对抗、预防和/或测定心力衰竭或心力衰竭的风险的工具和方法

专利名称：对抗、预防和/或测定心力衰竭或心力衰竭的风险的工具和方法
技术领域：
本申请涉及生物学和医学领域。更具体而言，本申请涉及用于诊断和治疗心力衰竭的miRNA。
背景技术：
微RNA(miRNA)是植物和动物的基因组中编码的小RNA。它们存在于编码蛋白的基因的内含子中、编码多个miRNA的多顺反子转录物中和单个miRNA基因中。这些长度为大约21-23个核苷酸的高度同源的RNA通常通过结合特定mRNA的3’ -非翻译区(3’ -UTR) 而调节基因的表达。人们认为每个miRNA调节多个基因，由于据预测在高等真核生物中存在数百种miRNA基因，所以miRNA所赋予的潜在的调节线路是巨大的。数个研究小组已经提供了证据证明miRNA是多种过程的关键调节者，如早期发育、细胞增殖和细胞死亡、调亡和脂肪代谢，以及细胞分化。据推论在高等真核生物中，miRNA在调节基因表达中的作用可能与转录因子同样重要。目前已经验证了超过540种人类的miRNA ；然而，计算机模型提示可能还有数千种。人们相信多达30%的人类基因受到miRNA的调节。编码miRNA的基因是通过RNA聚合酶II从DNA转录而来的，但不翻译成蛋白质。 初级转录物一般具有数千碱基的长度，被称作pri-miRNA。pri_miRNA在细胞核中被加工为较短的70-100个核苷酸的茎-环结构，其被称作pre-miRNA。该过程在动物中是通过RNA 酶III核酸内切酶Drosha进行的。然后，pre-miRNA被转运至细胞质，在那里它们被第二种 RNA酶III核酸内切酶DICER加工为长度为21-23个核苷酸的双链miRNA。随后，miRNA双链体的一条链被掺入到RNA诱导的沉默复合体(RISC)中。作为RISC的一部分，靶基因的基因表达通过抑制翻译和/或通过切割mRNA而被阻抑。成熟的miRNA与一种或多种mRNA 分子部分互补。如果miRNA和mRNA在同一细胞中表达，则它们能够以序列特异性方式杂交， 从而阻止mRNA翻译成蛋白质，因此调节特定蛋白质的水平。miRNA作为可能的临床参与者的关注和信赖水平可由下列事实证明最近已经建立起了多个基于miRNA的生物技术公司。数种miRNA与癌症和心脏疾病相关。表达分析研究揭示相对于正常组织，肿瘤中的miRNA表达是紊乱的。在乳腺癌、肺癌和结肠癌中，微RNA下调；而在Burkitt氏和其它人类B-细胞淋巴瘤中，微RNA上调。因此，人miRNA可能作为生物标志物有很大的用途，尤其是用于将来的癌症诊断，并且正迅速成为疾病干预的受关注的靶标。除了它们与癌症的关联之外，微RNA在控制心脏功能和紊乱的多个方面具有重要作用，包括肌细胞生长、心室壁的完整性、收缩性、基因表达和心律的维持。已经证明miRNA的表达失调对于多种形式的心脏疾病是必要的和足够的。最近描述了 miRNA也存在于血液中。在血清、血浆、血小板、红细胞以及有核血细胞中可以检测到相对高水平的数种miRNA。已经描述了具有镰状细胞贫血或前列腺癌的受试者的血液中的miRNA的异常表达谱。
虽然已经确定遗传因素与易于发生心力衰竭的倾向相关，但是，鉴于该病症的复杂性质，此类遗传因素的鉴定仍然是有疑问的。已经描述了用于诊断急性冠状动脉综合征、包括心力衰竭的方法，尤其是 W0/2002/083913.W02002/089657和W02006/120152。所有这些方法使用例如血液或尿液中的脑钠肽(brain natriuretic peptide, BNP)的水平作为急性冠状动脉综合征的标志物。 然而，该多肽是由心脏的心室响应于心肌细胞的过度伸展而分泌的，因此其是反映心脏状况的生理标志物。需要更精确地反映受试者患心力衰竭的遗传倾向性的遗传标志物。此类标志物也允许更早地进行诊断。因此，预测患心力衰竭的遗传标志物的获得是十分理想的。目前，不存在此类标志物。

发明内容
现在发现在心脏疾病中，血液中的miRNA谱被改变。不希望被任何理论所限， 相信细胞、包括心肌细胞通过外来体将这些miRNA分泌进入血液，在疾病中，分泌模式被改变。因此，本发明人证明，血液中的miRNA谱可用作心力衰竭的新的诊断工具或生物标志物方法。本发明的目标是提供用于治疗、预防或测定心力衰竭(其风险)的工具和方法。因此，在第一个方面，本发明提供了用于治疗或预防受试者中的心力衰竭的方法， 该方法包括下列步骤-降低所述受试者中的至少一种miRNA的表达、数量和/或活性；或-降低所述受试者中的至少一种miRNA与其mRNA靶标之间的相互作用；或-增加所述受试者中的至少一种miRNA的mRNA靶标的表达、数量和/或活性，其中所述至少一种miRNA 选自 miR-423_5p，miR-191*，miR-15b, miR-1228*, miR-181a, miR-18a*, miR-107, miR-299-3p, miR-342-3p, miR-652, miR-675, miR-129-5p, miR18b*, miR-1254, miR-622, HS_202. l，miR_302d 和 solexa-3927-221。在另一个方面，本发明提供了用于治疗或预防受试者中的心力衰竭的方法，该方法包括下列步骤-增加所述受试者中的至少一种miRNA的表达、数量和/或活性；或-增加所述受试者中的至少一种miRNA与其mRNA靶标之间的相互作用；或
-降低所述受试者中的至少一种miRNA的mRNA靶标的表达、数量和/或活性，其中所述至少一种miRNA 选自 miR-191，miR_30e，miR-744, miR-142_3p 和 solexa-2952-306。在上述方面的优选实施方式中，所述的增加所述miRNA的表达、数量和/或活性或相互作用的方法包括向所述受试者施用所述miRNA以作为功能性miRNA，作为前体微 RNA(pre-miRNA)，或作为微 RNA 初级转录物(pri_miRNA)。在另一个方面，本发明提供了选自miR-191, miR_30e，miR-744, miR-142_3p 和 solexa-2952-306,或其前体微RNA (pre_miRNA)或微RNA初级转录物，其用作药物，优选用于治疗或预防心力衰竭。
在另一个方面，本发明提供了能够与至少一种选自miR-423-5p，miR-191*, miR-15b, miR-1228*, miR-181a, miR-18a*, miR-107, miR-299-3p, miR-342-3p, miR-652, miR-675, miR-129_5p，miR-18b*, miR-1254, miR-622, HS_202. 1，miR-302d 和 solexa-3927-221的miRNA及其前体微RNA (pre_miRNA)或微RNA初级转录物特异性结合、 从而抑制其活性和/或功能的化合物、优选核酸，其用作药物，优选用于治疗或预防心力衰竭。本文中的术语“功能”特别是指所述miRNA抑制靶mRNA的翻译的能力。因此，核酸优选能够以序列特异性方式抑制miRNA与其mRNA靶标之间的杂交。在本文定义的核酸的上下文中，术语“特异性结合”特别是指，核酸能够在严格条件下与所述miRNA杂交。在优选的实施方式中，所述核酸具有与如图3中提供的miRNA的序列互补的序列。在另一个方面，本发明提供了用作药物、优选用于治疗或预防心力衰竭的载体， 其包含编码能够与至少一种选自 miR-423-5p，miR-19r, miR-15b, miR-1228*, miR-181a, miR-18a*, miR-107, miR-299-3p, miR-342-3p, miR-652, miR-675, miR-129-5p, miR-18b*, miR-1254, miR-622, HS_202. 1，miR-302d 和 solexa-3927-221 的 miRNA 及其前体微 RNA(pre-miRNA)或微RNA初级转录物miRNA特异性结合、从而抑制其活性和/或功能的核酸的核酸序列；或者编码选自 miR-191，miR-30e，miR-744，miR-142-3p 和 solexa4952-306 的miRNA及其前体微RNA (pre-miRNA)和微RNA初级转录物的核酸序列，并能够表达所述核酸或(pre 或 pri)miRNA。在另一方面，本发明提供了包含如上所述的根据本发明的载体的细胞，其用作药物、优选用于治疗或预防心力衰竭。在另一方面，本发明提供了用于治疗或预防受试者中的心力衰竭的药物组合物， 其包含-如上所述的根据本发明的基因或其表达产物，如上所述的根据本发明的 (pre-或pri_) miRNA，如上所述的根据本发明的载体，或如上所述的根据本发明的细胞；以及-药学上可接收的载体、稀释剂或赋形剂。