用于调节干细胞的组合物和方法及其应用的制作方法

专利名称：用于调节干细胞的组合物和方法及其应用的制作方法
技术领域：
本发明通常涉及用于调节干细胞，特别是干细胞的分裂对称性的组合物和方法及其应用。
背景技术：
干细胞是能产生多种特化的细胞类型并最终产生终末分化细胞的未分化的或未成熟的细胞。大多数成体干细胞是谱系限制性的，并且通常根据它们的组织来源命名。与任何其它细胞不同，干细胞能自我更新，以便在生物的生存期中需要时，可以几乎不断地提供成熟细胞类型。由于这种自我更新的能力，干细胞在治疗上可用于组织的形成、再生、修复和维持。为了确保自我更新，干细胞经历两种类型的细胞分裂。对称分裂产生两个相同的子代细胞，两个子代细胞都被赋予干细胞的性质，并且能导致干细胞群体的扩增。另一方面，不对称分裂产生一个干细胞和一个具有有限自我更新潜能的祖细胞。祖细胞是短暂扩增细胞，其能在最终分化成为成熟细胞之前经历几轮细胞分裂，即增殖。在成年生物体中， 干细胞和祖细胞作为机体组织的修复系统、补充特化细胞并维持诸如血液、皮肤或肠组织的再生器官的正常更新。最近已经确定，卫星细胞代表了由成熟肌肉组织中所见的干细胞和小单核祖细胞所组成的混合群体(Kimng et al.，2007)。成体骨骼肌中的卫星细胞位于它们的驻留肌纤维肌膜和基膜之间的小凹陷中。卫星细胞参与肌肉的正常生长以及受损或患病组织的再生。在未损伤的肌肉中，大多数卫星细胞是静止的，表示它们既不分化也不发生细胞分裂。 卫星细胞表达大量的独特基因标志物，包括配对盒转录因子1^x7，其在卫星细胞的功能和存活中起重要的调节作用(Kuang et al. ,2006 ；Seale et al. ,2000) 因此，Pax7可用作卫星细胞的标志物。—旦发生损伤，例如身体外伤或劳损、重复性运动或患病，卫星细胞就会被激活， 增殖并产生短期扩增的祖细胞群体，所述祖细胞是表达诸如MyoD和Myf5的肌原性调节因子(MRF)的肌原性祖细胞(成肌细胞)。在再生过程的进程中，成肌细胞先经历多轮分裂， 然后进行终末分化、与驻留纤维融合或生成新的肌纤维，以重建受损的组织(Charge and Rudnicki，2004)。在影响肌肉的数种疾病或疾病状态中，观察到肌肉量的减少，其与卫星细胞数量的减少和卫星细胞修复、再生和长成骨骼肌的能力的降低相关。影响肌肉的几种示例性的疾病或疾病状态包括诸如恶病质、肌肉弱化或萎缩(包括少肌症)的消耗性疾病、 ICU导致的虚弱、手术导致的虚弱(例如膝关节或髋关节置换术之后)和诸如肌营养不良的肌肉退行性疾病。肌肉再生的过程涉及细胞外基质的大量重塑，并且如果发生广泛的损伤， 这种再生是不完全的。肌肉中的成纤维细胞沉积瘢痕组织，所述瘢痕组织能影响肌肉功能并且是肌营养不良的病理学的重要部分。
肌营养不良是特征为控制运动的骨骼肌或随意肌的进行性虚弱和退变的遗传疾病。在某些形式的肌营养不良中，心肌和一些其它的随意肌也受到影响。在很多情况下，组织学图片显示出纤维大小、肌细胞坏死和再生以及通常在结缔组织和脂肪组织的增殖上的变化。进行性肌营养不良至少包括杜兴氏肌营养不良(DMD)、贝克肌营养不良(BMD)、埃-德二氏肌营养不良、兰迪二氏肌营养不良、面肩胛肱型肌营养不良(FSH)、肢带型肌营养不良、 冯·格雷菲-福克斯(von Graefe-Fuchs)肌营养不良、眼咽型肌营养不良(OPMD)、强直性肌营养不良(斯太纳特病)和先天性肌营养不良。目前，还不能治愈这些疾病，但是某些药物和疗法已被证实是有效的。例如，皮质类固醇已被证实能延缓杜兴氏肌营养不良患者的肌肉破坏。尽管皮质类固醇能有效延缓很多患者的疾病进展，但是由于有害的副作用，长期使用皮质类固醇是不可取的。研究人员还在研究某些肌肉建设医学的潜力。一种该类方法是阻断蛋白肌肉抑制素，肌肉抑制素是一种已知在肌肉的生长和发育中起作用的生长因子。例如，肌肉抑制素的特异性单克隆抗体已被证实能改善患肌营养不良的小鼠的状况，据推测是通过阻断肌肉抑制素的作用。然而，肌肉抑制素阻断方法存在问题。例如，阻断肌肉抑制素会干扰卫星细胞帮助替换受损的或死亡的肌细胞。肌肉抑制素被认为能帮助保持卫星细胞处于静止状态直到需要它们时，并且如果没有肌肉抑制素，卫星细胞将被耗尽。此外，已有人提出，肌肉抑制素阻断剂可能由于靶向性太强而无法促进肌肉生长，因为还存在很多与肌肉抑制素相似的限制肌肉生长的蛋白。PCT 申请号 WO 2007/059612 (Rudnicki et al.)描述了一种新的 Pax7+/Myf5_ 卫星干细胞群体。该小组首次证实，卫星干细胞是含有干细胞(Pax7+/Myf5-)和祖细胞 (Pax7+/Myf5+)的异质群体。在本公开之前，不清楚卫星细胞是干细胞、定向的祖细胞还是去分化的成肌细胞，并且不清楚细胞龛(niche)是同质的还是异质的。利用Cre/LoxP谱系追踪，该小组鉴定出卫星细胞的亚群体，这群细胞从不表达Myf5并且作为干细胞贮库(还参见Kuang et al.，2007)。该小组成功地分离出Ι^χ7+/ΜΥ ·5-卫星干细胞，发现该1^x7+/ Myf5-卫星干细胞占成体卫星细胞库的大约10%，并且通过不对称的顶端-基底端细胞分裂而产生子代卫星肌原细胞(PaX7+/Myf5+)。FACS分选的Myf5_*Myf5+卫星细胞的移植表明，卫星干细胞能重新形成成体卫星细胞龛并能自我更新(Kimng et al.，2007)。最近已经证实，在骨骼肌再生的过程中，卫星细胞群体由干细胞亚群维持，因而实现个体存活期间的组织稳态和多轮再生(Kuang et al.，2007)。对调节卫星干细胞命运决定的分子网络的了解仍是不清楚的。PCT申请号WO 2004/113513 (Rudnicki et al.)公开了通过调节Wnt蛋白的肌原性决定来调节位于卫星干细胞小室之外的CD45+Scal+干细胞非典型群体的增殖或谱系定向的方法和组合物。Wnt基因家族编码超过20种富含半胱氨酸的分泌型Wnt糖蛋白，这些蛋白通过与靶细胞上的Frizzled(i^Zd)受体结合来发挥作用。Frizzled受体属于G蛋白偶联受体蛋白家族。Wnt家族不同成员与!^zd家族某些成员的结合可以通过数种不同通路中的一种起始信号转导。在所谓的经典通路中，信号分子蓬乱蛋白(Disheveled)的激活导致糖原合酶激酶-3 (GSK-3 β )的失活，GSK-3 β是一种胞质丝氨酸-苏氨酸激酶。因而使得GSK-3 β的靶标β-连环蛋白稳定，并转移至细胞核，在细胞核中β-连环蛋白激活特定启动子的TCF(Τ细胞因子)依赖性转录(Wodarz，1998，Dierick，1999)。在非经典或平面细胞极性(PCP)通路中，Wnt与!^zd的结合也激活蓬乱蛋白，而在这种情况下，蓬乱蛋白激活I^hoA (—种小的g 蛋白)。PCP通路的激活不会导致β-连环蛋白向细胞核转移。Wnt信号转导在调节胚胎发育期间的发育程序以及在调节成体组织中的干细胞功能上起重要作用(Clevers，2006)。Wnt已被证实是肌纤维发育期间轴旁中胚层中(Borello et al.，2006 ；Chen et al.，2005 ；Tajbakhsh et al.，1998)以及分化控制中的胚胎肌原性诱导所必需的(Anakwe et al.，2003)。最近，发现Wnt平面细胞极性(PCP)通路参与调节发育的生肌节中分化肌细胞的伸长(Gros et al.，2009)。在成体中，Wnt信号转导是急性损伤后的肌肉组织中成体CD45+/^cal+干细胞的肌原性定向所必需的(Polesskaya et al., 2003 ；Torrente et al.，2004)。其它的研究表明，经典Wnt/β -连环蛋白信号转导通过储备成肌细胞的激活和补充来调节肌原性分化。此外，成体肌肉卫星细胞中的Wnt/β -连环蛋白信号转导似乎通过限制Notch信号转导并因而促进分化来控制肌原性谱系进程。因此，习惯上，假定Wnt蛋白作为干细胞生长因子，促进干细胞和/或祖细胞的增殖和分化。干细胞以及靶向于干细胞的治疗具有在多种临床环境中提供益处的潜力。多种可能的治疗应用的限制已经获得足够数量的未分化的干细胞，并且在不耗尽干细胞贮库的情况下刺激终末分化成为成熟的组织特异性细胞。多数当前的干细胞研究集中在引导干细胞、尤其是短期扩增的祖细胞的增殖和分化，从而修复或再生受损的组织。除了担心干细胞耗尽之外，刺激干细胞的增殖和分化的另一担心是异常的或形成不良的组织。因此，本领域内需要干细胞领域的不断研究和发展，并且需要以生理学方式调节干细胞功能的改进的方法和组合物。发明概述概括地说，本发明提供了用于调节干细胞的组合物和方法及其应用。更具体而言， 本发明提供了用于调节干细胞的分裂对称性的组合物和方法。以下描述了本发明的多个非限制性的方面和实施方案。一方面，提供了用于调节干细胞的分裂对称性的组合物，其包含作为活性剂的干细胞平面细胞极性(PCP)信号转导的调节剂。另一方面，提供了调节干细胞的分裂对称性的方法，包括将干细胞与包含作为活性剂的干细胞平面细胞极性(PCP)信号转导的调节剂的组合物接触。在一些实施方案中，所述活性剂是能促进干细胞对称分裂的PCP信号转导的活性齐U。例如，所述活性剂可以包含或衍生自小分子、多核苷酸、肽、多肽或以上的组合。在一些实施方案中，所述活性剂包含以下的一种或多种(a)能结合和/或激活内(17的肽或多肽；(b)编码能结合和/或激活内(17的肽或多肽的多核苷酸；(c)能结合和/或激活内(17的小分子；(d)能上调干细胞上内(17的表达的多核苷酸或多肽；或(e)能激活或诱导PCP通路中的效应分子的表达并进而促进对称分裂的多核苷酸或多肽。在某些实施方案中，所述活性剂包含(a)Wnt7a多肽或Wnt7a多肽的能结合并激活内(17的活性变体、片段、类似物或衍生物，或(b)编码Wnt7a多肽或Wnt7a多肽的能结合并激活的活性变体、片段、类似物或衍生物的多核苷酸。在某些选定实施方案中，所述活性剂包含Wnt7a多肽。在其它实施方案中，所述活性剂包含编码Wnt7a多肽的多核苷酸。例如，所述多核苷酸可以存在于表达载体中。在其它实施方案中，所述活性剂调节PCP通路中的一种或多种效应分子，例如 Vangl2, α 7-整联蛋白、Pricklel 或 Celsr2。在一个实施方案中，所述活性剂能诱导Vangl2在细胞膜中的表达和极化分布。在一些实施方案中，所述组合物可以包含干细胞。在一些实施方案中，所述组合物可以包含干细胞中经典Wnt/β-连环蛋白信号转导的抑制剂。在一些实施方案中，所述组合物可以包含一种或多种干细胞调节剂，例如能提高干细胞分裂速率或干细胞存活的调节剂。在一些实施方案中，所述干细胞是成体干细胞。在某些实施方案中，所述成体干细胞是卫星干细胞。在一些实施方案中，本发明的组合物和方法用于促进组织形成、再生、维持或修复。在一些实施方案中，所述组织是肌肉。在一些实施方案中，所述肌肉是骨骼肌。一方面，提供了用于增强哺乳动物中的组织形成、再生、维持或修复的组合物，其包含作为活性剂的(a)Wnt7a多肽或Wnt7a多肽的能结合并激活i^Zd7的活性变体、片段、类似物或衍生物，或(b)编码Wnt7a多肽或Wnt7a多肽的能结合并激活i^Zd7的活性变体、片段、类似物或衍生物的多核苷酸。一方面，提供了增强哺乳动物中的组织形成、再生、维持或修复的方法，包括向有需要的个体给予组合物，所述组合物包含作为活性剂的(a)Wnt7a多肽或Wnt7a多肽的能结合并激活1^(17的活性变体、片段、类似物或衍生物，或(b)编码Wnt7a多肽或Wnt7a多肽的能结合并激活内(17的活性变体、片段、类似物或衍生物的多核苷酸。在一些实施方案中，所述组合物可以与生理学可接受的介质、载体或稀释剂混合。 在一些实施方案中，所述组合物可被配制成用于注射。例如，所述组合物可被配制成用于静脉内注射、肌肉内注射、心内注射、皮下注射或腹膜内注射中的一种或多种。在一些方面中，本文所述的组合物和方法可用于促进有需要的人类个体中骨骼肌的形成、维持、修复或再生。例如，所述有需要的个体可以患有影响肌肉的疾病或疾病状态。在一些实施方案中，所述个体可以患有或疑似患有退行性疾病。在一些实施方案中，所述退行性疾病是肌营养不良，肌营养不良的实例包括杜兴氏肌营养不良(DMD)、贝克肌营养不良(BMD)、埃-德二氏肌营养不良、兰迪二氏肌营养不良、面肩胛肱型肌营养不良 (FSH)、肢带型肌营养不良、冯 格雷菲-福克斯(von Graefe-Fuchs)肌营养不良、眼咽型肌营养不良(OPMD)、强直性肌营养不良(斯太纳特病)和先天性肌营养不良.在一些实施方案中，所述肌营养不良是杜兴氏肌营养不良(DMD)。在一些实施方案中，所述个体患有与损伤或疾病相关的肌肉消耗或萎缩。在一些实施方案中，所述影响肌肉的疾病或疾病状态可以包括消耗性疾病(例如恶病质，其可以与诸如癌症或AIDS的疾病相关)、肌肉弱化或萎缩(例如少肌症，其可以与衰老相关)、ICU导致的虚弱、长期废用(例如昏迷、瘫痪)、手术导致的虚弱(例如，膝关节或髋关节置换术之后)或肌肉退行性疾病(例如肌营养不良)。该列举并非穷举。另一方面，提供了在体内或体外调节干细胞的分裂对称性的方法，包括将所述干细胞与包含有效量活性剂的组合物接触，所述活性剂选自干细胞平面细胞极性(PCP)信号转导的激活剂或抑制剂。在一些实施方案中，所述方法可以包括将干细胞与干细胞中经典Wnt/β-连环蛋白信号转导的抑制剂接触。这样的抑制可以进一步促进干细胞的对称分裂。在一些实施方案中，所述方法可以包括将干细胞与一种或多种干细胞调节剂接触，所述调节剂例如提高干细胞分裂速率或增强细胞存活的调节剂。在一些实施方案中，所述方法是体内方法，并且其中将所述组合物给予有需要的个体。在一些实施方案中，所述方法可以包括将干细胞给予个体。所述干细胞例如与所述组合物同时给予或相继给予。在一些实施方案中，所述组合物包含干细胞。