专利名称：通过抑制针对δ样1同源物(DLK1)的天然反义转录物来治疗DLK1相关的疾病的制作方法
技术领域：
本发明的实施方案包括调节DLKl和相关分子的表达和/或功能的寡核苷酸。
背景技术：
DNA-RNA和RNA-RNA杂交对于核酸功能的许多方面(包括DNA复制、转录和翻译) 而言为重要的。杂交对于探测特定核酸或者改变其表达的各种技术而言亦为主要的。反义核苷酸例如通过与靶RNA杂交来扰乱基因表达，从而干扰RNA剪接、转录、翻译和复制。 反义DNA具有附加的特征，该特征为DNA-RNA杂合体充当核糖核酸酶H消化的底物，该活性存在于大多数细胞类型中。可将反义分子递送到细胞中，这与寡脱氧核苷酸(ODN)的情况一样，或者它们如RNA分子一样可由内源基因表达。FDA最近批准了一种反义药物， VITRAVENE (用于治疗巨细胞病毒视网膜炎)，这反映了反义物具有治疗应用。发明概述提供本概述以呈现本发明的概述，从而简要地指出本发明的性质和实质。在理解以下的情况下提出本概述其不会用于解释或限制权利要求的范围或含义。在一个实施方案中，本发明提供通过使用靶定天然反义转录物的任何区域的反义寡核苷酸来抑制天然反义转录物的作用，引起相应有义基因的增量调节的方法。本文也考虑天然反义转录物的抑制可通过siRNA、核酶和小分子来达到，认为所述siRNA、核酶和小分子在本发明的范围之内。一个实施方案提供在体内或体外调节患者细胞或组织中的DLKl多核苷酸的功能和/或表达的方法，所述方法包括用长度为5-30个核苷酸的反义寡核苷酸接触所述细胞或组织，其中所述寡核苷酸与以下多核苷酸的反向互补序列具有至少50%的序列同一性，所述多核苷酸包含在SEQ ID NO :3(图幻的核苷酸1-1347之内的5_30个连续核苷酸；从而在体内或体外调节患者细胞或组织中的DLKl多核苷酸的功能和/或表达。在另一个优选的实施方案中，寡核苷酸靶定DLKl多核苷酸的天然反义序列，例如 SEQ ID NO :3所述的核苷酸，以及其任何变体、等位基因、同源物、突变体、衍生物、片段和互补序列。反义寡核苷酸的实例如SEQ ID NO :4-5(图4)所述。另一个实施方案提供在体内或体外调节患者细胞或组织中DLKl多核苷酸的功能和/或表达的方法，所述方法包括用长度为5-30个核苷酸的反义寡核苷酸接触所述细胞或组织，其中所述寡核苷酸与DLKl多核苷酸的反义物的反向互补序列具有至少50%的序列同一性；从而在体内或体外调节患者细胞或组织中DLKl多核苷酸的功能和/或表达。
另一个实施方案提供在体内或体外调节患者细胞或组织中DLKl多核苷酸的功能和/或表达的方法，所述方法包括用长度为5-30个核苷酸的反义寡核苷酸接触所述细胞或组织，其中所述寡核苷酸与DLKl反义多核苷酸的反义寡核苷酸具有至少50%的序列同一性；从而在体内或体外调节患者细胞或组织中DLKl多核苷酸的功能和/或表达。在优选的实施方案中，组合物包含一种或多种与有义和/或反义DLKl多核苷酸结合的反义寡核苷酸。在另一个优选的实施方案中，所述寡核苷酸包含一个或多个经修饰或取代的核苷酸。在另一个优选的实施方案中，所述寡核苷酸包含一个或多个经修饰的键。在又一个实施方案中，所述修饰核苷酸包含经修饰的碱基，该碱基包含硫代磷酸酯、甲基膦酸酯、肽核酸、2’-0_甲基、氟或碳、亚甲基或其他锁定核酸(LNA)分子。优选地， 所述修饰核苷酸为锁定核酸分子，包括a-L-LNA。在另一个优选的实施方案中，将所述寡核苷酸经皮下、肌内、静脉内或腹膜内给予
^^ ο在另一个优选的实施方案中，将所述寡核苷酸在药物组合物中给予。治疗方案包括至少一次向患者给予反义化合物；然而，可将此治疗修改成在一段时间内包含多次给药。 所述治疗可与一种或多种其它类型的疗法组合。在另一个优选的实施方案中，将所述寡核苷酸封装到脂质体中或附着于载体分子 (例如胆固醇、TAT肽)。其它方面描述于下文。附图
简述图 1 图IA为实时PCR结果的图表，显示相比于对照，用硫代磷酸寡核苷酸处理H印G2 细胞后DLKl mRNA的倍数变化+标准偏差，所述硫代磷酸寡核苷酸使用Lipofectamine 2000弓I入。实时PCR结果显示!fepG2细胞中DLKl mRNA水平在用针对DLKl反义物HS. 697829 设计的两种寡核苷酸处理后4 显著增加。表示为⑶R-0338和⑶R-0340的条分别对应用 SEQ ID NO :4和5处理的样品。图2显示SEQ ID NO 1 人类 δ 样 1 同源物(果蝇属)(delta-like 1 homolog，DLKl)mRNA。 (NCBI 检索号NM_003836)SEQ ID NO :2 =DLKl的基因组序列(外显子用大写字母显示，内含子用小写字母显示)°图 3 显示 SEQ ID NO 3 天然 DLKl 反义序列(HS. 697829)。图4显示反义寡核苷酸SEQ ID NO :4_5。*指硫代磷酸酯键。图5显示有义寡核苷酸SEQ ID NO :6和7。有义寡核苷酸SEQ ID NO :6和7分别为反义寡核苷酸SEQ ID NO :4和5的反向互补序列。发明详述参考用于说明的示例应用在下文中描述本发明的数个方面。应当理解的是，陈述许多具体细节、关系和方法来提供对本发明的充分理解。然而，在相关领域的普通技术人员CN 102549159 A将容易地认识到，可在不含一个或多个具体细节的情况下实施本发明或者可用其他方法来实施本发明。本发明不受行为或事件的排序限制，因为一些行为可以不同的顺序进行和/ 或与其他行为或事件同时进行。此外，并非所有说明性的行为或事件对实施本发明的方法都为必需的。DLKl ( δ样)为表皮生长因子样同源异型家族中的跨膜和分泌蛋白。跨膜糖蛋白在胞外域中具有六个表皮生长因子样基序，与在信号分子的S /刻缺蛋白/Serrate家族中存在的那些相似。与其它刻缺蛋白配体相比，DLKl不具有δ =Serrate :Lin-12 (DSL)结构域，认为该结构域介导刻缺蛋白受体的相互作用和激活。然而，DLKl可通过特殊的EGF样重复与刻缺蛋白相互作用，并且在培养物中和在体内均可充当刻缺蛋白拮抗剂，其与受体结合而不使其激活。在体外，Dlkl维持前体细胞群并抑制分化。Dlkl在广泛范围的胚胎组织中高水平表达。尽管在胚胎发育期间广泛表达，但是仅少数组织在成体中保留表达。S样 1同源物(DLKl)的中脑表达受胶质细胞衍生神经营养因子(GDNF)调节并与多巴胺能分化有关(Christophersen Nicolaj S 等，Experimental Neurology 2007 ；204 (2) :791-801)。神经营养因子的胶质衍生(⑶NF)家族包括四个成员胶质细胞系衍生神经营养因子(GDNF)、神经秩蛋白(neurturin)、artemin和pers印hin(PSPN)。GDNF家族配体通过受体传导信号，该受体由GPI连接的GFRa亚基和跨膜受体酪氨酸激酶RET组成。为了激活跨膜受体酪氨酸激酶Ret，每个GDNF家族神经营养因子优先地与糖基-磷脂酰肌醇(GPI) 连接的⑶NF家族a-受体(GFRal-4)之一结合。⑶NF为这样的蛋白，其可在神经胶质细胞中鉴定到或从神经胶质细胞中获得，且表现出神经营养活性。更具体地说，GDNF为这样的多巴胺能神经营养蛋白，其特征部分地在于其增加黑质多巴胺能神经元胚胎前体的多巴胺摄取的能力，并进一步在于其促进副交感和交感神经细胞生存的能力。本文公开的所有基因、基因名称和基因产物意图对应来自任何物种的同源物，对该物种而言本文公开的组合物和方法为适用的。因此，该术语包括但不限于来自人和小鼠的基因和基因产物。理解的是，当公开来自具体物种的基因或基因产物时，意图此公开仅为示范性的，并且除非其出现的文段中明确指示，否则不应理解为限制。因此，例如，对于本文公开的在一些实施方案中有关哺乳动物核酸和氨基酸序列的基因而言，意图包括来自其他动物(包括但不限于其他哺乳动物、鱼类、两栖动物、爬行动物和鸟类)的同源和/或直向同源基因和基因产物。在优选的实施方案中，所述基因或核酸序列为人的。定义本文所用的术语仅以描述具体的实施方案为目的而不意图限制本发明。除非文段另有明确指示，否则本文所用的单数形式“一”、“一个”和“所述”也意图包括复数形式。此夕卜，就术语“包括的”、“包括”、“具有的”、“具有”、“含有”或其变型在详述和/或权利要求中所用的程度而言，这类术语意图以类似于术语“包含”的方式是包括在内的。术语“约”或“大约”意为在由本领域普通技术人员所确定的具体值的可接受误差范围之内，这部分取决于该值是如何测定或确定的，即，测量系统的限制。例如，按照本领域的实践，“约”可意为在1之内或大于1的标准偏差。或者，“约”可意为高达给定值的20%， 优选10%，更优选5%，和还更优选1 %的范围。或者，具体地关于生物系统或过程，该术语可意为在值的数量级之内，优选在值的5倍之内，更优选在2倍之内。当本申请和权利要求描述具体值时，除非另作说明，否则应假设术语“约”意为在具体值的可接受误差范围之内。
