专利名称：用于癌症治疗的卡那霉素反义核酸的制作方法
技术领域：
本发明涉及含有与卡那霉素抗性蛋白的编码序列的片段互补的序列的核酸。该核酸可用作DNA疫苗的佐剂，例如可以用于治疗癌症，比如与诸如全反式维甲酸(ATRA)的肿瘤细胞凋亡的非免疫抑制性诱导剂联合使用。
背景技术：
在美国，癌症是导致死亡的第二原因，仅次于心血管疾病。约10%的这些癌症死亡是由于血癌，例如白血病、淋巴瘤和骨髓瘤。仅在欧洲和美国，据估计有190万人患有血癌。其中一些血癌是罕见疾病，例如急性髓系白血病(AML)。急性早幼粒细胞白血病(APL， M3型AML)的特点是t(15;17)的相互易位，将早幼粒细胞白血病基因(PML)与维甲酸受体 α基因(RARa)融合，并在早幼粒阶段被髓样分化所捕获。全反式维甲酸(ATRA)介导的分化治疗是目前APL患者标准治疗的基础。然而，尽管目前与ATRA相结合的化疗的尝试能够延长存活，但约10%的患者由于缺少对当前维持治疗的顺应性而复发。因此，需要新的治疗策略来根除剩余的疾病以及改善生命的质量。迄今为止，已经确定了许多与肿瘤相关的抗原，并已开发出疫苗的接种策略以诱发对这些肿瘤抗原的免疫应答。天然的和重组的癌症蛋白抗原包括标准化级别所定义的免疫原性的抗原，其疗效取决于找到合适的佐剂和传递系统。DNA传递是新型的疫苗和免疫治疗方法，例如直接将基因表达盒注射到活的宿主中。所传递的基因的表达会导致宿主的免疫防御系统对抗所表达的抗原而产生特定的免疫激活。疫苗策略的有效性依赖于免疫应答的获得，可以是体液的和细胞毒性的。DNA疫苗已经被证明能够满足这些需求，其导致对质粒编码的抗原产生一个强大而持久的细胞介导的(生成CD8+细胞毒性和CD4+辅助T细胞)和体液的免疫应答。该类型的癌症疫苗接种首次用在B-非霍奇金淋巴瘤(B-NHL)上，使用表面免疫球蛋白的独特型(idiotype) 作为抗原，从而诱发抗肿瘤应答(Stevenson et al.，1995，Immunological Reviews 145 211-28 ；Syrengelas et al. ,1996, Nature Medicine 2 :1038_41，Rice et al. ,2008, Nature Reviews 8 108-20)。在其他的淋巴瘤和骨髓瘤的小鼠模型中也观察到该保护性免疫。然而，在一些癌症患者中细胞免疫系统的全身性恶化被报道了。因此，这些患者， 特别是APL患者的较差的免疫状态，被视为是单靠接种策略进行免疫治疗的方法的主要障碍。Padua 等(2003，Nature Medicine 9 1413-1417)使用 APL 动物模型(Brown 等· 1997,Proc Natl Acad Sci U S A. 94 :2551_6)测试了含有核酸的DNA疫苗效果的体内效力，其中，PML-RARα肿瘤抗原与破伤风毒素片段C(FrC)序列连接。他们的结果证实ATRA 作为辅料与PML-RAR α -FrC DNA接种一起延长APL小鼠的存活。这伴随着⑶4+和⑶8+Τ 细胞、RARa抗体以及Y干扰素(IFNy)产物的增加，证明了相关免疫应答的诱导。WO 03/090778进一步教导了含有(i)肿瘤细胞凋亡的非免疫抑制性诱导剂，例如全反式维甲酸，和(ii)含有免疫原性多肽，例如PML-RARa FrC、PML-RARa AS-FrC或 ScFvBCLl-FrC的编码序列的核酸的疫苗组合物从旧病复发和死亡中挽救APL小鼠。因此，DNA接种与ATRA给药的联合疗法有望治疗白血病(Padua和Chomienne， 2004，Discovery Medicine 4 :41_44)。在本领域有开发有助于增加癌症患者 免疫应答的 DNA辅料的需求。
发明内容
已出人意料地发现，与卡那霉素抗性蛋白的编码序列的片段互补的KanAS序列 SEQ ID NO 1是一种高效的DNA接种辅料。更具体地，发明人已经证明单独含有KanAS序列SEQ ID NO 1或与PML-RAR α月中瘤抗原融合的质粒在与ATRA联合给药时可以延长APL小鼠的寿命。此外，单独的KanAS会延长MDS小鼠的寿命。通过流式细胞仪检测免疫应答，发现使用KanAS单独治疗的MDS小鼠相比于确认的野生型FVB/N小鼠，其记忆性T细胞增加了 3倍。此外，使用KanAS治疗后， 白血病干细胞(leukaemic stem cell)的祖群(progenitor population)减少了(未经治疗的小鼠约为25%，而经治疗的小鼠约为10%)。最后，观察到Toll样受体(TLRs)通路下游的MyD88转录产物的瞬时上调，对于该受体来说，DNA是配体之一。在KanAS上游或下游发挥免疫应答的任何抗原都是可以被克隆的。因此，含有 KanAS的核酸的DNA接种适用于所有的癌症，以及许多其它需要免疫应答的疾病，包括传染性疾病。