在一些实施方案中，所述干细胞可以包含表达载体，所述表达载体包含编码内(17或能促进对称分裂的PCP信号转导的调节剂的多核苷酸。在一些实施方案中，所述方法可以包括将辅助细胞给予个体。所述辅助细胞例如可以与所述组合物同时给予或相继给予。在一些实施方案中，所述组合物可以包含辅助细胞。所述辅助细胞可以例如包含表达载体，所述表达载体包含编码Wnt7a蛋白或Wnt7a蛋白的能从所述辅助细胞分泌并结合和/或激活内(17的活性片段、变体、类似物或衍生物的多核苷酸。一方面，提供了促进哺乳动物中肌肉形成、再生、维持或修复的方法，所述方法包括给予所述哺乳动物治疗有效量的本文所述的组合物。一方面，提供了促进有需要的个体中的肌肉形成、再生或修复的方法，包括将组合物给予所述个体，所述组合物包含作为活性剂的(a)Wnt7a多肽或Wnt7a多肽的能结合并激活内(17的活性变体、片段、类似物或衍生物，或(b)编码Wnt7a多肽或Wnt7a多肽的能结合并激活的活性变体、片段、类似物或衍生物的多核苷酸。在一些实施方案中，对细胞或组织进行转化，使其过表达Wnt7a，从而诱导干细胞的对称分裂。基因表达可以任选地受诱导型启动子的控制。另一方面，提供了预防有需要的个体中的肌肉消耗、萎缩或退变的方法，包括给予所述个体治疗有效量的组合物，所述组合物包含(a)Wnt7a多肽或Wnt7a多肽的能结合并激活内(17的活性变体、片段、类似物或衍生物，或(b)编码Wnt7a多肽或Wnt7a多肽的能结合并激活的活性变体、片段、类似物或衍生物的多核苷酸。另一方面，提供了在体内或体外扩增卫星干细胞群体的方法，包括将所述干细胞与有效量的组合物接触，所述组合物包含(a)Wnt7a多肽或Wnt7a多肽的能结合并激活内(17 的活性变体、片段、类似物或衍生物，或(b)编码Wnt7a多肽或Wnt7a多肽的能结合并激活内(17的活性变体、片段、类似物或衍生物的多核苷酸。在一些实施方案中，在体外扩增干细胞，例如卫星干细胞。在一些实施方案中，随后将所述体外扩增的干细胞给予有需要的个体。另一方面，提供了促进卫星干细胞扩增的方法，包括将所述干细胞与Wnt7a或Wnt7a的能激活的活性片段、变体、类似物或衍生物接触。另一方面，提供了本文所述的组合物在促进有需要的个体的肌肉形成、维持、修复或再生中的用途。另一方面，提供了本文所述的组合物在制备用于促进有需要的个体的肌肉形成、 维持、修复或再生的药物中的用途。另一方面，提供了作为静止的卫星细胞的标志物的用途，其中所述标志物与另一种干细胞标志物联合使用。另一方面，提供了鉴定或分离卫星干细胞的方法，包括选择标志物1^x7+与 YFP-或Myf-的组合。另一方面，提供了组合物，所述组合物中的活性剂是能抑制干细胞对称分裂的PCP 信号转导的抑制剂。所述抑制剂例如可以是能通过抑制Wnt7a、Fzd7或PCP通路中的效应分子(例如，Vangl2, α 7_整联蛋白、Pricklel或Celsr2)而直接或间接抑制PCP信号转导的肽、多肽、多核苷酸或小分子。在一些实施方案中，所述抑制剂是能抑制Wnt7a、i^d7或PCP通路中的效应分子的表达的多核苷酸，例如siRNA或miRNA。在一个实施方案中，所述抑制剂是Vangl2 siRNA。另一方面，提供了筛选可用于肌肉修复或再生的化合物的方法，包括(a)提供卫星干细胞群体；(b)用受试化合物处理干细胞；以及(c)与对照相比，确定所处理的干细胞中对称分裂与不对称分裂的比例。其中与对照相比对称分裂的比例增加表明所述化合物可用于肌肉的修复或再生。另一方面，提供了筛选可用于肌肉修复或再生的化合物的方法，包括(a)提供卫星干细胞群体；(b)用受试化合物处理干细胞；以及(c)确定所述化合物是否激活、刺激所处理的干细胞中的PCP信号转导，其中PCP 信号转导的增加表明所述化合物可用于肌肉的修复或再生。在一些实施方案中，所述PCP信号转导的刺激是通过内(17的激活而发生。在一些实施方案中，所述增加是至少约10%、25%、50%、75%或更大的增加。在本发明的一方面中，提供了用于促进干细胞对称分裂的组合物，其包含作为活性剂的一种或多种内(17受体的激活剂，其中所述一种或多种激活剂可以包括但不限于，能激活成体干细胞中内(17受体的一种或多种小分子、核酸、多肽、肽、大分子或以上的组合。 在一些实施方案中，所述成体干细胞是卫星干细胞。在一些实施方案中，可以转化干细胞，使其过表达内(17。另一方面，提供了防止卫星干细胞耗尽的方法，包括将所述干细胞与以下接触
(a)ffnt7a多肽或Wnt7a多肽的能结合并激活i^Zd7的活性变体、片段、类似物或衍生物，或
(b)编码Wnt7a多肽或Wnt7a多肽的能结合并激活内(17的活性变体、片段、类似物或衍生物的多核苷酸。在结合附图并阅读以下对本发明的具体实施方案进行的描述的基础上，本发明的其它方面和特征将变得对本领域技术人员显而易见。附图简要说明
下面参照附图仅通过举例说明的方式对本发明的实施方案进行描述，其中

图1 骨骼肌中卫星细胞的发育程序。卫星干细胞的祖细胞以表达1^x3和/或1^x7的祖细胞的形式起源于体节。卫星干细胞表达1^x7，而如Myf5-lacZ和Myf5-cre引入的等位基因的表达所示，卫星肌原细胞还具有激活的Myf5转录能力。激活并进入细胞周期之后，肌原前体细胞表达Myf5和MyoD。 成肌素和Mef2c的诱导以及Myf5然后是MyoD的下调标志了退出细胞周期并进入终末分化程序。图2 卫星细胞群体是由卫星干细胞和卫星肌原细胞组成的异质群体。用Myf5_Cre和ROSA^-YFP Cre等位基因，本发明人发现，在体内，表达1^x7的膜下卫星细胞中的约10%从不表达Myf5。此外，他们发现I^X77Myf5_l星细胞通过顶端-基底端方向的分裂而产生I^X77Myf 5+卫星细胞，所述顶端-基底端方向的分裂不对称地产生基底端f^X7+/Myf5-和顶端I^X77Myf5+细胞。预测性地分离并移植入肌肉中的结果表明， 鉴于I^X77Myf5+细胞表现出过早的分化，Pax7+/Myf5-细胞在整个注射的肌肉中大量地贡献卫星细胞贮库。因此，卫星细胞是由干细胞和定向祖细胞组成的异质群体。图3.卫星干细胞的对称扩增是由PCP介导的干细胞分裂的轴的定向所致。Wnt7a与其受体内(17的结合通过激活RacAhoA诱导Vangl2及其共同受体Syn4 的极化分布。该信号转导由于通过内(17和Vangl2的PCP信号转导而导致α7/β1_整联蛋白受体的激活及其定向极化。因此产生的α 7/β 1-整联蛋白的上调和极化定位允许两个子代细胞均保持与基膜相连。图4.卫星干细胞表达Wnt受体Frizzled7。(A)从Myf5-Cre/R0SA^_YFP小鼠分离单肌纤维。90 %的Pax7+细胞表达YFP且 10%的Pax7+细胞是YFP-。卫星细胞一致地表达干细胞标志物CXCR4。(B)基于Myf5_Cre 激活的YFP荧光，分离从静止四肢骨骼肌提取的画门的卫星细胞(α 7-整联蛋白+、CD34+、 ⑶45_、⑶31_、⑶llb_、Scal_)。(C)对分选细胞的实时PCR分析表明在YFP_分选细胞(n = 3) 中不存在Myf5和YFP转录物，并且表明了转录物的表达。(D)在新鲜分离的Myf5_Cre/ ROSA^-YFP肌纤维中，Fzd7在静止的I^X77YFP_1星干细胞中特异表达(左)，但在1^x7+/ YFP+卫星肌原细胞(右)中则没有表达。(E)增殖的卫星细胞和肌原前体细胞表达内(17。 在胫前肌损伤后4天，分离再生的趾长伸肌纤维。f^X7+/Myf5_(左)和f^X7+/Myf5+(右)分裂的卫星细胞表达内(17。比例尺为10 μ m。误差棒表示标准误。图5. Wnt7a在肌肉再生过程中是高度上调的。(A)静止的胫前肌(顶图)和损伤后3天(中图)和6天(下图)时分析的冷冻损伤的胫前肌的冷冻切片。通过层粘连蛋白α 2链染色来显示肌纤维的基膜，且通过1^x7 染色使卫星细胞的细胞核能被观察到。(B)对冷冻损伤后6天再生的胫前肌进行的实时PCR 阵列分析表明，当卫星细胞回到静止时(n = 3)ffnt7a mRNA的上调。(C)重组Wnt7a蛋白与肌原细胞表面的Frizzled7结合，这种结合在Frizzled7敲低(knock-down)之后消除。 (D)激活β -连环蛋白/TCF靶基因的是Wnt3a而不是Wnt7a。用BSA (对照)和重组Wnt 蛋白刺激之后，对培养的肌原细胞进行实时PCR分析。只有Wnt3a诱导β-连环蛋白/TCF 靶基因Tcf7和Axin2的转录(n = 5)。(E)再生的肌纤维表达Wnt7a蛋白，而血管内皮细胞不表达Wnt7a蛋白。心脏毒素诱导4天再生的胫前肌(左)和静止对侧胫前肌(右)的冷冻切片。检测切片的成肌素(分化的肌原细胞)、CD144(内皮细胞)和Wnt7a蛋白的表达。比例尺为25 μ m。误差棒表示标准误。图6. Wnt7a-Frizzled7信号转导驱动卫星干细胞扩增。(A)从Myf5-Cre/R0SA^-YFP小鼠分离趾长伸肌单肌纤维42小时后，悬浮条件下培养的星干细胞首次分裂。卫星干细胞通过不对称细胞分裂(左)产生一个YFP_干细胞和一个YFP+定向细胞，或通过对称细胞分裂(右)产生两个YFP_子代细胞。
(B)显著增加对称细胞分裂的比例，从而导致卫星干细胞扩增的是Wnt7a刺激而不是Wnt3a 刺激(n = 3,*p = 0. 009)。(C)与非沉默条件下的细胞(上图)相比，分离后培养42小时的肌纤维上的激活的卫星细胞在用siRNA敲低内(17之后不表达内(17 (下图)。(D)将培养 42小时后的肌纤维上的内(17沉默之后，Wnt7a诱导的卫星干细胞对称分裂比例的增加被消除(η = 3,*ρ < 0. 02)。(E)将培养52小时后的肌纤维上内(17沉默后，由Wnt7a所诱导的对称卫星干细胞数量的增加被阻断(n = 3，Y < 0. 03)。比例尺为10 μ m。误差棒表示标准误。图7.肌原细胞表达PCP成员。(A)实时定量PCR分析表明，YFP+和YFP_卫星细胞来源的成肌细胞(n = 3)表达 PCP核心成员转录物。(B)免疫染色表明Vangl2在培养M小时的肌纤维的Pax7+卫星细胞的激活期间是上调的。(C)Wnt7a诱导在培养的肌纤维上的分裂1^x7+卫星细胞的相对极上的Vangl2极化细胞定位。趾长伸肌纤维在对照培养基中或补充有Wnt7a的培养基中培养，并在分离后42小时进行固定。(D)Wnt处理对初始分裂期间Vangl2极化的影响。在卫星细胞分裂期间，Wnt7a信号转导诱导Vangl2和的极化定位，而不是Wnt3a (η = 3， Y = O. 006)。(E)对Wnt7a处理的肌纤维进行Vangl2和膜标志物α7_整联蛋白的免疫定位。Vangl2是极化的并共定位于平面分裂的卫星细胞的膜中(箭头)。注意到极化且上调的α 7-整联蛋白的表达，其促进两个子代细胞附着于基膜。比例尺为ΙΟμπι。误差棒表示标准误。图8.卫星干细胞对称扩增需要Vangl2。在悬浮条件下培养来自Myf5-Cre/R0SA^-YFP小鼠的趾长伸肌单肌纤维，并对其进行非沉默转染或VanglkiRNA转染。(A) 42小时时，Pax7+/Syndecan4+卫星细胞首次细胞分裂的方向。将分裂记录为平面的(上图)或顶端-基底端的(下图)。注意到在肌纤维培养物中，卫星细胞转移至基膜的外表面，并且顶端-基底端细胞分裂指向培养基中。(B) 在培养42小时之后，Wnt7a诱导顶端-基底端细胞分裂的比例显著降低，这支持其刺激干细胞扩增的功能。Vangl2的敲低能抑制Wnt7a刺激平面细胞分裂的能力(η = 3,*ρ < 0. 02)。
(C)将培养42小时后之后的肌纤维的Vangl2沉默后，Wnt7a诱导的卫星干细胞对称分裂的增加被消除(n = 3, *ρ < 0. 02)。(D)与非沉默条件下的细胞(上图)相比，培养52小时之后的敲低Vangl2的肌纤维上的激活的卫星细胞不表达Vangl2 (下图)。(E) Vangl2的敲低增加了顶端-基底端分裂的速率(η = 5,*ρ = 0. 001)。(F)Vangl2的敲低降低了 1^x7+/ YFP—干细胞的比例(n = 3,*p = 0. 03)。(G)Vangl2的敲低降低了每个纤维的细胞数(n = 5，Y = 0. 001)。(H和I)培养3天之后，Vangl2的沉默增加分化的成肌素7 ^χ7_细胞肌纤维的比例(n = 4，*ρ = ΙΟ"5)。(J)Vangl2的沉默耗尽卫星细胞库(n = 4, *p = 0. 001)。 (K)如卫星细胞来源的成肌细胞(n = 4)中基因表达的实时PCR分析所示，Vangl2沉默促进肌原性分化。比例尺为10 μ m。误差棒表示标准误。图9.异位Wnt7a增强肌肉再生。(A)电转移诱导损伤后8天，3月龄小鼠的再生胫前肌的代表性组织学图片。再生的肌纤维显示出位于中央的细胞核。比例尺为25 μ m。(B)正如纤维的质量、数量和纤维径的增加所证实的，CMV-Wnt7a质粒电穿孔后3周的胫前肌的代表性冷冻切片表现出加速的再生。CMV-Wnt3a的电穿孔产生具有异常基质积累的畸形肌肉。通过层粘连蛋白α 2链的免疫染色检测肌纤维的基膜。比例尺为200 μ m。(C)用盐水或Wnt7a/Wnt3a表达质粒对胫前肌进行电穿孔后3周，在电穿孔的胫前肌与对侧腿相比的肌肉纤维径的定量(n = 4， *ρ彡0. 008)。Wnt7a和Wnt3a对肌纤维径具有不同的效应。(D)用盐水或Wnt7a/Wnt3a表达质粒对胫前肌进行电穿孔后3周，电穿孔的胫前肌与对侧腿相比的肌纤维数量的定量(η =4, *p ^ 0. 03)。误差棒表示标准误。图10. Wnt7a驱动卫星干细胞扩增。(A)用盐水或Wnt7a/Wnt3a表达质粒对3月龄小鼠的胫前肌进行电穿孔，并在3 周后解剖。记录电穿孔肌肉的冷冻切片上的膜下1^x7+卫星细胞。