本文所用的术语“mRNA”意为目前已知的靶定基因的mRNA转录物，以及任何可阐明的其它转录物。“反义寡核苷酸”或“反义化合物”意为与另一个RNA或DNA (靶RNA、DNA)结合的 RNA或DNA分子。例如，如果其为RNA寡核苷酸，则其通过RNA-RNA相互作用结合另一个RNA 靶标并改变靶RNA的活性(Eguchi等，(1991) Ann. Rev. Biochem. 60，631-652)。反义寡核苷酸可增量调节或减量调节特定多核苷酸的表达和/或功能。该定义意在包括从治疗、诊断或其他观点来看有用的任何外源RNA或DNA分子。这类分子包括例如反义RNA或DNA分子、 干扰RNA(RNAi)、微小RNA、诱饵RNA分子、siRNA、酶促RNA、治疗用编辑RNA(therapeutic editing RNA)以及激动剂和拮抗剂RNA、反义寡聚化合物、反义寡核苷酸、外部指导序列 (EGS)寡核苷酸、可变剪接物(alternate splicer)、引物、探针以及其他与靶核酸的至少一部分杂交的寡聚化合物。因此，可将这些化合物以单链、双链、部分单链或环状寡聚化合物的形式引入。在本发明的文段中，术语“寡核苷酸”是指核糖核酸(RNA)或脱氧核糖核酸(DNA) 或其模拟物的寡聚物或聚合物。术语“寡核苷酸”，也包括天然和/或经修饰单体或键 (linkage)的线性或环状寡聚体，包括脱氧核糖核苷、核糖核苷、其取代和α-异头物形式、 肽核酸(PNA)、锁定核酸(LNA)、硫代磷酸酯、甲基膦酸酯等。寡核苷酸能够通过单体与单体相互作用的规律模式(例如沃森-克里克(Watson-Crick)型破基配对、Ho6gsteen或反 Hoijgs^en型碱基配对等)特异地结合靶多核苷酸。寡核苷酸可为“嵌合的”，即，由不同的区组成。在本发明的文段中，“嵌合的”化合物为寡核苷酸，其包含两个或更多个化学区，例如，DNA区、RNA区、PNA区等。每个化学区由至少一个单体单元(即，在寡核苷酸化合物的情况下为核苷酸)组成。这些寡核苷酸典型地包含至少一个区，其中所述寡核苷酸为经修饰的以表现出一种或多种所需特性。寡核苷酸的所需特性包括但不限于，例如增强的对核酸酶降解的抗性、增强的细胞摄取和/或增强的对靶核酸的结合亲和力。因此寡核苷酸的不同区可具有不同的特性。本发明的嵌合寡核苷酸可形成为两种或更多种如上所述的寡核苷酸、修饰寡核苷酸、寡聚核苷和/或寡核苷酸类似物的混合结构。寡核苷酸可由可“全符合状态(in “register”)”地连接或通过间隔物连接的区组成，所述“全符合状态”地连接即此时单体像在天然DNA —样连续地连接。所述间隔物意在构成区之间的共价“桥”，并在优选的情况下具有不超过约100个碳原子的长度。所述间隔物可携带不同的功能性，例如具有正或负电荷的、具有特殊的核酸结合特性(嵌入剂、沟黏合剂、毒素、荧光团等)、为亲脂的、诱导特殊的二级结构如例如诱导α -螺旋的含丙氨酸的肽。本文所用的“DLK1”和“ δ样1同源物”包括所有家族成员、突变体、等位基因、片段、种类(species)、编码和非编码序列、有义和反义多核苷酸链等。本文所用的措词“δ 样 1 同源物”、DLKl、DLK、DLK-I、FAl、pG2、PREFl、Pref-I、蛋白S同源物1、Z0G在本申请中可交换地使用。本文所用的术语“对……特异的寡核苷酸”或“靶定……的寡核苷酸”是指具有以下序列的寡核苷酸，该序列(i)能够与靶定基因的一部分形成稳定的复合体，或(ii)能够与靶定基因的mRNA转录物的一部分形成稳定的双链体。复合体和双链体的稳定性可通过
9理论计算和/或体外测定来确定。用于确定杂交复合体和双链体的稳定性的示例性测定法描述于下文实施例中。本文所用的术语“靶核酸”包括DNA、从这类DNA转录的RNA (包括前mRNA和mRNA)， 以及从这类RNA衍生的cDNA、编码序列、非编码序列、有义或反义多核苷酸。寡聚化合物与其靶核酸的特异性杂交干扰核酸的正常功能。这种通过特异地与靶核酸杂交的化合物对该靶核酸功能的调节，一般称为“反义”。待干扰的DNA功能包括例如复制和转录。待干扰的 RNA功能，包括所有的生活机能，例如，RNA向蛋白质翻译位点的易位、蛋白质自RNA的翻译、 产生一种或多种mRNA种类的RNA剪接，以及可由RNA参与或促进的催化活性。对靶核酸功能的这类干扰的整体效果为对编码产物或寡核苷酸表达的调节。RNA干扰“RNAi ”由双链RNA (dsRNA)分子介导，该分子具有与其“靶”核酸序列的序列特异性同源性(Caplen，N. J.等，(2001) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 98 :9742-9747)。在本发明的某些实施方案中，介体为5-25个核苷酸的“小干扰”RNA双链体(siRNA)。siRNA通过称为切酶的 RNA 酶对 dsRNA 的加工得到(Bernstein, E.等，(2001) Nature 409:363-366)。 siRNA双链体产物被募集到叫做RISC(RNA诱导的沉默复合体)的多蛋白siRNA复合体中。 不希望受任何具体理论所约束，认为随后RISC被引向靶核酸(适当地为mRNA)，其中siRNA 双链体以序列特异性的方式相互作用来介导催化方式的切割(Bernstein，Ε.等，Q001) Nature 409 :363-366 ；Boutla，A.等，(2001)Curr. Biol. 11 :1776-1780)。可依照本发明使用的小干扰RNA，可根据本领域众所周知和普通技术人员熟悉的程序来合成和使用。用于本发明的方法中的小干扰RNA适当地包含约1-约50个核苷酸(nt)。在非限制性实施方案的实例中，siRNA可包含约5-约40nt、约5-约30nt、约10-约30nt、约15-约25nt、或约 20-25个核苷酸。适当寡核苷酸的挑选通过使用电脑程序来促进，该程序自动比对核酸序列并指出具有同一性或同源性的区。将这类程序用于比较通过例如搜索诸如GenBank等的数据库或通过测序PCR产物而获得的核酸序列。对来自一系列物种的核酸序列的比较，允许选择在物种之间显示适度同一性的核酸序列。在未测序基因的情况下，进行DNA印迹来确定在靶物种和其他物种的基因之间的同一性程度。如本领域众所周知的，通过在不同的严格程度下进行DNA印迹，可能获得同一性的近似衡量。这些程序允许选择以下寡核苷酸，其对待控制的受试者中的靶核酸序列表现出高度的互补性，并且对其他物种中的相应核酸序列表现出较低程度的互补性。本领域的技术人员将认识到，在挑选用于本发明的适当的基因区方面具有相当大的自由。“酶促 RNA，，意为具有酶促活性的 RNA 分子(Cech，(1988) J. American. Med. Assoc. 260, 3030-3035)。酶促核酸(核酶)通过首先结合靶RNA来起作用。这类结合通过酶促核酸的靶结合部分进行，所述靶结合部分保持紧密靠近进行切割靶RNA的分子的酶促部分。因此，酶促核酸首先识别而后通过碱基配对结合靶RNA，且一旦结合到正确的位点，即进行酶促切割靶RNA。“诱饵RNA”意为模拟配体的天然结合域的RNA分子。因此诱饵RNA与天然结合靶标竞争与特异性配体的结合。例如，已显示HIV反式激活应答(TAR)RNA的过表达可充当“诱饵”并有效地结合HIVtat蛋白，从而阻止其结合到在HIV RNA中编码的TAR序列(Sullenger 等，(1990)Cell，63，601-608)。这意指特定实例。本领域的技术人员将认识到，这只是一个
10实例，而其他的实施方案可使用本领域一般已知的技术容易地产生。本文所用的术语“单体”通常指以下单体，其通过磷酸二酯键或其类似物连接以形成大小范围从少量单体单元(例如从约3-4)到约数百个单体单元的寡核苷酸。磷酸二酯键的类似物包括硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、甲基膦酸酯、硒代磷酸酯、氨基磷酸酯等，如下文更充分地描述。术语“核苷酸”涵盖天然存在的核苷酸和非天然存在的核苷酸。本领域的技术人员应清楚的是，先前认为“非天然存在”的多种核苷酸后来已在自然中发现。因此，“核苷酸”不仅包括已知的含嘌呤和嘧啶杂环的分子，而且还包括其杂环类似物和互变异构体。其他类型的核苷酸的说明性实例为以下分子，其含有腺嘌呤、鸟嘌呤、胸腺嘧啶、胞嘧啶、尿嘧啶、嘌呤、黄嘌呤、二氨基嘌呤、8-氧代-N6-甲基腺嘌呤、7-脱氮杂黄嘌呤、7-脱氮杂鸟嘌呤、N4, N4-桥亚乙基胞嘧啶(ethanocytosin)、N6, N6-桥亚乙基_2，6_ 二氨基嘌呤、5-甲基胞嘧啶、5-(C3-C6)-炔基胞嘧啶、5-氟尿嘧啶、5-溴尿嘧啶、假异胞嘧啶、2-羟基-5-甲基-4-三唑并吡啶、异胞嘧啶、异鸟嘌呤、肌苷和在Bermer等美国专利第5，432，272号中描述的“非天然存在的”核苷酸。术语“核苷酸”意在涵盖这些实例以及其类似物和互变异构体中的每一个和全部。尤其令人关注的核苷酸为含腺嘌呤、鸟嘌呤、胸腺嘧啶、胞嘧啶和尿嘧啶的核苷酸，其被认为是有关人中的治疗和诊断应用的天然存在核苷酸。核苷酸包括天然 2，-脱氧和 2，-羟基糖，例如，如 Kornberg 和 Baker，DNA 复制(DNA Replication), H 2 版(Freeman，San Francisco, 1992)中所述的以及其类似物。提及核苷酸的“类似物”包括具有经修饰的碱基部分和/或经修饰的糖部分的合成核苷酸(参见例如，由Scheit，核苷酸类似物(Nucleotide Analogs), John Wiley, New York, 1980 ；Freier 禾口 Altmann， (1997)Nuc1. Acid. Res.，25(22)，4429—4443，Toulme, J. J. , (200l)Nature Biotechnology 19 :17-18 ；Manoharan Μ. , (1999)Biochemica et Biophysica Acta 1489 :117-139 ；Freier S. Μ. , (1997)Nucleic Acid Research,25 4429-4443,Uhlman,E. ， (2000)Drug Discovery & Development，3 :203-213,Herdewin P.， (2000) Antisense & Nucleic Acid Drug Dev. , 10 :297-310 —般描述的)；2，-0，3，-C-连接的[3.2.0] 二环阿糖核苷(参加例如 N. KChristiensen.等，(1998) J.Am. Chem. Soc., 120 :5458-5463 ；Prakash TP,Bhat B. (2007)Curr Top Med Chem. 7(7) :641-9 ；Cho EJ 等， (2009) Annual Review of Analytical Chemistry，2，24H64)。