇的细菌。
30.一种分离的细菌，其中yqhD基因和dkgA基因的表达与参照细菌相比降低，其中所述细菌能够生产乙醇，且其中所述细菌通过包含下述步骤的方法制备 a)在有糠醛存在下，培养细菌的候选株；和 b)选择在有糠醛存在下生产乙醇的细菌。
31.一种分离的细菌，其中yqhD基因和dkgA基因的表达与参照细菌相比降低，其中所述细菌能够生产乙醇，且其中所述细菌通过包含下述步骤的方法制备 a)在有递增浓度的糠醛存在下，培养细菌的候选株；和 b)选择在有糠醛存在下生产乙醇的细菌。
32.如权利要求28-31中任一项所述的分离的细菌，其中yqhC基因的表达降低。
33.如权利要求28-31中任一项所述的分离的细菌，其中yqhC基因被删除。
34.一种分离的细菌，其中yqhC基因的表达与参照细菌相比降低，其中所述细菌能够生产乙醇，且其中所述细菌通过包含下述步骤的方法制备 a)在有糠醛存在下，培养细菌的候选株；和 b)选择在有糠醛存在下生产乙醇的细菌。
35.一种分离的细菌，其中yqhC基因的表达与参照细菌相比降低，其中所述细菌能够生产乙醇，且其中所述细菌通过包含下述步骤的方法制备 a)在有递增浓度的糠醛存在下，培养细菌的候选株；和 b)选择在有糠醛存在下生产乙醇的细菌。
36.一种分离的细菌，其具有降低的NADPH-依赖性的糠醛还原酶活性的表达，其中所述细菌生产乙醇，其中所述细菌通过包含下述步骤的方法制备 a)降低yqhD基因的表达； b)在有糠醛存在下，培养细菌的候选株；和c)选择在有糠醛存在下生产乙醇的细菌。
37.一种分离的细菌，其具有降低的NADPH-依赖性的糠醛还原酶活性的表达，其中所述细菌生产乙醇，其中所述细菌通过包含下述步骤的方法制备 a)降低yqhD基因和dkgA基因的表达； b)在有糠醛存在下，培养细菌的候选株；和 c)选择在有糠醛存在下生产乙醇的细菌。
38.如权利要求36或37所述的分离的细菌，其中yqhC基因的表达降低。
39.如权利要求36或37所述的分离的细菌，其中yqhC基因被删除。
40.一种分离的细菌，其具有降低的NADPH-依赖性的糠醛还原酶活性的表达，其中所述细菌生产乙醇，其中所述细菌通过包含下述步骤的方法制备 a)降低yqhC基因的表达； b)在有糠醛存在下，培养细菌的候选株；和 c)选择在有糠醛存在下生产乙醇的细菌。
41.一种分离的细菌，其具有降低的yqhD基因的表达，其中所述细菌能够生产乙醇，且其中所述细菌如下制备 a)降低yqhD基因的表达， b)在有糠醛存在下，培养细菌的候选株；和 c)选择在有糠醛存在下生产乙醇的细菌。
42.一种分离的细菌，其具有降低的yqhD基因和dkgA基因的表达，其中所述细菌能够生产乙醇，且其中所述细菌如下制备 a)降低yqhD基因和dkgA基因的表达， b)在有糠醛存在下，培养细菌的候选株；和 c)选择在有糠醛存在下生产乙醇的细菌。
43.如权利要求41或42所述的分离的细菌，其中yqhC基因的表达降低。
44.如权利要求41或42所述的分离的细菌，其中yqhC基因被删除。
45.一种分离的细菌，其具有降低的yqhC基因的表达，其中所述细菌能够生产乙醇，且其中所述细菌如下制备 a)降低yqhC基因的表达， b)在有糠醛存在下，培养细菌的候选株；和 c)选择在有糠醛存在下生产乙醇的细菌。
46.一种分离的细菌，其中与参照细菌相比，YqhD蛋白的活性降低或消除，其中所述细菌能够生产乙醇，其中所述细菌如下制备 a)在有糠醛存在下，培养细菌的候选株；和 b)选择在有糠醛存在下生产乙醇的细菌。
47.一种分离的细菌，其中与参照细菌相比，YqhD蛋白的活性降低，其中所述细菌能够生产乙醇，其中所述细菌如下制备 a)在有递增浓度的糠醛存在下，培养细菌的候选株；和 b)选择在有糠醛存在下生产乙醇的细菌。