注意到在用CMV-Wnt7a 质粒电穿孔之后，Pax7+卫星细胞的数量增加。比例尺为25μπι。(B)与盐水或Wnt3a电穿孔的样品相比，CMV-ffnt7a质粒电穿孔后的卫星细胞群体增加两倍(n = 4, *p ^ 0. 03)。 (C)电穿孔后3周，从电穿孔的Myf5-Cre/R0SA^-YFP胫前肌通过FACS分选卫星细胞，并接种培养M小时，固定并用1^x7和YFP进行染色。比例尺为10 μ m。⑶电穿孔的胫前肌中Wnt7a过表达之后，Pax7+/YFP"卫星干细胞的比例显著增加(n = 5, *p ^ 0. 0001)。(E) Wnt7a+肌纤维显示出，从趾长伸肌肉分离的肌纤维上的1^x7+卫星细胞群体减少(n = 4， *P = 0. 03)。(F) 3月龄裸小鼠和它们的同窝对照的冷冻损伤的胫前肌在损伤后3 周的冷冻切片分析。在再生的肌肉中没有观察到结构或横截面积方面的显著差异。比例尺为20μπι(η = 3)。(G)在再生mfetTa+胫前肌中观察到卫星细胞数量减少，其中以横截面积中的肌纤维数和对侧腿进行标准化(n = 3,*p = 0. 03)。误差棒表示标准误。图11.肌肉卫星细胞的FACS纯化。㈧从前肢和后肢骨骼肌选择活的卫星细胞的FACS图。对细胞进行 CD34(APC-Cy7)和α 7_整联蛋白(APC)的阳性选择和CDllb、CD31、CD45和Seal的阴性选择(均在PE中)。然后根据YFP荧光来分离Myf5+和Myf5_卫星细胞。(B)新鲜分离的{CD34+、α 7-整联蛋白+、LirO卫星细胞的细胞涂片。分选的细胞表达卫星细胞标志物 Pax7(左)和Syndecan4(右)。(C)分选的{CD34\ α 7_整联蛋白+、Linl卫星细胞的体外发育。培养一周后，98%的分选细胞表达Ι^χ7(不等水平的1^x7染色解释了个体成肌细胞的细胞周期的差异)。在分化培养基中4天之后，从多核肌管分选的细胞表达成肌素和肌球蛋白重链。图12. YFP_卫星细胞来源的成肌细胞不表达Myf5蛋白。将FACS分选的YFP+和YFP—卫星细胞在高促有丝分裂培养基中培养2周。使细胞维持在低于10%的融合，以避免YFP—细胞的肌原性定向。如同通过免疫染色(A)和 western (B)分析所示，周期中的YFP+成肌细胞表达高水平的Myf5蛋白，而YFP_成肌细胞没有表现出任何可检测到的Myf5蛋白表达。10Τ1Λ细胞用作阴性非肌原性对照(η = 3)。图13. Wnt7a没有在激活的肌肉卫星细胞中诱导β -连环蛋白的稳定化和细胞核定位。在对照培养基或补充有Wnt3a或Wnt7a的培养基中将单趾长伸肌纤维悬浮培养2 天。用能识别活性形式的β-连环蛋白的抗体对肌纤维进行染色。Wnt3a处理导致β-连环蛋白稳定化并转移至卫星细胞的细胞核中。Wnt7a没有在分裂的卫星细胞中激活Wnt经典信号转导。图14. Wnt7a提高卫星干细胞的自我更新同时没有更改卫星细胞的增殖动力学。(A)对照(非沉默)和i^Zd7-沉默条件下培养的肌原细胞中Frizzled转录物的实时PCR分析。转录下降80% (n = 3，ρ = 0. 01，η = 3)。的敲低是特异性的，并且不影响肌原细胞中所表达的其它Frizzled转录物的表达。(B)在悬浮条件下培养来自 Myf5-Cre/R0SA26-YFP小鼠的趾长伸肌单肌纤维持续52小时。在肌纤维上的i^Zd7被沉默之后，Wnt7a诱导的卫星干细胞数的增加被消除(n = 3, *ρ < 0. 03)。(C)Wnt7a处理对每个肌纤维的Pax7+细胞的总数没有影响(n =幻。误差棒表示标准误。图15.在成体胫前肌中进行有效的质粒电穿孔。(A)用CMV-LacZ表达质粒转染胫前肌纤维的绝大部分。X-Gal染色显示整体视图 (左)中的半乳糖苷酶活性和冷冻切片的组织图(右)。(B)电穿孔后1周转染的肌肉的代表性组织学图片。用对照质粒进行的电穿孔(左)与盐水电穿孔(右)相比在再生过程中没有产生任何显著的差异。(C)用CMV-Wnt7a表达质粒对胫前肌进行电穿孔后8天，大多数纤维的Wnt7a异位表达。用与α 2-层粘连蛋白和Wnt7a反应的特异性抗体染色的冷冻切片的免疫组化。图16. Wnt7a不影响肌原性增殖或分化。(A)卫星细胞来源的成肌细胞在对照或补充有Wnt的生长培养基中体外生长。 Wnt7a处理没有改变定向肌原祖细胞的动力学。Wnt3a处理导致细胞增殖降低(n = 3，p = 0. 01)。(B)将在分化培养基中培养M小时的卫星细胞来源的成肌细胞用Wnt3a或Wnt7a 重组蛋白处理M小时。Wnt处理没有激活MyoD或1^x7转录(n =幻。Wnt3a处理激活 Axin2转录。(C)卫星细胞来源的成肌细胞生长至60%融合，并转移至对照分化培养基中或补充有Wnt7a的分化培养基中生长4天。对分化细胞进行针对肌球蛋白重链的染色。在对照和Wnt7a处理的培养物中没有观察到分化肌管的形态和大小的差异。(D)融合指数定量在对照和Wnt7a处理的培养物之间没有显示出任何显著的差异(n = 3)。(E)将在分化培养基中培养24小时的成肌细胞用Wnt3a或Wnt7a重组蛋白处理6小时。Wnt3a激活诸如Axin2(增加10倍，η = 3)的Wnt-β -连环蛋白靶基因的转录，而Wnt7a未产生这样的结果。误差棒表示标准误。图17.将Wnt7a cDNA电穿孔入成年wt小鼠的胫前肌中导致卫星细胞数的增加。将Wnt7a cDNA电穿孔入胫前肌中导致卫星细胞数量以及卫星干细胞(myf5阴性、 Pax7阳性)数量的增加。图18.用含有的质粒电穿孔之后，mdx小鼠中的卫星细胞数。在注射对照(IacZ)质粒或含有CMV启动子控制下的Wnt7a编码区的质粒之后，对 mdx小鼠的胫前肌进行电穿孔。对卫星细胞(所有1^x7阳性细胞)以及卫星干细胞(myf5 阴性卫星细胞)的总数进行计数。在用含有Wnt7a的质粒电穿孔的mdx小鼠中的卫星细胞的总数显著增加(P = 0. 005)。
图19.含有Wnt7a的质粒的电穿孔使mdx和wt小鼠中的纤维直径增加。用含有Wnt7a的质粒或IacZ对照质粒对Mdx小鼠以及年龄匹配的wt小鼠(3月龄，雄性)进行电穿孔。Wnt7a cDNA的电穿孔导致mdx和wt小鼠中肌纤维直径显著增加
(P < 0. 001)。图20.给予Wnt7a重组蛋白产生与用Wnt7a质粒电穿孔相似的效应。将人Wnt7a蛋白注射入胫前肌中，并在注射后2周发现肌纤维大小显著增加(ρ < 0. 001)。所观察到的效应与CMV驱动的小鼠Wnt7a质粒电穿孔所产生的效应相似。图 21.小家鼠(Mus musculus)ffnt7a cDNA 序列。小家鼠Wnt7a cDNA序列，编码区用下划线标出(SEQ ID NO :1)。图22.小家鼠Wnt7a氨基酸序列。小家鼠Wnt7a氨基酸序列，推定的成熟肽用下划线标出(SEQ ID NO 2)。图 23.智人(Homo sapiens)Wnt7a cDNA 序列。智人Wnt7a cDNA序列，编码区用下划线标出(SEQ ID NO :3)。图24.智人Wnt7a氨基酸序列。智人Wnt7a氨基酸序列，成熟肽用下划线标出(SEQ ID NO 4)。图25.小家鼠Fzd7 cDNA序列。小家鼠!^(17 cDNA序列，编码区用下划线标出(SEQ ID NO :5)。图26.小家鼠内(17氨基酸序列。小家鼠氨基酸序列，推定的富含半胱氨酸的Wnt结合结构域用下划线标出， 界定推定的Wnt结合位点的残基被加粗，并且推定的PDZ-结构域-结合基序用双下划线标出(SEQ ID NO 6)。图 27.智人!^(17 cDNA 序列。智人cDNA序列，编码区用下划线标出(SEQ ID NO :7)。图28.智人内(17氨基酸序列。智人氨基酸序列，推定的富含半胱氨酸的Wnt结合结构域用下划线标出，界定推定的Wnt结合位点的残基被加粗，并且推定的PDZ-结构域-结合基序用双下划线标出 (SEQ ID NO 8)。图 29.小家鼠 Vangl2 cDNA 序列。小家鼠Vangl2 cDNA序列，编码区用下划线标出(SEQ ID NO :9)。图30.小家鼠Vangl2氨基酸序列。小家鼠Vangl2氨基酸序列，推定的磷酸化位点用下划线标出且推定的PDZ-结构域-结合基序被加粗(SEQ ID NO 10)。图 31.智人 Vangl2 cDNA 序列。智人Vangl2 cDNA序列，编码区用下划线标出(SEQ ID N0:11)。图32.智人Vangl2氨基酸序列。智人Vangl2氨基酸序列，推定的磷酸化位点用下划线标出且推定的PDZ-结构域-结合基序被加粗(SEQ ID NO 12)。发明的详细描述概括地说，本发明提供了用于调节干细胞、尤其是成体干细胞的组合物和方法。更具体而言，本发明提供了用于调节干细胞分裂决定的组合物和方法。还提供了本文所述的组合物和方法的多种用途，包括治疗用途，例如用于促进组织形成、再生、修复或维持。以下详细描述了本发明人所考虑到的本发明的各个方面和实施方案。应当理解， 本发明的范围并不限制于本文所述的示例性的实施方案。目前已经证实，诸如成体干细胞的干细胞中平面细胞极性(PCP)通路的激活能促进干细胞对称分裂。对称分裂产生两个子代细胞，并且导致干细胞库的扩增。相反地，干细胞中PCP信号转导的抑制会抑制了对称分裂，导致不对称(顶端-基底端)细胞分裂增加， 这样不会扩增干细胞库。有趣的是，通过激活PCP通路而促进干细胞的对称分裂对细胞分裂的速率没有影响。目前已经证实，通过FriZZled7(!^d7)受体发挥作用的Wnt7a激活成体干细胞 (例如卫星干细胞)中的PCP信号转导。卫星干细胞是能产生肌细胞的成体干细胞。还证实，对PCP通路中的受体或效应分子(例如内(17或Vangl2)的抑制能消除Wnt7a的效应。 还证实，给予Wnt7a多肽或编码Wnt7a多肽的多核苷酸能在体外和体内显著增加卫星干细胞的数量，并在体内促进组织形成，从而提高损伤或患病的肌肉组织中的修复和再生。因此，Wnt7a、i^d7和PCP信号通路中的其它成员是用于调节干细胞分裂决定和促进组织形成、再生、维持和修复中的新靶标。定义除非另外定义，本文所用的所有技术和科学术语都具有与本发明所属领域的技术人员所通常理解的相同的含义。本文所用的术语“干细胞”是指能分化成为多种最终分化的细胞类型的未分化的细胞。不同的干细胞可以具有不同的潜能。尽管以下定义反映了目前的理解，但是我们对干细胞的的研究和了解在不断进步。全能干细胞通常具有发育成为任何细胞类型的能力， 并且通常是胚胎来源的。多能干细胞通常是能分化为数种分化的细胞类型的干细胞系的细胞。专能干细胞可以分化成为多种细胞，但是仅限于密切相关的家族中的那些细胞。单能干细胞仅可以产生一种细胞类型，但是它们自身具有自我更新的性质，使其区别于非干细胞。 肌肉干细胞是干细胞的实例，其通常被认为是单能的，仅产生肌细胞。“成体干细胞”是见于发育成熟的生物体中的干细胞。成体干细胞包括但不限于， 造血干细胞、间充质干细胞、神经干细胞、内皮干细胞和肌肉干细胞。“卫星干细胞”是能产生肌细胞的成体干细胞的实例。本文所用的术语“祖细胞”是指定向为特定细胞谱系并能通过有限系列的细胞分裂产生该谱系细胞的细胞。成肌细胞是祖细胞的实例，其仅能分化成为一种细胞类型，但是其自身不是完全成熟的或完全分化的。就干细胞而言，本文所用的术语“对称分裂”是指能增加相同类型的细胞数量的细胞分裂。还可以使用术语“平面分裂”。干细胞对称分裂产生两个子代干细胞，从而扩增了干细胞库。因此，术语“扩增”是指由于对称分裂而导致的特定类型的细胞数量的增加。就干细胞而言，本文所用的术语“不对称分裂”是指产生一个子代干细胞和一个祖细胞的细胞分裂，其中干细胞数量没有增加。也可以使用术语“顶端-基底端分裂”。“促进”、“提高”或“增加”干细胞对称分裂表示与正常或对照相比，对称细胞分裂与不对称细胞分裂的比值增加，所述正常或对照的比值例如为在不存在特定活性剂、组合物或处理方法的情况下的比值。例如，对称细胞分裂与不对称细胞分裂的比值可以增加至少 10 %、20 %、30 %、40 %、50 %、60 %、70 %、80 %、90 %、100 %、125 %、150 %、175 %、200 %