这类类似物包括设计以增强结合特性的合成核苷酸，所述结合特性为例如双链体或三链体稳定性、特异性等。本文所用的“杂交”意为寡聚化合物的基本上互补链的配对。一种配对的机理涉及寡聚化合物的链的互补核苷或核苷酸碱基(核苷酸)之间的氢键合，其可为沃森-克里克、Ho0gsteen或反Hodgsteen氢键合。例如，腺嘌呤和胸腺嘧啶为互补的核苷酸，其通过形成氢键配对。杂交可在各种环境下发生。反义化合物为“可特异地杂交的”，如果所述化合物与靶核酸的结合干扰靶核酸的正常功能而导致功能和/或活性的调节，并且在需要特异性结合的条件下存在足够程度的互补性来避免所述反义化合物与非靶核酸序列的非特异性结合，所述条件即在体内测定或治疗性处理情况中的生理条件下，以及其中在体外测定情况下进行测定的条件下。本文所用的短语“严格杂交条件”或“严格条件”是指以下条件，在该条件下本发明的化合物与其靶序列杂交，但与最少数量的其他序列杂交。严格条件为序列依赖的且在不同环境下将不同，在本发明的文段中，在其下寡聚化合物与靶序列杂交的“严格条件”由寡聚化合物的性质和组成以及正在其中研究它们的试验来确定。一般而言，严格杂交条件包括低浓度(< 0. 15M)的含有诸如Na++或K++等无机阳离子的盐(即，低离子强度)、温度高于20°C _25°C、低于寡聚化合物靶序列复合体的Tm，以及存在变性剂，例如甲酰胺、二甲基甲酰胺、二甲基亚砜，或去污剂十二烷基硫酸钠(SDS)。例如，杂交率对于每甲酰胺减少1.1%。高严格杂交条件的实例为0. IX氯化钠-柠檬酸钠缓冲液(SSC) /0. 1 % (w/v) SDS、60°C下达30分钟。本文所用的“互补的”是指在一条或两条寡聚链上两个核苷酸之间精确配对的能力。例如，如果在反义化合物的某个位置上的核碱基能够与在靶核酸的某个位置上的核碱基氢键合，所述靶核酸为DNA、RNA或寡核苷酸分子，则认为所述寡核苷酸和所述靶核酸之间氢键合的位置为互补位置。当可彼此氢键合的核苷酸占据了每个分子中足够数量的互补位置时，寡聚化合物和另外的DNA、RNA或寡核苷酸分子为彼此互补的。因此，“可特异性杂交的”和“互补的”为以下术语，其用于表示在足够数量的核苷酸上有足够程度的精确配对或互补性，使得稳定和特异的结合发生在寡聚化合物和靶核酸之间。据本领域了解，寡聚化合物的序列不需要与其可特异地杂交的靶核酸的序列 100%互补。此外，寡核苷酸可在一个或多个区段上杂交，使得间插或邻近的区段不涉及杂交事件(例如，环结构、错配或发夹结构)。本发明的寡聚化合物包含与其靶定的靶核酸序列内的靶区至少约70 %、或至少约75 %、或至少约80 %、或至少约85 %、或至少约90 %、或至少约95%、或至少约99%的序列互补性。例如，其中反义化合物的20个核苷酸中有18个与靶区互补且因而会特异地杂交的反义化合物，表示90%互补性。在此实例中，余下的非互补核苷酸可与互补核苷酸是聚簇或散布的且不需要彼此邻接或邻接互补核苷酸。因此，长度为18个核苷酸的反义化合物具有4(四)个非互补核苷酸，该非互补核苷酸位于与靶核酸完全互补的两个区的侧翼，所述反义化合物会具有与靶核酸77. 8%的总互补性，因此落入本发明的范围内。反义化合物与靶核酸区的互补性百分比可使用本领域已知的BLAST程序(基本局部比对搜索工具)和PowerBLAST程序常规地确定(Altschul等，(1990) J. Mol. Biol.，215，403-410 ;Zhang 和 Madden，(1997)Genome Res.，7，649-656)。同源性、序列同一性或互补性百分比可通过例如Gap程序(Wisconsin序列分析包，Unix操作系统版本8， Genetics Computer Group, University Research Park, Madison Wis.)使用默认设置来确定，该程序使用 Smith 和 Waterman 的算法(Adv. Appl. Math.，(1981) 2，482-489)。本文所用的术语“解链温度(Tm) ”是指以下温度，在限定的离子强度、pH和核酸浓度下，在该温度下平衡时50%与靶序列互补的寡核苷酸与靶序列杂交。典型地，对于短寡核苷酸(例如，10-50个核苷酸)而言严格条件为以下条件，其中盐浓度至少为约0.01-1. OM Na离子浓度(或其他盐)，pH 7. 0-8. 3且温度至少为约30°C。严格条件也可通过外加诸如甲酰胺等去稳定剂来达到。本文所用的“调节”意为在基因表达方面的增加(刺激)或减少(抑制)。术语“变体”，当用于多核苷酸序列的情况下时，可包括有关野生型基因的多核苷酸序列。此定义也可包括，例如，“等位基因的”、“剪接”、“物种”或“多态的”变体。剪接变体可具有与参比分子显著的同一性，但因为在mRNA加工期间外显子的可变剪接而通常具有更多或更少数量的多核苷酸。对应的多肽可具有附加的功能域或不存在域。物种变体为在不同物种之间不同的多核苷酸序列。本发明中尤其实用的是野生型基因产物的变体。变体可由核酸序列中的至少一个突变产生并可导致产生改变的mRNA或者其结构或功能可能改变或不变的多肽。任何给定的天然或重组基因可不具有、具有一个或许多等位基因形式。 产生变体的常见突变变化一般归因于核苷酸的自然缺失、添加或取代。这些变化类型中的每一个可单独或与其他类型联合发生，在给定序列中发生一次或多次。产生的多肽一般将具有相对于彼此的显著的氨基酸同一性。多态变体为在给定物种的个体之间特定基因的多核苷酸序列的变化。多态变体也可包括“单核苷酸多态性”(SNP)或单碱基突变，其中多核苷酸序列因一个碱基而不同。SNP的存在可指示例如具有疾病状态倾向(即与抗性相对的易感性)的某个种群。衍生多核苷酸包括经过化学修饰的核酸，例如用烷基、酰基或氨基置换氢。衍生物 (例如，衍生寡核苷酸)可包含非天然存在的部分，例如改变的糖部分或糖间键。这些中示例性的是硫代磷酸酯及本领域已知的其他含硫的种类。衍生核酸也可含有标记，包括放射性核苷酸、酶、荧光剂、化学发光剂、显色剂、底物、辅因子、抑制剂、磁性颗粒，等等。“衍生的”多肽或肽为经修饰的多肽或肽，例如，通过糖基化、聚乙二醇化、磷酸化作用、硫酸盐化作用、还原/烷基化、酰化、化学偶联或温性福尔马林处理。也可将衍生物修饰以含有可检测标记(直接地或间接地)，包括但不限于放射性同位素、荧光和酶标记。本文所用的术语“动物”或“患者”意在包括例如人、棉羊、麋鹿、鹿、长耳鹿、貂、哺乳动物、猴、马、牛、猪、山羊、狗、猫、大鼠、小鼠、鸟、鸡、爬行动物、鱼、昆虫和蜘蛛类。“哺乳动物”涵盖通常在医疗护理下的温血哺乳动物(例如，人和驯养动物)。实例包括猫科动物、犬、马、牛科动物和人，以及仅仅人。“处理”或“治疗”涵盖对哺乳动物中疾病状态的治疗，并包括(a)防止疾病状态出现于哺乳动物中，特别是当这类哺乳动物倾向于疾病状态但尚未诊断为患有该疾病状态时；(b)抑制疾病状态，例如，阻止其发展；和/或(c)减轻疾病状态，例如，引起疾病状态的退行直到达到所需的终末点。治疗也包括改善疾病的症状(例如，减少疼痛或不适)，其中这类改善可直接或可非直接地影响疾病(例如，原因、传递、表达等)。本文所用的“癌症”是指在哺乳动物中发现的所有类型的癌症或新生物或恶性肿瘤，包括但不限于白血病、淋巴瘤、黑素瘤、癌和肉瘤。癌症自身表现为包含癌症恶性细胞的“肿瘤”或组织。肿瘤的实例包括肉瘤和癌，例如但不限于纤维肉瘤、粘液肉瘤、脂肪肉瘤、软骨肉瘤、骨肉瘤、脊索瘤、血管肉瘤、内皮肉瘤、淋巴管肉瘤、淋巴管内皮肉瘤、滑膜瘤、间皮瘤、尤因氏瘤(Ewing' s tumor)、平滑肌肉瘤、横纹肌肉瘤、结肠癌、胰腺癌、乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌、鳞状细胞癌、基底细胞癌、腺癌、汗腺癌、皮脂腺癌、乳头状癌、乳头状腺癌、囊腺癌、髓样癌、支气管癌、肾细胞癌、肝细胞瘤、胆管癌、绒毛膜癌、精原细胞瘤、胚胎性癌、维尔姆斯氏肿瘤(Wilms' tumor)、子宫颈癌、睾丸肿瘤、肺癌、小细胞肺癌、膀胱癌、 上皮癌、神经胶质瘤、星形细胞瘤、髓母细胞瘤、颅咽管瘤、室管膜瘤、松果体瘤、成血管细胞瘤、听神经瘤、少突神经胶质瘤、脑膜瘤、黑素瘤、成神经细胞瘤和视网膜母细胞瘤。可通过依照本发明的公开组合物治疗的其它癌症，包括但不限于，例如，何杰金病、非何杰金淋巴瘤、多发性骨髓瘤、成神经细胞瘤、乳腺癌、卵巢癌、肺癌、横纹肌肉瘤、原发性血小板增多症、原发性巨球蛋白血症、小细胞肺肿瘤、原发性脑肿瘤、胃癌、结肠癌、恶性胰腺胰岛素瘤 (insulanoma)、恶性类癌、膀胱癌、恶化前皮肤病损、睾丸癌、淋巴瘤、甲状腺癌、成神经细胞瘤、食管癌、生殖泌尿道癌、恶性高钙血症、子宫颈癌、子宫内膜癌、肾上腺皮质癌和前列腺癌。 “神经疾病或病症”是指神经系统和/或视觉系统的任何疾病或病症。“神经疾病或病症”包括涉及中枢神经系统(脑、脑干和小脑)、周围神经系统(包括脑神经)和自主神经系统(其部分位于中枢和周围神经系统二者中)的疾病或病症。神经病症的实例包括但不限于，头痛、木僵和昏迷、痴呆、发作、睡眠障碍、创伤、感染、新生物、神经眼科学、运动障碍、脱髓鞘病、脊髓病症、以及周围神经、肌肉和神经肌肉接点的病症。成瘾和精神病也包含在神经病症的定义中，包括但不限于，双相性精神障碍和精神分裂症。