48.一种分离的细菌，其中与参照细菌相比，YqhD蛋白和DkgA蛋白的活性降低或消除，其中所述细菌能够生产乙醇，其中所述细菌如下制备 a)在有糠醛存在下，培养细菌的候选株；和 b)选择在有糠醛存在下生产乙醇的细菌。
49.一种分离的细菌，其中与参照细菌相比，YqhD蛋白和DkgA蛋白的活性降低，其中所述细菌能够生产乙醇，其中所述细菌如下制备 a)在有递增浓度的糠醛存在下，培养细菌的候选株；和 b)选择在有糠醛存在下生产乙醇的细菌。
50.如权利要求46-49中任一项所述的分离的细菌，其中yqhC基因的表达降低。
51.如权利要求46-49中任一项所述的分离的细菌，其中yqhC基因被删除。
52.一种分离的细菌，其中与参照细菌相比，YqhC蛋白的活性降低或消除，其中所述细菌能够生产乙醇，其中所述细菌如下制备 a)在有糠醛存在下，培养细菌的候选株；和 b)选择在有糠醛存在下生产乙醇的细菌。
53.一种分离的细菌，其中与参照细菌相比，YqhC蛋白的活性降低，其中所述细菌能够生产乙醇，其中所述细菌如下制备 a)在有递增浓度的糠醛存在下，培养细菌的候选株；和 b)选择在有糠醛存在下生产乙醇的细菌。
54.如权利要求1-53中任一项所述的分离的细菌，其中与参照细菌相比，所述细菌在有糠醛存在下具有增加的乙醇生产。
55.如权利要求1-53中任一项所述的分离的细菌，其中与参照细菌相比，所述细菌在有5-羟甲基糠醛(5-HMF)存在下具有增加的乙醇生产。
56.如权利要求1-53中任一项所述的分离的细菌，其中与参照细菌相比，所述细菌在有选自下述的醛存在下具有增加的乙醇生产乙醛、丙醛、丁醛和肉桂醛。
57.如权利要求1-53中任一项所述的分离的细菌，其中与参照细菌相比，所述细菌在有甲基乙二醛存在下具有增加的乙醇生产。
58.如权利要求1-53中任一项所述的分离的细菌，其中与参照细菌相比，当糠醛的还原性去除水平降低时，所述细菌具有增加的乙醇生产。
59.如权利要求1-52中任一项所述的分离的细菌，其中与参照细菌相比，所述细菌具有降低的糠醛代谢。
60.如权利要求1-53中任一项所述的分离的细菌，其中所述细菌不具有可检测的糠醛代谢。
61.如权利要求1-53中任一项所述的分离的细菌，其中与参照细菌相比，所述细菌具有增加的生长。
62.如权利要求1-53中任一项所述的分离的细菌，其中与参照细菌相比，所述细菌在有糠醛存在下具有增加的生长。
63.如权利要求1-53中任一项所述的分离的细菌，其中与参照细菌相比，所述细菌在有糠醛存在下具有增加的生长和增加的乙醇生产。
64.如权利要求1-53中任一项所述的分离的细菌，其中与参照细菌相比，所述细菌在有5-HMF存在下具有增加的生长。
65.如权利要求1-53中任一项所述的分离的细菌，其中与参照细菌相比，所述细菌在有5-HMF存在下具有增加的生长和增加的乙醇生产。
66.如权利要求1-53中任一项所述的分离的细菌，其中与参照细菌相比，所述细菌具有降低的糠醛还原酶活性。
67.如权利要求1-53中任一项所述的分离的细菌，其中所述细菌具有降低的5-HMF依赖性的NADPH氧化速率。
68.如权利要求I所述的分离的细菌，其中由于ISlO在yqhC基因中的插入，yqhC基因的表达降低。
69.如权利要求1-53中任一项所述的分离的细菌，其中与参照细菌相比，所述细菌在有水解物存在下具有增加的生长。
70.如权利要求1-53中任一项所述的分离的细菌，其中所述水解物源自生物质、半纤维素生物质、木质纤维素生物质或纤维素生物质。
71.如权利要求1-53中任一项所述的分离的细菌，其中所述细菌生产乙醇作为主要发酵产物。
72.如权利要求71所述的分离的细菌，其中在缺氧条件下生产乙醇。