或更大。本文所用的术语“分化”是指细胞特化出特定功能的发育过程，例如，细胞获得一种或多种与最初的细胞类型不同的形态特征和/或功能。术语“分化”包括谱系定向分化过程和终末分化过程。例如，可以通过使用免疫组化或本领域技术人员已知的其它方法来评定或监测是否存在生物标志物来评定未分化或分化的状态。本文所用的术语“谱系定向”是指干细胞被定向为形成特定的有限范围的分化的细胞类型的过程。例如，当干细胞在顶端-基底端分裂期间产生祖细胞时，发生谱系定向。 定向的祖细胞通常能自我更新或进行细胞分裂。本文所用的术语“终末分化”是指细胞最终分化成为成熟的、完全分化的细胞。通常，终末分化与退出细胞周期和停止增殖相关。术语“Wnt”是指相关基因和蛋白的家族。Wnt基因编码超过20种富含半胱氨酸的分泌型Wnt蛋白(糖蛋白)，这些蛋白通过与靶细胞上的Frizzled(i^Zd)受体结合来发挥作用。多种Wnt多肽在本领域内是已知的，包括人Wnt :Wnt Uffnt 2、Wnt 3、Wnt 4、Wnt 5a、 Wnt 5b、Wnt 7a 禾口 Wnt 7b，以及小鼠 Wnt :Wnt 1、Wnt 2、Wnt 3a、Wnt 3b、Wnt 4、Wnt 5a、 Wnt 5b,Wnt 6、Wnt 7a、Wnt 7b,Wnt 8a,Wnt 8b,Wnt lea、Wnt 10b,Wnt 11 和 Wnt 12。来自其它物种的同源物也是本领域技术人员已知且可获得的。Wnt家族的成员表现出明显的进化保守性，并因而可在物种之间观察到高度的同源性。"Frizzled(Fzd)，，受体是一种G蛋白偶联受体蛋白家族，并已知Wnt分子与其结合。本领域技术人员可以获取各种i^d受体的序列。本文所示的内(17在卫星干细胞表达。 表达内(17的其它干细胞包括hESC和NSC。Wnt家族的不同成员与特定细胞上的Fzd家族的某些成员的结合能通过数种不同的通路中的一种起始信号转导，包括经典和非经典Wnt信号通路。在所谓的“经典通路”中，信号分子蓬乱蛋白的激活导致糖原合酶激酶-3(GSK-3i3)的失活，GSK-3i3是一种胞质丝氨酸-苏氨酸激酶。因而使得GSK_3i3的靶标连环蛋白稳定化，并转移至细胞核，在细胞核中连环蛋白激活特定启动子的 TCF (Τ细胞因子)依赖性转录。本文还将该通路称为“Wnt/β-连环蛋白”通路。已有充分的证据证明经典Wnt-信号转导在调节肌原性生长和分化中所起的作用。所谓的“非经典”Wnt信号通路也被称为“平面细胞极性”(PCP)通路，在该通路中 Wnt与!^zd的结合也激活蓬乱蛋白(Dvl)，而在这种情况下，蓬乱蛋白激活I^hoA(—种小的 g蛋白)，触发不同于经典通路的级联。例如，与经典通路相反，PCP通路的激活或刺激不会导致β-连环蛋白向细胞核转移。本文所用的“效应”分子是指受体后信号分子，也称为“下游效应”分子。效应分子可以包括例如，胞质信号分子或细胞核信号分子和转录因子，或细胞膜内的分子，例如受体或共受体。效应分子可以包括例如，蛋白、多核苷酸和肽。PCP通路中示例性的效应分子包括 Celsrl、Celsr2、Celsr3、Dvll、Dvl2、Dvl3、Pkl、Pk2、Pk3、Pk4、Rac/RhoA、Vangll、Vangl2、 Syndecan 4 (Syn4)和 α 7_ β 1_ 整联蛋白。
对于信号通路，“激活”可以包括以下的一种或多种例如细胞或细胞膜内分子的磷酸化、构象、极化、定位或分布的改变。激活可以通过信号通路的激活性成员的激活、刺激或上调而直接发生，或者可以通过抑制抑制性成员而间接发生。反过来也适用于“抑制”的直接或间接发生。本文所用的术语“调节剂”是指信号转导事件或通路的“激活剂”和“抑制剂”，例如，Wnt7a信号通路的调节剂。Wnt7a信号通路的调节剂可以是能刺激或抑制Wnt7a多肽或 Wnt7a信号通路中的上游(激活剂)或下游(效应分子)分子的活性或表达的化合物或分子，包括FriZZled7(i^d7)受体的调节剂。Wnt7a信号通路的候选调节剂可以直接或间接刺激或抑制Wnt7a多肽的活性。直接的调节剂可以作用于Wnt7a多肽或编码Wnt7a多肽的基因，而间接的调节剂可以作用于Wnt7a信号通路中Wnt7a多肽的上游(“激活剂”)或下游(“效应分子”)的一种或多种蛋白或编码该蛋白的基因。调节剂可以在基因水平上起作用，例如上调或下调编码Wnt7a多肽或Wnt7a信号转导的激活剂或效应分子的基因的表达， 或者在蛋白水平上起作用，干扰Wnt7a多肽或Wnt7a信号转导的激活剂或效应分子的活性。 调节剂本身可以是Wnt多肽或其活性片段、衍生物或变体。例如，调节剂可以是多肽、肽、多核苷酸、寡核苷酸、抗体或抗体片段、或小分子激活剂或抑制剂。小分子调节剂可以是有机的或者无机的。“干细胞调节剂”是激活或抑制干细胞功能的调节剂。例如，干细胞调节剂可以改变干细胞的分裂、增殖、分化或存活。例如，Wnt7a是干细胞分裂决定的调节剂。对于干细胞，本文所用的术语“Wnt7a信号通路”是指成体干细胞(例如卫星干细胞)中的Wnt7a-FZd7信号通路，该通路被证实能激活PCP信号转导。Wnt7a信号转导被证实能诱导Vangl2和α 7_整联蛋白(PCP通路中的两种已知的效应分子)的极化分布，进而促进干细胞对称分裂。因此，本文所指的Wnt7a信号通路是PCP信号通路。在某些其它的细胞类型中，Wnt7a可以激活其它Wnt信号通路。Wnt7a信号通路的组成成员表现出明显的进化保守性，例如在脊椎动物和哺乳动物中。人和小鼠的Wnt7A蛋白享有约98%的序列同一性，而对应的i^zd7同源物的同一性为约96%，Vangl2同源物的同一性为约99%。如此高度的同源性通常导致跨物种活性。例如，本文已经证实，人Wnt7a在小鼠体系中是有活性的(实施例2)。因此，科学发现通常可以跨物种进行推断。本文所用的术语“蛋白”、“多肽”和“肽”是指通过肽键或修饰的肽键而连接在一起的氨基酸残基的序列。通常，多肽的长度为至少6个氨基酸，肽的长度为至少3个氨基酸。多肽或肽可以是天然存在的、重组的、合成的或上述的组合。多肽或肽可以是天然存在的蛋白或多肽的片段。术语多肽和肽还包括类似物、衍生物和肽模拟化合物。这类化合物是本领域内公知的，并且相对于天然存在的肽具有显著的优势，包括例如，更好的化学稳定性、增强的对蛋白水解降解的抗性、提高的药物特性(例如，半衰期、吸收、效力和功效)、改变的特异性(例如，广谱的生物活性)或降低的抗原性。本文所指的特定蛋白或多肽(例如Wnt7a、i^d7或Vangl2等)包括具有对应于天然存在的序列的氨基酸序列的蛋白和多肽，以及具有与野生型蛋白至少基本相同的活性的变体或同源多肽序列、片段和衍生物。同样，特定的基因(例如Wnt7a、i^d7或Vangl2等) 包括编码具有对应于天然存在的序列的多肽序列的蛋白，以及具有与野生型蛋白至少基本相同活性的变体或同源多肽序列、片段和衍生物的核酸序列或序列的一部分。还考虑到活性高于野生型多肽的多肽，包括其变体、片段、类似物和衍生物。就多肽或基因或其一部分而言，本文所用的功能“活性”是指多肽、基因或其一部分展现出的一种或多种与天然存在蛋白或基因相关的活性。对于多肽或其一部分，功能活性可以包括，例如，特异性结合和/或激活该多肽的受体或配体的能力。对于某一物质，本文所用的“天然存在的”表示自然界中可以发现该物质。例如， 天然存在的多肽或多核苷酸序列可以是生物体中存在的序列，可以从该生物体中将其分离出来，并且没有在实验室中进行人为有意的修饰。术语“野生型”通常可与天然存在的交换使用。在本发明的背景下，当多肽或其片段、变体、类似物或衍生物表现出的活性为野生型蛋白活性的约50 %，优选至少60 %、75 %或80 %时，认为其与所述野生型蛋白具有至少基本相同的活性。在优选的实施方案中，多肽、变体、片段、类似物或衍生物表现出的活性为野生型蛋白活性的至少约85%，例如88%、90%、95%、99%、100%。在某些实施方案中，可以实现高于野生型活性的活性。例如，可以通过测量Wnt7a多肽、变体、片段、类似物或衍生物促进干细胞对称扩增的能力并与野生型蛋白进行比较来确定Wnt7a多肽、变体、片段、类似物或衍生物的活性。测量并表征干细胞分裂的方法是本领域内已知的。多肽的“片段”包括但不限于相对于野生型序列或另一参考序列缺失了一个或多个氨基酸的氨基酸序列。例如，当从氨基末端、羧基末端或两端去除一个或多个氨基酸时则产生了片段，但并不局限于此。此外，可以缺失多肽内部的一个或多个氨基酸。活性片段是保留了例如天然序列或其它参考序列的功能特性的片段。通常，活性片段是保留了与野生型蛋白基本相同活性的片段。例如，片段可以含有功能上重要的结构域，例如对受体或配体结合重要的结构域。“变体”多肽或变体片段是对野生型序列或另一参考序列的氨基酸序列中出现的氨基酸残基进行了一个或多个氨基酸残基的缺失、添加或取代的序列。在本发明的背景下， 变体优选保留与野生型序列或其它参考序列基本相同的活性，或具有高于野生型蛋白的活性。变体可以含有一个或多个氨基酸取代，其可以是“保守型”或“非保守型”取代。 如本领域内所已知的，二十种天然存在的氨基酸可以按照它们的侧链的物化性质进行分类。合适的分类包括丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸和色氨酸 (疏水性侧链)；甘氨酸、丝氨酸、苏氨酸、半胱氨酸、酪氨酸、天冬酰胺和谷氨酰胺(极性、不带电的侧链)；天冬氨酸和谷氨酸(酸性侧链)和赖氨酸、精氨酸和组氨酸(碱性侧链)。 另一氨基酸分类是苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸(芳香族侧链)。保守型取代涉及将一个氨基酸用来自同一组的另一氨基酸进行取代，而非保守型取代涉及将一个氨基酸用来自不同组的另一氨基酸进行取代。通常，变体氨基酸序列与野生型或参考序列具有大于约70%，更优选大于约 80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%的同一性。同一性的程度可以由上文所列出的值中的任意两个所限定的范围或该范围中的任意值来表示。变体包括“突变体”，其中参考序列是野生型序列。“衍生物”是含有正常情况下不是天然存在的分子的一部分的其它化学或生化部
21分的肽或多核苷酸。肽衍生物包括一个或多个氨基酸侧链和/或氨基末端和/或羧基末端用合适的化学取代基进行衍生的肽，并且包括环状肽、双重肽、肽的多聚体、与其它蛋白或载体融合的肽、糖基化的肽、磷酸化的肽、与亲脂性部分(例如，己酰基、月桂酰基、硬脂酰基部分)缀合的肽和与抗体或其它生物配体缀合的肽。可用于衍生肽的化学取代基的实例包括但不限于，烷基、环烷基和芳香基；酰基，包括烷酰基和芳酰基；酯；酰胺；商素；羟基； 氨甲酰基等。取代基还可以是保护基，例如Fmoc(芴甲基-0-C0-)、苄氧羰基(苄基-CO-)、 单甲氧基琥珀酰萘基-NH-C0-、乙酰氨基-己酰基和金刚烷基-NH-C0-。其它衍生物包括 C-末端羟甲基衍生物、0-修饰的衍生物(例如，C-末端羟甲基二苄醚)和N-末端修饰的衍生物，包括取代的酰胺，例如烷基酰胺和酰胼。“类似物”是包含一个或多个非天然存在的氨基酸的多肽或肽。如本领域技术人员所已知的，用所有D-氨基酸取代肽中的所有L-氨基酸能产生“反转(inverse) ”肽或“逆反转(retro-inverso) ”月太(参见 Goodman et al. "Perspectives in Peptide Chemistry (月太化学展望)” PP. 283-294(1981)；美国专利第4，544，752号)，两种肽都被认为是本发明背景下的类似物。“反转”肽是序列的所有L-氨基酸都被D-氨基酸取代的肽，“逆反转”肽是氨基酸序列被颠倒(“逆”)且所有L-氨基酸都被D-氨基酸取代的肽。“肽模拟物”是在结构上与肽相似并且含有模拟本发明的多肽或肽的功能的化学部分的化合物。例如，如果多肽含有两个具有功能活性的带电化学部分，则模拟物以空间定向和限定的结构安置两个带电的化学部分，使得在三维空间中维持该带电的化学功能。因而，术语肽模拟物意图包括等排物。术语“等排物”是指这样的化学结构因为所述化学结构的立体构象与所述肽或多肽的立体构象相似，所以其可以被多肽或肽取代，例如，所述结构符合所述多肽或肽的特异性结合位点。本领域技术人员应当理解，并非肽或多肽中的所有氨基酸都需要被修饰。同样，不是所有的氨基酸都需要以同样的方式进行修饰。本发明的肽衍生物、类似物和肽模拟物包括嵌合分子，所述嵌合分子含有两个或更多个化学上不同的区，每个区包含至少一个氨基酸或其修饰形式。本文所用的“Wnt7a多肽”包括具有对应于野生型Wnt7a序列的多肽序列的Wnt7a 蛋白，或者具有与天然存在的Wnt7a序列的同一性为至少约70%，更优选约80 %、85%、 90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或约 100%的序列的 Wnt7a 蛋白。 可以在至少约50、100、200、300或更多个连续的氨基酸上评价同一性，或者可以在序列的全长上评价同一性。测定同一性百分比或同源性百分比的方法是领域内已知的，并且为此目的可以利用任何合适的方法。Wnt7a多肽还包括与野生型Wnt7a多肽具有基本相同的活性的变体、片段、类似物和衍生物，所述活性例如结合内(17。美国专利第6，四7，030号描述了 Wnt7a多肽和多核苷酸以及通过重组技术产生这类多肽的方法。示例性的Wnt7a多肽包括含有SEQ ID N0:2(小鼠)或SEQ ID N0:4(人)所示的氨基酸序列以及上述序列的活性片段、变体或衍生物的多肽。可以通过领域内已知的方法制备本发明的多肽，例如从细胞提取物纯化或者使用重组技术。本文所述的多肽优选包括纯化的或分离的多肽制备物。在某些实施方案中，多肽的纯化可以利用领域内公知的重组表达方法，并且可以涉及将亲和标签并入表达构建体， 从而允许靶多肽的亲和纯化。
