专利名称：适合将免疫原性分子递送到细胞中的突变CyaA多肽及多肽衍生物的制作方法
技术领域：
本发明涉及适合用于将一种或更多种分子递送到细胞中的多肽。具体而言，本发明涉及适合用于将一种或更多种能够引发免疫应答的分子，特别是通过表达⑶lib/⑶18受体的靶向细胞(在本文也称为“⑶lib表达细胞”)递送到宿主中的多肽。本发明更具体而言涉及得自腺苷酸环化酶蛋白质(CyaA)的多肽，腺苷酸环化酶蛋白质以毒素或解毒蛋白质或类毒素形式使用，所述多肽为突变多肽。所述突变多肽能够保留天然CyaA与靶细胞的结合活性，且优选还能够保留天然CyaA经过其N-端结构域进入靶细胞中的易位活性，并且此外其具有成孔活性，该成孔活性与天然CyaA毒素的成孔活性相比是降低的或抑制的。本发明特别涉及所述多肽作为蛋白质载体的应用。因此，所述突变多肽进一步与非-CyaA分子结合，从而产生多肽衍生物，其中所述分子当施用给宿主时具有预防性疫苗和/或治疗益处。本发明的多肽适合用作蛋白质载体，用于将分子，尤其是具有含一个或更多个表位特别是抗原的氨基酸序列的多肽分子递送到细胞中，特别是CDllb表达细胞中。本发明因此还涉及多肽衍生物(本发明的突变多肽的衍生物)，其包含本发明的突变多肽或由本发明的突变多肽组成，其中所述突变多肽与一个或更多个分子，尤其是一个或更多个适合引发免疫应答的分子重组，从而构成重组多肽或融合多肽。本发明还涉及通过使所述分子与突变多肽化学接枝而获得的多肽衍生物。根据一个实施方式，本发明的多肽衍生物适合用在预防疗法中，并且特别适合疫苗接种以及包括免疫疗法的治疗中，特别是用于在受试对象中引发免疫应答。在本发明的上下文中使用的用于设计本发明多肽的天然CyaA是主要在博德特氏菌属(Bordetella)生物中，特别是在百日咳博德特氏菌(Bordetella Pertussis)中产生的腺苷酸环化酶，其具有下述特征和性质，其公开的目的是在本发明的上下文中表征所述蛋白质。双功能RTX腺苷酸环化酶毒素-溶血素(于此也称为腺苷酸环化酶毒素(CyaA、 ACT或AC-Hly)是百日咳博德特氏菌的关键致病因子，其是百日咳(1)的病原体。其1706 个残基长度的多肽是N-端腺苷酸环化酶(AC)酶结构域或部分( 400个残基)与构成 C-端部分或结构域O)的 1306个残基的成孔RTX溶血素(在IoXin溶细胞素中重复) 的融合体。后者通过共价翻译后棕榈酰化Lys86tl和Lys983的ε _氨基而包含将proCyaA活化为CyaA的位点，以及包含形成 40个钙结合部位的众多RTX重复，其装载(loading)是 CyaA(3,4)的细胞毒素活性所需的。CyaA蛋白质实际上作为无活性原毒素而被合成，其通过翻译后棕榈酰化两个内部赖氨酸残基(赖氨酸860和98 而被转化为活性毒素。这种翻译后修饰要求与cyaA基因表达附加基因，即位于百日咳博德特氏菌染色体上的cyaA附近的cyaCo
毒素主要靶向表达α 32整联蛋白受体的宿主骨髓吞噬细胞，αΜβ2整联蛋白受体也称为⑶lib/⑶18、CR3或Mac-I (5)。所述毒素具体是通过存在于其C-端部分的受体结合部位而与表达⑶lib/⑶18受体的细胞的⑶lib/⑶18受体结合。这些细胞因此是天然毒素的靶细胞，且还是本发明多肽的靶细胞。CyaA插入细胞的细胞质膜中并将AC酶结构域易位到所述靶细胞的胞质溶胶中(6，7)。在细胞内，AC被钙调节蛋白激活并催化不受控制的细胞ATP向cAMP的转化，cAMP是激发削弱吞噬细胞杀菌功能的关键第二信使分子(1)。 在高剂量下(> lOOng/ml)，CyaA-催化的ATP消耗成cAMP变成细胞毒性的，并且促进凋亡甚或迅速的坏死性死亡以及⑶Ilb+单核细胞的溶解(8，9)。最近，发明人显示，CyaA结合其⑶lib/⑶18受体的N联寡糖(10)。这表明与普遍存在的细胞表面蛋白的葡聚糖或糖脂的低特异性相互作用可解释虽然降低了大约2个数量级，但是能够容易检测到CyaA也穿透缺乏⑶lib/⑶18的细胞。的确，由于AC结构域具有极其高的特异性催化活性，发现CyaA也显著升高哺乳动物和鸟类红细胞、淋巴细胞、淋巴瘤、成神经细胞瘤CHO或气管上皮细胞中的cAMP(l，11)。最近现有技术中已经提出提供也称为类毒素的解毒毒素，其中腺苷酸环化酶的活性减小，特别是基本被抑制。此类CyaA/AC—类毒素可用于实现本发明多肽的制备。除提高cAMP之外，所述毒素还在哺乳动物和鸟类红细胞上显示出中等溶血活性。 这是由于形成估计直径为0. 6至0. Snm的小阳离子选择性孔的能力，这些孔使细胞膜透化并最终引发胶体-渗透细胞溶解(1 。最近，发明人及其他人已经表明，CyaA的成孔活性与其细胞入侵AC酶活性协同作用并有助于⑶Ilb+细胞上的CyaA总溶细胞效力(13，14)。由于完整的成孔(溶血)能力，在诸如血清的渗透保护剂不存在时，无酶促活性的CyaA/AC—类毒素(1 在红细胞上仍显示完整的溶血活性，并且在⑶lib-表达单核细胞上显示残留的降低约10倍的溶细胞活性(8)，这对其在治疗中的应用设定了限制。早期，发现CyaA的溶血(成孔)和AC膜易位(细胞入侵)活性由于低钙浓度、低温(16)以及由于CyaA酰化的程度和性质(4，12，17)而易分离。此外，两种活性在对疏水结构域内的位置509、516、570和581处的谷氨酸的电荷逆转或中性置换的灵敏度上有很大差异(8，13，18)。CyaA的细胞入侵和成孔活性因此被认为是相互独立的而且在靶细胞膜中平行操作。图5A图解的模型表明，两种不同的CyaA构象体平行插入靶细胞膜中，一个是易位前体，负责将AC结构域经过具有伴随钙离子流入的细胞膜递送到细胞中，另一个是最终形成低聚物孔的孔前体(13，18，19)。发明人现在已经测试了这种模型并对其进行修整，显示成孔活性不参与AC结构域经过靶细胞的易位。在本发明中，发明人最初设计了 CyaA突变多肽，特别是基于百日咳博德特氏菌的腺苷酸环化酶，其处于毒素或类毒素形式，具有在成孔(E570Q)和具酰化(K860R)结构域内的置换组合，并且发明人表明，这些特异性置换组合选择性破坏CyaA的细胞透化活性，因此消除了残留的CyaA/AC-类毒素对CDllb+细胞的溶细胞活性。同时，E570Q+K860R构建物保留了将AC结构域易位到细胞胞质溶胶中以提高细胞cAMP的完整能力，并且其类毒素完全能够将所述构建物内插入的含表位分子递送至树突状细胞的胞浆途径，用于体内特异性细胞毒性T细胞应答的MHC类别I-限制呈递和诱导。由发明人设计的CyaA/2330VA/E570Q+K860R突变体(如在实施例中所述，OVA抗原肽被插入其中)，是例证CyaA突变体能力的第一构建物，即提供显著降低的透化细胞的能力，同时保留了越过细胞膜易位AC结构域的完整能力。发明人现在已经设计出具体构建物，其特别以CyaA/E570Q+K860R/AC_类毒素为例，并且已经显示尽管其细胞透化(溶细胞)活性降低很多，但是其保留了将抗原递送到 ⑶Ilb+APCs中的完整活性。发明人还表明，说明性CyaA/E570Q+K860R/AC_类毒素的总溶细胞活性非常低。因此，其在动物或人类宿主中没有残留毒性，并且因此非常适合用于治疗。
发明内容
本发明因此提供新型多肽，其为类毒素且具有增强的安全特性(profile)，可用作蛋白质载体，用于将目标分子，特别是免疫原性肽序列递送到需要治疗的患者的细胞，更具体而言，表达⑶lib的细胞中。基于由发明人实施的实验，因此能够定义并提供一种多肽，其为腺苷酸环化酶蛋白质的突变体(突变多肽)，并且其氨基酸序列包含下述序列之一或由下述序列之一组成a)百日咳博德特氏菌、副百日咳博德特氏菌(Bordetella parapertussis)或欣氏博德特氏菌(Bordetella hinzii)的腺苷酸环化酶(CyaA)的氨基酸序列，其中已经进行下述突变(i) 570位的谷氨酸残基被谷氨酰胺残基(E570Q)或被保守氨基酸残基置换，和(ii)860位的赖氨酸残基被精氨酸残基(K860I )或被保守氨基酸残基置换，或；b)百日咳博德特氏菌、副百日咳博德特氏菌或欣氏博德特氏菌的腺苷酸环化酶片段的氨基酸序列，该片段具有百日咳博德特氏菌的CyaA蛋白质结合靶细胞的能力以及使其N-端腺苷酸环化酶酶结构域或所述N-端腺苷酸环化酶酶结构域的部分易位进入所述细胞中的能力，其中所述片段还含有位于所述腺苷酸环化酶的570位和860位的下述突变氨基酸残基E570Q和K860R，或c)氨基酸序列，由于一个或更多个氨基酸残基置换和/或插入，其不同于如在a) 或b)中定义的氨基酸序列，并且其具有百日咳博德特氏菌的CyaA蛋白质结合靶细胞的能力以及使其N-端腺苷酸环化酶酶结构域或所述N-端腺苷酸环化酶酶结构域的部分易位进入所述细胞中的能力，其中所述氨基酸序列还含有位于所述腺苷酸环化酶的570位和860 位的下述突变氨基酸残基E570Q和K860R，或d)支气管败血性博德特氏菌(支气管败血性博德特氏菌)的腺苷酸环化酶 (CyaA)的氨基酸序列，其中已经进行下述突变(i) 569位的谷氨酸残基被谷氨酰胺残基(E569Q)或被保守氨基酸残基置换，和(ii)859位的赖氨酸残基被精氨酸残基(K859R)或被保守氨基酸残基置换，或；e)支气管败血性博德特氏菌的腺苷酸环化酶片段的氨基酸序列，该片段具有百日咳博德特氏菌的CyaA蛋白质结合靶细胞的能力以及使其N-端腺苷酸环化酶酶结构域或所述N-端腺苷酸环化酶酶结构域的部分易位进入所述细胞中的能力，其中所述片段还含有位于所述腺苷酸环化酶的569位和859位的下述突变氨基酸残基E569Q和K859R，或f)氨基酸序列，由于一个或更多个氨基酸残基置换和/或插入，其不同于如在d) 或e)中定义的氨基酸序列，并且其具有百日咳博德特氏菌的CyaA蛋白质结合靶细胞的能力以及使其N-端腺苷酸环化酶酶结构域或所述N-端腺苷酸环化酶酶结构域的部分易位进入所述细胞中的能力，其中所述氨基酸序列还含有位于所述腺苷酸环化酶的569位和859 位的下述突变氨基酸残基E569Q和K859R。为了本发明的目的，所描述的片段的N-端结构域是下述片段的氨基酸序列，所述片段包括天然CyaA蛋白质N-端部分的连续氨基酸残基，例如，所述片段的N-端部分是形成百日咳博德特氏菌CyaA蛋白质的N-端结构域的400个氨基酸残基序列的连续残基的全部或一部分。本文中，“E570Q”包括百日咳博德特氏菌、副百日咳博德特氏菌或欣氏博德特氏菌的天然CyaA的570位的谷氨酸残基被谷氨酰胺残基或被另一保守残基的置换，具体而言是这样的残基，其侧链尺寸和亲水性接近谷氨酸的侧链尺寸和亲水性。