以下为可使用依照本发明的组合物和方法治疗的数种神经障碍、症状、体征和综合征的清单获得性癫痫样失语症；急性播散性脑脊髓炎；肾上腺脑白质营养不良；年龄相关性黄斑变性；胼胝体发育不全；失认症；艾卡迪综合征；亚历山大病；阿尔珀斯病(Alpers’ disease)；交叉性偏瘫；血管性痴呆；肌萎缩侧索硬化；无脑畸形；Angelma综合征；血管瘤病；缺氧；失语症；失用症；蛛网膜囊肿；蛛网膜炎；阿-基氏脑畸形(Anronl-Chiari malformation)；动静脉畸形；阿斯佩各综合征；共济失调毛细血管扩张症(ataxia telegiectasia)；注意不集中的过度反应症；孤独症；自主神经功能障碍；背痛；巴滕病；贝切特病；贝尔氏麻痹；良性自发性睑痉挛；良性灶；肌萎缩；良性颅内高血压；宾斯旺格病；睑痉挛；Bloch Sulzberger 综合征；臂丛损伤；脑脓肿；脑损伤；脑肿瘤(包括多形性成胶质细胞瘤)；脊髓肿瘤；布朗-塞卡尔综合征；卡纳万病；腕管综合征；灼痛；中枢性疼痛综合征；脑桥中央髓鞘溶解； 头部病症(cephalic disorder)；脑动脉瘤；脑动脉硬化；脑萎缩；大脑性巨人症；大脑性瘫痪；夏-马-图病；化学疗法诱导的神经病和神经性疼痛；Chiari畸形；舞蹈症；慢性炎性脱髓鞘性多神经病；慢性痛；慢性区域性疼痛综合征；科-勒综合征；昏迷，包括持续性植物状态；先天性面瘫；皮质基底节变性；颅动脉炎；颅缝早闭；克雅病；累积性创伤障碍 (cumulative trauma disorder)；库兴综合征(Cushing' s syndrome)；巨细胞包涵体病； 巨细胞病毒感染；舞蹈眼-舞蹈脚综合征；丹-沃(DandyWalker)综合征；Dawson病；德摩西埃综合征；Dejerine-Klumke麻痹；痴呆；皮肌炎；糖尿病神经病变；弥漫性硬化；自主神经功能异常；书写困难；诵读困难；张力失常；早期幼儿癫痫性脑病；空蝶鞍综合征；脑炎； 脑膨出；脑三叉神经血管瘤病；癫痫；欧勃麻痹；特发性震颤；法布里病；法尔综合征；昏厥；家族性痉挛性瘫痪；热性癫痫发作；费希尔综合征；弗里德赖希共济失调；额颞痴呆和其它“tau蛋白病变(tauopathies)”;高歇病；格斯特曼综合征；巨细胞动脉炎；巨细胞性包涵体病；球样细胞脑白质营养不良；格-巴综合征；HTLV-I相关性脊髓病；哈-斯病；颅脑损伤；头痛；偏侧面肌痉挛；遗传性痉挛性截瘫；多神经炎型遗传性共济失调；耳部带状疱疹；带状疱疹；Hirayama综合征；HIV相关性痴呆和神经病(还是AIDS的神经表现)；前脑无裂畸形；亨廷顿舞蹈病和其它聚谷氨酰胺重复疾病(polyglutamine repeat disease)； 积水性无脑畸形；脑积水；皮质醇增多症；缺氧；免疫介导的脑脊髓炎；包涵体肌炎；色素失调症；婴儿植烷酸贮积病；婴儿雷夫叙姆病；婴儿性痉挛；炎性肌病；颅内囊肿；颅内高血压Joubert综合征；基-塞(Keams-^iyre)综合征；肯尼迪病Kinsboum综合征；克-费 (Klippel Feil)综合征；克拉伯病；库-韦病；库鲁病；拉福拉病；朗-爱(Lambert-Eaton) 肌无力综合征；Landau-Kleffner综合征；侧髓(瓦伦伯格)综合征；学习无能；利氏病； Lermox-Gustaut综合征；累-奈综合征；脑白质营养不良；路易(Lewy)体痴呆；无脑回；闭锁综合征；Lou Gehrig病(即，运动神经元病或肌萎缩侧索硬化)；椎间盘疾病；莱姆病-神经后遗症；马-约病；巨脑(macrenc印haly)；巨脑(megalenc印haly)；梅-罗综合征；美尼尔症；脑膜炎；门克斯病；异染性脑白质营养不良；小头畸形；偏头痛；米勒费希尔综合征；小中风(mini-stroke)；线粒体肌病；默比厄斯综合征；单肢肌萎缩；运动神经元病；脑底异常血管网病；粘多糖症；多发性梗塞性痴呆(milti-infarct dementia)； 多病灶运动神经病；多发性硬化和其它脱髓鞘病症；多系统萎缩伴随直立性低血压；P肌肉萎缩症；重症肌无力；髓鞘脱失(myelinoclastic)弥漫性硬化；婴儿肌阵挛性脑病；肌阵挛；肌病；先天性肌强直；发作性睡病；神经纤维瘤病；神经阻滞剂恶性综合征；AIDS的神经表现；狼疮的神经后遗症；神经性肌强直；神经元腊样脂褐质症；神经元迁移障碍；尼曼-皮克病；0’ Sullivan-McLeod综合征；枕神经痛；隐性脊柱神经管闭合不全序列征 ’大田原(Ohtahara)综合征；橄榄体脑桥小脑萎缩；视性眼肌阵痉挛；视神经炎；直立性低血压；过度使用综合征；感觉异常；神经变性疾病或病症(帕金森病、亨廷顿舞蹈病、阿尔茨海默氏病、肌萎缩侧索硬化(ALS)、痴呆、多发性硬化以及其它和神经元细胞死亡有关的疾病和病症)；先天性副肌强直；类肿瘤性疾病；发作性发作(paroxysmal attacks)；帕-罗 (Parry Romberg)综合征；佩-梅病；周期性瘫痪；周围神经病；疼痛性神经病和神经性疼痛；持续性植物状态；全身性发育迟缓；感光性喷嚏反射；植烷酸贮积病；皮克病；神经挟捏；垂体瘤；多肌炎；脑穿通畸形；小儿麻痹症后期综合征；疱疹后神经痛；感染后脑脊髓炎；直立性低血压；普-韦(feider-Willi)综合征；原发性侧索硬化；朊病毒病；进行性一侧面萎缩；进行性多灶性白质脑病；进行性硬化性灰质萎缩；进行性核上性麻痹；脑假瘤； 拉姆齐·亨特综合征(I型和11型)；拉斯马森(Rasmussen)脑炎；反射性交感神经营养不良综合征；雷夫叙姆病；反复性运动障碍；反复性应激损伤；腿多动综合征；反转录病毒相关性脊髓病；雷特综合征；雷耶综合征；舞蹈病；桑德霍夫病；谢耳德病；脑裂；中隔-视神经发育不良(s印to-optic dysplasia)；惊吓婴儿综合征；带状疱疹；希-德综合征；斯耶格伦综合征；睡眠性呼吸暂停；索托斯综合征(Soto' s syndrome)；痉挛状态；脊柱裂； 脊髓损伤；脊髓瘤；脊髓性肌萎缩；僵人综合征(Stiff-Person syndrome)；中风；斯-韦综合征；亚急性硬化性全脑炎；皮层下动脉硬化性脑病；西德纳姆舞蹈病；晕厥；脊髓空洞症；迟发性运动障碍；泰-萨克斯病；颞动脉炎；脊髓栓系综合征(tethered spinal cord syndrome)；肌强直性白内障；胸廓出口综合征；三叉神经痛；Todd麻痹；图雷特综合症；短暂性脑缺血发作；传染性海绵状脑病；横贯性脊髓炎；外伤性脑损伤；震颤；三叉神经痛； 热带痉挛性轻截瘫；结节性硬化症；血管性痴呆(多发梗塞性痴呆)；血管炎，包括颞动脉炎；希-林(Von Hippel-Lindau)病；瓦伦伯格综合征；韦-霍(Werdnig-Hoffman)病；韦斯特综合征；急性颈部扭伤(whiplash)；威廉斯综合征；Wildon病；以及泽尔韦格综合征。
“炎症”是指全身性炎性病况以及局部地与单核细胞、白细胞和/或中性粒细胞的迁移和吸引有关的病况。炎症的实例包括但不限于，因以下引发的炎症感染致病生物(包括革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌、病毒、真菌、以及寄生物，例如原生动物和蠕虫)、移植排斥 (包括实质器官的排斥，例如肾、肝、心、肺或角膜，以及骨髓移植的排斥，包括移植物抗宿主病(GVHD))或者局限性慢性或急性自身免疫反应或变态反应。自身免疫性疾病包括急性肾小球肾炎；类风湿性或反应性关节炎；慢性肾小球肾炎；炎性肠病，例如克罗恩氏病、溃疡性结肠炎和坏死性小肠结肠炎；与粒细胞输注有关的综合征；炎性皮肤病，例如接触性皮炎、特应性皮炎、银屑病；系统性红斑狼疮(SLE)；自身免疫性甲状腺炎、多发性硬化、以及糖尿病的某些形式、或任何其它自体免疫状态(其中受试者自身免疫系统的攻击导致病理性组织破坏)。变态反应包括变应性哮喘、慢性支气管炎、急性和迟发型超敏反应。全身性炎性疾病状态包括与创伤、烧伤、缺血事件后的再灌注(例如在心、脑、肠或外周脉管系统中的血栓形成事件，包括心肌梗死和中风)、脓毒症、ARDS或多器官功能障碍综合征相关的炎症。炎性细胞募集也在粥样硬化斑块中发生。炎症包括但不限于，非何杰金淋巴瘤、韦格纳肉芽肿病、桥本甲状腺炎、肝细胞癌、胸腺萎缩、慢性胰腺炎、类风湿性关节炎、反应性淋巴样增生、骨关节炎、溃疡性结肠炎、乳头状癌、克罗恩氏病、溃疡性结肠炎、急性胆囊炎、慢性胆囊炎、肝硬化、慢性涎腺炎、腹膜炎、急性胰腺炎、慢性胰腺炎、慢性胃炎、子宫肌腺病、 子宫内膜异位、急性子宫颈炎、慢性子宫颈炎、淋巴样增生、多发性硬化、继发于特发性血小板减少性紫癜的肥大、原发性IgA肾病、系统性红斑狼疮、银屑病、肺气肿、慢性肾盂肾炎、 以及慢性膀胱炎。内分泌疾病或病症包括肾上腺、乳腺、生殖腺、胰腺、甲状旁腺、垂体、甲状腺的病症；侏儒症等。肾上腺病症包括但不限于，阿狄森病、多毛症(hirutism)、癌症、多发性内分泌瘤病、先天性肾上腺增生、以及嗜铬细胞瘤。乳腺病症包括但不限于，乳腺癌、纤维囊性乳房疾病、以及男子乳腺发育。生殖腺病症包括但不限于，先天性肾上腺增生、多囊卵巢综合征、以及特纳综合征。胰腺病症包括但不限于，糖尿病(I型和II型)、低血糖症、以及胰岛素抵抗。甲状旁腺病症包括但不限于，甲状旁腺功能亢进、以及甲状旁腺功能减退。垂体病症包括但不限于，肢端肥大症、库兴综合征、尿崩症、空蝶鞍综合征、垂体功能减退、以及催乳素瘤。甲状腺疾病包括但不限于，癌症、甲状腺肿、甲状腺机能亢进、甲状腺机能减退、 小瘤、甲状腺炎、以及威尔逊综合征。神经内分泌病症的实例包括但不限于，与激素失调有关的抑郁和焦虑性障碍、月经性癫痫、绝经、月经性偏头痛、生殖内分泌病症、胃肠道病症， 例如，肠内分泌肿瘤，包括类癌、胃泌素瘤、以及生长抑素瘤、失弛缓症和先天性巨结肠。在一些实施方案中，内分泌和神经内分泌病症包括结节性增生、桥本甲状腺炎、胰岛细胞瘤、 以及乳头状癌。儿童的内分泌和神经内分泌疾病或病症包括生长障碍和尿崩症的内分泌病况。可观察到生长延迟伴随脑垂体的先天性异位位置或不发育/发育不全，如在前脑无裂畸形中，中隔-视神经发育不良和基底脑膨出。后天性病况，例如颅咽管瘤、视/下丘脑神经胶质瘤可伴随临床的身材矮小症和间脑综合征出现。性早熟和生长过度可能见于以下病况蛛网膜囊肿、脑积水、下丘脑错构瘤和生殖细胞瘤。垂体腺瘤分泌过多生长激素和促肾上腺皮质激素可导致儿童的病理性高身材和躯干性肥胖。尿崩症可继发于浸润过程，例如组织细胞增多症的朗格汉斯细胞、结核病、生殖细胞瘤、垂体茎的外伤/外科手术后损伤和缺氧缺血性脑病。