在另一方面，本发明提供了用于诊断受试者为患有心力衰竭或具有患心力衰竭的风险的方法，该方法包括a)测定获自所述受试者的样品中的遗传标志物的水平，其中所述遗传标志物是选自 miR-19r，miR-15b, miR-1228*, miR_181a，miR-18a*, miR-107, miR-299_3p，miR-342_3p， miR-652, miR-675, miR-191, miR-302d, miR-30e, miR-744, miR-142-3p, solexa-2952-306 和solexa-3927-221的miRNA及其前体微RNA (pre-miRNA)或微RNA初级转录物；b)基于步骤a)中测定的遗传标志物的水平诊断该受试者是否患有心力衰竭或具有患心力衰竭的风险。在另一个实施方式中，本发明提供了用于诊断受试者为患有心力衰竭或具有患心力衰竭的风险的方法，该方法包括a)测定获自所述受试者的样品中的至少一种遗传标志物的水平，其中所述至少一种遗传标志物是选自 miR-423-5p，miR-191*，miR-15b, miR-1228*, miR-181a, miR_18a*， miK-107, miR-299-3p, miR-342_3p，miR-652, miR-675, miR-129_5p，miR-18b*, miR-1254, miR-622, HS_202. 1, miR-191, miR-302d, miR_30e，miR-744, miR-142_3p，solexa-2952-306和solexa-3927-221的miRNA及其前体微RNA (pre_miRNA)或微RNA初级转录物；和b)基于步骤a)中测定的所述至少一种遗传标志物的水平诊断该受试者是否患有心力衰竭或具有患心力衰竭的风险。在优选的实施方式中，所述至少一种遗传标志物包括至少两种miRNA，更优选至少三种miRNA，其选自于选自miR-423_5p，miR-191*, miR-15b, miR-1228*, miR-181a, miR-18a*, miR-107, miR-299-3p, miR-342-3p, miR-652, miR-675, miR-129_5p， miR-18b*, miR-1254, miR-622, HS_202.1， miR-191, miR_302d， miR-30e, miR-744, miR-142_3p， solexa-2952-306 和 solexa-3927-221 的 miRNA 及其前体微RNA(pre-miRNA)或微RNA初级转录物。在另一个优选的实施方式中，至少两种 miRNA 选自 miR-423-5p 和 miR_19r，miR-423_5p 和 miR_15b，miR-423_5p 和 miR_12^*， miR-423-5p 和 miR_181a，miR-423_5p 和 miR_18a*，miR-423_5p 和 miR-107，miR-423_5p 和 miR-299-3p，miR-423-5p 和 miR-342-3p，miR-423-5p 和 miR-652，miR-423-5p 和 miR-675， miR-423-5p 和 miR-129-5p，miR-423_5p 和 miR-18b*，miR-423_5p 和 miR-1254，miR-423_5p 和 miR-622，miR-423_5p 和 HS 202. 1，miR-423_5p 和 miR-191，miR-423_5p 和 miR_302d， miR-423-5p 和 miR_30e，miR-423_5p 和 miR-744，miR-423_5p 和 miR-142_3p， miR-423-5p 禾口 solexa-2952—306，或 miR-423_5p 禾口 solexa—3927—221。在另一方面，本发明提供了用于诊断受试者为患有心力衰竭或具有患心力衰竭的风险的方法，该方法包括a)测定获自所述受试者的样品中的遗传标志物的水平，其中所述遗传标志物是选自 miR-423-5p，miR-19r, miR-15b, miR-1228*, miR-181a, miR-18a*, miR-107, miR-299_3p， miR-342-3p, miR-652, miR-675, miR-129_5p， miR-18b*, miR-1254, miR-622, HS_202.1， miR-191，miR-302d，miR-30e，miR-744，miR-142-3p，solexa-2952-306 禾口 solexa—3927—221 的miRNA及其前体微RNA (pre-miRNA)或微RNA初级转录物；b)基于步骤a)中测定的遗传标志物的水平诊断该受试者是否患有心力衰竭或具有患心力衰竭的风险。在所述方法的优选实施方式中，当下列情况时，所述步骤b)认为所述受试者患有心力衰竭或具有患心力衰竭的风险-相对于不患有或不具有患心力衰竭的风险的对照受试者，miR-423-5p， miR-191*, miR-15b, miR-1228*, miR_181a，miR-18a*, miR-107, miR-299_3p，miR-342_3p， miR-652, miR-675, miR-129_5p，miR-18b*, miR-1254, miR-622, HS_202. 1，miR_302d 和 / 或 solexa-3927-221或其前体微RNA (pre-miRNA)或微RNA初级转录物的表达、数量和/或活性上调；和/或-相对于不患有或不具有患心力衰竭的风险的对照受试者，miR-191,miR-30e, miR-744, miR-142-3p 和 / 或 solexaj952_306 或其前体微 RNA (pre-miRNA)或微 RNA 初级转录物的表达、数量和/或活性下调。本发明还提供了用于治疗或预防受试者中的心力衰竭的方法，该方法包括基于根据本发明的至少一种遗传标志物的水平诊断该受试者是否患有心力衰竭或具有患心力衰竭的风险；和，当该受试者患有心力衰竭或具有患心力衰竭的风险时，治疗该受试者。在另一方面，本发明提供了诊断受试者为患有心力衰竭或具有患心力衰竭的风险的试剂盒(kit of parts)，其包含
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-能够特异性结合选自miR-423-5p，miR-191*，miR-15b, miR-1228*, miR-181a, miR-18a*, miR-107, miR-299-3p, miR-342-3p, miR-652, miR-675, miR-129-5p, miR-18b*, miR-1254, miR-622, HS_202.1， miR-191, miR-302d, miR-30e, miR-744, miR-142-3p, solexa1952-306 和 solexa-3927-221 的至少一种 miRNA 及其前体微 RNA (pre-miRNA)或微 RNA初级转录物的至少一种化合物；和-使用所述化合物根据本发明的方法诊断受试者为患有心力衰竭或具有患心力衰竭的风险的说明书。在另一个方面，本发明提供了用于确定候选化合物是否能够治疗或预防人类受试者中的心力衰竭的方法，该方法包括-将所述候选化合物与人组织细胞、优选心脏组织细胞接触，和-确定所述候选化合物是否能够调节所述组织细胞中的miR-423_5p，miR-191*, miR-15b, miR-1228*, miR-181a, miR-18a*, miR-107, miR-299-3p, miR-342-3p, miR-652, miR-191, miR-302d, miR-30e, miR-744, miR-675, miR-129-5p, miR-18b*, miR-1254, miR-622, HS_202. 1，miR-142_3p，solexa-2952-306 和 solexa-3927-221 中的任一项的表达、数量和/或活性。优选地，所述化合物以不再与心力衰竭(其风险)相关的方向影响所有miRNA的表达。在用于确定候选化合物是否能够治疗或预防人类受试者中的心力衰竭的优选方法中，该方法包括-将所述候选化合物与组织细胞、优选人组织细胞、更优选心脏组织细胞接触，和-确定所述候选化合物是否能够降低所述组织细胞中的miR-423-5p，miR-191*, miR-15b, miR-1228*, miR-181a, miR-18a*, miR-107, miR-299-3p, miR-342-3p, miR-652, miR-675,miR-129-5p,miR-18b*,miR-1254,miR-622,HS_202. l，miR_302d solexa-3927-221 的表达、数量和/或活性，和/或是否能够增加所述组织细胞中的miR-191，miR-30e, miR-744, miR-142_3p 或 solexa-2952-306 的表达、数量和 / 或活性。在所有的方面和实施方式中，本发明的一部分是下列miRNA :miR-654_3p， miR-346, miR-1301, miR-24-2和HS_239，发现与健康对照的血浆相比，它们在HF患者的血浆中差别化表达。本发明的涉及筛选候选治疗化合物的方面也可以在模型系统中进行，例如在动物模型中进行，其显示出如本文指明的与心力衰竭(增加的风险)相关的特定miRNA表达模式。因此，本发明的另一个方面是显示出如本文指明的与心力衰竭(增加的风险)相关的 miRNA表达模式的(动物、包括人)模型系统。此类模型系统可用于筛选候选治疗剂的方法中，所述方法包括步骤将所述模型系统(的细胞)暴露于、或向所述模型系统施用候选化合物，和测定所述候选化合物是否能够诱导所述miRNA表达谱的变化，其不再与心力衰竭 (其增加的风险)相关，尤其是能够增加所述模型系统(其细胞)中的miR-191，miR-30e, miR-744, miR-142-3p或solexa-2952-306的表达、数量和/或活性，和/或降低所述模型系统(其细胞)中的 miR-423_5p，HiiR-I9I*, miR-15b, miR-1228*, miR-181a, miR-18a*, miR-107, miR-299-3p, miR-342_3p，miR-652, miR-675, miR-129_5p，miR-18b*, miR-1254, miR-622, HS_202. 1，miR-302d 或 solexa-3927-221 的表达、数量和 / 或活性。