570位的谷氨酸残基优选被选自 Gin、Asn、Met、Thr、Ser、Gly、Arg、Lys, Val、Leu、Cys, lie、Asp 的氨基酸残基置换。本文中，“K860R”包括百日咳博德特氏菌、副百日咳博德特氏菌或欣氏博德特氏菌的天然CyaA的860位的赖氨酸残基被精氨酸残基或被另一保守残基的置换，具体而言是这样的残基，其侧链尺寸和亲水性接近赖氨酸的侧链尺寸和亲水性。860位的赖氨酸残基优选被选自 Arg、Asn、Gin、Met、Thr、Ser、Gly、Val、Leu、Cys, lie 的氨基酸残基置换。本文中，“E569Q”包括支气管败血性博德特氏菌的天然CyaA的569位的谷氨酸残基被谷氨酰胺残基或被另一保守残基的置换，具体而言是这样的残基，其侧链尺寸和亲水性接近谷氨酸的侧链尺寸和亲水性。569位的谷氨酸残基优选被选自Gin、Asn、Met、Thr, Ser、Gly、Arg、Lys、Val、Leu、Cys、lie、Asp 的氨基酸残基置换。本文中，“K859R”包括支气管败血性博德特氏菌的天然CyaA的的859位的赖氨酸残基被精氨酸残基或被另一保守残基的置换，具体而言是这样的残基，其侧链尺寸和亲水性接近赖氨酸的侧链尺寸和亲水性。859位的赖氨酸残基优选被选自Arg、Asn、Gin、Met、 Thr、Ser、Gly、Val、Leu、Cys, lie 的氨基酸残基置换。在下文所述的实施方式中，携带“E570Q”和“K860R”置换的突变百日咳博德特氏菌CyaA蛋白质或蛋白质片段可被携带等价“E570Q”和“K860R”置换的突变副百日咳博德特氏菌或欣氏博德特氏菌CyaA蛋白质或蛋白质片段取代，或者被携带等价“E569Q”和 “K859R”置换的突变支气管败血性博德特氏菌CyaA蛋白质或蛋白质片段取代。百日咳博德特氏菌的天然CyaA 已经被 Glaser，P. et al，1988，19_30Molecular Microbiology 2(1)以氨基酸序列和核苷酸序列进行了描述。该序列被称为SEQ ID N0 1， 如图6所示。因此，当在本发明中引用百日咳博德特氏菌的CyaA蛋白质的氨基酸残基或序列或核苷酸或核苷酸序列时，其位置相对于在Glaser等1988的所述出版物中公开的序列来确定。在本发明的实施方式中，百日咳博德特氏菌腺苷酸环化酶的氨基序列是如SEQ ID N0 1公开的序列。当在本文提到SEQ ID N0 1或SEQ ID N0 2时，要特别指出的是，除非技术上不相关，所公开的特征将类似地应用于通过在SEQ ID N0 1或SEQ ID N0 2中插入残基以便使CyaA蛋白质解毒而修饰的序列。在这种情况下，氨基酸残基的编号应该进行修改(特别是在天然序列的位置570和860是受关注的情况下)。有利地，CyaA蛋白质或其片段是蛋白质或蛋白质片段，其是cyaA和cyaC基因在细胞中，特别是重组细胞中共表达的结果。的确已经显示，为对靶细胞具有侵入性质，CyaA 必须经历翻译后修饰，这通过cyaA和cyaC基因二者的表达来得以实现(W0 93/21324) 0
在本发明的具体实施方式
中，CyaA蛋白质是细菌蛋白。在优选的实施方式中，CyaA 蛋白质得自博德特氏菌属种。在受关注的博德特氏菌属种中，根据本发明，其中之一为百日咳博德特氏菌。其他受关注的博德特氏菌属菌株是副百日咳博德特氏菌、欣氏博德特氏菌或支气管败血性博德特氏菌的那些菌株。副百日咳博德特氏菌的CyaA蛋白质的序列已经具体以登记号NC 0(^拟8.3(为 1了40 个氨基酸的序列)并在 Parkhill J.等(Nat. Genet. DOI，KK2OO3))中公开，欣氏博德特氏菌在Donato G. M.等(J. Bacteriol. 2005 Nov, 187(22) :7579-88)中公开，以及支气管败血性博德特氏菌在Betsou F.等(Gene 1995,August 30 ；162(1) :165-6) 中公开。副百日咳博德特氏菌的序列已经具体以登记号CAB76450公开，本文中称为SEQ ID N0 7，如在图14中所示。欣氏博德特氏菌的序列已经具体以登记号AAY57201公开，本文中称为SEQ ID N0 8，如在图15中所示。支气管败血性博德特氏菌的序列已经具体以登记号CAA8M81公开，本文中称为SEQ ID N。9，如在图16中所示。因此，当在本发明中引用副百日咳博德特氏菌、欣氏博德特氏菌或支气管败血性博德特氏菌的CyaA蛋白质的氨基酸残基或序列时，其位置分别相对于在SEQ ID N0 7、8和9中所公开的序列来确定。表述“腺苷酸环化酶蛋白质的多肽突变体”不包括由博德特氏菌属所表达的天然腺苷酸环化酶。如上所述，其特征在于与天然蛋白质的主要不同在于两个特定氨基酸残基的结合置换。其可以相对于所述天然蛋白质进行进一步修饰，并且其特别可以是如此突变的蛋白质的片段，例如，诸如所述突变蛋白质的截短变体，其中在任一或两个末端的残基被缺失。具体而言，在C-末端的残基可以被缺失直至缺失程度使之不会影响CDllb/CD18细胞受体的识别和结合部位。可选地或另外地，可以在N-末端缺失残基，条件是其不会影响所得突变多肽的易位能力。其也可以是内部缺失天然突变CyaA蛋白质的一个或更多个残基而获得的片段。在本发明涉及为本文所述片段的多肽突变体的情况下，必然包含突变残基E570Q 和K860R(当提到百日咳博德特氏菌的CyaA蛋白质的氨基序列时)的所述片段还保留突变的全长CyaA与细胞结合以及使其N-端结构域易位到靶细胞，特别是⑶1 Ib/⑶18表达细胞的胞质溶胶中的能力。本发明因此提供突变多肽，其适合用于设计将一种或更多种分子递送到细胞，特别是表达⑶lib/⑶18受体的靶细胞中的工具。具体而言，本发明提供CyaA蛋白质的突变多肽，其中所述蛋白质得自CyaA毒素或者优选得自其类毒素，特别是CyaA/AC—类毒素。所述突变多肽能够结合细胞，特别是结合靶细胞，尤其是表达CDllb/CD18受体的靶细胞，所述突变多肽能够将其N-端结构域或插入所述结构域中或在其上接枝的分子易位到所述细胞中，并且其成孔活性与CyaA毒素或类毒素的成孔活性相比被全部或部分抑制。特别地，可按照EP 03291486. 3 以及 El-Azami-El-Idrissi Μ.等，J. Biol. Chem.， 278 00)38514-21或WO 02/22169中公开的方法，测定突变多肽与靶CDllb/CD18细胞的能力。此外，通过应用WO 02/22169中所述的方法，可以测定突变多肽将表位或含所述表位的多肽易位到靶细胞的胞质溶胶中的能力。
CyaA毒素或类毒素成孔活性或细胞透化能力的全部或部分抑制应当被理解为形成孔具体是估计直径为0. 6至0. Snm的阳离子选择孔使得细胞膜透化并最终引发胶体_渗透细胞溶解的能力被全部或部分抑制。成孔活性可利用如在实施例中所述的单一全细胞膜片钳实验来测量。CyaA毒素的成孔活性有助于细胞上的总溶细胞或溶血活性。实际上，在本发明的上下文中，CyaA的总溶细胞或溶血活性(或其“总细胞毒活性”)应当至少被理解为腺苷酸环化酶和CyaA毒素成孔活性的结果。因此，CyaA毒素的成孔活性的全部或部分抑制允许至少部分抑制其细胞溶剂活性。在优选的实施方式中，与百日咳博德特氏菌CyaA毒素的总溶细胞活性相比，本发明的多肽特别是对表达CDllb/CD18受体的细胞的总溶细胞活性全部或部分降低。如在实施例中所述，通过测量用测试多肽温育时细胞所释放的血红蛋白(对于红细胞而言)或乳酸脱氢酶(对于单核细胞而言)的量，可以测定本发明多肽的溶细胞活性。在优选的实施方式中，与百日咳博德特氏菌CyaA毒素，或者与腺苷酸环化酶活性被部分或全部抑制的百日咳博德特氏菌CyaA蛋白质(或“CyaA类毒素”)的总溶细胞活性相比，本发明的多肽对表达CDllb/CD18受体的细胞的总溶细胞活性要低至少75%，优选低至少80%、85%、90%或95%。在特别优选的实施方式中，本发明的多肽对表达⑶lib/⑶18 受体的细胞的总溶细胞活性，相比氨基酸序列示于图2中的百日咳博德特氏菌CyaA类毒素 (SEQ ID N0 2)，要低至少75%，优选低80%或85%。在优选的实施方式中，本发明涉及一种多肽，其为腺苷酸环化酶的突变体，并且其氨基酸序列包含下述氨基酸序列或由其组成(i)所述氨基酸序列相对于SEQ ID N0 1中公开的氨基酸序列进行突变，所述突变至少包含置换E570Q和K860R，或(ii)其为具有如 SEQ ID N0 1公开的所述氨基酸序列的CyaA蛋白质的片段，其片段化程度直至所述片段具有包括置换E570Q和K860R的氨基酸序列，并且其中所述多肽能够与靶细胞结合而且能够将其N-端结构域易位到所述细胞中。在本发明的特定实施方式中，所述片段包括SEQ ID N0 1的570位的谷氨酸残基被谷氨酰胺残基的置换(称为“E570Q”)以及SEQ ID N0 1的860位的赖氨酸残基被精氨酸残基的置换(称为“K860R”)，该片段至少包括下述CyaA蛋白质的氨基酸序列，其始于第一 N-端残基或者从包含在1位与400位之间，优选为1位与380位之间的氨基酸残基之一延伸至形成CDllb/CD18细胞受体的识别和结合部位的残基，并且所述片段含有对应于突变E570Q和K860R残基的残基或者由所述氨基酸序列组成。在一个具体实施方式
中，包括 E570Q和K860R置换的片段不包含从SEQ ID N0 1的1位氨基酸延伸至SEQ ID N0 1的 372位氨基酸的氨基酸序列。在优选的实施方式中，如此制备的片段基本失去了腺苷酸环化酶酶活性(AC活性)。在优选的实施方式中，通过编码具有E570Q和R860R突变的CyaA氨基酸序列的突变基因和cyaC基因在重组细胞中共表达，之后回收突变体CyaA的选择表达片段，产生本发明的突变多肽。优选地，本发明的突变多肽具有赖氨酸残基，其对应于如SEQ ID N0 1所述的CyaA氨基酸序列的983位的赖氨酸残基，并且其被酰化，具体而言，其被棕榈酰化(palmytoylated)或棕榈油酉先化(palmitoleilated)。可选地，本发明的突变多肽具有赖氨酸残基，其对应于如SEQ ID N0 1所述的 CyaA氨基酸序列的983位的赖氨酸残基，其未被酰化。在一个具体实施方式