根据本发明的DNA接种策略还可以适用于患有遗传倾向的癌症，诸如乳腺癌和结肠癌的个体，其癌基因在生殖细胞系(germ line)中，并且是可遗传的。此外，与自体疫苗不同，根据本发明的DNA疫苗不是特异性针对给定癌症病情的疫苗。它们不存在任何对自身抗原诱导自体免疫的危险。此外，这些疫苗可以通过标准细菌发酵过程操作，很容易扩大生产。根据本发明的KanAS核酸本发明涉及分离和/或纯化的核酸，其含有或组成为与卡那霉素抗性蛋白的编码序列的片段互补的序列。根据本发明的这种核酸被称为“KanAS核酸”。所述卡那霉素抗性蛋白的编码序列的片段可以是任何长度，例如，至少、至多或约为50、100、150、200、250、 300、350、400、450、473 或 500 个连续核苷酸。在本发明的内容中，“核酸”是指核糖核酸(“RNA分子”)或脱氧核糖核酸(“DNA 分子”)，或它们的任何磷酸酯类似物(例如硫代磷酸酯和及硫酯)的磷酸酯聚合形式，既可以是单链形式，也可以是双链螺旋形式。术语“核酸”包括双链DNA弧(DNA round)，尤其是线性(如限制性酶切片段)或环状DNA分子。所述核酸优选对应于DNA分子。本文使用的“分离和/或纯化”是指从人或动物体和/或化合物库中分离和/或纯化得到的化合物。本文使用的术语“卡那霉素抗性蛋白”是指能够赋予卡那霉素抗性的酶。这样的酶催化下面的酶反应ATP+卡那霉素=> ADP+卡那霉素3 ‘-磷酸酯卡那霉素抗性蛋白编码序列可以源于任何微生物，例如源自肺炎克雷伯杆菌 (Klebsiella pneumoniae)，环状芽抱杆菌(Bacillus circulans)，大肠杆菌(Escherichiacoli)，鼠伤寒沙门氏菌(Enterococcus faecalis)，弗氏链霉菌(Streptomyces fradiae)， 粪肠球菌(Salmonella typhimurium)，金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus),鲍曼不动杆菌(Acinetobacter baumannii)，核糖苷链霉菌(Streptomyces ribosidificus)，空肠弯曲菌(Campylobacter jejuni)或乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)。优选地，所述卡那霉素抗性蛋白的编码序列具有SEQ ID NO 9的1226到2020的核苷酸组成的序列。根据本发明的KanAS核酸可以进一步包括pVaxl核酸载体(vector)片段的互补序列(目录编号 V260-20，Invitrogen，Carlsbad，California，USA)。pVaxl 核酸载体的序列如SEQ ID NO 9所示。因此，根据本发明的KanAS核酸，例如可能包括，或由SEQ ID NO 9的片段的互补序列组成，其中所述SEQ ID NO :9的片段包括至少、至多或约50、100、150、200、250、300、 350、400、450、473或500个位于SEQ ID NO 9的1226到2020位置的核苷酸中的连续核苷酸。例如，所述SEQ ID NO 9的片段可包括50到500、100到500,200到500,300到500或 450到500个位于SEQ ID NO 9的1226到2020位置的核苷酸中的连续核苷酸。所述KanAS 核酸还可以是这些序列相应的衍生物。在一个优选的实施方式中，所述KanAS核酸包括或组成为 -与SEQ ID NO :1 或 SEQ ID NO :2 具有至少 80%、85%、90%、95%、96%、97%、 98%或99%相似性的序列；-SEQ ID NO :1 或 SEQ ID NO :2 中的至少 50、100、150、200、250、300、350、400 或 450个连续核苷酸的片段；或-SEQ ID NO :1 或 SEQ ID NO 2 的衍生物。优选地，这些KanAS核酸具有生物活性。本文所使用的KanAS核酸的“生物活性”是指在诸如小鼠、大鼠或人的哺乳动物中诱发免疫应答的能力。测量这类生物活性的方法是本领域公知的。例如，可以使用Padua等公开的方法(2003，Nature Medicine 9 1413-1417)。在一个优选的实施方式中，将所述KanAS核酸与ATRA联合给药(参见本专利申请的实施例2和实施例3)，通过检测延长APL模型小鼠或MDS模型小鼠(此后称为“APL 小鼠”或“MDS小鼠”)存活的能力来测量所述KanAS核酸的生物活性。核酸序列与本发明的相关序列(query sequence)具有至少，例如95%“相似性”， 是指除非每100个相关序列的核苷酸中有高达5个核苷酸发生改变，否则该核酸的序列与所述相关序列是相同的。