心血管疾病或病症包括可引起缺血或者由心脏的再灌注引发的那些病症。实例包括但不限于，动脉粥样硬化、冠状动脉疾病、肉芽肿性心肌炎、慢性心肌炎(非肉芽肿性)、 原发性肥大性心肌病、外周动脉病(PAD)、中风、心绞痛、心肌梗死、由心搏停止引发的心血管组织损伤、由心脏转流引发的心血管组织损伤、心源性休克，以及相关的病况，所述病况会是本领域普通技术人员已知的，或涉及心脏或脉管系统的机能障碍或组织损伤，特别是但不限于，与DLKl激活有关的组织损伤。CVS疾病包括但不限于，动脉粥样硬化、肉芽肿性心肌炎、心肌梗死、继发于瓣膜性心脏病的心肌纤维化、无梗死形成的心肌纤维化、原发性肥大性心肌病、以及慢性心肌炎(非肉芽肿性)。多核苷酸和寡核苷酸组合物和分子靶标在一个实施方案中，靶标包括δ样1同源物(DLKl)的核酸序列，包括但不限于与DLKl有关的有义和/或反义非编码和/或编码序列。δ样同源物1 (DLK1 ；也称为携带双亮氨酸拉链的激酶1)，其为具有数个交替剪接同种型的亲代印记基因，是胎儿发育和出生后发育的重要调节剂。DLKl表达和/或功能的调节在神经再生中有效。例如，受损神经元的再生可恢复功能，但大多数神经元再生差或根本不再生。再生失败在某些情况下是由于缺乏细胞内在再生途径的激活。可将这些途径针对治疗开发靶定，所述治疗可恢复损伤或疾病之后的神经元功能。DLKl促分裂原活化蛋白(MAP)激酶途径对秀丽隐杆线虫(Caenorhabditis elegans)运动神经元中的再生为必要的。丧失此途径消除再生，而将其激活则促进再生。 此外，这些蛋白也调节生长锥迁移的后续步骤。因此，轴突损伤之后，需要激活此MAP激酶级联以使成熟神经元从再生障碍状态转变为能够生长的状态。此多核苷酸的调节在治疗与δ样同源物1 (DLKl)表达和/或功能有关的疾病或病症中为重要的。可用由使用反义化合物获得的干细胞再生的细胞/组织治疗的示例性δ 样1同源物(DLKl)介导的疾病和病症包括神经疾病或病症、神经变性疾病或病症、癌症、 与受损神经修复和/或神经再生有关的疾病或病症；麻痹、与受损神经内分泌分化有关的疾病或病症、母体起源的单亲二体(14号染色体)、父体起源的单亲二体(14号染色体)、心血管疾病或病症、肥胖症、与脂肪形成有关的疾病或病症、与增加的血清脂质代谢产物有关的疾病或病症、与生长激素表达有关的疾病或病症(例如，生长迟缓等)、睑裂狭小、骨骼畸形、糖尿病、炎症、与受损的免疫应答有关的疾病或病症、内分泌疾病或病症、与受损的血细胞生成有关的疾病或病症、以及与受损的干细胞分化有关的疾病或病症。作为治疗神经病症的实例，通过反义化合物在患者中调节DLKl表达和功能，治疗罹患例如帕金森病的这类患者。还考虑将所述化合物用于防止患者处于形成疾病如帕金森病、阿尔茨海默氏病、其它神经疾病或病症、神经麻痹和损伤、癌症等等的风险中。在一个优选的实施方案中，在细胞或患者中调节DLKl减少和修复神经损害和神经麻痹。在一个优选的实施方案中，调节DLKl防止患者处于形成神经病症的风险中和/或治疗已形成神经病症的患者。在另一个优选的实施方案中，调节DLKl防止患者处于形成肿瘤的风险中或治疗已患肿瘤的患者。在另一个优选的实施方案中，调节DLKl调节细胞存活、神经突生长、细胞分化和细胞迁移。在一个优选的实施方案中，DLKl多核苷酸通过反义寡核苷酸调节。在一个优选的实施方案中，通过反义寡核苷酸增量调节DLKl多核苷酸的表达和/ 或功能，所述反义寡核苷酸靶定反义和有义多核苷酸。在一个优选的实施方案中，通过反义寡核苷酸减量调节DLKl多核苷酸的表达和/ 或功能，所述反义寡核苷酸靶定反义和有义多核苷酸。在一个优选的实施方案中，寡核苷酸对于DLKl的多核苷酸(其包括但不限于非编码区)而言为特异的。DLKl靶标包括DLKl的变体；DLKl的突变体，包括SNP ；DLKl的非编码序列；等位基因、片段等。优选所述寡核苷酸为反义RNA分子。依照本发明的实施方案，靶核酸分子不单独限于DLKl多核苷酸，而是扩展到DLKl 的任何同种型、受体、同源物、非编码区等。在另一个优选的实施方案中，寡核苷酸靶定DLKl靶标的天然反义序列(针对编码和非编码区的天然反义物)，所述DLKl靶标包括但不限于其变体、等位基因、同源物、突变体、衍生物、片段和互补序列。优选所述寡核苷酸为反义RNA或DNA分子。在另一个优选的实施方案中，本发明的寡聚化合物也包括变体，其中在所述化合物的一个或多个核苷酸位置上存在不同的碱基。例如，如果第一个核苷酸为腺嘌呤，则可产生在此位置含有胸苷、鸟苷、胞苷或其他天然或非天然核苷酸的变体。这可在所述反义化合物的任何位置上完成。然后使用本文所述的方法来检测这些化合物以确定其抑制靶核酸的表达的能力。在一些实施方案中，反义化合物与靶标之间的同源性、序列同一性或互补性为约 50%-约60%。在一些实施方案中，同源性、序列同一性或互补性为约60% -约70%。在一些实施方案中，同源性、序列同一性或互补性为约70% -约80%。在一些实施方案中，同源性、序列同一性或互补性为约80% -约90%。在一些实施方案中，同源性、序列同一性或互补性为约90%、约92%、约94%、约95%、约96%、约97%、约98%、约99%或约100%。反义化合物在以下情况时为可特异性杂交的所述化合物与靶核酸的结合干扰靶核酸的正常功能而引起活性损失，并且在需要特异性结合的条件下存在足够程度的互补性以避免所述反义化合物与非靶核酸序列的非特异性结合。这类条件包括，即，在体内测定或治疗性处理情况中的生理条件，以及其中在体外测定情况下进行测定的条件。反义化合物，不论DNA、RNA、嵌合的、取代的等等，在以下情况时为可特异性杂交的所述化合物与靶DNA或RNA分子的结合干扰靶DNA或RNA的正常功能而引起效用损失， 并且在需要特异性结合的条件下存在足够程度的互补性以避免所述反义化合物与非靶序列的非特异性结合，所述条件即在体内测定或治疗性处理情况中的生理条件下，以及在体外测定情况下在其中进行测定的条件下。在另一个优选的实施方案中，靶定DLKl调节DLKl的表达或功能，DLKl包括但不限于使用例如PCR、杂交等鉴定和扩增的反义序列、一个或多个如SEQ ID NO :3所述的序列， 等等。在一个实施方案中，表达或功能与对照相比为增量调节的。在另一个优选的实施方案中，表达或功能与对照相比为减量调节的。在另一个优选的实施方案中，寡核苷酸包括如SEQ ID NO :4_5所述的核酸序列，包括使用例如PCR、杂交等鉴定和扩增的反义序列。这些寡核苷酸可包含一个或多个经修饰的核苷酸、较短或较长的片段、经修饰的键等。经修饰的键或核苷酸间键的实例包括硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯等。在另一个优选的实施方案中，所述核苷酸包括磷衍生物。可连接到本发明的修饰寡核苷酸中的糖或糖类似物部分的磷衍生物(或经修饰的磷酸基)，可为单磷酸酯、二磷酸酯、三磷酸酯、烷基磷酸酯、链烷磷酸酯、硫代磷酸酯等。上述磷酸酯类似物的制备，以及它们掺入到核苷酸、修饰核苷酸和寡核苷酸中本身也为已知的且无需在此描述。反义物的特异性和灵敏性也被本领域的技术人员掌握用于治疗用途。已将反义寡核苷酸用作在动物和人的疾病状态治疗中的治疗部分。已将反义寡核苷酸安全和有效地施用给人，并且目前正在进行许多临床试验。因此已确定寡核苷酸可为有用的治疗形式，其可将经配置以在用于治疗细胞、组织和动物尤其人的治疗方案中有用。在本发明的实施方案中，寡聚反义化合物(具体地寡核苷酸)结合到靶核酸分子并调节由靶基因编码的分子的表达和/或功能。待干扰的DNA功能包括例如复制和转录。 待干扰的RNA功能包括所有的生活机能，例如RNA向蛋白质翻译位点的易位、蛋白质自RNA 的翻译、产生一种或多种mRNA种类的RNA剪接，以及可由RNA参与或促进的催化活性。所述功能可被增量调节或受抑制，这取决于所需的功能。反义化合物包括反义寡聚化合物、反义寡核苷酸、外部指导序列(EGQ寡核苷酸、 可变剪接物、引物、探针和与靶核酸的至少一部分杂交的其他寡聚化合物。因此，这些化合物可以单链、双链、部分单链或环状寡聚化合物的形式引入。在本发明的情况下，将反义化合物靶定到特定的核酸分子可为多步过程。所述过程通常以鉴定待调节其功能的靶核酸开始。此靶核酸可为，例如其表达与特定病症或疾病状态有关的细胞基因(或从基因转录的mRNA)，或来自传染剂的核酸分子。在本发明中，所述靶核酸编码δ样1同源物(DLKl)。靶定过程通常也包括确定靶核酸内的至少一个靶区、区段或位点以用于发生反义相互作用，使得产生所需的效应，例如，表达的调节。在本发明的文段中，术语“区”定义为具有至少一个可识别结构、功能或特征的靶核酸的一部分。靶核酸区内为区段。“区段”定义为在靶核酸内区的较小或亚部分。本发明所用的“位点”定义为靶核酸内的位置。在一个优选的实施方案中，反义寡核苷酸结合到δ样1同源物(DLKl)的天然反义序列并调节δ样1同源物(DLKl) (SEQ ID NO=D的表达和/或功能。反义序列的实例包括 SEQ ID NO 3-5 ο在另一个优选的实施方案中，反义寡核苷酸结合到δ样1同源物(DLKl)多核苷酸的一个或多个区段并调节δ样1同源物(DLKl)的表达和/或功能。所述区段包含δ 样1同源物(DLKl)有义或反义多核苷酸的至少五个连续的核苷酸。在另一个优选的实施方案中，反义寡核苷酸对δ样1同源物(DLKl)的天然反义序列而言为特异的，其中所述寡核苷酸与δ样1同源物(DLKl)的天然反义序列的结合调节S样1同源物(DLKl)的表达和/或功能。在另一个优选的实施方案中，寡核苷酸化合物包括如SEQ ID NO :4-5所述的序列、 使用例如PCR、杂交等鉴定和扩增的反义序列。这些寡核苷酸可包含一个或多个修饰核苷酸、较短或较长的片段、经修饰的键等。经修饰的键或核苷酸间键的实例包括硫代磷酸酯、 二硫代磷酸酯等。在另一个优选的实施方案中，所述核苷酸包括磷衍生物。