中，本发明的突变多肽具有衍生自SEQ ID N0 1中公开的 CyaA氨基酸序列并由于残基突变而产生E570Q和K860R的氨基酸序列，并且具有下述氨基酸序列，该氨基酸序列与SEQ ID N0 1所述的序列共享至少50%，优选至少60%、70%、 75%、80%、85%、90%、95%或 99% 的同一性。在另一个具体实施方式
中，本发明的突变多肽具有的氨基酸序列不同于如在SEQ ID N0 1中所述的CyaA氨基酸序列，不同之处在于残基突变产生E570Q和K860R，以及由于进一步的突变产生1至500，具体地1至400、1至300、1至200、1至100、1至50、1至40、1 至30、1至25、1至20、1至15、1至10或1至5个氨基酸残基置换、缺失和/或插入，其中包括E570Q和K860R置换。在一个具体实施方式
中，本发明的突变多肽与百日咳博德特氏菌CyaA氨基酸序列相比，不携带任何除E570Q和K860R置换外的任何氨基酸残基置换、缺失和/或插入。在一个具体实施方式
中，突变多肽具有SEQ ID N0 2的氨基酸序列，如在图7中所示。在另一个具体实施方式
中，与SEQ ID N0 2的氨基酸序列相比，仅有的进一步氨基酸置换、缺失和 /或插入由全部或部分抑制CyaA蛋白质的腺苷酸环化酶酶促活性的氨基酸置换、缺失和/ 或插入组成，具体而言，诸如，二肽的插入，例如，在188位和189位的氨基酸之间的“LQ”或 “GS” 二肽。 在一个具体实施方式
中，除E570Q和K860R置换外，本发明的突变多肽由于1、2、3、 4、5、6、7、8、9或10个氨基酸残基置换、缺失和/或插入而不同于如SEQ ID N0 1中所述的 CyaA氨基酸序列。在一个具体实施方式
中，除E570Q和K860R置换外，百日咳博德特氏菌的天然CyaA 蛋白质的247位的亮氨酸残基被谷氨酰胺残基(L247Q)或被另一氨基酸残基特别是保守氨
基酸残基置换。作为如本文公开的SEQ ID N0 1所公开的氨基酸序列的片段的本发明突变多肽应当被理解为下述序列，该序列包含一个或更多个片段，所述片段至少具有SEQ ID N0 1氨基酸序列的约350个氨基酸残基及多达约1705个氨基酸残基，具体而言，该序列包含的片段含 SEQ ID N° 1 的至少 400、500、600、700、800、900、1000、1100、1200、1300、1400、1500、 1600个氨基酸残基的连续部分，包括残基E570Q和K860R在内。本发明的突变多肽还可被定义为在SEQ ID N0 2中公开的氨基酸序列的片段，其包含一个或更多个片段，所述片段至少具有SEQ ID N0 2氨基酸序列的约350个氨基酸残基及多达约1705个氨基酸残基，具体而言，其包含的片段含 SEQ ID N° 2 的至少 400、500、600、700、800、900、1000、1100、1200、 1300、1400、1500、1600个氨基酸残基的连续部分，包括残基570和860在内。所述片段优选保留与CDllb/CD18细胞受体结合的能力以及将其N-端结构域易位到靶细胞中的能力。优选地，本发明的突变多肽是这样的片段，该片段具有一段氨基酸残基，其包含SEQ ID N0 1 的氨基酸残基570 (为E570Q)至860 (为K860R)或者氨基酸残基1至860或2至860，直至相对于原始SEQ ID N0 1观察到E570Q和K860R。在优选的实施方式中，所述片段还包含如CyaA蛋白质的SEQ ID N0 1所述的CyaA氨基酸序列的氨基酸残基1166至1281或氨基酸残基1208至1243，用于与⑶lib/⑶18靶细胞相互作用。具体的片段因此包括全部或部分的天然蛋白质C-端部分，该部分负责使本发明的多肽与与靶细胞膜和/或CDllb/CD18受体结合，以及负责随后将该多肽的N-端结构域递送到细胞胞质溶胶中。本发明的具体多肽是CyaA蛋白质的片段，其含有CyaA蛋白质特别是SEQ ID N0 1的氨基酸残基373至1706，直至残基570和860被突变为E570Q和K860R。在另一个优选的实施方式中，作为此种片段的突变多肽包含a)第一氨基酸序列，其对应于一段来自SEQ ID N0 1的至少100个连续氨基酸残基，包括为E570Q的氨基酸残基570，并且与SEQ ID N0 1相比还包括0、1、2、3、4或5个缺失、置换或插入，和b)第二氨基酸序列，其对应于一段来自SEQ ID N0 1的至少100个连续氨基酸残基，包括为K860R的氨基酸残基860，并且与SEQ ID N0 1相比还包括0、1、2、3、4或5个缺失、置换或插入，和优选地c)第三氨基酸序列，其包含如CyaA蛋白质的SEQ ID N0 1所述的CyaA氨基酸序列的氨基酸残基1166至1281或氨基酸残基1208至1243，用于与⑶lib/⑶18靶细胞相互作用。本发明的另一个具体多肽是下述片段，其是对应于具有E570Q和K860R突变的 CyaA蛋白质的一个片段，其中氨基酸残基225至234已经缺失，因此提供了含突变蛋白质的残基1至2 和235至1706的片段。在特别优选的实施方式中，作为与CDllb/CD18受体特异性结合的结果，根据本发明的多肽片段与表达所述受体的细胞结合。在优选的实施方式中，与百日咳博德特氏菌CyaA毒素的腺苷酸环化酶活性相比， 所述多肽在细胞中的腺苷酸环化酶活性被部分或完全抑制。如上所述，表述“CyaA蛋白质” 涉及蛋白质的毒素形式或优选涉及其类毒素形式。因此，所涉及的多肽为CyaA蛋白质的突变体的本发明的每个实施方式适用蛋白质的每一种毒素或类毒素形式。CyaA腺苷酸环化酶或酶促活性的全部或部分抑制应当被理解为，与由cyaA和 cyaC基因在细胞中共表达产生的CyaA毒素的腺苷酸环化酶或酶促活性相比，在细胞环境中将ATP转化成cAMP的能力被全部或部分抑制。如在实施例中所述，通过测量胞内cAMP 水平，可以测定将ATP转化成cAMP的能力。此种全部或部分抑制可以作为遗传失活的结果获得，例如，通过在作为部分催化部位的CyaA氨基酸序列的部位中，即位于SEQ ID N° 1的前400个氨基酸内(AC结构域) 的部位中，引入短氨基酸序列，其包含例如1至10个氨基酸，特别是二肽，或者通过对如SEQ ID N0 1所述的对酶促活性必要的CyaA氨基酸序列的一部分进行缺失或置换。在优选的实施方式中，通过在如SEQ ID N0 1所述的CyaA序列的188位和189位氨基酸之间插入二肽， 例如“LQ”或“GS” 二肽，获得对CyaA酶促活性的全部或部分抑制。这可以通过在cyaA基因编码相的564位的EcoRV位点插入寡核苷酸诸如“CTG CAG”或“CGATCC”完成。参见See Ladant等，1992。可选地，酶促活性的全部或部分抑制还可以通过定向突变获得，例如，通过用Gln残基取代天然CyaA百日咳博德特氏菌蛋白质的58或65位的赖氨酸残基(Glaser 等，1989)。
根据本发明的多肽还可以定义为下述多肽，其可以通过下述从具有根据SEQ ID N0 1、7、8或9的氨基酸序列的CyaA多肽获得a)用谷氨酰胺残基或保守氨基酸残基置换SEQ ID N0 1、7、8的570位或SEQ ID N0 9的569位的谷氨酸残基，b)用精氨酸残基或保守氨基酸残基置换SEQ ID N0 1、7、8的860位或SEQ ID N0 9的859位的赖氨酸残基，和c)任选地，在除a)和b)中所述位置外的位置上进行一个或更多个氨基酸残基置换、插入和/或缺失，条件是如此获得的多肽具有使百日咳博德特氏菌CyaA蛋白质与靶细胞结合并将其N-端腺苷酸环化酶酶结构域或所述N-端腺苷酸环化酶酶结构域的部分易位到所述细胞中的能力。优选地，在步骤a)中，谷氨酸残基被选自Gln、Asn、Met、Thr、kr、Gly、Arg、Lys、 Val、Leu、CyS、Ile、ASp的氨基酸残基置换，最优选被Gln置换。优选地，在步骤b)中，赖氨酸残基被选自Arg、Asn、Gln、Met、Thr、kr、Gly、Val、Leu、Cys、Ile的氨基酸残基置换，最优选被Arg置换。在一个具体实施方式
中，在步骤C)中不进行另外的氨基酸残基置换、插入和/或缺失。具体而言，步骤C)可包含截短任一末端或两个末端。具体而言，C-末端的残基可以被缺失，其程度为直至其不影响CDllb/CD18细胞受体的识别和结合部位。可选地或另外，残基可以在N-末端被缺失，条件是其不影响所获得的突变多肽的易位能力。还可以进行位于除步骤a)和b)中所述那些位置外的位置的天然CyaA蛋白质的一个或更多个残基的内部缺失。在一个具体实施方式
中，步骤c)包含在CyaA多肽的N-端氨基酸序列中的多达380或多个400个氨基酸的缺失，优选地，包含从SEQ ID N0 1、7、8或9的1位氨基酸延伸至SEQ ID N0 1、7、8或9的372位氨基酸的氨基酸段的缺失。优选地，在进行步骤C)后，所得到的多肽包括全部或部分的天然蛋白质的C-端部分，该部分负责使本发明多肽与靶细胞膜和/或CDllb/CD18受体结合，以及负责随后将该多肽的N-端结构域递送到细胞胞质溶胶中。在一个具体实施方式
中，在步骤c)中，SEQ ID N0 1、7或8的氨基酸残基373至1706，或SEQ ID N° 9的氨基酸残基373至1705未被缺失。在优选的实施方式中，在步骤c)中，SEQ ID N。1、7或8的氨基酸残基1208至1243， 或SEQ ID N0 9的氨基酸残基1207至1242未被缺失。在优选的实施方式中，步骤C)包含氨基酸置换、缺失和/或插入，其全部或部分抑制CyaA蛋白质蛋白质的腺苷酸环化酶酶促活性。此种全部或部分抑制可以如下获得通过在位于SEQ ID N0 1、7、8或9的前400个氨基酸(AC结构域)内的部位中引入短氨基酸序列，其包含例如1至10个氨基酸，特别是二肽；或者通过对如SEQ ID N0 1、7、8或9所述的，对酶促活性必要的CyaA氨基酸序列的一部分进行缺失或置换。在优选的实施方式中， 通过在如SEQ ID N。1、7、8或9所述的CyaA序列的188位和189位氨基酸之间插入二肽， 例如“LQ”或“GS” 二肽，获得对CyaA酶促活性的全部或部分抑制。可选地，酶促活性的全部或部分抑制还可以通过定向突变获得，例如，通过用Gln残基取代天然CyaA百日咳博德特氏菌蛋白质的58或65位的赖氨酸残基(Glaser等，1989)。优选地，在步骤c)中，如SEQ ID N° 1、7、8所述的CyaA氨基酸序列的983位的或者SEQ ID N0 9中的982位的赖氨酸残基既未置换也未缺失。在一个实施方式中，该赖氨酸残基被酰化，具体而言，其被棕榈酰化或棕榈油酰化。可选地，该赖氨酸残基未被酰化。优选地，在进行步骤c)后，所得到的多肽具有与SEQ ID N0 1、7、8或9所述的序列共享至少50%、优选至少60%、70%、75%、80%、85%、90%、95%或99%同一性的氨基酸序列。仍优选地，在进行步骤c)后，所得到的多肽具有与SEQ ID N0 1、7、8或9所述的序列不同的氨基酸序列，这是由于源自步骤a)和b)的氨基酸残基置换，以及由于1至500、 具体而言 1 至 400、1 至 300、1 至 200、1 至 100、1 至 50、1 至 40、1 至 30、1 至 25、1 至 20、1 至15、1至10或1至5另外的氨基酸残基置换、缺失和/或插入。在一个具体实施方式