换句话说，通过插入、删除或使用其它核苷酸替代相关序列中不超过5% (100个中的5个)核苷酸，可以得到与相关序列具有至少95%相似性的核酸序列。术语“衍生物”包括片段、同源基因、突变体和自然产生的变异体，例如等位基因变异体、剪接变异体或通过蛋白水解处理得到的变异体。由与参照序列具有“至少80%、85%、 90%、95%、96%、97%、98%或99%相似性”的氨基酸序列所组成的衍生物可含有相比于参照序列的突变，例如删除、插入和/或替代。在替代的情况下，由与参照序列具有至少80%、 85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%相似性的氨基酸序列所组成的衍生物，相比于参照序列，其可能与衍生自其它物种的同源序列更相关。替代可能对应于如下表所示的保守替代。
权利要求
1.一种应用于DNA接种的分离的核酸，该核酸含有与卡那霉素抗性蛋白的编码序列的片段互补的反义序列。
2.一种分离的核酸，该核酸含有与卡那霉素抗性蛋白的编码序列的片段互补的反义序列，其中，所述反义序列由选自由下列序列组成的组中的序列组成a)与SEQID NO :9所示的片段互补的序列，其中，所述片段包括位于SEQ ID NO 9的1226位置到2020位置的核苷酸中的至少50个连续核苷酸；b)SEQID NO 1 或 SEQ ID NO 2 所示的序列；c)与SEQID NO :1或SEQ ID NO 2具有至少80%相似性的序列；d)SEQ ID NO :1或SEQ ID NO 2中至少50个连续核苷酸的片段；以及e)能够在哺乳动物中诱发免疫应答的(a)或(b)的衍生物。
3.根据权利要求1或2所述的核酸，其中，核酸进一步含有编码免疫原性多肽的序列。
4.根据权利要求3所述的核酸，其中，所述免疫原性多肽是肿瘤抗原。
5.根据权利要求4所述的核酸，其中，所述编码肿瘤抗原的序列与SEQID N0:5所示的PML-RARα序列具有至少80%相似性。
6.根据权利要求3-5中任意一项所述的核酸，其中，所述核酸含有选自由下列序列组成的组中的序列a)SEQ ID NO 3 或 SEQ ID NO 4 所示的序列；b)与SEQID NO :3或SEQ ID NO 4具有至少80%相似性的序列；c)SEQ ID NO 3或SEQ ID NO 4中至少50个连续核苷酸的片段；以及d)能够在哺乳动物中诱发免疫应答的(a)的衍生物。
7.根据权利要求1-6中任意一项所述的核酸，其用于治疗和/或预防癌症、良性肿瘤或传染性疾病。
8.根据权利要求1-7中任意一项所述的核酸，其与肿瘤细胞凋亡的非免疫抑制性诱导剂同时或依次联合使用，用于治疗和/或预防癌症。
9.根据权利要求7或8所述的核酸，其中，所述癌症是血癌，所述血癌选自由淋巴白血病、髓细胞性白血病、急性早幼粒细胞白血病、骨髓增生异常综合征、急性髓系白血病、髓单核细胞白血病、慢性淋巴细胞白血病、慢性粒细胞性白血病、儿童急性淋巴细胞白血病、霍奇金淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤和多发性骨髓瘤组成的组。
10.根据权利要求7或8所述的核酸，其中，所述癌症是实体肿瘤，所述实体肿瘤选自由癌、腺癌、肉瘤、恶性黑色素瘤、间皮瘤和胚细胞瘤组成的组。
11.含有权利要求1-10中任意一项所述的核酸的核酸载体。
12.一种药用组合物，该药用组合物含有(i)权利要求1-10中任意一项所述的核酸或者权利要求11所述的核酸载体；( )生理上可接受的载体；以及任选地(iii)肿瘤细胞凋亡的非免疫抑制性诱导剂。
13.一种联合物，该联合物包括(i)第一药用组合物，该第一药用组合物含有在生理上可接受的载体中的权利要求 1-10中任意一项所述的核酸或者权利要求11所述的核酸载体；(ii)第二药用组合物，该第二药用组合物含有在生理上可接受的载体中的肿瘤细胞凋亡的非免疫抑制性诱导剂。
14.根据权利要求8-10中任意一项所述的核酸，根据权利要求12所述的药用组合物或根据权利要求13所述的联合物，其中，所述肿瘤细胞凋亡的非免疫抑制性诱导剂是维甲酸化合物或砷相关化合物。
15.根据权利要求14所述的核酸，根据权利要求14所述的药用组合物或根据权利要求 14所述的联合物，其中，所述维甲酸化合物是ATRA。
全文摘要
本发明涉及含有与卡那霉素抗性蛋白的编码序列的片段互补的序列的核酸。该核酸可用作DNA疫苗的佐剂，例如可以用于治疗癌症，比如与肿瘤细胞凋亡的非免疫抑制性诱导剂，如全反式维甲酸(ATRA)联合使用。
文档编号C12N15/113GK102439150SQ201080021388
公开日2012年5月2日 申请日期2010年3月26日 优先权日2009年3月27日
发明者C·肖米耶纳, R·A·帕多瓦 申请人:巴黎狄德罗大学, 法国国家健康医学研究院