可连接到本发明的修饰寡核苷酸中的糖或糖类似物部分的磷衍生物(或经修饰的磷酸基)，可为单磷酸酯、二磷酸酯、三磷酸酯、烷基磷酸酯、链烷磷酸酯、硫代磷酸酯等。上述磷酸酯类似物的制备，以及它们掺入到核苷酸、修饰核苷酸和寡核苷酸中本身也为已知的且无需在此描述。由于如本领域已知，翻译起始密码子通常为5' -AUG(在转录的mRNA分子中；在相应的DNA分子中为5' -ATG)，因而翻译起始密码子也称为“AUG密码子”、“起始密码子” 或“AUG起始密码子”。少数基因具有翻译起始密码子，其具有RNA序列5' -GUG、5' -UUG 或5' -CUG ；以及5' -AUA、5' -ACG和5' -CUG已显示在体内起作用。因此，术语“翻译起始密码子”和“起始密码子”可包括许多密码子序列，但在每个情况下起始氨基酸通常为甲硫氨酸(在真核生物中)或甲酰甲硫氨酸(在原核生物中)。真核和原核基因可具有两个或更多个备选起始密码子，其中的任何一个可优先地用于在特定细胞类型或组织中或在特定条件组下的翻译起始。在本发明的文段中，“起始密码子”和“翻译起始密码子”是指这样的一个或多个密码子，其在体内用于起始由编码δ样1同源物(DLKl)的基因转录的 mRNA的翻译，与这类密码子的一个或多个序列无关。基因的翻译终止密码子(或“终止密码子”)可具有三个序列中的一个，即，5 ‘ -UAA、5 ‘ -UAG和5 ‘ -UGA (对应的DNA序列分别为 5 ‘ -TAA、5 ‘ -TAG 和 5 ‘ -TGA)。术语“起始密码子区”和“翻译起始密码子区”是指从翻译起始密码子开始在任一方向上(即，5’或3’)包含约25-约50个连续的核苷酸的这类mRNA或基因的部分。类似地，术语“终止密码子区”和“翻译终止密码子区”是指从翻译终止密码子开始在任一方向上 (即，5’或3’)包含约25-约50个连续的核苷酸的这类mRNA或基因的部分。因此，“起始密码子区”(或“翻译起始密码子区”)和“终止密码子区”(或“翻译终止密码子区”)均为可用本发明的反义化合物有效地靶定的区。本领域已知的可读框(ORF)或“编码区”是指在翻译起始密码子和翻译终止密码子之间的区，也为可有效地靶定的区。在本发明的内容内，靶定的区为包含基因的可读框 (ORF)的翻译起始或终止密码子的基因内区。另一种靶区包括本领域已知的5’非翻译区(5’UTR)，是指在翻译起始密码子的5’ 方向上的mRNA的部分，因此包括在mRNA的5’加帽位点和翻译起始密码子之间的核苷酸 (或基因上对应的核苷酸)。再一种靶区包括本领域已知的3’非翻译区(3' UTR)，是指在翻译终止密码子3’方向上的mRNA的部分，因此包括在mRNA的翻译终止密码子和3’末端之间的核苷酸(或基因上对应的核苷酸)。mRNA的5’加帽位点包含经由5’ -5’三磷酸酯键连接到mRNA的5’最末端残基的N7-甲基化鸟苷残基。认为mRNA的5’帽区包括5’帽子结构本身以及邻近该加帽位点的前50个核苷酸。用于本发明的另一种靶区为5’帽区。尽管一些真核mRNA转录物为直接翻译的，但是许多包含一个或多个称为“内含子”的区，其在翻译前被从转录物中切除。余下的(且因此翻译的)区称为“外显子”，并将其剪接在一起形成连续的mRNA序列。在一个实施方案中，靶定剪接位点(即，内含子-外显子连接处或外显子-内含子连接处)在疾病牵涉异常剪接或疾病牵涉特定剪接产物过度产生的状况中特别有用。因重排或缺失所致的异常融合连接处为靶位点的另一个实施方案。 经由来自不同基因来源的两个(或更多个)mRNA的剪接过程产生的mRNA转录物称为“融合转录物”。内含子可使用靶定到例如DNA或前-mRNA的反义化合物来有效地靶定。在另一个优选的实施方案中，反义寡核苷酸结合到靶多核苷酸的编码和/或非编码区并调节靶分子的表达和/或功能。在另一个优选的实施方案中，反义寡核苷酸结合到天然反义多核苷酸并调节靶分子的表达和/或功能。在另一个优选的实施方案中，反义寡核苷酸结合到有义多核苷酸并调节靶分子的表达和/或功能。可变RNA转录物可产生自DNA的相同基因组区。这些可变转录物一般称为“变体”。 更具体地，“前mRNA变体”为产生自相同的基因组DNA的转录物，其与产生自相同的基因组 DNA的其他转录物在其起始或终止位置上不同且包含内含子和外显子序列二者。
当剪接期间切除了一个或多个外显子或内含子区、或其部分时，前mRNA变体产生更小的“mRNA变体”。因此，mRNA变体为经加工的前mRNA变体，并且由于剪接所致，每种独特的前mRNA变体必须总是产生独特的mRNA变体。这些mRNA变体也称为“可变剪接变体”。 如果未发生前mRNA变体的剪接，则前mRNA变体与mRNA变体完全相同。
变体可通过使用可变信号启动或终止转录来产生。前mRNA和mRNA可具有多于一个起始密码子或终止密码子。起源于使用可变起始密码子的前mRNA或mRNA的变体称为该前mRNA或mRNA的“可变起始变体”。使用可变终止密码子的转录物称为该前mRNA或mRNA 的“可变终止变体”。可变终止变体的一个具体类型为“聚腺苷酸变体”，其中所产生的多重转录物起因于转录机构对其中一种“聚腺苷酸终止信号”的可变选择，从而产生终止在独特的聚腺苷酸位点上的转录物。在本发明的文段内，本文所述的变体类型也为靶核酸的实施方案。
将反义化合物与之杂交的靶核酸上的位置定义为活性反义化合物靶定的靶区的至少5个核苷酸长的部分。
虽然将某些示例性靶区段的具体序列列举于此，但是本领域的技术人员会认识到，这些用于说明和描述在本发明范围内的具体实施方案。根据本公开内容，其他靶区段可由本领域普通技术人员容易地鉴定。
认为以下靶区段同样适合靶定，该靶区段长度为5-100个核苷酸并包含选自说明性的优选靶区段之内的至少五( 个连续核苷酸段。
靶区段可包括DNA或RNA序列，其包含来自说明性优选靶区段之一的5’末端的至少5个连续核苷酸(余下的核苷酸为相同DNA或RNA的连续段，其开始于靶区段5’末端的紧接上游且持续到该DNA或RNA包含约5-约100个核苷酸为止)。类似优选的靶区段由以下DNA或RNA序列表示，该序列包含来自说明性优选靶区段之一的3’末端的至少5个连续核苷酸(余下的核苷酸为相同DNA或RNA的连续段，其开始于靶区段3’末端的紧接下游且持续到该DNA或RNA包含约5-约100个核苷酸为止)。本领域技术人员根据本文所说明的靶区段，无需过度试验就能够鉴定进一步优选的靶区段。
一旦鉴定一个或多个靶区、区段或位点，就选出与该靶足够互补的反义化合物，所述足够互补即充分良好且具有足够的特异性地杂交以得到所需的效果。
在本发明的实施方案中，寡核苷酸与特定靶标的反义链结合。所述寡核苷酸长度为至少5个核苷酸且可为合成的，使得每个寡核苷酸靶定重叠的序列，由此将寡核苷酸合成为覆盖靶多核苷酸的全长。靶标也包括编码区以及非编码区。
在一个实施方案中，优选通过反义寡核苷酸来靶定特定核酸。将反义化合物靶定到特定核酸为多步过程。该过程通常开始于鉴定其功能待调节的核酸序列。这可为，例如其表达与特定的病症或疾病状态有关的细胞基因(或从该基因转录的mRNA)，或非编码多核苷酸，例如非编码RNA(ncRNA)。
可将RNA归类为(1)信使RNA(mRNA)，其被翻译成蛋白，和(2)非编码蛋白的 RNA(ncRNA)。ncRNA包括微小RNA、反义转录物和包含高密度的终止密码子并缺少任何广泛的“可读框”的其他转录单元(TU)。许多ncRNA似乎开始于蛋白编码基因座的3’非翻译区 (3 ‘ UTR)中的起始位点。ncRNA常常为罕见的且至少一半已由FANTOM协会测序的ncRNA 似乎未聚腺苷酸化。大多数研究者因为明显的原因而关注经加工并输出到细胞质的聚腺苷21酸化mRNA。近来，已显示非聚腺苷酸化核RNA的群体可非常巨大，且许多这类转录物产生于所谓的基因内区(Cheng, J.等，(2005) Science 308 (5725), 1149-1154 ；Kapranov,P.等， (2005). Genome Res 15 (7)，987-997)。ncRNA调节基因表达的机制可为通过与靶转录物的碱基配对。通过碱基配对起作用的RNA可分组成(1)顺式编码RNA，其在相同的基因位置、 但在其所作用的RNA相反的链上编码，因此显示对其靶标完美的互补性，和( 反式编码 RNA，其在与其所作用的RNA不同的染色体位置上编码，一般不表现出与其靶标完美的碱基配对潜能。
不希望受到理论的约束，通过本文所述的反义寡核苷酸来扰乱反义多核苷酸，可改变相应有义信使RNA的表达。然而，此调节可为不一致的(反义敲减导致信使RNA上升) 或一致的(反义敲减导致伴随的信使RNA下降)。在这些情况下，可将反义寡核苷酸靶定到反义转录物的重叠或非重叠部分，引起其敲减或隔离。编码以及非编码反义物可以相同的方式来靶定，并且任一种类别均能够调节相应有义转录物——以一致或不一致的方式。用于鉴定针对靶标使用的新寡核苷酸的策略可基于通过反义寡核苷酸或任何其他调节所需靶标的方法来敲减反义RNA转录物。
策略1 在不一致调节的情况下，敲减所述反义转录物提升常规(有义)基因的表达。若后者基因编码已知或假定的药物靶标，则其反义配对物的敲减可预料到地模拟受体激动剂或酶刺激剂的作用。
策略2 在一致调节的情况下，可伴随地敲减反义和有义转录物两者，从而达到常规(有义)基因表达的协同下降。如果例如将反义寡核苷酸用于进行敲减，则此策略可用于应用针对有义转录物靶定的一种反义寡核苷酸和针对相应反义转录物的另一种反义寡核苷酸，或同时靶定重叠的有义和反义转录物的单个有力对称的反义寡核苷酸。