图1显示了心力衰竭(HF)患者的血浆中富含的miRNA。血浆样品1)健康人员1 ； 2)健康人员2 ；4) HF患者1 ；5) HF患者2 ；6) HF患者3。图2显示了在心力衰竭患者的血浆中下调的miRNA。血浆样品1)健康人员1 ；2) 健康人员2 ；4) HF患者1 ；5) HF患者2 ；6) HF患者3。图3显示了本文讨论的miRNA的序列(5 ‘ -3')图4显示了在DNA芯片阵列上测定的如本文讨论的miRNA的表达，其中显示了每个miRNAWM个测定值。前12个是来自患者样品的测定值，后12个(13-M号)是对照。 FC =倍数变化；ρ = ρ值；Ρ δ正是就多个测试校正的ρ值。通过QPCR确认了结果。图5显示了 HF患者和对照受试者的血浆中的16种候选miRNA的表达谱。每个图板中的左侧2个条柱显示的是通过miRNA阵列测定的12个健康对照和12个HF患者中的 miRNA水平。右侧两个条柱显示了通过实时PCR在单独的受试者(30个HF病例和39个健康对照)中验证的相同的miRNA的水平。数据表示为平均值士SEM。*表示相对于健康对照 P < 0. 05。图6显示了 miRNA的诊断精确性。A、D和G显示了健康对照、非HF病例和HF病例中的miRNA水平。数据表示为平均值士SEM。*表示相对于健康对照P < 0. 05 ；$表示相对于非HF病例P < 0. 05。B、E和H显示了关于曲分HF与非HF病例的诊断能力的ROC曲线和AUC。C、F和I显示了 proBNP与miRNA之间的Spearman关联，对于miR-423_5p是显著性的(P = 0.002)，对于miR-18b*是边缘显著性的(P = 0.049)。单一离群值的舍弃对于miR423-5p的相关性没有影响，但是降低了 miR_18b*的相关性。图7显示了相对于死于非心脏原因的受试者(对照)，死于扩张型心肌病(DCM)的受试者的尸检心肌组织中的miRNA表达。就U6的表达校正miR-423_5p的实时PCR。*表示相对于对照ρ < 0. 05。图8显示了具有动脉粥样硬化形式的心力衰竭和非动脉粥样硬化形式的心力衰竭的受试者中的循环miRNA的水平。为了根据心力衰竭的潜在诱因比较循环miRNA的水平， 我们区分了 HF的动脉粥样硬化形式和HF的非动脉粥样硬化形式。在此重要的是指出在该研究中，我们排除了显示出心肌缺血的实际症候的患者，所以活性缺血被排除在HF的诱因之外。在30位患者中，有12位具有慢性广泛的冠状动脉粥样硬化性疾病史，其导致HF。 相对于具有非动脉粥样硬化性HF的患者(η = 18)，这些具有动脉粥样硬化疾病的受试者显示出显著较高的miR-423-5p和miR-675的循环水平，但miR_18b*则不是这样。* 相对于非动脉粥样硬化形式P <0. 05。
具体实施例方式术语〃心力衰竭(heart failure)“或〃心力衰竭(cardiac failure)“是指这样的病理生理学状态其中，由于心脏功能的异常(可检测到的或不可检测到的)，不能以代谢中的组织的需求相当的速率泵血，和/或仅以异常升高的舒张充盈压泵血。心力衰竭可以由心肌衰竭引起，但也可以在高需求条件下在存在接近正常心脏功能的情况下发生。 心力衰竭总是引起循环衰竭，但反之则不总是如此，因为在正常、中等程度破坏、甚至是超常心脏功能的情况下，多种非心脏状况(例如低血容量性休克、脓毒性休克)也会产生循环衰竭。因此，术语"心力衰竭"包括收缩和舒张心力衰竭，急性心力衰竭和慢性心力衰竭， 与心力衰竭的起因无关，并且与是否存在与心力衰竭和/或心力衰竭的起因相关的遗传成分无关。如本文使用的"核酸"包括单链或双链形式的脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸聚合物，除非另有指明，否则包括具有天然核苷酸的必要结构的类似物(例如肽核酸)它们以类似于天然存在的核苷酸的方式与单链核酸杂交。术语"分离的"，例如在"分离的细胞"中，是指这样的物质，例如细胞，其实质上或基本上不含在天然存在的环境中通常伴随它的成分或与其相互作用的成分。分离的细胞可以是通过培养细胞(分离自其通常驻留于的组织，并且不再整合于其所源自的生物体的组织内)而获得的细胞培养物。“核苷酸"是通过以下的IUPAC命名法通过它们的通常接受的单字符来指称的 A(腺嘌呤)、C(胞嘧啶)、T(胸腺嘧啶)、G(鸟嘌呤)、U(尿嘧啶)、W(A或T)、R(A或G)、 K (G 或 T)、Y (C 或 T)、S (C 或 G)、M(A 或 C)、B (C、G 或 T)、H(A、C 或 T)、D (A、G 或 T)、V (A、C 或 G)、N(A、C、G 或 T)。“编码(coding)“或"编码(encoding)“序列是编码蛋白的氨基酸序列或功能性RNA例如tRNA或rRNA的基因的一部分。如本文使用的术语“基因”是指DNA序列，包括但不限于这样的DNA序列可以转录为mRNA的，mRNA可以翻译为多肽链；可以转录为rRNA或tRNA的，或作为酶及其它参与 DNA复制、转录和调节的蛋白的识别位点。该术语是指任意DNA序列，包括数个可操作连接的DNA片段、例如启动子区域、5'非翻译区(5‘ UTR)、编码区(其可以编码或可以不编码蛋白)和包括多腺苷化位点的3'非翻译区(3' UTR)。通常而言，5' UTR、编码区和3' UTR 转录为RNA，在编码蛋白的基因的情况下，编码区翻译为蛋白。基因通常包括内含子和外显子。基因可以包括另外的DNA片段，例如内含子。“样品”以其最广泛的含义使用，包括核酸。样品可以包括体液，例如血液或尿液； 细胞制备物的可溶性级分，或细胞生长培养基的等份试样；染色体，细胞器，或分离或提取自细胞的膜；溶液中的或结合至基底的基因组DNA、RNA或cDNA ；细胞；组织印迹；指纹，口颊细胞，皮肤或毛发；等等。用于检测根据本发明的miRNA的优选样品是选自血液和尿液的体液。最优选的样品是血液样品。血液样品可以包括全血样品，或通过离心和/或过滤获得的样品，例如，血浆、血清、血小板、红细胞、白细胞，如技术人员已知。血液样品可以通过静脉穿刺、动脉穿刺和/或毛细血管穿刺获得，例如手指穿刺。可以将样品、优选血液样品收集于含有抗凝剂的管中，例如肝素管或EDTA-管，如技术人员已知。本发明涉及如本文指明的miRNA的诊断性、预后性和治疗性应用，所述miRNA 是 hsa-miR-423_5p, hsa-miR-191*, hsa_miR-15b, hsa-miR-1228*, hsa-miR-18la, hsa-miR-18a*, hsa-miR-107, hsa-miR-299_3p, hsa-miR-342_3p, hsa-miR-652, hsa-miR-675, hsa-miR-129_5p, hsa_miR-18b*, hsa-miR-1254, hsa-miR-622, HS_202. 1， hsa-miR-191, hsa-miR-302d, hsa-miR-30e, hsa-miR-744, hsa-miR-142-3p, solexa-2952-306, solexa-3927-221。这些miRNA的核苷酸序列提供于图3中。MiRNA通过与编码蛋白基因产物的基因编码的mRNA退火而阻抑特定基因产物的