还可以通过领域内已知的方法化学合成较短的序列，所述方法包括但不限于全部固相合成、部分固相合成、片段缩合或经典的溶液合成(Merrifeld(196 Am. Chem. Soc. 85 2149 ；Merrifeld(1986) Science 232:341)。可以使用诸如层析(例如离子交换层析、亲和层析和分级柱层析或高效液相层析)、离心、差别溶解度的标准技术或者通过本领域技术人员熟悉的其它技术来纯化本发明的多肽。还可以通过重组技术产生多肽。这通常涉及用包含编码蛋白或多肽的多核苷酸的表达载体转化(包括转染、转导或感染)合适的宿主细胞。人和小鼠的Wnt7a基因和PCP信号通路的各种其它成员的核酸序列是领域内已知的 (参见例如，GenBank 登录号 000755、PM383、NP_004616、G36470、PF6706、P^047、H36470、 NM_004625、M89801)，并且可以用作本发明多核苷酸的基础。还可以以融合蛋白的形式产生本发明的多肽和肽。这类融合蛋白的一个用途是便于所述多肽或肽的纯化或检测。例如，可以将多肽或肽与免疫球蛋白Fc结构域融合，并且利用蛋白A柱可容易地纯化得到的融合蛋白。融合蛋白的其它实例包括将多肽或肽与组氨酸标签融合(允许在Me+树脂柱上纯化)、与谷胱甘肽-S-转移酶融合(允许在谷胱甘肽柱上纯化)或者与生物素融合(允许在链霉亲和素柱或用链霉亲和素标记的-19磁珠纯化)。一旦纯化出融合蛋白，利用领域内已知的化学或酶学方法，通过位点特异性切割去除标签。术语“基因”包括结构基因的编码区，并且包括邻近编码区的5'和3'端、距任一端大约11Λ距离的序列，使得基因对应于全长mRNA的长度。位于编码区5'并且存在于 mRNA上的序列被称为5'非翻译序列。位于编码区3'或下游并且存在于mRNA上的序列被称为3'非翻译序列。术语“基因”包括基因的cDNA形式和基因组形式。基因的基因组形式或克隆含有称为“外显子”或“表达区”或“表达序列”的编码区和中断编码区的称为“内含子”或“间插区”或“间插序列”的非编码序列。内含子是被转录入核RNA(hnRNA)中的基因区段；内含子可以含有诸如增强子的调节元件。内含子被从核转录物或初级转录物中去除或“剪掉”；因此，内含子不存在于信使RNA(mRNA)转录物上。mRNA在翻译过程中发挥功能，从而指定新生多肽中的氨基酸序列或顺序。除了含有内含子之外，基因的基因组形式还可以含有位于RNA转录物上存在的序列的5'和3'两端的序列。这些序列被称为“侧翼” 序列或区(这些侧翼序列位于mRNA转录物上存在的非翻译序列的5'或3' )。5'侧翼区可以含有控制或影响基因转录的调节序列，例如启动子和增强子。3'侧翼区可以含有指导转录终止、转录后切割和多腺苷酸化的序列。本文所用的术语“多核苷酸序列”或“核酸序列”是指任何核苷酸序列(例如RNA 或DNA)，出于任何原因(例如，调节细胞功能、治疗疾病等)，本领域技术人员需要对其进行操纵。这类核苷酸序列包括但不限于，基因的编码序列(例如，报告基因、选择标记基因、癌基因、疾病抗性基因、生长因子等)和不编码mRNA的非编码调节序列(例如，启动子序列、 多聚腺苷酸化序列、终止序列、增强子序列等)。术语“寡核苷酸”是指由两个或更多个、优选多于三个、通常多于十个脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸组成的分子。确切的大小将取决于多种因素，而这些因素随之取决于寡核苷酸的最终功能或用途。可以以任何方式产生寡核苷酸，包括化学合成、DNA复制、逆转录或以上的组合。术语“调节序列”、“调节区”、“调节元件”表示通常(但并非总是)位于核苷酸序列的蛋白或多肽编码区上游的一部分核酸，其可以由DNA或RNA或DNA与RNA两者组成。 当调节区是有活性的并且与目的核苷酸序列的可操作关联时，可以导致该目的核苷酸序列的表达。调节元件可以能介导器官特异性或控制发育式或短暂的核苷酸序列的激活。“调节区”包括启动子元件、表现出基础启动子活性的核心启动子元件、可响应于刺激的诱导型元件、调解启动子活性的元件(例如负调节元件或转录增强子)。本文所用的“调节区”还包括转录之后有活性的元件，例如，调节核苷酸序列表达的调节元件，例如翻译和转录增强子、翻译和转录抑制子、上游激活序列和mRNA不稳定决定子。这些后述元件中的数种可以邻近编码区。术语“互补的”和“互补性”是指通过碱基配对法则而相关的多核苷酸(即核苷酸序列)。例如，序列“A-G-T-”与序列“T-C-A”互补。互补性可以是“部分的”，其中只有部分的核酸碱基是按照碱基配对法则匹配的。或者，核酸之间可以存在“完全的”或“全部的” 互补性。核酸链之间互补性的程度对核酸链之间杂交的效率和强度具有显著影响。这在扩增反应以及基于核酸间结合的检测方法中尤为重要。当涉及核酸分子时，术语“重组的”是指由借助于分子生物学技术而连接在一起的核酸区段组成的核酸分子。当涉及蛋白或多肽时，术语“重组的”是指利用重组核酸分子所表达的蛋白分子。当涉及多核苷酸时，术语“分离的”是指从在核酸序列的天然来源中与其通常相联的至少一种污染性核酸鉴定并分离出的核酸序列。分离的核酸分子的存在形式或设置不同于其在自然界中存在的形式或设置。相比之下，非分离的核酸(例如DNA和RNA)以它们在自然界存在的形式存在。例如，发现给定的DNA序列(例如，基因)在宿主细胞染色体上与相邻基因接近；诸如编码特定蛋白的特定mRNA序列的RNA序列以与编码大量蛋白的多种其它mRNA的混合物的形式被发现于细胞中。然而，编码特定蛋白的分离的核酸分子包括(通过举例的方式)通常表达该蛋白的细胞中的所述核酸，其中所述核酸所处的染色体位置不同于在天然细胞中的染色体位置，或者其侧翼的核酸序列与自然界中所见的不同。分离的核酸可以单链或双链的形式存在。当分离的核酸被用来表达蛋白时，多核苷酸至少应含有有义链或编码链(即多核苷酸可以是单链的)，但是可以同时含有有义链和反义链(即多核苷酸可以是双链的)。术语“纯化的”是指从天然环境分离或隔离的分子，包括核酸或氨基酸序列。因此， “分离的核酸序列”是纯化的核酸序列。“基本上纯化的”分子至少60%、至少75%或通常至少90%、95%或99%不含与它们天然相联的其它组分。本文所用的术语“纯化的”和“纯化”还指从样品去除污染物。包括蛋白在内的污染分子的去除使样品中目的多肽的百分比提高。在另一实例中，在细菌、酵母或哺乳动物宿主细胞中表达重组多肽，并且通过去除宿主细胞蛋白来纯化所述多肽；从而提高样品中重组多肽的百分比。对应于与本发明的基因或编码本发明的多肽的核酸序列可容易购买到，或可以通过标准技术从合适的来源纯化，或可以通过化学方法合成。核酸可以是基因组DNA、RNA、从分离的mRNA制备的cDNA或通过标准技术从天然存在的核酸序列扩增出的DNA。或者，已知序列可用于制备探针，从而利用标准技术从多种来源获得编码Wnt7a多肽的其它核酸序列。适于获得核酸的来源是已知能表达目的蛋白的细胞或组织，例如具有可检出的Wnt7a 转录物的骨骼肌组织和其它组织。合适的细胞的实例可以是表达Wnt7a的成肌细胞。
可以利用标准技术(例如定点诱变技术)，通过在编码序列中制造一个或多个核苷酸的缺失、添加和/或取代来构建编码天然存在的Wnt7a蛋白的片段或变体的多核苷酸。特定的起始信号是克隆多核苷酸的有效翻译所必需的。这些信号包括ATG起始密码子和邻近序列。当将整个野生型基因或cDNA (包括其自身的起始密码子和邻近的序列) 插入合适的表达载体中时，可以不需要其它翻译控制信号。在其它情况下，必须提供外源翻译控制信号，可能包括ATG起始密码子。此外，起始密码子必须与所需编码序列的读码框同相，从而确保整个插入物的翻译。外源翻译控制信号和起始密码子可以是天然的或合成的。可以通过并入合适的转录增强子元件和/或转录终止子来提高表达的效率(Bittner et al. (1987)Methods in Enzymol. 153，516)。在某些情况下，将特定基因的编码序列与氨基末端或羧基末端表位标签连接，从而促进所表达的蛋白的检测或纯化是可取的。合适的表位标签可以包括但不限于，血凝素 (HA)、myc、FLAG、6 XHis、V5、谷胱甘肽-S-转移酶(GST)等。“表达载体”也被称为表达构建体，其被用于将具体的基因导入靶细胞。一旦表达载体位于细胞内，就会通过细胞转录和翻译体系产生由基因所编码的蛋白。通常将载体进行工程改造，使之含有调节序列，所述调节序列作为增强子和启动子区并且使表达载体所携带的基因能有效转录。设计良好的表达载体的目标是产生大量的稳定的信使RNA。合适的表达载体包括但不限于质粒、噬菌粒、病毒颗粒和载体、噬菌体等。整个表达载体或其一部分可被整合进宿主细胞的基因组中。在一些情况下，利用领域内已知的诱导型表达载体是理想的，例如 LACSWITCH Inducible Expression System(Stratagene, LaJolla, CA) 0合适的表达载体可以包含用于驱动特定宿主细胞中的表达的启动子。一些表达载体可以包含CMV启动子。表达载体可以是例如pCMV或pCMV-Sport6。分子生物学领域内的技术人员应当了解，可以使用多种表达体系来提供重组多肽或肽。可以在原核宿主(例如，大肠杆菌或枯草芽孢杆菌(B. subtilis))或真核宿主(例如，酵母属(Saccharomyces)或毕赤酵母属(Pichia)；诸如 C0S、NIH 3T3、CHO、BHK、293 或 HeLa细胞的哺乳动物细胞、昆虫细胞或植物细胞)中产生多肽或肽。转化或转染方法以及表达载体的选择取决于所选的宿主体系，并且本领域技术人员容易确定。转化和转染方法描述于例如Ausubel et al. (1994)Current Protocols in Molecular Biology(现代分子生物学实验方法)，John Wiley & Sons, New York中，并且从例如在Cloning Vectors =A Laboratory Manual (克隆载体实验手册)(Ponwels et al.，1985，Supp. 1987)中和多个供应商所提供的那些表达载体中可以选择出多种表达载体。此外，可以选择能调节插入序列的表达或以特异的、所需的方式修饰和加工基因产物的宿主细胞。蛋白产物的这类修饰(例如糖基化)和加工(例如切割)对蛋白活性可能至关重要。不同的宿主细胞对蛋白和基因产物的翻译后加工和修饰具有特有且专门的机制。本领域技术人员可以选择合适的细胞系或宿主系统以确保所表达的异源蛋白的正确修饰和加工。按照已知方法，可以将携带表达载体的宿主细胞在常规营养培养基中进行培养， 所述培养基可以视情况进行调整来激活所选基因、抑制所选基因、选择转化体或扩增所选基因。在本发明的背景下，“寡核苷酸调节剂”是基于寡核苷酸的抑制剂或激活剂，其靶向于Wnt7a-PCP信号通路的一个或多个成员基因或编码PCP通路的激活剂或效应分子的基因。例如，寡核苷酸调节剂可以包括反义寡核苷酸、短干扰RNA(siRNA)分子、核酶和三螺旋形成寡核苷酸。由siRNA所介导的RNA干扰在领域内已知能在转录后的基因沉默中起重要作用[Zamore, Nature Struc. Biol. , 8 :746-750 (2001) ] 在自然界中，siRNA 分子的长度通常为21-22个碱基对，并且在长的双链RNA分子通过核糖核酸内切酶的作用被切割时，会产生siRNA分子。最近，已经证实，用具有与靶基因的一部分相同的序列的合成siRNA分子转染哺乳动物细胞会导致该靶基因的mRNA水平降低。例如，用siRNA抑制Vangl2表达，这会进而抑制对称细胞分裂并导致不对称分裂增加。可以通过本领域技术人员公知的常规技术制备寡核苷酸调节剂。例如，可以利用商购的设备用固相合成来制备寡核苷酸，例如利用 BJiAApplied Biosystems Canada Inc. (Mississauga,Canada) 1! ^-° $#，胃以使用领域内已知的标准技术，通过对天然存在的靶基因或mRNA或从mRNA合成的cDNA进行酶学消化和/或扩增来制备寡核苷酸调节剂。当寡核苷酸抑制剂包含RNA时，还可以通过领域内已知的体外转录方法来制备它们。如上文所指出的，还可以使用商购的体外转录试剂盒来方便地制备siRNA分子。还可以使用重组DNA技术来制备寡核苷酸。本文所用的“引物”是指含有两个或更多个、通常多于三个脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸的寡核苷酸，可以从该引物起始引物延伸产物的合成。可用于合成的实验条件包括存在三磷酸核苷和诸如DNA聚合酶的用于聚合和延伸的试剂，以及合适的缓冲液、温度和 pH。对于本文所定义的多肽和多核苷酸序列，涉及序列同一性时，术语“基本同一的” 表示至少 70%，优选至少 80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98% 或99%的序列同一性。“同一性”表示通过领域内已知的标准比对算法或程序、使用每个供应商建立的默认参数所测定的保守氨基酸或核苷酸的数量。应当理解，同一性的程度可以由上文所列出的值中的任意两个所限定的范围或该范围之间的任意值来表示。例如，可以在至少约50、100、200、300或更多个连续的氨基酸或至少约50、100、200、300、500、750、 1000或更多个核苷酸上评价同一性，或者可以在序列的全长上评价同一性。术语“同源性” 和“同一性”通常可交换使用。测定同一性百分比或同源性百分比的方法是领域内已知的， 并且为此目的可以利用任何合适的方法。通常，进行序列比对以便获取最佳匹配。适于测定序列同一性百分比的算法的实例是诸如BLAST的算法，这是本领域技术人员公知的。用于进行 BLAST 分析的软件可通过 National Center for Biotechnology Information (美国生物技术信息中心)(httP://V驟· ncbi. nlm. nih. rov)为公众所获得。其它商用或公众可利用的程序包括 DNAMar MegAlign 程序(Madison, Wl)和 University of Wisconsin Genetics Computer Group (UWG) Gap 禾呈序(Madison Wl)。本文所用的术语“至少90%的同一性”是指相对于参考多核苷酸或多肽的 90-99. 99%的同一性百分比。同一性为90%或更高的水平表明举例假设比较长度为100 个核苷酸或氨基酸的测试和参考多核苷酸或多肽，所述测试多肽中不超过10%的核苷酸或氨基酸与参考核苷酸/多肽的对应比对位置的核苷酸或氨基酸不同。差异可以表示为随机分布于多核苷酸或氨基酸序列全长上的点突变，或者可以聚集在一个或多个位置，所述位置的长度可以不同，最高至可允许的最大值，例如在以上实例中，“至少90%的同一性”表示 100个核苷酸/氨基酸中有10个不同。差异可以定义为核酸或氨基酸取代或缺失。基本同一的核酸分子通常在中度严紧或高度严紧条件下沿核酸长度或沿全长目