中， 在进行步骤c)后，所得到的多肽由于除在步骤a)和b)中进行的置换之外的1、2、3、4、5、6、 7、8、9或10个氨基酸残基置换、缺失和/或插入而不同于如SEQ ID N0 1、7、8或9所述的 CyaA氨基酸序列。本发明还涉及多肽衍生物，所述多肽衍生物包含进一步与一个或更多个受关注的分子相结合的本发明的突变多肽或由其组成。在优选的实施方式中，受关注的分子当单独采用时或者当与本发明多肽结合时，是一种生物活性分子。所述分子尤其可以具有预防价值或治疗价值，即，可以具有预防或治疗活性，或者可以增强预防或治疗活性。在具体实施方式
中，受关注的分子选自肽、糖肽、脂肽、多糖、低聚糖、核酸、脂质和化学品。在一个具体实施方式
中，所述一个或更多个受关注的分子(molecules of interest)是多肽分子或含多肽分子。其氨基酸序列可包含2至1000个氨基酸残基，优选 5-800,5 至 500、5 至 200、5 至 100、8 至 50、5 至 25、5 至 20 或 8 至 16 或 300-600、400_500
个氨基酸残基。在优选的实施方式中，所述一个或更多个受关注的分子是适合引发免疫应答的异源氨基酸序列(也称为“异种抗原”)，具体而言，是包含表位或由表位组成的氨基酸序列， 其中所述表位包括抗原。如本文所用的，术语“异源的”指的是其本身用在载体中的除突变多肽之外的抗原。如本文所用的，术语“表位”指的是异源分子，尤其是当呈递至宿主的免疫系统时，能引发免疫应答的异源肽。具体而言，此类表位可包含或由8、9、10、11、12、13、14、 15或16个氨基酸残基的段组成。其可以可选地由全长抗原组成或者由抗原片段组成。在一个具体实施方式
中，根据本发明的多肽可以由下述质粒编码，该质粒对应于以登记号CNCM 1-4137(图12)保藏的0VA_QR_AC_质粒，其中编码“OVA”抗原序列的DNA序列被编码包含一个或更多个表位的抗原序列的DNA序列取代。特别地，适合引发免疫应答的多肽分子是引发T-细胞免疫应答的多肽分子，举例而言包括CTL应答。适合引发免疫应答的多肽分子也可以是引发B-细胞免疫应答的多肽分子。在具体实施方式
中，异种抗原选自细菌性病原体的抗原、肿瘤细胞抗原、病毒抗原、逆转录病毒抗原、真菌抗原或寄生虫细胞抗原。特别地，受关注的分子可以是选自下述的抗原=Chlamidia抗原、支原体抗原、肝炎病毒抗原、HIV病毒抗原、流感病毒抗原、脉络丛脑膜炎病毒抗原、肿瘤抗原，或者至少包含表位的任意这些抗原的一部分。
在本发明的多肽衍生物的优选实施方式中，适合引发免疫应答的每一个所述分子的氨基酸序列包含下述的氨基酸序列或由下述的氨基酸序列组成抗原、支原体抗原、肝炎病毒抗原、脊髓灰质炎病毒抗原、HIV病毒抗原、流感病毒抗原、脉络丛脑膜炎病毒序列、肿瘤抗原；或者包含包括至少一个表位的任意这些抗原的氨基酸序列的一部分或由其组成。在特别优选的实施方式中，受关注的分子是肿瘤相关抗原(TAA)。肿瘤相关抗原已经为很多肿瘤所表征，诸如例如黑素瘤，特别是转移性黑素瘤；肺癌；头颈癌；子宫颈癌、 食道癌；膀胱癌，特别是浸润膀胱癌；前列腺癌；乳腺癌；结肠直肠癌；肾细胞癌；肉瘤；白细胞；骨髓瘤。对于这些不同的癌症组织学类型，已经发现，抗原肽在肿瘤样品上特异性表达，并被T细胞识别，特别是被⑶8+T细胞或⑶4+T细胞。Van der Bruggen P.等(Immunological Reviews, 2002, vol 188 :51-64)对发现可作为这些类型肿瘤中的肿瘤相关抗原的肽进行了综述。特别地，所述综述表3中所包含的肽的公开内容在本文中被称为提供了此类肿瘤相关抗原的实例，并且所述表3作为参考被引入本申请。根据Kawakami Y.等(Cancer Sci, October 2004，vol. 95, no. 10，p784_791)的出版物，该出版物也提供了筛选这些抗原或另外一个抗原的方法，下述抗原被引用作为由 T细胞识别的肿瘤相关抗原的实例由各种癌症共享的抗原，包括MAGE(特别是在黑素瘤中)、NY-ES0-1、Her2/neu、WTl、Survivin, hTERT、CEA, AFP、SART3、GnT-V,对一些特定癌症具有特异性的抗原，诸如黑素瘤的日-联蛋白、^1(4、嫩肌-2、1^0、gp 100、MART-I，酪氨酸酶；非白血性白血病的bcr-abl、TEL-AMLl ；前列腺癌的PSA、PAP、PSM、PSMA ；髓细胞性白血病的蛋白酶3 ；乳腺癌、卵巢癌或胰腺癌的MUC-I ；淋巴瘤、ATL或子宫颈癌的EBV-EBNA、 HTLV-I tax ；肾细胞癌的图标HLA-A2 ；非白血性白血病/淋巴瘤的HAl。也已经描述了动物中的肿瘤相关抗原，诸如影响猫或狗的肿瘤中的环化素Dl和环化素D2。由T细胞识别的肿瘤相关抗原也已经在Novellino L.等(Immunol Immunother 2004,54 :187-207)中公开。更通常地，本发明中受关注的TAA是对应于突变抗原，或对应于在肿瘤细胞上过表达的抗原、对应于共享抗原、组织特异性分化抗原或对应于病毒抗原的那些。在本发明的具体实施方式
中，肿瘤相关抗原是乳头瘤病毒属(HPV)的抗原或者是酪氨酸酶。根据本发明的另一个具体实施方式
，包含表位或由表位组成的多肽分子的氨基酸序列已经相对于其天然氨基酸序列进行了修饰，例如，以便减少该序列内带负电氨基酸残基的数目。通过去除这些带负电氨基酸残基中的一些，或者还通过添加一些带正电的氨基酸残基，特别是作为表位的侧翼残基，可以获得此类修饰。因此包含较少带负电残基的多肽可能有利于将本发明的多肽衍生物的催化结构域易位到靶细胞的胞质溶胶中。包含表位或抗原或由其组成的多肽分子的氨基酸序列还可以以下述途径设计，当其被插入本发明的多肽衍生物中时其是展开的，这改进了根据本发明的目标分子内化进入靶细胞中的效率。在作为其氨基酸含量而经历折叠的多肽中，这种展开例如可通过去除或置换半胱氨酸残基以便避免形成二硫键获得，二硫键可参与多肽的折叠。在一些情况中，通过在还原剂的存在下制备多肽能够防止其折叠，还原剂能够避免在体内重折叠。在一个具体实施方式
中，氨基酸序列特别是抗原可包含隐蔽表位或由隐蔽表位组成。发明人实际已经确定，多肽衍生物构建物，作为其在构建物中呈递的结果，能够使所述抗原的隐蔽表位变成免疫原性的，所述多肽衍生物构建物包含(i)本发明的多肽，其为根据本文所公开的定义的CyaA蛋白质的突变体(多肽突变体)，和(ii)具有下述氨基酸序列的多肽分子，所述氨基酸序列含一种或数种抗原的一个或几个抗原片段。特别地，在靶细胞中加工所述构建物，其包括如在本发明中定义的突变多肽，包含得自受关注的抗原的多肽分子，特别用于预防或治疗应用，包括免疫治疗接种目的，其中作为突变多肽的N-端结构域易位的结果，使多肽分子内化。此种加工能够通过靶细胞的I类MHC分子实施表位呈递，并且所述表位可包含抗原的隐蔽表位，其被允许变成免疫原性的，并且具体而言被允许提高宿主中的T-细胞应答，特别是CTL应答。本发明因此还涉及多肽衍生物，特别是包含一种或几种多肽分子的重组蛋白质， 所述多肽分子具有氨基酸序列，该氨基酸序列含一种或数种抗原的一个或多个表位，或含所述抗原，所述多肽分子的所述氨基酸序列被插入相同或不同的部位中，特别是根据本发明的突变多肽的不同许可位点中，所述重组蛋白质保留CyaA毒素靶向抗原呈递细胞(APC) 的性质，其中所述表位中的至少一个是亚优势隐蔽T-细胞表位，并且其中所述多肽衍生物，特别是所述重组蛋白质，能够引发针对所述多肽分子的抗原特异性应答。在根据本发明的多肽衍生物的具体实施方式
中，一个或更多个氨基酸序列被插入一个或更多个位点中，特别是许可位点中。对于本发明，“许可位点，，是CyaA蛋白质序列中的位点，多肽可被插入该位点，而不会实质上影响需要的CyaA蛋白质功能性质，特别是不会实质上影响细胞的靶向，具体是 CyaA的抗原呈递细胞(APC)的靶向，包括不会实质上影响与CDllb/CD18受体的特异性结合，以及有利地不会实质上影响参与使CyaA N-端结构域进入靶细胞中的易位过程的蛋白质的结构域。选择许可位点的方法呈现在例如W093/213 (Ladant等、1992)以及Osicka等、 2000 (Infection and Immunity,2000,68 (1) :247-256)中。具体而言，利用双选择的方法 (抗生素抗性以及通过互补在比色皿上的比色测试)使得能够在编码毒素的N-端催化结构域的基因部分容易地鉴定寡核苷酸插入(其保存了阅读框)。可容易地分析这些突变对所述毒素的催化活性的功能结果，包括遗传学方面的(大肠杆菌cya—菌株的功能互补) 以及生物化学方面的(表征修饰腺苷酸环化酶的稳定性、其酶促活性、其与caM的相互作用等)。该方法使得能够筛选大量突变，以便鉴定对抗原决定簇的插入潜在有利的部位。允许CyaA催化结构域易位并因此允许被插入许可位点中的氨基酸序列易位的百日咳博德特氏菌腺苷酸环化酶的许可位点包括但不限于残基137-138 (Val-Ala)、 残基 224-225(Arg-Ala)、残基 228-229(Glu-Ala)、残基 235-236(Arg-Glu)和残基 317-318 (Ser-Ala) (Sebo等，1995)。下述另外的许可位点也包括在本发明的实施方式中残基 107-108(Gly-His)、残基 132-133(Met-Ala)、残基 232-233(Gly-Leu)和 335-336 (Gly-Gln)与336-337。然而，在本发明中可以使用其他许可位点，其可通过例如应用上面所述的方法鉴定，特别是CyaA蛋白质的残基400与1700之间的位点。对于其他博德特氏菌属种，通过序列比较并测定相应的残基，可定义相应的许可位点。