根据本发明，反义化合物包括反义寡核苷酸、核酶、外部指导序列(EGQ寡核苷酸、siRNA化合物、单链或双链RNA干扰(RNAi)化合物(例如siRNA化合物)，以及与靶核酸的至少一部分杂交且调节其功能的其他寡聚化合物。因此，其可为DNA、RNA、DNA样、RNA 样、或其混合物，或可为这些中的一种或多种的模拟物。这些化合物可为单链、双链、环状或发夹寡聚化合物且可包含结构元件，例如内部或末端突起、错配或环。将反义化合物常规地制备为线性的但可被连接，或者另外制备成环状和/或分枝的。反义化合物可包括构建体， 例如杂交以形成完全或部分双链化合物的两条链，或具有足够自我互补性以允许杂交并形成完全或部分双链化合物的单链。可将所述两条链内部连接而留下自由的3’或5’末端， 或可将其连接形成连续的发夹结构或环。发夹结构可在5’或3’末端上包含突出端，产生单链特征的延伸。所述双链化合物任选可在末端上包含突出端。进一步的修饰可包括与末端之一、经挑选的核苷酸位置、糖位置或与核苷酸间键之一连接的缀合基团。或者，所述两条链可经由非核酸部分或连接基团来连接。当仅由一条链形成时，dsRNA可呈自我互补的发夹型分子形式，其在其自身上对折形成双链体。因此，所述dsRNA可为完全或部分双链的。基因表达的特异性调节可通过在转基因细胞系中稳定表达dsRNA发夹来完成，然而，在一些实施方案中，基因表达或功能为增量调节的。当形成自两条链，或呈在其自身上对折形成双链体的自身互补发夹型分子形式的单链时，所述两条链(或单链的双链体形成区)为以沃森-克里克模式碱基配对的互补RNA链。
一旦引入系统，本发明的化合物可引起一种或多种酶或结构蛋白的作用以实现靶核酸的切割或其他修饰，或可经由基于占据的机制来运作。一般而言，核酸(包括寡核苷酸)可描述为“DNA样”(即，一般具有一个或多个2’脱氧糖和一般地T而不是U碱基)或 "RNA样”(即，一般具有一个或多个2’羟基或2’修饰的糖和一般U而不是T碱基)。核酸螺旋可采取多于一种类型的结构，最普通地A和B型。据认为，一般而言，具有B型样结构的寡核苷酸为“DNA样”而具有A型样结构的寡核苷酸为“RNA样”。在一些(嵌合的)实施方案中，反义化合物可包含A和B型区两者。
在另一个优选的实施方案中，所需的寡核苷酸或反义化合物，包括以下中的至少一种反义RNA、反义DNA、嵌合反义寡核苷酸、包含经修饰的键的反义寡核苷酸、干扰 RNA (RNAi)、短干扰 RNA (siRNA)；微小干扰 RNA (miRNA)；小时序 RNA (stRNA)；或短发夹 RNA(shRNA)；小RNA诱导的基因激活(RNAa)；小激活RNA(saRNA)、或其组合。
dsRNA也可激活基因表达，这是已被称为“小RNA诱导的基因激活”或RNAa的机制。 靶定基因启动子的dsRNA诱导相关基因的有效转录激活。在人细胞中使用合成dsRNA(称为“小激活RNA” (saRNA))证实RNAa。目前未知RNAa在其他生物体中是否为保守的。
已发现小双链RNA (dsRNA)(例如小干扰RNA (siRNA)和微小RNA (miRNA))是称为 RNA干扰(RNAi)的进化保守机制的触发物。RNAi总是经由重构染色质来导致基因沉默，从而抑制转录、降解互补mRNA或阻断蛋白翻译。然而，在下文实施例章节详述的例子中，显示寡核苷酸增加δ样1同源物(DLKl)多核苷酸和其编码产物的表达和/或功能。dsRNA也可充当小激活RNA(saRNA)。不希望受理论约束，通过靶定基因启动子中的序列，saRNA在称为dsRNA诱导的转录激活(RNAa)的现象中诱导靶基因表达。
在另一个实施方案中，本文鉴定的“优选靶区段”可用于筛选调节δ样1同源物 (DLKl)多核苷酸表达的另外化合物。“调节剂”为以下化合物，其减少或增加编码δ样1同源物(DLKl)的核酸分子的表达并包含与优选靶区段互补的至少5-核苷酸部分。筛选方法包括以下步骤使编码δ样1同源物(DLKl)有义或天然反义多核苷酸的核酸分子的优选靶区段与一种或多种候选调节剂接触，以及选择一种或多种减少或增加编码S样1同源物 (DLKl)多核苷酸的核酸分子表达的候选调节剂(例如SEQ ID NO 4-5)。一旦显示一种或多种候选调节剂能够调节(例如减少或增加)编码S样1同源物(DLKl)多核苷酸的核酸分子表达，则可将所述调节剂用于δ样1同源物(DLKl)多核苷酸功能的进一步调查研究， 或用作依照本发明的研究、诊断或治疗剂。
靶定天然反义序列优选地调节靶基因的功能。例如，DLKl基因(例如检索号 ΝΜ_003836. 4，图2)。在一个优选的实施方案中，靶标为DLKl基因的反义多核苷酸。在一个优选的实施方案中，反义寡核苷酸靶定δ样1同源物(DLKl)多核苷酸(例如检索号 ΝΜ_003836. 4，图幻的有义和/或天然反义序列、其变体、等位基因、同种型、同源物、突变体、衍生物、片段和互补序列。优选所述寡核苷酸为反义分子且所述靶标包括反义和/或有义DLKl多核苷酸的编码和非编码区。
本发明的优选靶区段也可与本发明的其各自互补的反义化合物结合，以形成稳定的双链(双链体)寡核苷酸。
本领域中已显示这类双链寡核苷酸部分经由反义机制来调节靶表达和调节翻译以及RNA加工。此外，所述双链部分可经受化学修饰(Fire等，(1998) Nature, 391,806-811 ； Timmons 禾口 Fire， (1998)Nature,395,854 ；Timmons 等，(2001)Gene,263,103-112 ；Tabara等，(1998) Science, 282,430-431 ；Montgomery 等，(1998) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 95, 15502-15507 ;Tuschl 等，(1999) Genes Dev.，13，3191-3197 ;Elbashir 等，(2001) Nature, 411,494-498 ;Elbashir 等，Q001)Genes Dev. 15，188-200)。例如，已显示这类双链部分通过所述双链体的反义链与靶标的典型杂交来抑制该靶标，从而触发靶标的酶促降解 (Tijsterman 等，Q002) Science, 295,694-697)。
在一个优选的实施方案中，反义寡核苷酸靶定δ样1同源物(DLKl)多核苷酸(例如检索号ΝΜ_003836. 4)、其变体、等位基因、同种型、同源物、突变体、衍生物、片段和互补序列。优选所述寡核苷酸为反义分子。
依照本发明的实施方案，靶核酸分子不单独限于δ样1同源物(DLKl)而是延伸到S样1同源物(DLKl)分子的任何同种型、受体、同源物等等。
在另一个优选的实施方案中，寡核苷酸靶定DLKl多核苷酸的天然反义序列(例如，如SEQ ID NO :3所述的多核苷酸)，以及其任何变体、等位基因、同源物、突变体、衍生物、片段和互补序列。反义寡核苷酸的实例如SEQ ID NO :4-5所述。
在一个实施方案中，所述寡核苷酸与δ样1同源物(DLKl)反义物的核酸序列互补或结合，并调节δ样1同源物(DLKl)分子的表达和/或功能，所述核酸序列包括但不限于与S样1同源物(DLKl)多核苷酸有关的非编码有义和/或反义序列。
在另一个优选的实施方案中，所述寡核苷酸与如SEQ ID NO :3所述的DLKl天然反义物的核酸序列互补或结合，并调节DLKl分子的表达和/或功能。
在一个优选的实施方案中，寡核苷酸包含SEQ ID NO :4_5的至少5个连续核苷酸的序列且调节δ样1同源物(DLKl)分子的表达和/或功能。
多核苷酸靶标包括DLKl，包括其家族成员、DLKl的变体；DLKl的突变体，包括SNP ； DLKl的非编码序列；DLKl的等位基因；物种变体、片段等等。优选所述寡核苷酸为反义分子。
在另一个优选的实施方案中，靶定δ样1同源物(DLKl)多核苷酸的寡核苷酸包括反义RNA、干扰RNA (RNAi)、短干扰RNA (siRNA)；微小干扰RNA (miRNA)；小时序 RNA(StRNA)；或短发夹RNA(shRNA)；小RNA诱导的基因激活RNAa)；或小激活RNA (saRNA)。
在另一个优选的实施方案中，δ样1同源物(DLKl)多核苷酸(例如SEQ ID NO 3)的靶定调节这些靶标的表达或功能。在一个实施方案中，表达或功能相比于对照为增量调节的。在另一个优选的实施方案中，表达或功能相比于对照为减量调节的。
在另一个优选的实施方案中，反义化合物包括如SEQ ID Ν0:4_5所述的序列。这些寡核苷酸可包含一个或多个经修饰的核苷酸、更短或更长的片段、经修饰的键等等。
在另一个优选的实施方案中，SEQ ID NO :4_5包含一个或多个LNA核苷酸。
表1显示可用于在本发明的方法中的示例性反义寡核苷酸。
权利要求
1.一种在体内或体外调节患者细胞或组织中S样1同源物(DLKl)多核苷酸的功能和 /或表达的方法，所述方法包括使所述细胞或组织与长度为5-30个核苷酸的至少一种反义寡核苷酸接触，其中所述至少一种寡核苷酸与以下多核苷酸的反向互补序列具有至少50%序列同一性，所述多核苷酸包含在SEQ ID NO :3(图幻的核苷酸1-1347之内的5_30个连续核苷酸；从而在体内或体外调节患者细胞或组织中δ样1同源物(DLKl)多核苷酸的功能和/或表达。
2.一种在体内或体外调节患者细胞或组织中δ样1同源物(DLKl)多核苷酸的功能和 /或表达的方法，所述方法包括使所述细胞或组织与长度为5-30个核苷酸的至少一种反义寡核苷酸接触，其中所述至少一种寡核苷酸与δ样1同源物(DLKl)多核苷酸的天然反义物的反向互补序列具有至少50%序列同一性；从而在体内或体外调节患者细胞或组织中δ样1同源物(DLKl)多核苷酸的功能和/或表达。
3.一种在体内或体外调节患者细胞或组织中δ样1同源物(DLKl)多核苷酸的功能和 /或表达的方法，所述方法包括使所述细胞或组织与长度为5-30个核苷酸的至少一种反义寡核苷酸接触，其中所述寡核苷酸与δ样1同源物(DLKl)多核苷酸的反义寡核苷酸具有至少50%序列同一性；从而在体内或体外调节患者细胞或组织中δ样1同源物(DLKl)多核苷酸的功能和/或表达。