26的核酸分子的至少约70%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%发生杂交。就编码序列而言，还考虑含有简并密码子替代了杂交核酸分子中的密码子的核酸分子。本文所用的“结构域”是指分子(例如多肽或编码多核苷酸)的一部分，其在结构上和/或功能上不同于该分子的其它部分。例如，内(17包含推定的富含半胱氨酸的Wnt 结合结构域，该结构域包含SEQ ID N0:6(小鼠)和SEQ ID N0:8(人)所示的多肽的残基 45-169。基于人/小鼠和小鼠和(它们分别的WNT结合结构域的晶体结构都已被报道)之间所表现出的同源性，人/小鼠内(17的残基56、58-60和62-64对于其与 Wnt7a的相互作用特别重要。作为另一个实例，SEQ ID NO :6和8中每一个的最后4个残基编码推定的PDZ-结合基序(特别是SEQ ID NO 6的残基569-572和SEQ ID NO 8的残基 571-574)(参见例如，Dann et al. Nature, 412, July 5，2001，ρ· 86—90)。本文所用的“基因治疗”包括离体和体内技术。因此，可以用多核苷酸对宿主细胞进行离体基因工程改造，然后将工程改造的细胞提供给待治疗的患者。活性剂的体内递送可以涉及将目的分子(例如Wnt-7A多肽或PCP-信号转导的其它激活剂)有效导入待治疗的细胞或组织中的过程。对于基于多肽的活性剂，可以直接实现这一点，或者可以通过将具有转录活性的DNA转染入活细胞，使得活性多肽编码序列能够被表达并通过细胞体系产生该多肽。可以使用转染方法将具有转录活性的DNA递送入待治疗的细胞或组织中(例如肌肉)，所述转染方法包括但不限于电穿孔、显微注射、磷酸钙共沉淀、DEAE葡聚糖促进的转染、阳离子脂质体和逆转录病毒。在某些实施方案中，将待转染的DNA克隆入载体中。这类载体可以包括在宿主细胞中有效递送并表达DNA的质粒。这类载体可以包括但不限于来源于人巨细胞病毒(hCMV)或其它合适的启动子(例如hPGK-Ι或hACT)的质粒。或者，可以通过利用领域内已知的技术给予多核苷酸对细胞进行体内工程改造。例如，通过直接注射“裸露的”多核苷酸(Feigner and Rhodes, (1991)Nature 349 351-352 ；美国专利第5，679，647号)或与一种或多种其它试剂一起配制在组合物中的多核苷酸，所述试剂能促进细胞对所述多核苷酸的摄取，例如皂苷(参见例如，美国专利第 5，739，118号)或阳离子聚酰胺(参见例如，美国专利第5，837，533号)；通过微粒轰击(例如，通过使用“基因枪”，Biolistic，Dupont)；通过用脂质、细胞表面受体或转染试剂包被多核苷酸；通过将多核苷酸封装入脂质体、微粒或微囊中；通过给予与已知能进入细胞核中的肽相连的多核苷酸；或者通过给予与能进行受体介导的内吞作用的配体相连的多核苷酸 (参见例如，mi and Wu, (1987) J :Biol. Chem. 262 :4429-4432)，该方法可用来靶向于特异表达该受体的细胞类型。或者，可以形成多核苷酸-配体复合物，其中所述配体包含基因融合的病毒肽以破坏核内体，从而使多核苷酸避免被溶酶体降解；或者可以通过靶向于特定受体而使多核苷酸靶向于细胞特异性摄取和体内表达(参见例如，国际专利申请WO 92/06180、WO 92/22635、W092/203167、W093/14188和WO 93/20221)。本发明还考虑将多核苷酸的细胞内导入，随后通过同源重组使所述多核苷酸并入宿主细胞DNA用于表达(参见例如，Koller and Smithies(1989)Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86 :8932-8935 ；Zijlstra et al. (1989) Nature 342 :435-438)。可以将多核苷酸并入合适的表达载体中。适于基因治疗应用的多种载体是领域内己知的(参见例如，Viral Vectors :Basic Science and Gene Therapy (病毒载体基础科学和基因治疗)，Eaton Publishing Co. QOOO))，并且可以使用这些方法。表达载体可以是质粒载体。产生和纯化质粒DNA的方法快速且简单。此外，质粒DNA通常并不整合入宿主细胞的基因组中，而是作为分离的实体维持为附加体的位置，这消除了染色体整合可能产生的基因毒性问题。目前，多种质粒易于购买到，并且包括来源于大肠杆菌和枯草芽孢杆菌的质粒，其中很多都被特别设计成用于哺乳动物系统中。可用于本发明中的质粒的实例包括但不限于，表达载体 pRc/CMVanvitrogen)、pCR2. 1 (Invitrogen)、pAd/CMV 禾口 pAd/TR5/GFPq(Massie et al.，(1998)Cytotechnology 沘53-64)。在示例性的实施方案中，质粒是 pRc/CMV、pRc/CMV2 (Invitrogen)、pAdCMV5 (IRB-NRC)、pcDNA3 (Invitrogen)、 pAdMLP5(IRB-NRC)或 pVAX (Invitrogen)。或者，表达载体可以是基于病毒的载体。基于病毒的载体的实例包括但不限于， 来源于复制缺陷型逆转录病毒、慢病毒、腺病毒和腺相关病毒的载体。逆转录病毒载体和腺相关病毒载体是当前选择用于将外源基因转移入体内、尤其是人体内的重组基因递送系统。这些载体将基因有效递送入细胞中，并且所转移的多核苷酸能稳定整合入宿主的染色体DNA中。使用逆转录病毒的首要的先决条件是确保其使用的安全性，尤其要注意野生型病毒在细胞群体中传播的可能性。可作为逆转录病毒载体来源的逆转录病毒包括但不限于，洛尼鼠白血病病毒、脾坏死病毒、诸如劳氏肉瘤病毒、哈维肉瘤病毒、禽白血病病毒、长臂猿白血病病毒、人类免疫缺陷病毒、腺病毒、骨髓增殖性肉瘤病毒和乳癌病毒的逆转录病毒。具体的逆转录病毒包括PLJ、pZIP、pffE和pEM，它们是本领域技术人员所公知的。通常将多核苷酸并入载体中并受合适的启动子的控制，所述启动子允许编码多肽的体内表达。可以使用的合适的启动子包括但不限于，腺病毒启动子，例如腺病毒主要晚期启动子、ElA启动子、主要晚期启动子(MLP)和相关的前导序列或E3启动子；巨细胞病毒 (CMV)启动子；呼吸道合胞体病毒(RSV)启动子；诱导型启动子，例如MMT启动子、金属硫蛋白启动子；热休克启动子；白蛋白启动子；ApoAI启动子；人类球蛋白启动子；病毒胸苷激酶启动子，例如单纯疱疹病毒胸苷激酶启动子；逆转录病毒LTR、组蛋白、pot III和果胶启动子；B 19细小病毒启动子；SV40启动子；以及人类生长激素启动子。启动子还可以是目的基因的天然启动子。合适启动子的选择将取决于载体、宿主细胞和所编码的蛋白，并且被认为是本领域技术人员的常规技术。对仅产生复制缺陷型逆转录病毒的特化细胞系(称为“包装细胞”)的开发提高了逆转录病毒用于基因治疗的功效，并且缺陷型逆转录病毒在以基因治疗为目的的基因转移中的应用已有很多研究(综述参见Miller，A.D. ；1990)Blood 76:271)。因此，可以这样构建重组逆转录病毒，其中逆转录病毒编码序列的一部分(gag、p0t、env)用主题多核苷酸替代，并使得逆转录病毒是复制缺陷的。然后通过标准技术将复制缺陷型逆转录病毒包装进病毒体中，通过使用辅助病毒可使用所述病毒体来感染靶细胞。产生重组逆转录病毒的方法和用这种病毒体外或体内感染细胞的方法可见于Current Protocols in Molecular Biology (当代分子生物学技术)，Ausubel，F. Μ· et al. (eds.), J. Wiley & Sons, (1989)， Sections 9. 10_9. 14和其它标准实验室手册。适于制备亲嗜性和双嗜性逆转录病毒系统的包装病毒系的实例包括Crip、Cre2和Am。包装细胞的其它实例包括但不限于，PE501、 PA317、1-2、yr-3S AM、PA12、T19—14X、VT-19-17—H2、ACRE、SCRIP、GP+E—86、GP+envAml2 禾口 Miller,Human Gene Therapy (人类基因治疗)，Vol. l，pas. 5-14(1990)中所描述的 DAN 细胞系。此外，已经证实，通过修饰病毒颗粒表面的病毒包装蛋白可以限制逆转录病毒以及因而得到的基于逆转录病毒的载体的感染谱(参见例如，PCT公开WO 93/25234和WO 94/06920)。例如，修饰逆转录病毒载体的感染谱的策略包括将细胞表面抗原的特异性抗体与病毒 env 蛋白偶联(Roux et al. (1989)PNAS 86 :9079-9083 Julan et al. (1992) J.Gen Virol 73 :3251-3255 ；以及 Goud et al. (1983) Virology 163 :251-254)；或者将细胞表面受体的配体与病毒env蛋白偶联(Neda et al. (1991)J.Biol Chem 266 14143-14146)。偶联可以是与蛋白或其它种类(例如，将erw蛋白转化为脱唾液酸糖蛋白的乳糖)的化学交联形式，以及通过产生融合蛋白(例如，单链抗体/erw融合蛋白)。尽管该项技术可用于限制或指导对某些组织类型的感染，但是其也可用于将亲嗜性载体转换成双嗜性载体。此外，可以通过使用组织特异性或细胞特异性转录调节序列来进一步提高逆转录病毒基因递送的应用，所述转录调节序列控制载体中所包含的多核苷酸的表达。可用于基因治疗技术中的另一种病毒载体是腺病毒来源的载体。可以操纵腺病毒的基因组，使其编码并表达目的基因产物，但失去在正常裂解病毒生命周期中复制的能力。 参见例如 Berlner et al. (1988) BioTechniques 6 616 ；Rosenfeld et al. (1991) Science 252 :431-434 ；以及 Rosenfeld et al. (1992)Cell 68:143-155。来源于腺病毒株 Ad 5 型 dl 3 或其它腺病毒株(例如，Adz、Ad3、Adz等)的合适的腺病毒载体是本领域技术人员公知的。在某些情况下，重组腺病毒是有优势的，其优势在于它们可用来感染多种细胞类型，包括周围神经细胞。此外，病毒颗粒相对稳定且可进行纯化和浓缩，并且如上文所述，可以修饰病毒颗粒来影响感染谱。此外，导入的腺病毒DNA(和其中所包含的外源DNA)不被整合入宿主细胞的基因组中，而是保持为附加体，从而避免了在导入的DNA整合入宿主基因组(例如，逆转录病毒DNA)中的情况下由于插入诱变而可能发生的潜在问题。而且，腺病毒基因组携带外源DNA的能力比其它基因递送载体更大(高达81Λ) (Berliner et al.， 如上；Haj-Ahmand and Graham(1986) J. Virol. 57 267)。当前使用的和本发明所考虑的大多数复制缺陷型腺病毒载体缺失病毒E2和E3基因的全部或部分，但是保留多达80%的腺病毒遗传物质(参见例如，Jones et al. (1979)Cell 16 :683 ；Berliner et al.，同上；以及 Graham et al. in Methods in Molecular Biology,Ε. J. Murray,Ed. (Humane,Clifton, N. J.，1991) vol. 7. pp. 109-127)。复制缺陷型人腺病毒载体的产生和增殖需要独特的辅助细胞系。辅助细胞系可以来源于人类细胞，例如人胚肾细胞、肌细胞、造血细胞或其它人胚胎间充质或上皮细胞。或者，辅助细胞可以来源于容许人腺病毒的其它哺乳动物种类的细胞，即能提供复制缺陷型病毒的复制所必需的序列的细胞。这类细胞包括例如，293细胞、 Vero细胞或其它猴胚胎间充质或上皮细胞。还考虑使用非人腺病毒载体，例如猪或牛腺病毒载体。合适病毒载体及辅助细胞系的选择属于本领域技术人员的常规技术。本文所用的“个体”可以是哺乳动物个体，例如但不限于小鼠、牛、绵羊、山羊、猪、 狗、猫、大鼠、兔、灵长动物或人。“药物组合物”通常可与“组合物”互换使用，其包含至少一种实现所需效应的活性剂。药物组合物还包含一种或多种生理学可接受的稀释剂、载体或赋形剂。药物组合物和制备药物组合物的方法是领域内已知的，并且例如描述于“Remington =The Science andPractice of Pharmacy (雷明顿制药科学和实践)”(以前为“Itemingtons Pharmaceutical Sciences (雷明顿制药科学)”)；Gennaro, A.，Lippincott, Williams & Wilkins, Philadelphia, PA(2000)中。“细胞组合物”是含有细胞和一种或多种生理学可接受的稀释剂、载体或赋形剂的组合物。细胞组合物还可以包含一种或多种活性剂。在某些情况下，细胞可以经过转化而能表达目的基因或蛋白。“干细胞组合物”是含有干细胞和一种或多种生理学可接受的稀释剂、载体或赋形剂的组合物。干细胞组合物可以包含一种或多种活性剂，例如干细胞调节剂。在某些情况下，干细胞可以经过转化而能表达目的基因或蛋白。“有效量”是足以实现有利或所需结果的量。有效量可以是体外有效量或体内有效量。体内有效量还可以被称为“治疗有效量”，可以以一个或多个剂量给予患者“治疗有效量”。对于疾病或损伤的治疗，有效量可以是足以减轻、改善、稳定、逆转或延缓疾病或损伤进程的量。有效量通常由医师基于具体病例来确定，并且属于本领域技术人员的技术。当确定达到有效量的合适剂量时，通常应考虑几个因素。这些因素包括患者的年龄、性别和体重、待治疗的疾病状态、疾病状态的严重程度以及所给予的抗原结合片段的形式和有效浓度。本文所用的术语“约”是指从给定值的变化为士5%。应当理解，这样的变化总是包含在本文所提供的任何给定的值当中，无论是否具体指出。上文定义中包括本发明的实施方案，可依赖该定义限定本发明。