根据另一个实施方式，所述一个或更多个氨基酸序列多肽此外或可选地可被插入本发明多肽的一个和/或另一末端(端部)，优选插入缺乏百日咳博德特氏菌CyaA蛋白质的全部或部分N-端催化结构域且更优选缺乏残基1-373的突变CyaA多肽的N-末端。根据一个具体实施方式
，所述适合引发免疫应答的一个或更多个氨基酸序列被接枝到所述多肽的氨基酸残基上。根据本发明，氨基酸序列与CyaA突变多肽的“结合”(或插入)以提供所谓的多肽衍生物，也称为“重组蛋白质”或“杂合蛋白质”，包括特别是通过可用的DNA技术进行的基因插入。可选地，“结合”还包括非基因插入，包括化学插入，例如特别是在氨基酸序列的一个末端进行的共价偶联，或者非共价偶联。当待被插入的氨基酸序列是合成或半合成时，非基因插入是特别受关注的。用于使药物与多肽偶联的方法在本领域是熟知的，并且包括例如通过使用N-吡啶基磺酰-活化的巯基的二硫键。具体而言，通过化学键或基因插入能够使分子与本发明的多肽接枝，用于体内靶向CyaA靶细胞，诸如APC，例如CDllb/CD18正细胞(positive cells)，以及特别是所述细胞的胞质溶胶。的确，当使对应于特定CD8+T-细胞表位的分子与解毒CyaA的催化结构域偶联时，或者通过二硫键或者通过基因插入，已经发现，基因工程分子能够引发体内特异性 CTL应答，从而显示所述⑶8+T-细胞表位被易位到⑶lib-表达细胞的胞质溶胶中。在本发明优选的实施方式中，突变CyaA多肽被用于制造蛋白质载体，或用于制备组合物，所述组合物具体设计为在⑶8+细胞毒T-细胞应答(CTL应答)遵循受关注的分子修饰的(特别是重组的或缀合的)突变CyaA多肽靶向CDllb表达细胞时，引发所述应答， 之后使受关注的分子易位到所述CDllb表达细胞具体而言骨髓树枝状细胞的胞质溶胶。就此而论，受关注的分子优选为表位或抗原或包含表位或抗原。在本发明另一个优选实施方式中，突变CyaA多肽被用于制造蛋白质载体，或用于制备组合物，所述组合物具体设计为在⑶4+细胞毒T-细胞应答(CTL应答)遵循受关注的分子修饰的(特别是重组的或缀合的)腺苷酸环化酶靶向⑶lib表达细胞具体而言骨髓树枝状细胞时，引发所述应答。就此而论，受关注的分子优选为表位或抗原或包含表位或抗原。突变多肽还可以用于制造用于使预防或治疗性化合物靶向⑶lib表达细胞的蛋白质载体。就此而论，在本发明的一个具体实施方式
中，所谓的受关注的分子具有预防或治疗价值，并且具体而言为药物。所述预防或治疗性化合物以及具体而言所述药物可以与突变多肽化学或基因偶联。使化合物与多肽偶联的方法在本领域是熟知的，并且包括例如通过使用N-吡啶基磺酰活化的巯基的二硫键。在一个实施方式中，受关注的分子是消炎化合物，所述消炎化合物当与突变多肽偶联时，特异性靶向参与炎症应答的细胞的表面，诸如树枝状细胞或中性白细胞。更具体而言，选择性CD8+细胞毒性细胞引发的抗原呈递主要由骨髓树枝状细胞进行。因此，在一个具体实施方式
中，用于制造蛋白质载体的突变CyaA多肽是基因修饰腺苷酸环化酶，其含有一个或多个通过二硫键化学偶联于位于突变CyaA多肽催化结构域内的基因插入半胱氨酸残基的分子。实际上，通过与位于催化结构域内不同许可位点处的不同半胱氨酸残基的二硫键，多个分子可以与突变CyaA多肽化学偶联。
本发明的突变多肽或多肽衍生物适合用于治疗或预防。治疗或预防效果意图指对患者的状况有益的任何效果，只要其是治疗性或或者足以限制病理状态的症状或后果，包括限制病理状态的进展。治疗或预防效果也包括预防病理状态的发作。本发明的突变多肽或多肽衍生物特别适合在需要其的宿主中引发细胞介导的免疫应答诸如T-细胞免疫应答或B-细胞免疫应答。其包括CTL和Th，特别是Thl应答，包括 ⑶4+T细胞应答和/或⑶8+T细胞应答。源自CyaA蛋白质的多肽引发细胞介导免疫应答的能力在动物中足以预防体内肿瘤生长，甚或能够肿瘤退化。其还可通过经由TLR激活而激活免疫应答的先天成分以及通过使用化学治疗剂向下激活免疫应答的调节成分得以增强。本发明提供下述方法，该方法作为已经被选择的结合突变E570Q和K860R的结果，应当能够使此类结果以改进的安全状态获得。本发明因此还涉及治疗方法，该方法包括向动物或人类患者施用根据本发明的突变多肽或多肽衍生物，以在需要其的宿主中引发T-细胞免疫应答或B-细胞免疫应答。根据本发明的突变多肽或多肽衍生物可特别用于预防或治疗选自瘤形成、癌症和传染病的疾病，所述传染病选自病毒、逆转录病毒、细菌或真菌诱发的疾病。具体而言，多肽衍生物可以用于在患者中治疗HIV感染。特别提供的是，在本发明的具体实施方式
中，按照公认的肿瘤分类临床标准，CyaA 突变多肽或多肽衍生物相比表面肿瘤(superficial tumors)更适合治疗浸润或血管化肿瘤，或者相比原发性肿瘤更适合治疗转移性肿瘤，。实体瘤尤其是通过使用本发明的多肽衍生物来治疗的靶标。在可以作为用本发明的多肽衍生物进行治疗的候选物的肿瘤中，描述了下述作为实例，其肿瘤相关抗原已被表征黑素瘤，特别是转移性黑素瘤；肺癌；头颈癌；子宫颈癌、食道癌；膀胱癌，特别是浸润膀胱癌；前列腺癌；乳腺癌；结肠直肠癌；肾细胞癌；肉瘤；白血病；骨髓瘤。对于这些各种组织性类型的癌症，已经显示，抗原肽在肿瘤样品上特异性表达而且被T细胞识别，特别是被⑶8+T细胞或⑶4+T细胞识别。本发明还涉及根据本发明的多肽衍生物在制备用于治疗选自瘤形成、癌症和传染病(所述传染病选自病毒或逆转录病毒诱发的疾病)的疾病的治疗在组合物中的应用。在优选的实施方式中，根据本发明的多肽或多肽衍生物可与佐剂结合和/或与另一治疗活性分子或药剂结合施用给患者。在本发明的上下文中，所述“另一治疗活性分子或药剂”是可能对其所施用的患者的状况有益的物质。其尤其是适合用于制造药物的有效成分。其可以是适合加强增加或调节治疗有效成分的效果的化合物。突变CyaA多肽或其多肽衍生物可以与治疗活性分子或药剂一起施用，特别适合在患者中引发免疫应答的治疗活性分子或药剂。具体而言，突变CyaA多肽或其多肽衍生物可以与治疗活性分子一起施用，该治疗活性分子适合特别是通过降低或阻断调节T细胞免疫抑制能力来调节患者中的细胞应答。根据本发明的具体实施方式
，在调节细胞应答上的此类效应可以借助调节T细胞和/或调节另一细胞抑制应答诸如骨髓抑制细胞应答的药剂获得，所述药剂通过下述行为靶向所述调节细胞特别是T细胞排除或钝化这些细胞(诸如利用CD25-特异性抗体，或环磷酰胺)、更改所述细胞特别是调节T细胞的运输(诸如CCL22-特异性抗体)或更改所述细胞的分化和发信号(诸如通过阻断F0XP3(forid!ead box P3)信号)。根据本发明的具体实施方式
，调整调节细胞应答的药剂靶向抑制分子，特别是存在于APCs上的此类分子(诸如B7-H1、B7-H4、ID0(吲哚胺2，3_ 二氧酶)或精氨酸酶)或存在于T细胞(诸如CTLA4 (细胞毒T-淋巴细胞-相关抗原4)或PDl (程序性细胞死亡 1))上的此类分子，或者靶向可溶性免疫抑制分子(诸如TGF beta(转化生长因子)、IL-10、 VEGF (血管内皮生长因子)、C0X2 (环氧化酶2))。作为对调节细胞应答具有影响的药剂的实例，提出细胞毒剂，其能杀死调节T细胞或其他免疫抑制细胞，或者其能阻断它们的活性和/或发育和/或积聚。在本发明的具体实施方式
中，调整调节细胞应答特别是调节T细胞应答的药剂是化学治疗剂。特别地，其选自已知作为抗癌剂并用在化学治疗中的化学治疗剂。此类药剂包括有助于降低肿瘤负荷的那些药剂、通过增加肿瘤细胞对治疗的灵敏度而作用的那些药剂，或者能够杀死或钝化免疫调节细胞的那些药剂。在本发明范围内使用的化学治疗剂因此增强抗肿瘤免疫。在本发明的具体实施方式
中，化学治疗剂是烷化剂。特别地，其为环磷酰胺(CTX) (Sigma, Steinheim, Germany)。环磷酰胺能够排除或钝化调节T细胞。在本发明的另一个具体实施方式
中，化学治疗剂是嵌入剂。在一个具体实施方式
中，化学治疗剂是阿霉素(DOX) (Calbiochem, La Jolla, CA, USA)。化学治疗剂有利地以低剂量施用。突变CyaA多肽或其多肽衍生物还可以与佐剂组分一起施用，该佐剂组分适合激活由患者中的肿瘤引发的先天免疫应答。在本发明的具体实施方式
中，所述佐剂组分选自核酸、肽聚糖、糖类、肽、细胞因子、激素和小分子，其中所述佐剂组分能够经过图式识别受体(PRR)发信号。已知PRRs通过识别来自病原体的所谓的进化保守标记(病原体相关性分子图式、 PAMPs)而介导对病原体以及对肿瘤的先天免疫应答。PRR存在于多种免疫细胞上，所述免疫细胞包括树枝状细胞、自然杀伤细胞、B细胞，以及还存在于一些非免疫细胞诸如上皮细胞或内皮细胞上。PRR及其参与先天免疫应答描述于I^ashine A.等中(Nature medicine supplement volume 11, N° 4, April 2005)。具体而言，用于激活先天免疫应答的佐剂组分可以靶向PRR并因此通过PRR激活发信号，其中所述PRR包括Toll-样受体或核苷酸结合寡聚结构域(NOD)或C型凝集素。在本发明的具体实施方式
中，所述佐剂组分是Toll-样受体(TLR)激动剂。所述 Toll-样受体激动剂特别被配制为有效激活患者的先天免疫系统。所述TLR激动剂能够结合TLR，即，其为TLR的配体，并且还能够增强在所述TLR的控制下引发的免疫应答。为了说明起见，TLR激动剂选自TLR-9、TLR-8、TLR-3和TLR-7激动剂。然而，其他 TLR受体的激动剂可用于实施本发明，诸如TLR2、TLR4、TLR5受体的激动剂。在本发明中所用的TLR激动剂可以是天然或合成的激动剂。其可以是相同或不同toll-样受体的不同激动剂的组合。根据本发明的具体实施方式
，所述TLR激动剂是免疫刺激核苷酸序列，特别是稳定的核苷酸序列，例如作为结构修饰诸如硫代磷酸修饰的结果进行的稳定化。核苷酸序列还可以被保护免于特定配制物引起的降解。特别地，其脂质体配制物，例如脂质体混悬液， 对有效施用免疫刺激核苷酸序列可以是有利的。在本发明的具体实施方式
中，免疫刺激核酸序列是单链RNA。在本发明的具体实施方式