10表达。因此，miRNA具有翻译性地阻抑靶mRNA的能力，从而功能性调节靶mRNA。因此，通过影响所述细胞中的选自 hsa-miR-423-5p，hsa_miR-19r，hsa_miR-15b， hsa-miR-1228*, hsa-miR-18la, hsa_miR-18a*, hsa-miR-107, hsa-miR-299_3p, hsa-miR-342_3p, hsa-miR-652, hsa-miR-675, hsa-miR-129_5p, hsa_miR-18b*, hsa-miR-1254, hsa-miR-622, HS_202. 1， hsa-miR-191, hsa-miR-302d, hsa-miR-30e, hsa-miR-744, hsa-miR-142_3p， solexa-2952—306， solexa—3927—221 的至少一种 miRNA或其功能部分或衍生物的表达、数量和/或活性，和/或通过影响靶mRNA与所述细胞中的选自 hsa-miR-423-5p， hsa-miR-191*， hsa_miR-15b， hsa-miR-1228*, hsa-miR-18la, hsa_miR-18a*, hsa-miR-107, hsa-miR-299_3p, hsa-miR-342_3p, hsa-miR-652, hsa-miR-675, hsa-miR-129_5p, hsa_miR-18b*, hsa-miR-1254, hsa-miR-622, HS_202.1， hsa-miR-191, hsa-miR-302d, hsa-miR-30e, hsa-miR-744, hsa-miR-142-3p, solexa-2952-306, solexa-3927-221 的至少一种 miRNA 或其功能部分或衍生物之间的相互作用来影响细胞中的这些mRNA编码的基因产物的表达。因此，还提供了选自 hsa-miR-423-5p，hsa-miR-191*，hsa_miR-15b，hsa-miR-1228*, hsa-miR-18la, hsa_miR-18a*, hsa-miR-107, hsa-miR-299_3p, hsa-miR-342_3p, hsa-miR-652, hsa-miR-675, hsa-miR-129_5p, hsa_miR-18b*, hsa-miR-1254, hsa-miR-622, HS_202. 1， hsa-miR-191, hsa-miR-302d, hsa-miR-30e, hsa-miR-744, hsa-miR-142-3p, solexa-2952-306, solexa-3927-221的至少一种miRNA或其功能部分或衍生物的用途， 或能够影响细胞中的选自 hsa-miR-423-5p，hsa-miR-191*, hsa_miR-15b，hsa-miR-1228*, hsa-miR-18la, hsa_miR-18a*, hsa-miR-107, hsa-miR-299_3p, hsa-miR-342_3p, hsa-miR-652, hsa-miR-675, hsa-miR-129_5p, hsa_miR-18b*, hsa-miR-1254, hsa-miR-622, HS_202. 1， hsa-miR-191, hsa-miR-302d, hsa-miR-30e, hsa-miR-744, hsa-miR-142-3p, solexa-2952-306, solexa-3927-221的至少一种miRNA的表达、数量和/或活性的化合物的用途，或能够影响靶 mRNA 与选自 hsa-miR-423-5p，hsa-miR-191*, hsa_miR-15b， hsa-miR-1228*, hsa-miR-18la, hsa_miR-18a*, hsa-miR-107, hsa-miR-299_3p, hsa-miR-342_3p, hsa-miR-652, hsa-miR-675, hsa-miR-129_5p, hsa_miR-18b*, hsa-miR-1254, hsa-miR-622, HS_202. 1， hsa-miR-191, hsa-miR-302d, hsa-miR-30e, hsa-miR-744, hsa-miR-142_3p，solexa-2952-306, solexa-3927-221 的至少一种 miRNA 之间的相互作用的化合物的用途，用于影响所述细胞中的由miRNA的靶mRNA编码的特定基因产物的表达。在一个实施方式中，在体外、例如在细胞培养物中影响特定基因产物的表达。miRNA沿用标准的命名法系统，如技术人员已知。无大写字母的〃 mir-〃是指 pre-miRNA，而有大写字母的"miR-"是指成熟的形式。具有几乎相同的序列的miRNA以另外的小写字母表示。例如，miR-123a与miR-12;3b密切相关。100%相同但是在基因组中的不同位置被编码的miRNA以另外的破折号-数字后缀表示miR-123-l和miR-123_2是相同的，但是产生于不同的pre-miRNA。来源的物种以三字符前缀表示，例如hsa-miR-123来自人(智人)，oar-miR-123来自绵羊(Ovis aries)HiiRNA0当已知相对表达水平时，名称后面的星号表示在相对于发夹的相对臂的miRNA较低的水平表达的miRNA。例如miR-123 和miR-123*具有相同的pre-miRNA发夹，但是细胞中存在相对较多的miR-123。后缀5p和 3p分别表示miRNA来源于pre-miRNA的5’臂和3’臂。当两种miRNA以相同水平表达时，CN 102421917 A
说明书
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使用这些后缀。例如miR423-5p和miR423_3p具有相同的pre_miRNA发夹。根据本发明，如本文提及的miRNA能够阻抑特定基因产物的表达。如本文使用的术语"miRNA"包括所述miRNA的任何同种型，并且所述miRNA家族的所有成员都能够阻抑特定基因产物的表达。因此，术语“miRNA”包括前体，例如pri-miRNA和pre-miRNA， 星-序列，例如miR-123和miR-123*，家族成员例如miR-17和miR-18 ；以及簇成员，例如 miR-92a, miR-92a_2* 和 miR-363。因此，术语 miR-423-5p 包括同种型 pre_mir423 和 miR423_3p ；术语 miR-U9_5p 包括同种型 pre-mirU9-l，pre-mirl29-2, miR-129* 和 miR-U9_3p ；术语 miR_18b* 包括同禾中型 pre_mirl8b, miR-18b, pre_mirl7, miR-17, miR-17*, pre_mirl8a, miR-18a, miR-18a*, pre_mir20a, miR_20a, pre_mir20b, miR_20b, miR_20b*, pre_mir93, miR-93, miR-93*, pre_mirl06a, miR-106a, miR-106a*, pre_miR106b, miR-106b, miR-106b*, pre-mirl9b_2, miR-19b, miR-19b_2*， pre-mir92a_2， miR-92a, miR-92a_2*， pre_mir363， miR-363 禾口 miR-363* ；术语 miR_12M 包括同种型 pre_mirl2M ；术语 miR-622 包括同种型 pre_mir622 ； 术语 HS_202. 1 包括同种型 pre-mir221，miR-221 和 miR-221*。因此，如本文使用的术语〃 miRNA"包括任何miRNA成员。虽然hsa-miR-423_5p， hsa-miR-191*, has_miR-15b, hsa-miR-1228*, hsa_miR-181a, hsa_miR-18a*, hsa-miR-107, hsa-miR-299_3p, hsa-miR-342_3p, hsa-miR-652, hsa-miR-675, hsa-miR-129_5p, hsa-miR-18b*, hsa-miR-1254, hsa-miR-622, HS_202. 1， hsa-miR-191, has-miR-302d, hsa-miR-30e, hsa-miR-744, hsa-miR-142_3p， solexa-2952—306 禾口 solexa—3927—221 是本领域已知的，但它们与心力衰竭的关联和它们对于心力衰竭的效应在本发明之前是未知的。本发明现提供了以下视点上述miRNA与心力衰竭相关联，可以诊断、预防和治疗心力衰竭。本文描述的miRNA与心力衰竭衰竭之间的关联是通过特定基因产物， 其表达被miRNA阻止或调节。阻抑这些特定基因产物中的一些的表达将引起这些特定基因产物的量的降低，这继而又会减少心力衰竭的发作、进展和/或效应。对于那些表达受到在心力衰竭中上调的miRNA调控的基因产物，尤其是这样。此外，刺激这些特定基因产物中的某一些的表达，例如，通过阻止miRNA的表达，将引起这些特定基因产物中的其它项的较高的量，这也可以减少心力衰竭的发作、进展和/或效应。对于那些表达受到在心力衰竭中下调的miRNA调控的基因产物，尤其是这样。因此，这些特定基因产物是心力衰竭的重要介导子，但其机理仍然未知。根据本发明，选自hsa-miR-423-5p， hsa-miR-191*, hsa_miR-15b, hsa-miR-1228*, hsa_miR-181a, hsa_miR-18a*, hsa-miR-107, hsa-miR-299_3p, hsa-miR-342_3p, hsa-miR-652, hsa-miR-675, hsa-miR-129_5p, hsa-miR-18b*, hsa-miR-1254, hsa-miR-622, HS_202. 1， hsa-miR-191, hsa-miR-302d, hsa-miR-30e, hsa-miR-744, hsa-miR-142-3p, solexa-2952-306, solexa-3927-221 禾中 miRNA能够通过阻抑特定基因产物的表达而对抗心力衰竭。因此，一个实施方式提供了用于对抗、治疗、减少、延缓和/或预防受试者中的心力衰竭的方法，该方法包括-增加所述受试者中的选自hsa-miR-191，hsa_miR-30e，hsa-miR-744, hsa-miR-142-3p, solexa-2952-306的miRNA或其功能部分或衍生物的表达、数量和/或活