一方面，提供了用于调节干细胞的分裂对称性的组合物，其包含作为活性剂的干细胞平面细胞极性(PCP)信号转导的调节剂。优选地，干细胞是成体干细胞，例如，卫星干细胞。在一些实施方案中，所述活性剂是能促进干细胞对称分裂的PCP信号转导的激活齐U。激活剂可以包含一种分子或分子的组合。PCP信号通路的多肽和肽激活剂包括直接激活剂以及通过抑制能抑制Wnt7a信号转导的蛋白的活性或表达来发挥其激活作用的激活齐U，即间接激活剂。本文所述的组合物可用于在体外或体内促进干细胞扩增。已经证实，卫星干细胞中PCP通路或其成员的激活能促进干细胞对称分裂，从而大量扩增干细胞库但不影响细胞分裂速率。例如，所述活性剂可以包含小分子、多核苷酸、肽、多肽、大分子或以上的组合。包括Wnt7a和在内的PCP通路的成员在物种间趋向于高度保守。因此，本发明的范围包括来源于多种物种的多肽和多核苷酸，只要它们具有所需的特性和活性。在一些实施方案中，所述活性剂包含能结合和/或激活干细胞上的内(17的肽或多肽。内(17包含推定的富含半胱氨酸的Wnt结合结构域，该结构域包含SEQ ID N0:6(小鼠)和SEQ ID NO :8 (人)所示的多肽的残基45-169。基于人/小鼠i^zd7和小鼠i^zd8和 Fzd3(它们分别的Wnt结合结构域的晶体结构都已被报道)之间所表现出的同源性，人/ 小鼠内(17的残基56、58-60和62-64对于其与Wnt7a的相互作用特别重要。因此，能激活 Fzd7的多肽可以包括能与内(17的Wnt结合结构域结合的多肽。在一些实施方案中，所述活性剂是Wnt7a多肽或Wnt7a多肽的能结合并激活内(17的活性类似物、变体、片段或衍生物。示例性的Wnt7a多肽如图22(SEQ ID NO 2) ID NO 4)所示，其分别为小鼠和人的序列。在一些实施方案中，所述活性剂是具有Wnt7a多肽序列的多肽或具有与Wnt7a多肽的同一性为至少约 70%,80%,85%,90%,91%,92%,93%,94%,95%,96%,97%,98% 或99%的序列的多肽。在一些实施方案中，Wnt7a多肽的序列包括SEQ ID NO :2或SEQ ID NO :4。在一些实施方案中，所述活性剂是具有包含SEQ ID NO :2或SEQ ID NO 4的氨基酸序列的Wnt7a多肽，或具有与SEQ ID NO :2或SEQ ID NO :4的同一性为至少约70%、80%、 85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或 99% 的序列的 Wnt7a 多肽。在一些实施方案中，在至少约50、100、200、300或更多个连续氨基酸上评价同一性百分比。在一些实施方案中，在成熟肽序列的全长上评价同一性百分比。在某些实施方案中，所述活性剂包含Wnt7a多肽。在一些实施方案中，所述Wnt7a 多肽是人Wnt7a多肽。在一些实施方案中，所述Wnt7a多肽是鼠Wnt7a多肽。还考虑到了其它物种。在一些实施方案中，所述Wnt7a多肽的氨基酸序列包含SEQ ID NO :2或SEQ ID NO 4 或者由 SEQ ID NO 2 或 SEQ ID NO 4 组成。在一些实施方案中，所述活性剂包含编码能结合和/或激活内(17的肽或多肽的分离的多核苷酸。所述能结合和/或激活内(17的肽或多肽可以如上文所述。因此，在一些实施方案中，所述多核苷酸编码Wnt7a多肽或Wnt7a多肽的能结合并激活i^Zd7的活性类似物、变体、片段或衍生物。示例性的Wnt7a多核苷酸如图21 (SEQ ID NO 1)和23 (SEQ ID NO 3)所示，它们分别是小鼠和人的序列。在一些实施方案中，所述活性剂包含编码多肽的多核苷酸，所述多肽具有包含SEQ ID NO :2或SEQ ID NO :4的氨基酸序列或具有与SEQ ID NO :2或SEQ ID NO :4的同一性为至少约 70%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98% 或 99% 的序列。在一些实施方案中，所述活性剂包含多核苷酸，所述多核苷酸具有包含SEQ ID NO :1或SEQ ID NO 3的氨基酸序列或具有与SEQ ID NO :1或SEQ ID NO 3的同一性为至少约 70%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98% 或 99% 的序列。在一些实施方案中，在至少约50、100、200、300、500、750或100或更多个连续核苷酸上评价同一性百分比。在一些实施方案中，在多核苷酸的全长上评价同一性百分比。在一些实施方案中，多核苷酸所包含的Wnt7a多核苷酸序列包含SEQ ID NO :1或 SEQ ID NO 3 或由 SEQ ID NO 1 或 SEQ ID NO 3 组成。在一些实施方案中，所述活性剂是能结合和/或激活内(17的小分子。在一些实施方案中，所述活性剂是能增加干细胞上内(17表达的多核苷酸或多肽。 在一些实施方案中，所述活性剂包含内(17多核苷酸。示例性的内(17多核苷酸如图25(SEQ ID NO 5)和27 (SEQ ID NO 7)所示。在一些实施方案中，所述激活剂包含多核苷酸，所述多核苷酸具有包含SEQ ID NO 6或SEQ ID NO 8的氨基酸序列或具有与SEQ ID NO 6或 SEQ ID NO :8 的同一性为至少约 70%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%的序列。在一些实施方案中，所述多肽相当于Wnt7a信号转导的调节剂，例如，Fzd7,Fzd3, Celsrl、Celsr2、Celsr3、Dvll、Dvl2、Dvl3、Pkl、Pk2、Pk3、Pk4、Rac/RhoA、Vangll、Vangl2、 Syndecan 4(Syn4)和α 7_ β 1_整联蛋白或以上的活性片段、变体或衍生物。在一些实施方案中，所述活性剂包含能调节PCP通路中的下游效应分子，从而促进或抑制细胞对称分裂的多核苷酸或多肽。可被调节而影响成体干细胞中细胞分裂决定的示例性的极性效应分子包括I^rickleHamingo (Celsr2)、蓬乱蛋白(Dsh)或PTK7。PCP通路中示例性的调节靶标包括但不限于，阼(17、Vangl 1、Vangl2、Dvl2、Dvl3、Pkl、Pk2、Celsr2 和α 7-整联蛋白。在一些实施方案中，所述活性剂包含能激活PCP通路中的下游效应分子，从而促进干细胞对称分裂的多核苷酸或多肽。例如，所述下游效应分子可以是Vangl2、α 7_整联蛋白、Pricklel 或 Celsr2。在一个实施方案中，所述效应分子是Vangl2。例如，所述活性剂可以是能诱导 Vangl2在细胞膜中的表达或极化分布的多肽或多核苷酸。在一些实施方案中，所述活性剂可以包含编码Vangl2多肽的多核苷酸。示例性的 Vangl2多肽显示在图30(SEQ ID NO :10)和32 (SEQ ID NO 12)中。在一些实施方案中， Vangl2多肽与野生型蛋白具有基本相同的活性。在一些实施方案中，所述组合物还包含一种或多种干细胞调节剂。例如，所述干细胞调节剂可以促进干细胞增殖、分化、谱系定向或定向祖细胞的终末分化中的一种或多种。在一些实施方案中，所述调节剂增加干细胞分裂的速率。可以使用任何合适的干细胞分裂速率的激活剂，例如合适的生长因子。已知的生长因子包括FGF、HGF和SDF。在一些实施方案中，选择能增加干细胞分裂速率而不会促进分化的生长因子。在一些实施方案中，所述调节剂是能提高扩增的干细胞群体的增殖的调节剂，或者是能提高已用Wnt7a处理扩增的干细胞群体的增殖的调节剂。在一些实施方案中，干细胞调节剂促进干细胞存活。例如，能增强干细胞存活的示例性的化合物包括音猬因子(Sih)蛋白。在一些实施方案中，干细胞调节剂是经典Wnt/β-连环蛋白信号转导的抑制剂。在一个实施方案中，提供了用于增强哺乳动物中的组织形成、再生、维持或修复的组合物，其包含作为活性剂的(a)Wnt7a多肽或Wnt7a多肽的能结合并激活内(17的活性变体、片段、类似物或衍生物，或(b)编码Wnt7a多肽或WnUa多肽的能结合并激活i^Zd7的活性变体、片段、类似物或衍生物的多核苷酸。在另一实施方案中，提供了用于促进干细胞对称分裂的组合物，其包含作为活性剂的一种或多种内(17受体激活剂，其中所述一种或多种激活剂可以包括但不限于，能激活成体干细胞中的内(17受体的一种或多种小分子、核酸、多肽、肽、大分子、抗体或以上的组
I=I O在一些实施方案中，所述成体干细胞是卫星干细胞。本文所述的组合物可用来将目的多核苷酸递送入细胞或组织中。例如，可以在体外给予所述组合物，从而扩增干细胞群体，或者例如，可以以基因治疗方法体内给予所述组合物。
目的多核苷酸可被直接递送入细胞或组织中(例如裸露的)。更通常，所述多核苷酸会被克隆入能表达所编码的多肽的表达载体中。因此，细胞或组织可经过转化而能表达目的多肽。可以利用领域内已知的任何合适的转化方法。多种表达系统是领域内已知的，且可通过多种来源(例如hvitrogeruClontech) 为公众所获取。可以使用任何合适的表达载体。在一些实施方案中，表达载体是哺乳动物表达载体。在一些实施方案中，表达载体是质粒。在一些实施方案中，质粒是病毒来源的质粒。在一些实施方案中，质粒包含CMV启动子序列。在一些实施方案中，质粒包含pCMV或 pCMV-Sport6。在一个实施方案中，质粒是Wnt7a_CMV。任选地，基因表达可以受诱导型启动子的控制。数种诱导型启动子是领域内已知的。在一些实施方案中，所述组合物包含携带编码多肽的多核苷酸的表达载体，所述多肽能激活干细胞中的PCP信号转导，从而促进干细胞对称扩增。在一些实施方案中，细胞或组织经过转化而能表达干细胞PCP信号转导的调节齐U。上文已经描述了多种示例性的调节剂。在一些实施方案中，细胞或组织经过转化而能过表达Wnt7a，从而诱导干细胞的对称分裂。Wnt7a可从转化的细胞分泌，并可以作用于分泌它的细胞或可以作用于邻近的干细胞。在一些实施方案中，所转化的细胞是可以是与干细胞共同培养或共同给予的辅助细胞。 辅助细胞还可以是经转化而能过表达Wnt7a或另一目的蛋白的组织中的驻留细胞。在一些实施方案中，辅助细胞是经转化而能过表达Wnt7a的成肌细胞或肌细胞。在一些实施方案中，肌肉组织经过转化而能过表达Wnt7a。在一些实施方案中，所述肌肉组织是骨骼肌。Wnt7a的过表达体内扩增了卫星干细胞库，增加了卫星细胞数量并促进了肌肉再生和修复。在一些实施方案中，干细胞经过转化而能过表达内(17、Vangl2, α 7_整联蛋白或干细胞PCP信号转导中的另一效应分子。在一些实施方案中，所述组合物包含细胞，并且因而可以是细胞组合物。例如， 所述组合物可以包含辅助细胞。在一些实施方案中，辅助细胞经过转化而能表达和分泌 Wnt7a0在一些实施方案中，所述辅助细胞是成肌细胞或肌细胞。在一些实施方案中，所述组合物包含干细胞，并且因而是干细胞组合物。在一些实施方案中，可以使用本发明的方法体外扩增干细胞，并且随后可以将所述扩增的干细胞添加到本发明的组合物中来形成干细胞组合物。例如，可以使用本发明的方法体外培养和扩增干细胞，然后可以按照本领域技术人员已知的方法将所述干细胞以治疗干细胞组合物的形式给予个体。在一些实施方案中，所述组合物包含干细胞和干细胞PCP信号转导的激活剂。在一些实施方案中，所述干细胞是卫星干细胞。在一些实施方案中，所述组合物包含经转化而能表达目的多核苷酸的干细胞。可以利用领域内已知的任何合适的转化方法。在一个实施方案中，提供了用于增强组织再生或修复的组合物，其包含干细胞和一种或多种PCP信号转导的激活剂或效应分子。上文已描述了 PCP信号转导的激活剂和效应分子。
在一些实施方案中，所述组合物包含经转化而能过表达PCP通路的激活剂或效应分子的干细胞，所述激活剂或效应分子例如Wnt7a、Fzd7或Vangl2。所述组合物可以包含生理学可接受的稀释剂、载体或赋形剂。制备用于不同给药途径的不同药物组合物的方法是领域内已知的，并且将在下面的部分进一步描述。在一些实施方案中，所述组合物可被配制成用于注射。例如，所述组合物可被配制成用于静脉内注射、肌肉内注射、心内注射、皮下注射或腹膜内注射中的一种或多种。在一个实施方案中，所述组合物用于系统注射。在一个实施方案中，所述组合物用于肌肉内注射。在一些实施方案中，提供了本文所述的组合物在制备用于促进干细胞扩增的药物中的用途。在一些实施方案中，提供了本文所述的用于制备促进干细胞扩增的药物的组合物。在一些实施方案中，提供了本文所述的组合物在制备用于促进有需要的个体的肌肉形成、维持、修复或再生的药物中的用途。在一些实施方案中，提供了本文所述的用于制备促进有需要的个体的肌肉形成、维持、修复或再生的药物的组合物。在一些实施方案中，所述组合物用于促进肌肉再生或修复。可以给予有效量的(例如治疗有效量的)所述组合物。本发明提供了调节干细胞的方法，尤其是调节诸如卫星干细胞的成体干细胞的分裂对称性的方法。在一些实施方案中，提供了在体内或体外调节干细胞分裂对称性的方法，包括将所述干细胞与本文所述的组合物接触。如上文的实施方案中所描述，所述组合物包含作为活性剂的干细胞平面细胞极性 (PCP)信号转导的调节剂。在一些实施方案中，所述活性剂是干细胞PCP信号转导的激活剂，且所述方法因而能促进干细胞扩增。例如，这类方法可用于在体内或体外增加干细胞群体中对称细胞分裂与不对称细胞分裂的相对比例。这类方法因而可用于在体内或体外扩增干细胞群体。在一些实施方案中，本文所公开的方法能促进干细胞对称分裂而不改变干细胞分裂速率。在一些实施方案中，所述方法可用于促进干细胞群体的存活。在一些实施方案中，在体外实施所述方法。在一些实施方案中，在体内实施所述方法。在一些实施方案中，所述体内方法包括将所述组合物给予有需要的个体。在一些实施方案中，提供了在体内或体外扩增卫星干细胞群体的方法，包括将所述干细胞与有效量的组合物接触，所述组合物包含(a)Wnt7a多肽或Wnt7a多肽的能结合并激活内(17的活性变体、片段、类似物或衍生物，或(b)编码Wnt7a多肽或Wnt7a多肽的能结合并激活1^(17的活性变体、片段、类似物或衍生物的多核苷酸。在一些实施方案中，所述活性剂是Wnt7a多肽或Wnt7a多肽的类似物、衍生物、变体或活性片段。在一些实施方案中，提供了促进卫星干细胞扩增的方法，包括将所述卫星干细胞与Wnt7a或Wnt7a的能激活i^Zd7的活性片段、变体、类似物或衍生物接触。