中，免疫刺激核苷酸序列包括CpG基序，而且特别是CpG 寡核苷酸(CpG ODNs) 0作为合适的CpG寡核苷酸的实例，本发明提供TLR-9配体，诸如A型 CpG 0DN，S卩，具有核苷酸序列 5，-GGGGGACGATCGTCGGGGGG-3，的 CpG 2216，或 B 型 CpG 0DN, 即，具有核苷酸序列 5，-TCCATGACGTTCCTGACGTT-3，的 CpG 1 拟6。CpG寡核苷酸可以在与DOTAP (Roche Manheim, Germany)复合之后使用，以便保护其免于降解以及促进其吸收。根据本发明的另一个具体实施方式
，所述TLR激动剂是小分子。适合作为TLR激动剂的小分子例如是咪唑并喹啉胺衍生物，诸如命名为R848(瑞喹莫德)的咪唑并喹啉胺衍生物，即，4-氨基-2-乙氧甲基_a，a、二甲基-I-H-咪唑并W，5c]喹啉乙醇，得自 hvivogen，，其为TLR-7配体，或者命名为R837 (imiqimod)的咪唑并喹啉胺衍生物，得自 Aldara，其为TLR-7激动剂。适合作为TLR激动剂的其他分子是作为TLR-3配体的聚尿苷(pU)或者作为TLR-7 配体的聚胞苷酸(PIC)。这些分子可被配制成促进其吸收和/或保护其免于降解。这些分子还可以作为脂质体配制物制得，特别是作为脂质体混悬液，用于适用给患者。根据本发明的另一具体实施方式
，所述佐剂组分可以是细胞类佐剂组分。其实例为树枝状细胞，该树枝状细胞抑制能够引发淋巴细胞应答，此类树枝状细胞在其施用之前能够先体外后体内进行调节，以便增加其T细胞应答刺激活性。树枝状细胞因此能够用与 PRR相互作用的佐剂来刺激，包括TLR配体或激动剂(Pashine A. et al Nature Medicine Supplement Volume 11, N° 4, April 2005 ρ S63-S68)。可选地，根据本发明的多肽或多肽衍生物可在无佐剂时施用给患者。事实上，发明人之前已经表明，在单次静脉注射重组毒素之后，可以体内引发对载体化抗原(vectorized antigen)特异性的CTL，特别是无需提供异源佐剂。这些结果，特别是表位对骨髓树枝状细胞的特异性靶向实现了无需佐剂和CD4+T细胞协助。因此，本发明还涉及与分子特别是受关注的肽相重组的突变CyaA多肽制备组合物的应用，该组合物配制用于静脉施用并且能够体内实施CD8+T细胞免疫应答，所述组合物不含异源佐剂。本发明同样还涉及这种组合物。本发明还涉及治疗方法，包括向患有选自瘤形成、癌症和传染病的疾病的动物或人类患者施用根据本发明的突变多肽或多肽衍生物，所述传染病选自病毒、逆转录病毒、细菌或真菌诱发的疾病。突变多肽或多肽衍生物具体而言可以与治疗活性分子和/或佐剂一起施用。突变CyaA多肽或多肽衍生物、治疗活性分子和/或佐剂可以作为药物组合物的一部分一起施用，该药物组合物不含药学上可接受的载体或赋形剂。
可选地，本文所述的实施本发明的各种分子类型在时间上可以同时施用(特别是对于突变CyaA多肽或多肽衍生物和佐剂)或者在时间上分开施用(特别是对于突变CyaA 多肽)。在施用突变CyaA多肽或多肽衍生物和/或佐剂之前和之后，可以可选地实施治疗活性分子的施用。其在时间上可以是顺序的。可以采纳的具体疗法是重复施用方案，特别是这样的方案，其包括两轮或更多轮施用至少一种选自突变CyaA多肽或多肽衍生物、治疗活性剂和/或佐剂的化合物。本发明还涉及药物组合物，其包含根据本发明的突变CyaA多肽或多肽衍生物、药学上可接受的载体或赋形剂以及任选的佐剂和/或另一种治疗活性分子。本发明还涉及组分的试剂盒，其包含突变CyaA多肽或多肽衍生物、治疗活性分子和/或佐剂。本发明组分试剂盒或组合物的化合物尤其可通过静脉施用、瘤内施用或皮下施用而被给予患者。本发明的组分试剂盒或组合物具有下述能力(i)通过本申请公开的突变CyaA多肽或多肽衍生物靶向适应性免疫应答，(ii)通过治疗活性剂下调调节免疫应答，以及如果佐剂存在的话，(iii)通过经佐剂激活所述先天应答而靶向免疫应答的先天成分。本发明还涉及治疗需要本文所公开的组分试剂盒或组合物的组分的患者的方法， 所述患者为人类或动物患者，包括施用本文所公开的组分试剂盒或组合物的组分的步骤。本发明具体而言还涉及新型免疫原性组合物，其被配制为在动物或人类宿主中施用，特别是静脉施用，特征在于其包含重组CyaA多肽衍生物，该衍生物包括插入催化结构域中的抗原。本发明进一步涉及用于在人类或动物中施用的药物组合物，其配制为使受关注的分子特异性靶向CDllb表达细胞，特征在于所述关注分子如本文所述与突变CyaA多肽偶联。在另一个具体实施方式
中，所述药物或免疫原性组合物包含编码重组CyaA多肽衍生物的核酸构建物，所述重组CyaA多肽衍生物包含如本文定义的、与关注分子偶联的 CyaA突变多肽。此外，本发明还涉及如上所定义的免疫原性组合物在制备用于施用给动物或人类宿主的疫苗或免疫治疗组合物方面的应用。如本文所用的，术语“免疫治疗组合物”涉及下述组合物，其导致免疫应答，而且其与治疗性治疗相关，诸如对抗瘤形成、癌症、病毒感染、真菌感染、寄生虫感染或细菌感染的治疗。本发明还涉及使动物或人类宿主免疫的方法，其中所述方法包括下述步骤a)提供如上定义的免疫原性组合物；b)向所述宿主施用所述免疫原性组合物，优选经由静脉内途径，以便促进免疫应答。具体而言，本发明的免疫原性组合物能够体内或体外诱导或刺激涉及特异性树枝状细胞的免疫细胞应答。本发明的免疫原性组合物具体而言可用于对患者的预防或治疗接种。
因此，在一个具体实施方式
中，所述免疫原性或药物组合物有利地不含本领域中常用的引发助剂(priming adjuvant)，诸如氢氧化铝。本发明还涉及制备适合将目标分子递送到细胞中的蛋白质载体的方法，包括使目标分子与如本文定义的CyaA突变多肽结合。本发明还涉及核酸分子，具体而言DNA或RNA分子，其编码如上定义的多肽或多肽衍生物。本发明还涉及真核或原核细胞，其包含如上所定义的核酸分子。本发明也涉及真核细胞，优选哺乳动物细胞，其包含如上所定义的突变CyaA多肽或多肽衍生物。在优选的实施方式中，所述细胞是人类细胞。本发明还涉及真核细胞，优选哺乳动物细胞，其用如上所定义的蛋白质载体转化。
图1.在成孔和酰化结构域中的置换协同作用减小CyaA的特异性溶血活性。㈧ 将TNC缓冲液中的绵羊红细胞(5x107ml)用5 μ g/ml酶促活性CyaA蛋白质在37°C温育。 30min后，将等分试样的细胞悬液反复洗涤以去除未结合CyaA，并用来测定细胞伴随和细胞浸入AC活性。在温育5小时后测量溶血活性，其为光度测定(A541)的已释放血红蛋白的量。完整CyaA的活性取为100%。(B)如上用所示浓度的酶促活性CyaA衍生蛋白质温育红细胞30分钟，洗涤，测定细胞结合AC酶活性的量。(C)具有K860R置换的蛋白质与细胞结合活性的降低通过使其浓度从5 μ g/ml增至25 μ g/ml来补偿。所存在的CyaA/2330VA(CyaA/ OVA)的活性取值为100%。结果表示来自重复试验进行的至少三个独立实验的平均值。 星号表示来自CyaA活性(图1A)或CyaA/0VA(图1C)活性的统计学显著性差异(**，ρ < 0. 001)。图 2. CyaA/0VA/E570Q+K860R 结合并易位到 CDl Ib+单核细胞中。(A) J774A. 1 细胞 (106/ml)在D-MEM中在4°C用2. 5 μ g/ml CyaA温育30分钟，反复洗涤，并在细胞溶解物中测定细胞结合AC活性的量。为封闭⑶lib/⑶18受体，将细胞用10 μ g/ml终浓度的⑶lib-特异性抗体 Ml/70(Exbio、Czech Republic)温育 30 分钟，之后添加 CyaA(**，ρ < 0. 001)。 (B)构建物的AC结构域易位能力被评价为穿透细胞并将胞质ATP转化为cAMP的能力。在 37°C, J774A. 1细胞用CyaA构建物温育30分钟，测定在细胞溶解物中累积的cAMP的量 01)。作为对照，如上用抗-⑶lib抗体M1/70封闭⑶lib/⑶18受体。通过使用双重突变 CyaA/E570K+E581P变体，控制CDl lb/CD 18-结合且内吞毒素的膜穿透，所述双重突变CyaA/ E570K+E581P变体对于受体结合而言是完整的，但是不能将AC结构域跨过细胞膜易位以及升高胞质 cAMP 浓度(Vojtova-Vodolanova 等，2009)。(C)在 Pluronic F-127
的存在下，J774A. 1细胞用K+敏感性荧光探针PBFI/AM以9.5 4 11最终外浓度于25°〇装载45min。在HBSS中洗涤细胞，之后添加3 μ g ml—1所示毒素。每1 记录反映胞内K+浓度的PBFI荧光强度比(激发波长340，发射波长450和510nm)。右侧标尺显示得自校准实验的胞内[K+]值(参见实验步骤)。在测定的时间间隔内没有观察到细胞溶解，其以乳酸脱氢酶释放评价。显示了代表重复试验进行的独立测定的结果。图3. E570Q+K860R类毒素不透化J774A. 1细胞。(A) J774A. 1细胞的溶解测定为用3、10和30 μ g πιΓ1所示蛋白质以37%在无血清的DMEM中温育3小时后从IO5细胞释放的乳酸脱氢酶的量。所述结果表示在以重复试验进行两个实验中获得的值的平均数。(B) 如在材料和方法中所述，在室温下暴露于1或10 ii g/ml CyaA/2330VA/AC_或CyaA/2330VA/ E570Q+K860R/AC_蛋白质的单J774A. 1细胞上，进行全细胞膜片钳测量。所示的曲线代表3 个独立实验中的六个测定。图4.含E570Q+K860R置换的类毒素递送OVA T细胞表位，用于呈递MHC类别 I分子的呈递以及⑶8+CTLs的诱导。㈧在所示浓度(0至60nM)的、包埋OVA表位或 具有模拟CyaA/AC_的类毒素的存在下，温育用作APCs的BMDC(3xl05细胞/孔)。在与 B3Z T细胞(IxlO5细胞/孔)共培养M小时后，通过CTLL增殖方法测定由刺激B3Z细 胞引发的IL-2分泌。结果表达为所引入的[3H]胸苷的Acpm(类毒素存在时的cpm-毒 素不存在时的cpm) 士SD，并且其代表五个独立实验。(B)分析通过体内杀伤测定诱导的 OVA (SIINFEKL)-特异性CTL应答。在第0天，小鼠接受50mg静脉注射的模拟AC_或OVA/ AC_类毒素，在第7天，对小鼠静脉注射OVA (SIINFEKL)肽加载的CFSEs和未加载的CFSEte 脾细胞混合物(1 1)。通过FACS分析，测定20小时后脾脏中保留的CFSE-正细胞数目， 如在上图曲线集合中一个代表性体内杀伤测定所记录的，其中指出了在出口(gate)中的 细胞百分比。下图显示三个独立实验的体内杀伤测定的汇集结果。斯氏t检验测定统计学 显著性(0VA/ACT 对 0VA/E570Q+K860R/ACT，p = 0. 75)。图5. CyaA对膜作用的模型。(A)所述模型预测在溶液中两种CyaA构象体之间的 平衡，其中每一个以不同构型被插入细胞膜中。一个将产生单体CyaA易位前体，将AC结构 域递送到胞质溶胶中并使钙离子伴随流入细胞中。所述构象体将作为孔前体寡聚化插入 CyaA孔中。(B) E570Q和K860R置换的协同效应将选择性阻断CyaA孔前体寡聚进入孔中的 能力，而越过膜递送AC结构域的易位前体的能力保持不受影响。图6.百日咳博德特氏菌CyaA毒素的氨基酸序列(SEQ ID N。1)。图7.百日咳博德特氏菌CyaA/E570Q+K860R突变体的氨基酸序列(SEQ ID N0 2)。图8.百日咳博德特氏菌CyaA/E570Q+K860R/AC_突变体的氨基酸序列(SEQ ID N° 3)。图9.百日咳博德特氏菌CyaA/2330VA/E570Q+K860R/AC_突变体的氨基酸序列 (SEQ ID N° 4)。图 10.编码 CyaA/E570Q+K860R/A(T 突变体的质粒 ^R-A(T)。图 11 编码 CyaA/E570Q+K860R/A(T 突变体的 QR-ACT 质粒的 DNA 序列(SEQ ID