12性；和/或-增加所述受试者中的特定靶mRNA与选自hsa-miR-191，hsa_miR-30e， hsa-miR-744, hsa-miR-142_3p，solexa-2952-306 的 miRNA 或其功能部分或衍生物之间的相互作用。如上文所述，所述miRNA包括所述miRNA家族的任意成员，和/或-降低所述受试者中的选自hsa-miR-423-5p，hsa-miR-191*，hsa_miR-15b， hsa-miR-1228*, hsa-miR-18la, hsa_miR-18a*, hsa-miR-107, hsa-miR-299_3p, hsa-miR-342_3p, hsa-miR-652, has-mir-675, hsa-miR-129_5p, hsa_miR-18b*, hsa-miR-1254, hsa-miR-622, HS_202. 1，miR-302d 和 / 或 solexa-3927-221 的 miRNA 或其功能部分或衍生物的表达、数量和/或活性；和/或-减少所述受试者中的特定靶mRNA与选自hsa-miR-423_5p，hsa-miR-191*, hsa-miR-15b, hsa-miR-1228*, hsa-miR-18la, hsa_miR-18a*, hsa-miR-107 , hsa-miR-299_3p, hsa-miR-342_3p, hsa-miR-652, hsa-miR-675, hsa-miR-129_5p, hsa-miR-18b*，hsa-miR-1254，hsa-miR-622，HS_202. 1 和 / 或 solexa-3927-221 的 miRNA 或其功能部分或衍生物之间的相互作用。如上文所述，所述miRNA包括所述miRNA家族的任意成员O在一个实施方式中，所述受试者被诊断为具有心力衰竭。而在另一个实施方式中， 所述受试者具有增大的心力衰竭的风险，例如，由于所述受试者已经具有损伤或疾病。在备选实施方式中，执行根据本发明的方法以在未受影响的受试者中一般性地预防心力衰竭。用于诊断心力衰竭的方法是本领域已知的。例如，通过测定僵硬是否增加，正常的功能例如心脏的电性质是否降低，ECM蛋白是否过量积累，和/或特定基因产物的水平是否高于一定的阈值水平来诊断受试者具有心力衰竭。当受试者具有损伤或病症时，心力衰竭的增大的风险通常存在于该受试者中。本发明的方法适合于心力衰竭的诊断和治疗性应用。在一个优选的实施方式中， 根据本发明的方法用于对抗、治疗、减少、延缓和/或预防心力衰竭。因此，还提供了用于治疗和/或预防受试者中的心力衰竭的方法，该方法包括-在有此治疗和/或预防需要的受试者中增加如本文中鉴定的在心力衰竭中下调的miRNA的表达、数量和/或活性；和/或降低如本文鉴定的心力衰竭中上调的miRNA的表达、数量和/或活性。这可以通过例如下列方式进行对于下调的miRNA，增加这些miRNA与靶mRNA之间的相互作用；和/或，对于上调的miRNA，减少这些miRNA与靶mRNA之间的相
互作用。在一个实施方式中，所述受试者被诊断为具有心力衰竭，或具有心力衰竭的风险。 在备选的实施方式中，执行所述方法以在未受影响的受试者中一般性地预防心力衰竭。可以直接增加如本文指明的在心力衰竭中下调的miRNA的表达、数量和/或活性， 例如通过施用能够增大所述miRNA的表达和/或活性的激活性化合物来进行。也可以间接增加miRNA的表达、数量和/或活性，例如通过降低miRNA抑制剂的表达、数量和/或活性来进行。对于降低那些如本文指明的在心力衰竭中上调的miRNA的表达、数量和/或活性而言，适用相反的情况。在优选的实施方式中，通过向所述受试者施用pri-miRNA和/或pre-miRNA和/ 或miRNA或其功能部分或衍生物来增加miRNA的量。这些化合物中的任意项或这些化合物的任意组合的施用引起靶mRNAW (增加的)抑制，因此会对抗和/或预防心力衰竭。 pri-miRNA是miRNA的初级转录物，长度为数千碱基，其是通过RNA聚合酶II进行的基因组 miRNA序列的转录获得的。Pre-miRNA较短，为70-100个核苷酸的茎-环结构，其是在通过核糖核酸酶Drosha进行的pri-miRNA的加工之后获得的。本文中所指的miRNA的序列记载于图3中。pri-miRNA或pre_miRNA或miRNA的功能部分在本文中定义为具有至少7个核苷酸的长度(分别短于pri-miRNA或pre-miRNA或(成熟的)miRNA)并且能够结合靶mRNA 基因(编码miRNA所结合的mRNA的基因)和/或靶mRNA并阻抑从所述编码mRNA或基因的蛋白表达的核酸序列。所述功能部分优选能够结合至靶mRNA上的能被miRNA结合的相同的3’UTR区。所述功能部分优选包括miRNA的种子区(seed region)的序列。miRNA的种子区存在于天然存在的miRNA的5’区域。所述种子区特别参与靶标识别。本领域技术人员通过进行miRNA与mRNA之间的结合实验可以发现miRNA的种子区的序列，无需花费艰难或创造性劳动。因此，pri-miRNA或pre-miRNA或miRNA的功能部分优选为具有至少7个核苷酸的长度的核酸序列，其包含种子区序列。然而，所述种子区的微小修饰是允许的，只要维持其结合靶mRNA基因或靶mRNA的能力。因此，pri-miRNA或pre-miRNA或miRNA的功能部分也包括具有至少7个核苷酸的长度的核酸序列，包括与本文指明的miRNA的种子区的序列具有至少72%，更优选至少80%，更优选至少86%，最优选更优选至少90%序列同一性的序列。pri-miRNA或pre-miRNA或miRNA的功能衍生物在本文中定义为这样的分子，其包含与pri-miRNA或pre-miRNA或miRNA具有70 %或以上，但小于100%的序列同一性的序列，并且，不考虑定量，与它们具有至少一个相同性质。所述功能等同物能够结合靶 mRNA基因和/或靶mRNA，并阻抑所述基因编码的蛋白的表达，虽然不一定与pri-miRNA或 pre-miRNA或miRNA的程度相同。此类功能等同物包括例如-这样的多核苷酸其中向pri-miRNA或pre-miRNA或miRNA的原始序列添加了一个或多个核苷酸；-这样的pri-miRNA或pre-miRNA或miRNA分子其中1% -40%的核苷酸被一个或多个其它核苷酸置换，条件是种子区序列与图3所示的miRNA序列保持至少72%的序列同一性；和/或-这样的pri-miRNA或pre-miRNA或miRNA衍生物其中至少一个核苷酸被修饰， 从而得到的产物具有非天然存在的核苷酸。优选地，pri-miRNA或pre-miRNA或miRNA的功能等同物包含与pri-miRNA或pre-miRNA或miRNA具有至少大约75%序列同一性，优选至少大约80 %，更优选至少大约85 %，更优选至少大约90 %，最优选至少大约95 %的序列同一性的核苷酸序列。序列同一性越高，所述功能等同物类似于pri-miRNA或pre-miRNA或 miRNA分子的程度越紧密。pri-miRNA或pre-miRNA或miRNA的功能等同物的优选实例是至少包含miRNA的种子区的载体，或包含与种子区序列具有至少72 %，优选至少80 %，更优选至少86 %，最优选至少90%的序列同一性的序列的载体。术语"％序列同一性"在本文中定义为在比对序列并任选导入空隙(视需要) 以达到最大百分率的序列同一性之后，与目标核酸序列中的核苷酸相同的核酸序列中的核苷酸的百分率。用于比对的方法和计算机程序是本领域熟知的。如本文使用的术语“核酸序列”和“核苷酸”也包括基于和/或衍生于核酸序列的非天然分子，例如人工修饰的核酸序列、肽序列，以及包含至少一个修饰的核苷酸和/或非天然核苷酸、例如肌苷的核酸序列。用于向细胞中导入多核苷酸的方法是本领域已知的。用于导入核酸的方法包括， 例如，磷酸钙转染、DEAE-Dextran、电穿孔或脂质体介导的转染。备选地，使用直接注射多核苷酸。然而优选的是，通过载体将核酸序列导入细胞，优选病毒载体。所述载体优选包括逆转录病毒、腺病毒、腺相关病毒(AAV)或慢病毒载体。在一个实施方式中，使用AAV9载体。本领域已知有多个术语用于指称通过载体将核酸导入细胞中。