73.如权利要求71所述的分离的细菌，其中在微氧条件下生产乙醇。
74.如权利要求1-53中任一项所述的分离的细菌，其中所述细菌是非重组的。
75.如权利要求1-53中任一项所述的分离的细菌，其中所述细菌是重组的。
76.如权利要求1-53中任一项所述的分离的细菌，其中所述细菌是革兰氏阴性的。
77.如权利要求1-53中任一项所述的分离的细菌，其中所述细菌是革兰氏阳性的。
78.如权利要求76所述的分离的细菌，其中所述革兰氏阴性细菌选自不动杆菌属、葡糖杆菌属、发酵单胞菌属、埃希氏菌属、土杆菌属、希瓦氏菌属、沙门菌属、肠杆菌属和克雷伯菌属。
79.如权利要求77所述的分离的细菌，其中所述革兰氏阳性细菌选自芽孢杆菌属、梭菌属、棒杆菌属、乳杆菌属、乳球菌属、酒球菌属、链球菌属和真杆菌属。
80.如权利要求1-53中任一项所述的分离的细菌，其中所述细菌是大肠杆菌。
81.如权利要求1-53中任一项所述的分离的细菌，其中所述细菌是产酸克雷伯菌。
82.如权利要求80所述的分离的非重组细菌，其中所述细菌是大肠杆菌株EMFR9。
83.从生物质、半纤维素生物质、木质纤维素生物质、纤维素生物质或寡糖源生产乙醇的方法，所述方法包括，使生物质、半纤维素生物质、木质纤维素生物质、纤维素生物质或寡糖接触如权利要求1-53中任一项所述的分离的细菌，从而从生物质、半纤维素生物质、木质纤维素生物质、纤维素生物质或寡糖源生产乙醇。
84.在有糠醛存在下从生物质、半纤维素生物质、木质纤维素生物质、纤维素生物质或寡糖源生产乙醇的方法，所述方法包括，使生物质、半纤维素生物质、木质纤维素生物质、纤维素生物质或寡糖接触如权利要求1-53中任一项所述的分离的细菌，从而从生物质、半纤维素生物质、木质纤维素生物质、纤维素生物质或寡糖源生产乙醇。
85.—种试剂盒，其包含如权利要求1-53中任一项所述的分离的细菌。
86.由指定为保藏号NRRLB-50239的农业研究培养物保藏中心的保藏物代表的大肠杆菌株LY180。
87.通过如权利要求83或84所述的方法生产的乙醇。
88.—种包含基因的微阵列，所述基因在没有yqhC基因存在下表现出表达的增加或降低。
89.一种分离的yqhD启动子，其包含图28所示的序列及其片段和其突变体。
90.yqhD启动子在有糠醛、5-HMF、乙醛、丙醛、丁醛、肉桂醛和甲基乙二醛中的至少一种存在下，与参照细菌相比，调节基因表达的应用。
91.一种分离的细菌，其中所述细菌与参照细菌相比，具有增加的对糠醛的抗性，且其中与参照细菌相比，NADPH-依赖性的氧化还原酶的表达和/或活性降低。
92.如权利要求91所述的分离的细菌，其中所述NADPH-依赖性的氧化还原酶的Km小于或等于YqhD的Km和/或DkgA的Km。
93.由指定为保藏号NRRLB-50240的农业研究培养物保藏中心的保藏物代表的大肠杆菌株EMFR9。
94.由指定为保藏号NRRLB-50241的农业研究培养物保藏中心的保藏物代表的大肠杆菌株EMFRl7。
95.由指定为保藏号NRRLB-50242的农业研究培养物保藏中心的保藏物代表的大肠杆菌株EMFR26。
96.由指定为保藏号NRRLB-50243的农业研究培养物保藏中心的保藏物代表的大肠杆菌株HMFR35。
全文摘要
本发明涉及具有增加的对糠醛的抗性的细菌及其制备方法。本发明也涉及使用所述细菌和对应的试剂盒生产乙醇的方法。
文档编号C12P7/06GK102686735SQ201080010459
公开日2012年9月19日 申请日期2010年1月4日 优先权日2009年3月5日
发明者E.N.米勒, K.尚穆加姆, L.O.因格拉姆, L.P.尤马诺, L.R.雅贝, S.W.约克 申请人:佛罗里达大学研究基金会有限公司