N° 5)。图 12.编码 CyaA/2330VA/E570Q+K860R/A(T 突变体的质粒(OVA-QR-ACT)。图 13.编码 CyaA/2330VA/E570Q+K860R/A(T 突变体的 OVA-QR-ACT 质粒的 DNA 序列 (SEQ ID N° 6)。图14.副百日咳博德特氏菌CyaA毒素的氨基酸序列(登记号CAB76450、SEQ ID
N° 7)。图15.欣氏博德特氏菌CyaA毒素的氨基酸序列(登记号AAY57201、SEQ ID N° 8)。图16.支气管败血性博德特氏菌CyaA毒素的氨基酸序列(登记号CAA85481、SEQ ID N° 钔。实施例腺苷酸腺苷酸环化酶毒素越过靶细胞膜易位而不形成孔材料和方法CyaA蛋白质的构建、生产和纯化。先前描述了产生CyaA/AC_、CyaA/2330VA、 CyaA/E570Q和CyaA/K860R构建物的修饰(13、20、21)，并且这些修饰被单独或组合地引入 CyaA/2330VA/AC_中。CyaA-衍生蛋白质在大肠杆菌XL-I Blue中生产并纯化接近均质，如前所述09)。在疏水色谱法期间，将带有结合毒素的树脂用60%异丙醇反复洗涤(30)，以降低CyaA样品的内毒素含量至低于100IU/mg蛋白质，如通过LAL assay QCL-1000 (Cambrex) 所测。含编码CyaA/E570Q+K860R/AC_突变体的QR-AC—质粒(图10)的大肠杆菌 XLl-Blue菌株(Stratagene)于2009年3月18日以登记号CNCM 1-4136(图10)保藏于 CNCM(Collection Nationale de Cultures de Microorganismes,France)。QR-ACT质粒的 DNA序列(SEQ ID N。5)公开在图11中。含编码CyaA/2330VA/E570Q+K860R/A(T 突变体的 OVA-QR-ACT 质粒(图 12)的大肠杆菌XLl-Blue菌株(Stratagene)于2009年3月18日以登记号CNCM 1-4137(图10)保藏于 CNCM(Collection Nationale de Cultures de Microorganismes,France)。 OVA-QR-ACT质粒的DNA序列(SEQ ID N0 6)公开在图13中。在绵羊红细胞上的细胞结合和红外溶血活性。将在50mM Tris pH 7. 4、150mM NaCl和2mM CaCl2 (TNC缓冲液)中的5xl08已洗绵羊红细胞在370Cffi 5 μ g/ml CyaA蛋白质温育，并如先前详细所述测定CyaA的细胞结合、细胞入侵AC溶血活性(13)。利用单向方 WMfi^ (ANOVA) UR Bonferroni post-test (SigmaStat v. 3. ll>Systat>San Jose>CA) 分析活性值的差异显著性。CyaA的巨噬细胞结合、cAMP提高以及溶细胞能力。使J774. Al鼠单核细胞/巨噬细胞(ATCC、编号TIB-67)在湿润空气/0)2(19 1)气氛中在补充有10% (ν/ν)热灭活胎牛血清、青霉素(100IU ml—1)、链霉素(100 μ g ml—1)和两性霉素B(250ng ml—1)的RPMl培养基中培养。在测定前，用不含FCS的达尔伯克改良伊格尔培养基(DMEM) (1.9mM Ca2+)代替RPM1，并使细胞在DMEM中于37°C在湿润5% CO2气氛(8)中保持lh。使J774A. 1巨噬细胞(106)在D-MEM中用2. 5 μ g/ml CyaA变体在4°C温育30min，之后通过在D-MEM洗三次去除未结合的毒素。将细胞用0. 1% Triton X_100溶化，测定细胞结合AC活性。对于胞内cAMP测定，使IO5细胞用CyaA在含100 μ M IBMX (3-异丁基-1-甲基黄嘌呤)的D-MEM 中温育30分钟，通过添加在IOOmM HCl中的0. 2% Tween-20终止反应，使样品在100°C煮沸15min，通过添加150mM未缓冲咪唑中和，并入所述测量cAMPQ9)。为封闭⑶lib/⑶18 受体，将细胞在冰上用CDl Ib-特异性封闭MAb Ml/70(Exbio、Czech Republic)以IOyg/ ml的终浓度预温育30分钟，之后添加CyaA。利用CytoTox 96试剂盒检验(ftOmega)测定毒素诱导的J774A. 1细胞，其为用10 μ g/ml适宜蛋白质在37°C在D-MEM中温育3小时时从 IO5细胞中所释放的乳酸脱氢酶的量，如所述(8)。如上分析活性值的差异显著性。膜片钳测量。在浸入HBSS(140mM NaCl、5mM KCl、2mM CaCl2、3mM MgCl2UOmM H印eS-Na、50mM葡萄糖；pH 7. 4)中的J774A. 1细胞上进行全细胞膜片钳测量。使外径约3口111的烧边玻璃微量加液器填充1251111葡萄糖酸钾、151111 KC1、0. 5mM CaCl2UmM MgCl2、5mM EGTAUOmM HEPES-KOH pH 7. 2的溶液。所得到的微电极的电阻是3至5ΜΩ。在-40mV夹细胞，在IkHz滤过数据，在2kHz利用Axopatch 200A放大器、Digidata 1320A数字转换器和 PClamp-9 软件包(Axon Instruments, Foster City、CA)使数字数据化。胞质K+浓度降低的测定。在HBSS中洗涤在盖玻片上生长的细胞，并在0.05% (w/ w)Pluronic F-127 (Sigma、St. Louis、MO)的存在下在 25°C加载 9. 5 μ M PFBI 乙酰氧基甲酯(PBFI/AM、Molecular Probes、Eugene、OR、USA) 30min。在 25°C利用装备有 DataMax 软件的FluoroMax-3荧光分光光度计(Jobin Yvon Horriba,France)进行放射测量。每15s 记录PBFl的荧光强度(激发波长340，发射波长450和510nm)，并且每个波长的积分时间是3s。显示450/510nm波长比。所观察到的安装在Icm小池中的盖玻片面积是约10mm2， 对应于约IO4细胞。在分别含各种浓度的醋酸钾(10、30、60或140mM)和醋酸钠(135、115、 85或5mM)的50mM HEPES、pH 7. 2中，在用3pM真菌霉素或尼日利亚菌素透化30分钟的细胞上，在进行校准实验。最终的强度比G50/510nm)示于绘图的右侧垂直轴上。小鼠和细胞系。使得自Charles River Laboratories的雌性C57BL/6保持在无特异性抗原条件下并根据惯例指导处理。CTLL-2细胞得自ATCC.B3Z，对Kb限制 OVA(SIINFEKL)表位具有特异性的CD8+特异性T细胞杂交瘤由N. Shastri (University of California, Berkeley)提供，并在 lmg/ml G418 和 400 μ g/ml 潮霉素 B 的存在下，在含 10% 热灭活FCS、100U/ml青霉素、100 μ g/ml链霉素和2-ME的完全RPMI 1640培养基 (Invitrogen Life Technologies)中保存。抗原呈递研究。使用作APC的骨髓树枝状细胞(BMDC，3xl05/孔)在携带 OVA(SIINFEKL)表位或模拟CyaA/AC_的各种浓度(O至60nM)的重组CyaA/0VA/AC_的存在下温育，并与选择性识别OVA SIINFEKL/H-2Kb MHC类别I复合物的B3Z T细胞(IxlO5/孔) 共培养M小时。在培养1 之后，使上清液在_80°C冷冻至少池。然后通过CTLL增殖方法测定由刺激B3Z细胞产生的IL-2的量。简言之，将IO4细胞的IL-2-依赖性CTLL系/ 孔用100 μ 1上清液培养，终体积为200 μ 1。24小时后，添加[3H]-胸苷(5(^以/孔)，611 后用自动化细胞收集器收集细胞。通过闪烁计数检测所引入的[3H]-胸苷。每个点重复进行，并使实验重复5次。结果以所引入[3H]-胸苷的Acpm表达(类毒素存在下的cpm-类毒素不存在下的cpm)。体内杀伤测定。对于CTL引发，通过静脉注射50yg携带OVA(SIINFEKL)表位或模拟CyaA/AC—的重组CyaA/OVA/AC—使小鼠免疫。免疫接种后7天，幼稚同源脾细胞被脉冲 OVA(SIINFEKL)肽(10 μ g/ml) (30min、37°C )，充分洗涤，并用高浓度(1.25μΜ)羧基荧光素琥珀酰亚胺酯(CFSE ；Molecular Probes、Eugene、OR)标记。非脉冲对照群体用低浓度 (0. 125 μ M)CFSE标记。CFSE髙-和CFSEffi-标记细胞以1 1比例混合(每个种群5χ106 个细胞)，并静脉注射到小鼠中。20h后收集脾细胞，洗涤，并再悬浮于FACS缓冲液(补充有1 % BSA和0. 1 % NaN3的PBS)中。通过FACS测定20h后保留在脾中的CFSE-正细胞的数目。如下计算特异性溶解的百分比特异性溶解百分比=100-[100X((%CFSE 免疫小鼠 /% CFSEte免疫小鼠)/(% CFSEs初次接受试验小鼠1% CFSEte初次接受试验小鼠)]。统计学分析利用单向方差分析法(ANOVA)以及Bonferroni post-test (SigmaStat ν· 3. 11、Systat、San Jose、CA)分析值的差异显著性。