此类术语的实例有"转导"、“转染"和"转化"。用于产生含有核酸序列的载体和将所述载体导入细胞的技术是本领域已知的。优选地，使用pri-miRNA或pre-miRNA或miRNA或其功能部分或衍生物，其能够被导入体内的哺乳动物细胞。根据本发明的方法的非限制性实例是将所述核酸序列偶联于细胞透过性肽、微载体或纳米载体，或使用包含所述核酸序列的脂质体。优选地，所述抑制剂靶向心肌细胞，例如通过使用结合至所述抑制剂的人工HDL-样颗粒，增强向心肌的递送。根据本发明，通过向患有心力衰竭或具有患心力衰竭风险的受试者施用在所述受试者中下调或表达不足的pri-miRNA或pre-miRNA或miRNA或其功能部分或衍生物，特别好地对抗和/或预防心力衰竭。通过施用能够增加或恢复在所述受试者中下调或表达不足的miRNA的表达、数量和/或活性，或者通过施用能够增加靶mRNA与在所述受试者中下调或表达不足的miRNA之间的相互作用的化合物，来对抗和/或预防心力衰竭。因此，本发明还提供了在所述受试者中下调或表达不足的pri-miRNA和/或pre-miRNA和/或miRNA或其功能部分或衍生物，或能够增加或恢复细胞中的如本文指明的在心力衰竭中下调或表达不足的miRNA的表达、数量和/或活性的化合物，或能够增加如本文指明的在心力衰竭中下调或表达不足的miRNA与靶mRNA之间的相互作用的化合物，它们用于对抗、治疗、减少、延缓和/或预防心力衰竭。对于如本文指明的在心力衰竭中上调或过表达的miRNA而言，适用相反的情况。因此，上述化合物或其任意组合特别适合于制备针对心力衰竭的药物或预防性试剂。因此，还提供了如本文指明的pri-miRNA和/或pre-miRNA和/或miRNA或其功能部分或衍生物的用途，能够增加或恢复细胞中的miRNA的表达、数量和/或活性的化合物的用途，或能够增加靶mRNA与所述miRNA之间的相互作用的化合物的用途，用于制备针对心力衰竭的药物或预防性试剂。所述预防性试剂特别适合于具有增加的心力衰竭风险的受试者，以及已经患有心力衰竭的受试者。然而，所述预防性试剂也适合于在未受影响的受试者中一般性预防心力衰竭。也可以通过增加或减少如本文指明的miRNA的靶mRNA编码的蛋白产物的量或活性来实现上述效应。向受试者施用任意上述化合物或其任意组合特别适合于在所述受试者中对抗和/或预防心力衰竭。在一个实施方式中，向被诊断具有心力衰竭的受试者施用任意上述化合物或其任意组合。在另一个实施方式中，向具有升高的心力衰竭风险的受试者、 例如已经具有损伤或疾病的受试者施用任意上述化合物或其任意组合。然而，所述化合物或其任意组合也适合于在未受影响的受试者中一般性预防心力衰竭。如已经描述的那样，用于确定心力衰竭的存在或风险的方法包括心脏功能的检查。现在发现，可以提供这样的方法，其包括测定如本文指明的(pri/pre)miRNA的积累或靶mRNA编码的蛋白的水平。然而，现在本发明公开了一组miRNA与心力衰竭之间存在的关联，所以另外的方法是可获得的。根据本发明，通过测定受试者的样品中的如本文指明的与心力衰竭相关的pri-miRNA和/或pre-miRNA和/或miRNA的量是否高于或低于一定的参考值来确定心力衰竭的存在或风险。在一个实施方式中，所述参考值代表健康受试者或健康群体中的选自 miR-191，miR-30e, miR-744, miR-142_3p 和 solexa4952-306 的 pri-miRNA和/或pre-miRNA和/或miRNA的量。如果受试者的样品中的所述pri-miRNA 和/或pre-miRNA和/或miRNA的量显著低于参考值，则靶mRNA的表达未被足够地抑制。 因此，由靶mRNA编码的蛋白的表达将会太高，所述受试者患有心力衰竭或具有患心力衰竭的风险。在这样的情况下，推荐根据本发明的治疗。另一方面，如果受试者的样品中的选自miR-423-5p，miK-191*, miR-15b, miR-1228*, miR-181a, miR-18a*, miR-107, miR-299-3p, miR-342-3p, miR-652, miR-675, miR-129-5p，miR-18b*，miR-1254，miR-622，HS_202. l，miR_302d 和 / 或 solexa-3927-221 的 pri-miRNA和/或pre-miRNA和/或miRNA的量显著高于该参考值，则靶mRNA的表达(或靶mRNA向蛋白的翻译)被严重抑制。在这种情况下，受试者也被诊断为患有心力衰竭或具有患心力衰竭的风险。可以在从样品、优选血液样品或尿液样品中分离RNA之后测定与心力衰竭相关的 pri-miRNA和/或pre-miRNA和/或miRNA的量。优选在强变性剂例如GITC, LiCl, SDS 和/或苯酚存在的情况下进行RNA的分离，以便灭活RNA酶，如果其存在的话。用于分离 RNA的方法是本领域已知的，包括使用商售的RNA分离试剂盒，例如mirVana PARIS试剂盒 (Ambion)和Trizol LS(Invitrogen)0然而，可以在不预先分离RNA的情况下处理样品以检测miRNA序列，例如通过从样品分离囊泡例如微囊泡。用于检测样品中的miRNA的方法是本领域技术人员已知的，包括Northern印迹， 使用微阵列和大阵列，原位杂交，液相中的单分子检测，大量平行测序和定量聚合酶链式反应Ο -PCR)。优选在检测miRNA序列之前扩增样品中的RNA。用于扩增RNA序列的方法是本领域已知的，包括逆转录酶聚合酶链式反应(RT-PCR)和基于扩增的核酸测序(NASBA)。 优选的扩增方法包括通过例如使用STOR GREEN (Roche, Basel, Switzerland)或荧光标记的 Taq man 探针(Applied Biosystems, Foster City, USA)定量扩增 RNA 序列。用于逆转录酶介导的cDNA合成的引物可以这样提供通过连接或通过末端转移酶的作用向所有的miRNA序列提供共有的序列，例如poly(A)-尾巴，然后进行接头-oligo(dT)引物的退火。另外的方法包括使用茎-环引物，和/或使用miRNA特异性引物。优选通过实时PCR进行RNA序列的定量扩增，优选包括普遍引物和miRNA特异性引物。用于检测、cDNA合成和/或扩增的引物优选包括RNA核苷酸、DNA核苷酸或修饰的核苷酸，例如锁核酸(LNA)核苷酸、肽核酸(PNA)核苷酸，和/或2' -0-烷基修饰、2'-氟修饰、4'-硫修饰，硫代磷酸酯键，吗啉键，膦酰羧酸酯键。在优选的实施方式中，引物、 优选miRNA特异性引物的长度与特定的miRNA的长度相同。在进一步优选的实施方式中， miRNA特异性引物的长度短于miRNA的长度，例如，14个核苷酸，15个核苷酸，16个核苷酸， 17个核苷酸，18个核苷酸，19个核苷酸，20个核苷酸，21个核苷酸，22个核苷酸或^个核苷酸，取决于特定miRNA的长度。相对于miRNA的序列或添加到miRNA上的接头序列，引物、
16优选miRNA特异性引物的序列优选包含一个或两个错配，更优选与miRNA的序列相同。用于检测样品中的一个或多个miRNA的方法和工具优选以试剂盒提供。所述试剂盒优选包括引物组，优选至少一组特异性引物，酶，例如RNA依赖性DNA聚合酶和/或DNA 依赖性DNA聚合酶，以及用于进行反应的至少一种缓冲液。所述试剂盒可以以干燥物质提供，例如，在冻干后，或作为液体提供。如果受试者的样品中的pri-miRNA和/或pre_miRNA和/或miRNA的量与参考值基本上相同，则靶mRNA的表达被足够地抑制。在这种情况下，受试者不被诊断为患有心力衰竭或具有患心力衰竭的风险。当然，可以使用除了健康受试者之外的其它类型的参考值。例如，可以使用代表患有心力衰竭的受试者或群体中的pri-miRNA和/或pre-miRNA和/或miRNA的数量的参考值。在这种情况下，具有基本上等于所述参考值的量的pri-miRNA和/或pre-miRNA和/ 或miRNA的样品指示心力衰竭(其风险)。所述值低得多或高得多的样品指示健康。因此，本发明提供了用于确定受试者是否患有心力衰竭或受试者是否具有增加的患心力衰竭风险的方法，该方法包括-从所述受试者获得样品；-测定所述样品中的本文中指明的与心力衰竭相关的pri-miRNA和/或 pre-miRNA 和 / 或 miRNA 的量；-将所述量与参考量进行比较；和-从所述比较确定该受试者是否患有心力衰竭，或具有患心力衰竭的增加的风险。优选使用结合性化合物测定受试者的样品中的pri-miRNA和/或pre-miRNA和/ 或miRNA的量。优选地，将至少部分样品与此类结合性化合物接触(任选在对样品进行预先处理之后)，然后优选洗掉未结合的成分，优选显示并定量结合的化合物的量。因此，一个实施方式提供了根据本发明的用于确定受试者是否患有心力衰竭或确定受试者是否具有增加的患心力衰竭的风险的方法，该方法还包括将所述样品的至少一部分与能够特异性结合pri-miRNA和/或pre-miRNA和/或miRNA的至少一种化合物接触。