4.一种在体内或体外调节患者细胞或组织中δ样1同源物(DLKl)多核苷酸的功能和 /或表达的方法，所述方法包括使所述细胞或组织与靶定δ样1同源物(DLKl)多核苷酸的天然反义寡核苷酸的区的至少一种反义寡核苷酸接触；从而在体内或体外调节患者细胞或组织中S样1同源物 (DLKl)多核苷酸的功能和/或表达。
5.权利要求4的方法，其中δ样1同源物(DLKl)的功能和/或表达在体内或体外相对于对照增加。
6.权利要求4的方法，其中所述至少一种反义寡核苷酸靶定δ样1同源物(DLKl)多核苷酸的天然反义序列。
7.权利要求4的方法，其中所述至少一种反义寡核苷酸靶定核酸序列，所述核酸序列包括S样1同源物(DLKl)多核苷酸的编码和/或非编码核酸序列。
8.权利要求4的方法，其中所述至少一种反义寡核苷酸靶定δ样1同源物(DLKl)多核苷酸的重叠和/或非重叠序列。
9.权利要求4的方法，其中所述至少一种反义寡核苷酸包含一种或多种选自以下的修饰至少一种经修饰的糖部分、至少一种经修饰的核苷间键、至少一种经修饰的核苷酸及其组合。
10.权利要求9的方法，其中所述一种或多种修饰包括至少一种选自以下的经修饰糖部分2’ -0-甲氧基乙基修饰的糖部分、2’ -甲氧基修饰的糖部分、2’ -0-烷基修饰的糖部分、二环糖部分及其组合。
11.权利要求9的方法，其中所述一种或多种修饰包括至少一种选自以下的经修饰核苷间键硫代磷酸酯、2’ -0-甲氧基乙基(MOE)、2’ -氟、烷基膦酸酯、二硫代磷酸酯、烷基硫代膦酸酯、氨基磷酸酯、氨基甲酸酯、碳酸酯、磷酸三酯、氨基乙酸酯、羧甲基酯及其组合。
12.权利要求9的方法，其中所述一种或多种修饰包括至少一种选自以下的经修饰核苷酸肽核酸(PNA)、锁定核酸(LNA)、阿糖核酸(FANA)、其类似物、衍生物和组合。
13.权利要求1的方法，其中所述至少一种寡核苷酸包含如SEQIDNO :4_5所述的至少一个寡核苷酸序列。
14.一种在体内或体外调节哺乳动物细胞或组织中δ样1同源物(DLKl)基因的功能和/或表达的方法，所述方法包括使所述细胞或组织与长度为5-30个核苷酸的至少一种短干扰RNA (siRNA)寡核苷酸接触，所述至少一种siRNA寡核苷酸对δ样1同源物(DLKl)多核苷酸的反义多核苷酸特异， 其中所述至少一种siRNA寡核苷酸与δ样1同源物(DLKl)多核苷酸的反义和/或有义核酸分子的至少约五个连续核酸的互补序列具有至少50%序列同一性；和，在体内或体外调节哺乳动物细胞或组织中δ样1同源物(DLKl)的功能和/或表达。
15.权利要求14的方法，其中所述寡核苷酸与至少约五个连续核酸的序列具有至少 80%序列同一性，所述序列与δ样1同源物(DLKl)多核苷酸的反义和/或有义核酸分子互补。
16.一种在体内或体外调节哺乳动物细胞或组织中δ样1同源物(DLKl)的功能和/ 或表达的方法，所述方法包括使所述细胞或组织与长度为约5-30个核苷酸的至少一种反义寡核苷酸接触，所述反义寡核苷酸对δ样1同源物(DLKl)多核苷酸的有义和/或天然反义链的非编码和/或编码序列特异，其中所述至少一种反义寡核苷酸与至少一个如SEQ ID N0:l、3所述的核酸序列具有至少50%序列同一性；和，在体内或体外调节哺乳动物细胞或组织中δ样1同源物 (DLKl)的功能和/或表达。
17.一种合成的、经修饰的寡核苷酸，所述寡核苷酸包含至少一种修饰，其中所述至少一种修饰选自至少一种经修饰的糖部分；至少一种经修饰的核苷酸间键；至少一种经修饰的核苷酸及其组合；其中与正常对照相比，所述寡核苷酸为在体内或体外与S样1同源物(DLKl)基因杂交并调节其功能和/或表达的反义化合物。
18.权利要求17的寡核苷酸，其中所述至少一种修饰包括选自以下的核苷酸间键硫代磷酸酯、烷基膦酸酯、二硫代磷酸酯、烷基硫代膦酸酯、氨基磷酸酯、氨基甲酸酯、碳酸酯、 磷酸三酯、氨基乙酸酯、羧甲基酯及其组合。
19.权利要求17的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸包含至少一种硫代磷酸酯核苷酸间键。
20.权利要求17的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸包含硫代磷酸酯核苷酸间键的骨架。
21.权利要求17的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸包含至少一种经修饰的核苷酸，所述经修饰的核苷酸选自肽核酸、锁定核酸(LNA)、其类似物、衍生物和组合。
22.权利要求17的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸包含多种修饰，其中所述修饰包括选自以下的经修饰的核苷酸硫代磷酸酯、烷基膦酸酯、二硫代磷酸酯、烷基硫代膦酸酯、氨基磷酸酯、氨基甲酸酯、碳酸酯、磷酸三酯、氨基乙酸酯、羧甲基酯及其组合。
23.权利要求17的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸包含多种修饰，其中所述修饰包括选自以下的经修饰的核苷酸肽核酸、锁定核酸(LNA)、其类似物、衍生物和组合。
24.权利要求17的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸包含至少一种选自以下的经修饰的糖部分2’ -0-甲氧基乙基修饰的糖部分、2’ -甲氧基修饰的糖部分、2’ -0-烷基修饰的糖部分、二环糖部分及其组合。
25.权利要求17的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸包含多种修饰，其中所述修饰包括选自以下的经修饰的糖部分2’ -0-甲氧基乙基修饰的糖部分、2’ -甲氧基修饰的糖部分、 2’ -0-烷基修饰的糖部分、二环糖部分及其组合。
26.权利要求17的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸具有至少约5-30个核苷酸的长度且与 δ样1同源物(DLKl)多核苷酸的反义和/或有义链杂交，其中所述寡核苷酸与δ样1同源物(DLKl)多核苷酸的反义和/或有义编码和/或非编码核酸序列的至少约五个连续核酸的互补序列具有至少约20%序列同一性。
27.权利要求17的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸与δ样1同源物(DLKl)多核苷酸的反义和/或有义编码和/或非编码核酸序列的至少约五个连续核酸的互补序列具有至少约 80%序列同一性。
28.权利要求17的寡核苷酸，其中与正常对照相比，所述寡核苷酸在体内或体外与至少一种δ样1同源物(DLKl)多核苷酸杂交并调节其表达和/或功能。
29.权利要求17的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸包含如SEQID Ν0:4_5所述的序列。
30.一种组合物，所述组合物包含对一种或多种δ样1同源物(DLKl)多核苷酸特异的一种或多种寡核苷酸，所述多核苷酸包括反义序列、互补序列、等位基因、同源物、同种型、 变体、衍生物、突变体、片段或其组合。
31.权利要求30的组合物，其中所述寡核苷酸与如SEQID NO :4_5所述核苷酸序列中的任何一个相比，具有至少约40 %序列同一性。
32.权利要求30的组合物，其中所述寡核苷酸包含如SEQID NO :4_5所述的核苷酸序列。
33.权利要求32的组合物，其中如SEQID NO :4_5所述的寡核苷酸包含一种或多种修饰或取代。
34.权利要求33的组合物，其中所述一种或多种修饰选自硫代磷酸酯、甲基膦酸酯、 肽核酸、锁定核酸(LNA)分子及其组合。
35.一种预防或治疗与至少一种δ样1同源物(DLKl)多核苷酸和/或至少一种其编码产物有关的疾病的方法，所述方法包括给患者施用治疗有效剂量的至少一种反义寡核苷酸，所述反义寡核苷酸与所述至少一种S样1同源物(DLKl)多核苷酸的天然反义序列结合，并调节所述至少一种δ样1同源物G3LK1)多核苷酸的表达；从而预防或治疗与至少一种δ样1同源物(DLKl)多核苷酸和 /或至少一种其编码产物有关的疾病。
36.权利要求35的方法，其中与至少一种δ样1同源物(DLKl)多核苷酸有关的疾病选自神经疾病或病症、神经变性疾病或病症、癌症、与受损神经修复和/或神经再生有关的疾病或病症；麻痹、与受损神经内分泌分化有关的疾病或病症、母体起源的单亲二体(14 号染色体)、父体起源的单亲二体(14号染色体)、心血管疾病或病症、肥胖症、与脂肪形成有关的疾病或病症、与增加的血清脂质代谢产物有关的疾病或病症、与生长激素表达有关的疾病或病症(例如，生长迟缓等)、睑裂狭小、骨骼畸形、糖尿病、炎症、与受损的免疫应答有关的疾病或病症、内分泌疾病或病症、与受损的血细胞生成有关的疾病或病症、以及与受CN 102549159 A损的干细胞分化有关的疾病或病症。
37. 一种鉴定和选择用于体内施用的至少一种寡核苷酸的方法，所述方法包括选择与疾病状态有关的靶多核苷酸；鉴定包含至少五个连续核苷酸的至少一种寡核苷酸，所述连续核苷酸与所选的靶多核苷酸或与所选靶多核苷酸的反义多核苷酸互补；测定在严格杂交条件下反义寡核苷酸与所述靶多核苷酸或所选靶多核苷酸的反义多核苷酸的杂合体的热解链温度；以及基于获得的信息选择用于体内施用的至少一种寡核苷酸。
全文摘要
本发明涉及反义寡核苷酸，具体而言，其通过靶定δ样1同源物(DLK1)的天然反义多核苷酸，调节δ样1同源物(DLK1)的表达和/或功能。本发明还涉及这些反义寡核苷酸的鉴定及其在治疗与DLK1表达有关的疾病和病症中的用途。
文档编号C12Q1/68GK102549159SQ201080022293
公开日2012年7月4日 申请日期2010年3月16日 优先权日2009年3月17日
发明者C·科伊托, J·科拉德, 谢尔曼 O·霍尔科瓦 申请人:欧科库尔纳有限责任公司