结果负电荷谷氨酸570和酰化赖氨酸860的联合消除破坏了 CyaA的细胞透化能力。 CyaA作用的工作模型预测，可对CyaA进行修饰，以失去其成孔(溶血)活性，同时保留其将AC结构域递送到靶细胞胞质溶胶中的能力。为测试这种假设，基于先前的观察，即CyaA/ AC—类毒素溶解细胞的能力可以通过在成孔结构域内的刺激而进行上调或下调，发明人寻求生产可展示尽可能低溶血和溶细胞活性的CyaA构建物(8、12-14、18)。同时为了能够评价CyaA/AC—类毒素的靶细胞穿透，发明人从之前通过从卵清蛋白(OVA)插入SIINFEKL肽而被标记的CyaA/2330VA毒素得到此类突变体。选择这种CyaA变体是因为在残基233处插入报道基因Kb-限制CD8+T-细胞表位不影响AC活性，并将0VA/AC酶进入细胞中的易位量化为胞质cAMP的提高。更重要的是，OVA表位的存在还允许评价酶促无活性CyaA/2330VA/ 八(7类毒素将其^^/^(7结构域递送到001113+抗原呈递细胞(APC)的胞质溶胶中的能力，因为能够进行蛋白酶体加工以及OVA表位在MHC类别I糖蛋白上的细胞表面呈递，其可被测定为对OVA-特异性CD8+T细胞的体外及体内刺激00)。为产生可能缺乏溶细胞活性的CyaA/AC_类毒素，发明人组合了先前所示的E570Q 和K860R置换，以降低CyaA对绵羊红细胞的特异性溶血活性，其中已经发现E570Q置换也降低CyaA/AC_对⑶llb+J774A. 1单核细胞的溶细胞活性(8、1；3)。使这些置换单独及组合地基因工程进入CyaA/^SOVA/ACT中，并比较所得到的类毒素的特异性溶血和溶细胞活性， 利用绵羊红细胞作为模型⑶llb_靶以及利用J774A. 1作为平行的模型⑶Ilb+靶(表I)。 与先前利用缺乏OVA表位的类毒素观察到的结果0、8、13、21) —致，在所用的条件下，与 0VA/AC—相比，单独携带E570Q和K860R置换的0VA/AC—类毒素在红细胞上分别显示降低两倍(55士8)和零(1 士 1)相对溶血活性，而且E570Q类毒素对⑶lib-表达J774A. 1细胞的相对溶细胞活性也降低(37士 10)。进而，如根据利用酶促活性K860R构建物所获得的结果所预期的，尽管在⑶1 lb_红细胞上的溶血活性低，但是K860R类毒素在⑶1 lb+J774A. 1细胞上仅显示稍微降低的相对溶细胞活性(72士22%)，这证实由K860R置换引起的结构缺陷由于与⑶lib/⑶18受体相互作用而得以补救0)。然而，当与E570Q组合时，K860R置换在降低E570Q+K860R构建物对J774A. 1细胞的相对溶细胞活性上显示出明确的协同效应，低至 14 士 7%。表I :0VA/AC_和衍生物对绵羊红细胞和J774A. 1巨噬细胞的溶细胞活性。
权利要求
1.一种多肽，其为腺苷酸环化酶蛋白质的突变体(突变多肽)，并且其氨基酸序列包含下述序列之一或由下述序列之一组成a)百日咳博德特氏菌、副百日咳博德特氏菌或欣氏博德特氏菌的腺苷酸环化酶 (CyaA)的氨基酸序列，其中已经进行下述突变(i)570位的谷氨酸残基被谷氨酰胺残基(E570Q)或被保守氨基酸残基置换，和(ii)860位的赖氨酸残基被精氨酸残基(K860I )或被保守氨基酸残基置换，或；b)百日咳博德特氏菌、副百日咳博德特氏菌或欣氏博德特氏菌的腺苷酸环化酶片段的氨基酸序列，该片段具有百日咳博德特氏菌的CyaA蛋白质结合靶细胞的能力以及使其 N-端腺苷酸环化酶酶结构域或所述N-端腺苷酸环化酶酶结构域的部分易位进入所述细胞中的能力，其中所述片段还含有位于所述腺苷酸环化酶的570位和860位的下述突变氨基酸残基E570Q和K860R，或c)氨基酸序列，由于一个或更多个氨基酸残基置换和/或插入，其不同于如在a)或b) 中定义的氨基酸序列，并且其具有百日咳博德特氏菌的CyaA蛋白质结合靶细胞的能力以及使其N-端腺苷酸环化酶酶结构域或所述N-端腺苷酸环化酶酶结构域的部分易位进入所述细胞中的能力，其中所述氨基酸序列还含有位于所述腺苷酸环化酶的570位和860位的下述突变氨基酸残基E570Q和K860R，或d)支气管败血性博德特氏菌的腺苷酸环化酶(CyaA)的氨基酸序列，其中已经进行下述突变(i)569位的谷氨酸残基被谷氨酰胺残基(E569Q)或被保守氨基酸残基置换，和(ii)859位的赖氨酸残基被精氨酸残基(K859R)或被保守氨基酸残基置换，或；e)支气管败血性博德特氏菌的腺苷酸环化酶片段的氨基酸序列，该片段具有百日咳博德特氏菌的CyaA蛋白质结合靶细胞的能力以及使其N-端腺苷酸环化酶酶结构域或所述 N-端腺苷酸环化酶酶结构域的部分易位进入所述细胞中的能力，其中所述片段还含有位于所述腺苷酸环化酶的569位和859位的下述突变氨基酸残基E569Q和K859R，或f)氨基酸序列，由于一个或更多个氨基酸残基置换和/或插入，其不同于如在d)或e) 中定义的氨基酸序列，并且其具有百日咳博德特氏菌的CyaA蛋白质结合靶细胞的能力以及使其N-端腺苷酸环化酶酶结构域或所述N-端腺苷酸环化酶酶结构域的部分易位进入所述细胞中的能力，其中所述氨基酸序列还含有位于所述腺苷酸环化酶的569位和859位的下述突变氨基酸残基E569Q和K859R。
2.根据权利要求1所述的多肽，其中所述百日咳博德特氏菌腺苷酸环化酶的腺苷酸环化酶氨基酸序列如SEQ ID N0 1所公开。
3.根据权利要求2所述的多肽，其中所述多肽的氨基酸序列由于1至200个氨基酸置换、缺失和/或插入而不同于SEQ ID N0 1的氨基酸序列。
4.根据权利要求1或2所述的多肽，其能够与细胞结合并使其N-端腺苷酸环化酶酶结构域易位到所述细胞中，其中所述细胞表达CDllb/CD18受体并且其中与所述细胞的结合通过与所述⑶lib/⑶18受体的结合而发生。
5.根据权利要求1、2、3或4所述的多肽，其是腺苷酸环化酶类毒素的突变体，其在细胞中的腺苷酸环化酶活性与百日咳博德特氏菌CyaA毒素的腺苷酸环化酶活性相比被部分或完全抑制。
6.根据权利要求5所述的多肽，其中所述腺苷酸环化酶活性的部分或完全抑制是通过具体是在SEQ ID N0 1的百日咳博德特氏菌腺苷酸环化酶的188和189位的氨基酸残基之间插入二肽而达到的。
7.一种多肽衍生物，其包含根据权利要求1至6任一项所述的多肽或由根据权利要求 1至6任一项所述的多肽组成，并且其还与一种或更多种受关注的分子结合。
8.根据权利要求7所述的多肽衍生物，其中所述一种或更多种受关注的分子中的每一种由适合引发免疫应答的氨基酸序列组成。
9.根据权利要求8所述的多肽衍生物，其中所述适合引发免疫应答的分子中的每一种的氨基酸序列由5至300、特别是300至600或者400至500个氨基酸残基组成。
10.根据权利要求8或9所述的多肽衍生物，其中所述适合引发免疫应答的分子中的每一种的氨基酸序列包含下述的氨基酸序列或由下述的氨基酸序列组成脊髓灰质炎病毒抗原、HIV病毒抗原、流感病毒抗原、脉络丛脑膜炎病毒序列、肿瘤抗原，或者包含任意这些含至少一种表位的抗原的氨基酸序列的一部分或由任意这些含至少一种表位的抗原的氨基酸序列的一部分组成。
11.根据权利要求8至10所述的多肽衍生物，其是重组多肽，其中所述适合引发免疫应答的分子中的每一种的氨基酸序列被插入到所述突变多肽的腺苷酸环化酶氨基酸序列的许可位点中，从而保留了所述突变多肽将其N-端腺苷酸环化酶酶结构域易位到靶细胞中的能力。
12.根据权利要求8或9所述的多肽衍生物，其中每一种所述适合引发免疫应答的氨基酸序列被接枝特别是化学接枝到所述突变多肽的氨基酸残基上。
13.在治疗中应用的根据权利要求1至6所述的多肽或根据权利要求7至12中任一项所述的多肽衍生物。
14.在治疗中应用以在需要其的宿主中引发T-细胞免疫应答和/或B-细胞免疫应答的根据权利要求1至6所述的多肽或根据权利要求7至12中任一项所述的多肽衍生物。
15.用于预防或治疗选自瘤形成、癌症和传染病的疾病的根据权利要求7至14中任一项所述的多肽衍生物，其中所述传染病选自病毒诱发疾病、逆转录病毒诱发疾病、细菌诱发疾病、寄生虫诱发疾病或真菌诱发疾病。
16.根据权利要求13、14或15所述的多肽或多衍生物，其中所述多肽与佐剂联合和/ 或与另一种治疗活性分子联合施用。
17.根据权利要求13或14所述的多肽或多衍生物，其中所述多肽不与佐剂联合施用。
18.—种药物组合物，其包含根据权利要求1至6中任一项所述的多肽或根据权利要求 7至17中任一项所述的多肽衍生物、药学上可接受的载体以及任选的佐剂和/或治疗活性分子。
19.根据权利要求7至12中任一项所述的多肽衍生物在制备用于治疗选自瘤形成、癌症和传染病的疾病的治疗组合物中的应用，所述传染病选自病毒诱发疾病或逆转录病毒诱发疾病。
20.一种用于制备适合将分子递送到细胞中的蛋白质载体的方法，所述方法包括使所述分子与根据权利要求1至6中任一项所述的多肽相结合。
全文摘要
本发明涉及突变CyaA/E570Q+K860多肽，其适合用作蛋白质载体将一种或更多种受关注的分子递送到细胞，特别是表达CD11b受体的细胞中。本发明还涉及适合引发宿主中的免疫应答的多肽衍生物。本发明更具体而言涉及得自毒素或类毒素形式下的腺苷酸环化酶蛋白质(CyaA)的多肽，其为突变多肽。所述突变多肽能够保留天然CyaA与靶细胞的结合活性，且优选还能够保留天然CyaA经过其N-端结构域进入靶细胞中的易位活性，并且此外其具有成孔活性，该成孔活性与天然CyaA毒素的成孔活性相比是降低的或受抑制的。
文档编号C12N9/88GK102439146SQ201080022547
公开日2012年5月2日 申请日期2010年3月23日 优先权日2009年3月23日
发明者A.奥西科瓦, C.法约尔, C.莱克勒克, J.克鲁塞克, J.马辛, M.巴斯勒, P.塞博, R.奥西卡 申请人:巴斯德研究院, 捷克微生物研究所, 捷克生理学研究所