当然，如果仅使用一部分所述样品，则使用含有微RNA的部分，从而进行适当的测试。样品优选是血液或血浆或尿液样品。本发明还提供了用于执行根据本发明的方法的试剂盒。因此，还提供了试剂盒，其包含-能够特异性结合如本文指明的与心力衰竭相关的pri-miRNA和/或pre-miRNA 和/或miRNA的至少一种化合物；和-使用所述化合物确定受试者是否患有心力衰竭的说明书。本发明还提供了用于执行根据本发明的治疗的试剂盒。通过此类试剂盒，通常通过miRNA阻抑靶mRNA的表达。根据本发明的试剂盒包含-在本文中所指明的在心力衰竭中下调或表达不足的pri-miRNA和/或 pre-miRNA和/或miRNA，或其功能部分或衍生物，和/或-能够增加或恢复细胞中的如本文中指明的在心力衰竭中下调或表达不足的 pri-miRNA和/或pre-miRNA和/或miRNA的表达、数量和/或活性的化合物，和/或-能够增加靶mRNA与如本文中指明的在心力衰竭中下调或表达不足的pri-miRNA和/或pre-miRNA和/或miRNA之间的相互作用的化合物，和-使用所述化合物在有此需要的受试者中对抗、治疗、减少、延缓和/或预防心力衰竭的说明书。所述的如本文中指明的在心力衰竭中下调或表达不足的pri-miRNA和/或 pre-miRNA和/或miRNA或其功能部分或衍生物优选存在于载体中。也可以使用包含编码任意上述化合物的核酸序列的载体。所述载体优选包括病毒载体，最优选逆转录病毒、腺病毒、腺相关病毒或慢病毒载体。在一个实施方式中，使用AAV9载体。因此，还提供了载体，其包含-如本文中指明的在心力衰竭中下调或表达不足的pri-miRNA和/或pre-miRNA 和/或miRNA或其功能部分或衍生物，和/或-编码能够增加或恢复细胞中的如本文中指明的在心力衰竭中下调或表达不足的 miRNA的表达、数量和/或活性的化合物的核酸序列，和/或-编码能够增加靶mRNA与如本文中指明的在心力衰竭中下调或表达不足的miRNA 之间的相互作用的化合物的核酸序列。在一个优选的实施方式中，所述载体包含-miR-191, miR_30e，miR-744，miR-142_3p 和 solexa4952-306 中的一项或多项， 或其pre-或pri-miRNA，或其功能部分或衍生物，和/或-编码能够增加或恢复细胞中的miR-191，miR_30e，miR-744，miR-142_3p禾口 solexa-2952-306中的一项或多项的表达、数量和/或活性的化合物的核酸序列，和/或-编码能够增加miR-191，miR_30e，miR-744, miR_142_3p 和 solexa4952-306 中的一项或多项的靴 mRNA 与 miR-191，miR-30e，miR-744, miR-142 和 solexa4952-306 之间的相互作用的化合物的核酸序列。此类载体特别适合于对抗心力衰竭。根据本发明的载体优选包括逆转录病毒、腺病毒、腺相关病毒或慢病毒载体。在一个实施方式中，所述载体包括AAV9载体。上述的任意的根据本发明的载体的核酸序列优选地可操作地连接于启动子，从而在转染之后将发生所述核酸的表达。所述启动子优选适合于在哺乳动物细胞中的表达。在特别优选的实施方式中，根据本发明的载体适合于在心细胞中的表达，从而对抗心力衰竭 (其风险)。在该情况下，所述载体优选包含适合于在心细胞中表达的启动子。然而，在另一个实施方式中，根据本发明的载体包含普遍的启动子。有利的是使用可诱导启动子，从而可以按照需要调节根据本发明的(至少一个)载体核酸的表达。可诱导型启动子的非限制性实例有心肌钙蛋白和α肌球蛋白重链，其为心肌细胞特异性启动子。在一个实施方式中， 可以使用心成纤维细胞特异性启动子。根据本发明的载体特别适合于治疗。因此，还提供了如上文定义的载体在制备用于对抗、治疗、减少、延缓和/或预防心力衰竭的药物和/或预防性试剂中的用途。还提供了用于在受试者中对抗、治疗、减少、延缓和/或预防心力衰竭的方法，该方法包括向所述受试者施用治疗量的根据本发明的载体。如上所述，所述载体优选包括逆转录病毒、腺病毒、腺相关病毒或慢病毒载体。在一个实施方式中，使用AAV9载体。本文还提供了包含根据本发明的载体的分离或重组的细胞。可以在体外向细胞提供pri-miRNA和/或pre-miRNA和/或miRNA。此类细胞特别适合于研究目的。此外，此类细胞适合于治疗。例如，可以向受试者施用过表达miR-191，miR-30e, miR-744, miR-142_3p 和 solexa-2952-306 中的一项或多项的细胞，以降低心力衰竭的风险。因此，还提供了能够过表达miR-191，miR-30e, miR-744, miR-142_3p和 solexa-2952-306中的一项或多项或其功能部分或衍生物的分离的细胞在制备用于对抗、 治疗、减少、延缓和/或预防心力衰竭的药物和/或预防性试剂中的用途。备选地，提供了能够过表达、优选分泌如本文指明的在患有心力衰竭的受试者中过表达的miRNA的靶mRNA 编码的一种或多种蛋白的分离的细胞的用途。本文还提供了允许预防和/或治疗心力衰竭的药物组合物，其包含如本文指明的一种化合物或化合物的组合，以及药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。根据本发明的药物组合物可以包含在本文中指明的其下调或表达不足与心力衰竭相关的pri-miRNA和/或pre_miRNA和/或miRNA或miRNA的功能部分或衍生物，和/ 或-能够增加或恢复细胞中的所述miRNA的表达、数量和/或活性的化合物，和/或-能够增加靶mRNA与所述miRNA之间的相互作用的化合物，和/或-能够在细胞中表达所述miRNA的根据本发明的载体，和/或-能够过表达所述miRNA或其功能部分或衍生物的细胞，和/或-如本文指明的其上调或过表达与心力衰竭相关的miRNA的靶mRNA编码的蛋白， 或能够表达所述蛋白的载体或细胞，以及药学上可接受的载体载体、稀释剂或赋形剂。还提供了用于在受试者中对抗、治疗、减少、延缓和/或预防心力衰竭的方法，该方法包括向所述受试者施用治疗量的根据本发明的药物组合物。还提供了非人动物，其包含-包含如本文指明的其上调或下调与心力衰竭相关的一种或多种pri-miRNA和/ 或pre-miRNA和/或miRNA或其功能部分或衍生物的外源核酸序列，和/或-编码能够增加或抑制细胞中的如本文指明的其下调或上调与心力衰竭相关的 miRNA或其功能部分或衍生物的表达、数量和/或活性的化合物的外源核酸序列，和/或-编码能够增加靶mRNA与如本文指明的其上调或下调与心力衰竭相关的miRNA之间的相互作用的化合物的外源核酸序列。所述非人动物优选包括哺乳动物。在一个优选实施方式中，所述非人动物包括测试动物，例如啮齿类、兔子、山羊、母牛、绵羊或猴子。还提供了向其中提供了根据本发明的载体、分离的细胞和/或药物组合物的非人动物。根据本发明的非人动物尤其适用于筛选、 检测和/或鉴定能够抑制或降低如本文指明的心力衰竭中上调的miRNA的表达、数量和/ 或活性的候选化合物。所述非人测试动物尤其适用于筛选、检测和/或鉴定能够降低靶 mRNA与其对应的miRNA之间的相互作用的候选化合物。因此，根据本发明的非人测试动物尤其适用于筛选、检测和/或鉴定能够诱导或增强心力衰竭的候选化合物。如果候选化合物似乎具有此性质，则推荐避免向人类受试者施用。在根据本发明的治疗方法中，受试者优选是哺乳动物，最优选是人，在优选实施方式，如本文指明的miRNA是指智人(has)的miRNA。在另一个实施方式中，提供了用于筛选、检测和/或鉴定能够对抗、治疗、减少、延缓和/或预防心力衰竭的候选化合物的方法。在该实施方式中，通常就潜在的增加那些下
19调与心力衰竭相关的miRNA的表达、数量和/或活性的能力、就潜在的降低那些上调与心力衰竭相关的miRNA的表达、数量和/或活性的能力，或具有对抗如本文指明的与异常miRNA 表达相关的异常蛋白表达的效应的能力来筛选候选化合物。如果候选化合物似乎具有此性质，则其能够对抗或预防心力衰竭。因此，还提供了用于确定候选化合物是否能够对抗、治疗、减少、延缓和/或预防心力衰竭的方法，所述方法包括-将所述候选化合物与细胞、优选心细胞接触；和-确定所述候选化合物是否能够在所述细胞中对抗如本文指明的与异常miRNA表达相关的异常蛋白表达的效应。在一个优选实施方式中，将候选化合物与根据本发明的细胞接触，在所述细胞中 miRNA (优选为在心力衰竭下调的)的表达是降低的，从而候选化合物对于miRNA表达或活性的效应更加清晰可见。然而，也可以使用本领域目前已知的任何细胞或非人动物进行根据本发明的筛选方法。在一个实施方式中，使用根据本发明的非人动物。在另一个实施方式中，就增加靶mRNA与如本文指明的miRNA或其功能部分或衍生物之间的相互作用的能力来筛选候选化合物。如果候选化合物似乎具有针对那些其下调与心力衰竭相关的miRNA的性质，则其能够对抗或预防心力衰竭。因此，还提供了用于确定候选化合物是否能够对抗、治疗、减少、延缓和/或预防心力衰竭的方法，该方法包括-将所述候选化合物与细胞、优选心细胞接触；和-确定所述候选化合物是否能够在所述细胞内增加mRNA与miR-191，miR-30e, miR-744, miR-142-3p和solexa-2952_306中的一项或多项或其功能部分或衍生物之间的
相互作用。在优选的实施方式中，根据本发明的用于诊断受试者为患有心力衰竭或具有患心力衰竭风险的方法包括(a)测定选自miR-423-5p, miR-191*, miR-15b, miR-1228*, miR-181a, miR-18a*, miR-107, miR-299-3p, miR-342-3p, miR-652, miR-675, miR-129-5p, miR-18b*, miR-1254, miR-622, HS_202. 1， solexa-3927-221, miR-191, miR-302d, miR-30e, miR-744, miR-142_3p 和 / 或 solexa4952-306 的至少一种 miRNA 或其前体微 RNA(pre-miRNA)或微RNA初级转录物的水平；和(b)基于步骤(a)中所测的所述的至少一种遗传标志物的水平诊断该受试者患有心力衰竭或具有患心力衰竭的风险。优选的miRNA 是 miR-423-5p。在另一个优选的实施方式中，根据本发明的方法包括测定选自miR-423_5p， miR-191*, miR-15b, miR-1228*, miR-181a, miR-18a*, miR-107, miR-299-3p, miR-342-3p, miR-652, miR-675, miR-129_5p， miR-18b*, miR-1254, miR-622, HS_202.1， solexa-3927-221, miR-191, miR-302d, miR-30e, miR-744, miR-142_3p 的至少两种 miRNA 和/或solexa-2952-306或其前体微RNA (pre-miRNA)或微RNA初级转录物的水平， 例如选自 miR-423-5p，miR-191*，miR-15b, miR-1228*, miR-181a, miR-18a*, miR-107, miR-299-3p, miR-342_3p，miR-652, miR-675, miR-129_5p，miR-18b*, miR-1254, miR-622, HS_202. 1，solexa-3927-221, miR-191, miR_302d，miR_30e，miR-744, miR-142_3p 和 / 或 solexa-2952-306 的 2 种 miRNA、3 种 miRNA、4 种 miRNA、5 种 miRNA、6 种 miRNA、7 种 miRNA、 8 种 miRNA、9 种 miRNA、10 种 miRNA、15 种 miRNA、20 种 miRNA 或全部 miRNA 或其前体微 RNA (pre-miRNA)或微RNA初级转录物。
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在优选的实施方式中，所述至少两种miRNA选自miR-423_5p和miR_19r， miR-423-5p 和 miR_15b，miR-423_5p 和 miR-1228*，miR-423_5p 和 miR_181a，miR-423_5p 禾口 miR-18a*， miR-423-5p 禾口 miR-107， miR-423-5p 禾口 miR-299_3p， miR-423-5p 禾口 miR-342-3p, miR-423_5p 和 miR-652，miR-423_5p 和 miR-675，miR-423_5p 和 miR-129_5p， miR-423-5p 和 miR_18b*，miR-423_5p 和 miR-1254，miR-423_5p 和 miR-622，miR-423_5p 和 HS_202. 1，miR-423-5p 和 miR-191，miR-423_5p 和 miR_302d，miR-423_5p 和 miR_30e， miR-423-5p 和 miR-744，miR-423_5p 和 miR-142_3p，miR-423_5p 和 solexa-2952-306，或， miR-423-5p 禾口 solexa—3927—221。根据本发明的优选的诊断和/或预后方法还包括检测可用于诊断和/或预后心力衰竭的一种或多种生物标志物。这些生物标志物优选包括炎性标志物，例如C-反应性蛋白，和炎性细胞因子，例如白介素-6和肿瘤坏死因子(TNF)；氧化应激的指示物，例如血浆和尿液中的低密度脂蛋白、丙二醛和髓过氧化物酶和异构前列腺素水平；心室的细胞外基质重塑的标志物，例如I型前肽前胶原和/或III型前肽前胶原；神经激素，例如去甲肾上腺素和内皮素-1的血浆水平；肌细胞损伤的标志物，例如心肌钙蛋白T和I ；心重塑和纤维化的标志物，例如半乳凝素-3 ；以及肌细胞应激标志物，例如钠肽BNP和N-末端前脑钠肽 (NT-pro-BNP)、肾上腺髓素和ST2(白介素-1受体家族的成员)。根据本发明的另一个优选的诊断和/或预后方法还包括常规方法，例如，心电图、超声波心动描记术和/或心脏磁共振成像(CM 。在另一个优选的实施方式中，根据本发明的诊断和/或预后方法的结果至少部分确定患有心力衰竭或具有患心力衰竭风险的受试者的治疗方法。可能的治疗方法包括食谱措施，例如减少钠的摄入，肥胖受试者的体重减少，和/或鼓励戒烟；开处方药，例如血管紧缩素转化酶抑制剂和/或β -肾上腺素受体拮抗剂；和/或侵入性程序，例如血管再形成程序，二尖瓣手术、心室恢复和心脏移植。治疗的选择可以至少部分取决于在获自受试者的样品中测定的选自下列的至少一种遗传标志物的性质和/或表达水平miR-423-5p， miR-191*, miR-15b, miR-1228*, miR_181a，miR-18a*, miK-107，miR-299_3p，miR-342_3p， miR-652, miR-675, miR-129-5p, miR-18b*, miR-1254, miR-622, HS_202.1， miR-191, miR-302d,miR-30e,miR-744,miR-142-3p,solexa-2952-306 和 solexa-3927-221 及其前体微RNA (pre-miRNA)或微RNA初级转录物。药物组合物和治疗应用药物组合物可以包括要求保护的本发明的多肽、多核苷酸或小分子，在本文中联合起来称作药学化合物。药物组合物将包含治疗有效量的如本文描述的生物标志物蛋白、 多核苷酸或小分子。如本文使用的术语“治疗有效量”是指用于治疗、缓解或预防目标疾病或病况或用于显示可检测的治疗或预防效应的治疗剂的量。可以通过例如临床标志物或抗原水平来检测所述的量。治疗效应还包括身体症状的减少。用于受试者的精确的有效量将取决于受试者的体形和健康状况，病况的性质和程度，以及所选的用于施用的治疗剂或治疗剂的组合。 因此，事先指明精确的有效量是无用的。然而，给定状况的有效量可以通过常规实验确定， 并且可由临床医生判断。为了本发明的目的，施用至个体的有效剂量将是大约0. 01mg/kg至50mg/kg或0. 05mg/kg至大约10mg/kg多核苷酸或多肽成分。药物组合物也可以包含药学上可接受的载体。术语“药学上可接受的载体”是指用于施用治疗剂、例如多肽、多核苷酸和其它治疗剂的载体。该术语是指自身不诱导产生对于接受组合物的个体有害的抗体并且可以施用而无不适当毒性的任意药学载体。适宜的载体可以是大的，缓慢代谢的大分子，例如蛋白质、多糖、聚乳酸、聚乙醇酸、聚氨基酸、氨基酸共聚物和无活性的病毒颗粒。此类载体是本领域普通技术人员熟知的。可用于其中的药学上可接受的盐有，例如，矿物质酸盐，例如盐酸、氢溴酸、磷酸、 硫酸等的盐；以及有机酸例如乙酸、丙酸、丙二酸、苯甲酸等的盐。关于药学上可接受的赋形齐U的详细讨论见 Remington' s Pharmaceutical Sciences (Mack Pub. Co.，N. J. 1991)。治疗性组合物中的药学上可接受的载体可以包括液体，例如水、盐水、甘油和乙醇。另外，此类介质中可以存在辅助性物质，例如润湿剂或乳化剂、PH缓冲物质等。通常而言，治疗性组合物制备为可注射的液体溶液或悬浮液；也可以制备适合在注射前溶解于或悬浮于液体介质中的固体形式。脂质体包括在药学上可接受的载体的定义内。递送方法配置完成之后，本发明的药物组合物可以(1)直接施用至受试者；(2)离体递送至源自受试者的细胞；或C3)体外递送以表达重组蛋白。组合物的直接递送一般通过注射完成，可以通过皮下、腹膜内、静脉内或肌内；或者递送至组织的间质间隙(interstitial space)。也可以将组合物施用至神经系统。其它施用途径包括表面、口、栓剂和透皮施用、针和颗粒枪或无痛皮下喷射器(hypospray)。剂量处理可以是单剂方案或多剂方案。用于离体递送和将经转化的细胞再植入受试者中的方法是本领域已知的，描述于例如国际
发明者A·J·M·迪吉森, E·E·J·M·克里莫斯, Y-M·品托 申请人:阿姆斯特丹大学学术医学中心