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在另一实施方案中，提供了增加组织中卫星细胞的数量并进而提供增强的组织再生潜能的方法，包括将所述干细胞与本文所述的组合物接触。在一些实施方案中，本发明的方法可用于体内治疗组织中的驻留干细胞，例如肌肉组织中的驻留卫星干细胞。 在一些实施方案中，提供了使用能激活Wnt7a从而使内源Wnt7a增加或内源Wnt7a 活性增加的化合物来促进干细胞扩增的方法。Wnt7a激活剂可以是多肽或者是编码多肽的基因，所述多肽在体内作用于Wnt7a上游，从而上调Wnt7a的表达或活性，或者所述Wnt7a 激活剂可以是小分子激活剂。例如，激活剂可以在基因水平上发挥作用来上调编码 Wnt7a的基因的表达，或者Wnt7a激活剂可以在蛋白水平上发挥作用来提高Wnt7a多肽的活性或降低Wnt7a抑制剂的活性。例如，Wnt7a激活剂可以是多肽和肽(或如上文所述对应于多肽的类似物、衍生物、变体或肽模拟化合物)、多核苷酸、寡核苷酸、抗体或抗体片段、或有机或无机的小分子。在一些实施方案中，所述方法还可以包括将干细胞与一种或多种干细胞调节剂接触，例如，能提高干细胞分裂速率或干细胞存活的调节剂。在一些实施方案中，所述方法包括将细胞给予个体。例如，所述细胞可以与本文所述的组合物同时给予或相继给予。在一些实施方案中，所述方法包括将干细胞给予个体。例如，所述干细胞可以与本文所述的促进干细胞扩增的组合物同时给予或相继给予。例如，可以在给予所述组合物之前给予干细胞(即可以在所需的时间之后给予组合物)。在一些实施方案中，所述组合物自身可以包含所要给予的干细胞。可以在体外维持并扩增干细胞以用于随后的实验或治疗应用。在一些实施方案中，体外扩增干细胞(例如卫星干细胞)，并随后将扩增的细胞给予有需要的个体。例如，可以利用本发明的方法体外培养和扩增干细胞，然后按照本领域技术人员已知的方法将扩增的细胞以治疗干细胞组合物的形式给予患者。在一些实施方案中，可以从个体获得干细胞，并保持培养。可以用Wnt7a或PCP信号转导的另一激活剂处理培养的干细胞群体，从而在体外促进对称扩增。在一些实施方案中，所述方法可以包括将辅助细胞给予个体。例如，所述辅助细胞可以与所述组合物同时给予或相继给予。在一些实施方案中，所述组合物本身可以包含辅助细胞。本发明还考虑通过领域内已知的多种基因治疗方法给予多核苷酸，然后所述多核苷酸在体内表达编码的产物，其中所给予的多核苷酸编码Wnt7a、Wnt7a的变体或活性片段、或PCP信号转导的另一激活剂、以及任选的干细胞调节剂。在一些实施方案中，所述方法包括转化细胞或组织。一些示例性的方法之前已在上文描述。各种转化方法是本领域技术人员已知的。在一些实施方案中，细胞或组织经过转化而能表达Wnt7a或其活性片段或变体， 然后Wnt7a或其活性片段或变体被分泌并通过结合内(17受体而在干细胞表面发挥作用。在一些实施方案中，辅助细胞经过转化而能过表达Wnt7a或其活性片段或变体。在一些实施方案中，干细胞经过转化而能表达内(17或PCP信号转导的效应分子， 例如 Vangl2。
在一些实施方案中，卫星干细胞经过转化而能过表达Wnt7a或其活性片段或变体或PCP信号转导的另一激活剂。在一个实施方案中，卫星干细胞经过转化而能过表达 Vangl20在另一实施方案中，卫星干细胞经过转化而能过表达内(17。在一些实施方案中，将干细胞与分化的细胞共培养，所述分化的细胞经过转化而能过表达并分泌Wnt7a或干细胞PCP信号转导中的另一刺激剂，例如内(17的激活剂。在一个实施方案中，将卫星干细胞与肌细胞共培养，所述肌细胞经过CMV-Wnt7a 的转化而能过表达并分泌Wnt7a。可以使用任何合适的表达载体，包括但不限于之前所描述的那些载体。如果进行体内方法，还可以使用细胞特异性或组织特异性载体或启动子。在一个实施方案中，载体是肌肉特异性AAV载体。可以任选地使用诱导型启动子。可以将PCP-信号转导的多肽激活剂或效应分子直接导入细胞，而省去DNA转染步骤。直接将多肽递送入细胞中的方式包括但不限于，显微注射、电穿孔、阳离子脂质和构建病毒融合蛋白。通常，可以使用携带多核苷酸的合适的表达系统的转染。可以使用促进干细胞扩增的方法来离体或体外刺激干细胞的扩增，从而提供适于移植入或给予有需要的个体的细胞群体。可以用干细胞调节剂(例如促进干细胞存活的调节剂)处理待给予的干细胞。还考虑到有序方法，即先促进干细胞的扩增，随后促进增殖和/或分化。例如，可以通过将干细胞直接或间接与Wnt7a或PCP信号转导的另一激活剂接触来体外扩增该干细胞群体。然后可以在体外或体内用一种或多种干细胞调节剂处理扩增的细胞群体，所述调节剂例如能促进干细胞原位增殖和/或分化或促进干细胞存活。或者，可以在将细胞给予个体之前，体外进行这两步。在本文中，“体外”有时可与“离体”交换使用。对于体内和离体移植方法，干细胞可以是自体的、同种异体的或异种的。在将来自供体个体的干细胞移植入有需要的受体个体的实施方案中，优选供体和受体在免疫相容性上是匹配的。例如，但不希望受限，优选的是供体和受体在主要组织相容性复合物(MHC)(人白细胞抗原(HLA))-I类抗原(例如，基因座A、B、C)和-II类抗原(例如，基因座DR、DQ、DRW))的相容性上是匹配的。可以按照领域内公知的方法来确定供体和受体之间的免疫相容性(参见例如，Charron, D. J.，Curr. Opin. Hematol. ，3 :416-422(1996) ；Goldman, J. ， Curr. Opin. Hematol. ，5 :417-418(1998)； 以及 Boisjoly, H. M. et al.，Opthalmology, 93 1290—1297 (1986))。在本发明的一实施方案中，基因治疗载体是腺病毒来源的载体。在一个实施方案中，将受肌肉特异性启动子或载体控制的Wnt7a-CMV给予患者。在一些实施方案中，所述个体是人。本文所述的方法具有很多应用。例如，所述方法可以用来在体外促进干细胞的扩增，其中所述细胞是意图用于其它体外应用，例如，用于研究或诊断目的。所述方法可以用来维持干细胞体外培养，并且还在开发药物测试或筛选的新的体外模型中具有潜在的应用。本文所述的组合物和方法还用于多种治疗应用。具体而言，本文所述的组合物和方法可用于促进有需要的个体中的组织形成、再生、修复或维持。在一些实施方案中，所述组织是肌肉。在一些实施方案中，所述肌肉是骨骼肌。
相关的治疗应用可以适于需要再生丧失的或损伤的肌肉组织的情况，例如，在化疗或放疗之后、在肌肉损伤之后或在影响肌肉的疾病或疾病状态的治疗或处理中。在一些实施方案中，所述影响肌肉的疾病或疾病状态可以包括消耗性疾病(例如恶病质，其可以与诸如癌症或AIDS的疾病相关)、肌肉弱化或萎缩(例如少肌症，其可以与衰老相关)、ICU 导致的虚弱、长期废用(例如昏迷、瘫痪)、手术导致的虚弱(例如，膝关节或髋关节置换术之后)或肌肉退行性疾病(例如肌营养不良)。该列举并非穷举。在一些实施方案中，如果需要防止例如消耗性疾病或萎缩中的组织丧失，则可以使用本文所述的组合物和方法。在一些实施方案中，如果需要或希望增加肌肉组织中驻留干细胞或定向祖细胞的比例，则使用本文所述的组合物和方法，例如用于替代受损的或有缺陷的组织或防止肌肉萎缩或肌肉量的丧失，尤其是涉及以下疾病或病症时例如肌营养不良、神经肌肉和神经退行性疾病、肌肉消耗性疾病和疾病状态、萎缩、心血管疾病、中风、心力衰竭、心肌梗塞、癌症、HIV感染、AIDS等。在一些实施方案中，在治疗、处理或预防退行性肌肉病症中，所述方法可以与卫星干细胞一起使用。在一些实施方案中，所述组合物和方法可用于促进肌细胞的形成，例如，用于修复或再生患肌肉退行性疾病的个体中有功能障碍的骨骼肌。因此，所述个体可以患有、疑似患有或有风险患有骨骼肌损伤、退变或萎缩。骨骼肌损伤可以是疾病相关的或非疾病相关的。人类个体可以表现出或有风险表现出肌肉退变或肌肉消耗。肌肉退变或肌肉消耗可以完全由疾病引起或在一定程度上由疾病引起，所述疾病例如艾滋病、癌症、肌肉退行性疾病或以上的组合。肌肉退变可以由诸如肌营养不良的肌肉退变疾病引起。肌营养不良的实例包括但不限于杜兴氏肌营养不良(DMD)、贝克肌营养不良 (BMD)、强直性肌营养不良(也称为斯太纳特病)、肢带型肌营养不良、面肩胛肱型肌营养不良(FSH)、先天性肌营养不良、眼咽型肌营养不良(OPMD)、远端型肌营养不良和埃-德二氏肌营养不良。参见例如，Hoffman et al.，N. Engl. J. Med.，318. 1363-1368(1988)； Bonnemann, C. G. et al. , Cure Opin. Ped. ,8 :569-582(1996) ；fforton, R. , Science, 270 755-756(1995) ；Funakoshi, M. et al. ， Neuromuscul. Disord. ,9(2) :108-1 14(1999)； Lim, L. E. and Campbell, K. P. ， Cure. Opin. Neurol. ，1 1(5) :443-452(1998) ；Voit, Τ.， Brain Dev.，20 (2) :65-74 (1998) ；Brown, R. H.，Annu. Rev. Med.，48 :457-466 (1997)； Fisher, J.以及 Upadhyaya, Μ. , Neuromuscul. Disord. , 7 (1) :55-62 (1997)。在一些实施方案中，所述肌营养不良是杜兴氏肌营养不良(DMD)。在某些形式的排尿节制中，可以用本发明的组合物或方法处理问题(culprit)肌肉，例如，通过肌肉的电穿孔。因此，在一个实施方案中，所述方法科用于治疗尿失禁。一方面，提供了促进有需要的个体中肌肉形成、再生或修复的方法，包括向哺乳动物给予包含以下的组合物作为活性剂的(a)Wnt7a多肽或Wnt7a多肽的能结合并激活内(17的活性变体、片段、类似物或衍生物，或(b)编码Wnt7a多肽或Wnt7a多肽的能结合并激活的活性变体、片段、类似物或衍生物的多核苷酸。另一方面，提供了预防有需要的个体中肌肉消耗、萎缩或退变的方法，包括向哺乳动物给予治疗有效量的组合物，所述组合物包含(a)Wnt7a多肽或Wnt7a多肽的能结合并激活内(17的活性变体、片段、类似物或衍生物，或(b)编码Wnt7a多肽或Wnt7a多肽的能结合并激活的活性变体、片段、类似物或衍生物的多核苷酸。在一些方面中，本文所述的组合物和方法可用于促进有需要的人类个体中骨骼肌的形成、维持、修复或再生。一方面，提供了增强哺乳动物中组织形成、再生、维持或修复的方法，包括向有需要的个体给予包含以下的组合物作为活性剂的(a)Wnt7a多肽或Wnt7a 多肽的能结合并激活内(17的活性变体、片段、类似物或衍生物，或(b)编码Wnt7a多肽或 Wnt7a多肽的能结合并激活内(17的活性变体、片段或衍生物的多核苷酸。在一个实施方案中，促进肌细胞的形成可进一步用于预防或治疗个体的肌肉破坏或萎缩，所述个体例如患废用性萎缩或少肌症的个体。在一些实施方案中，所述组合物用于治疗或预防萎缩和维持肌肉量。在一个实施方案中，促进肌细胞的形成还可用于修复受损的肌肉组织。在可选的实施方案中，促进肌细胞的形成可用于增加个体中的肌肉量。在其它实施方案中，受损的或功能不良的肌肉组织可以由缺血性事件引起。例如， 受损的肌肉组织可以是由诸如心肌梗塞或心力衰竭的心血管事件而损伤的心肌。在其它实施方案中，受损的或功能不良的肌肉组织可以是心肌。例如，受损的肌肉组织可以是由诸如心肌梗塞或心力衰竭的心血管事件而损伤的心肌，其中靶干细胞将是心脏干细胞。按照本发明的另一方面，提供了促进哺乳动物中心脏干细胞扩增的方法，包括向所述哺乳动物给予有效量的本文所述的组合物。本文所述的组合物和方法可以与用于给定疾病、损伤或疾病状态的其它已知治疗或护理标准联合使用。例如，对于肌营养不良，本发明用于促进干细胞对称扩增的组合物可以与诸如CT-1、强的松或肌肉抑制素的化合物联合给药。治疗可以同时进行、分别进行或相继进行。本发明还考虑抑制干细胞对称扩增的方法，例如，使用能抑制PCP信号通路的成员的化合物。另一方面，提供了促进干细胞非对称分裂的方法，包括将干细胞或干细胞群体与PCP信号转导的抑制剂接触。一方面，在提供的组合物中，所述活性剂是能抑制干细胞对称分裂的PCP信号转导的抑制剂。所述抑制剂例如可以是能通过抑制Wnt7a、i^d7或PCP通路中的效应分子(例如，Vangl2、α 7_整联蛋白、Pricklel或Celsrf)而直接或间接抑制PCP信号转导的肽、多肽、多核苷酸或小分子。在一些实施方案中，所述抑制剂是能抑制Wnt7a、i^d7或PCP通路中的效应分子的表达的多核苷酸，例如siRNA或miRNA。在一个实施方案中，所述抑制剂是VanglkiRNA或 Fzd7siRNA。对干细胞中PCP信号转导的抑制可用于，例如，治疗诸如肌肉肿瘤横纹肌肉瘤的癌症，或者治疗诸如进行性骨化性纤维发育不良的疾病。在一些实施方案中，所述方法可以包括将干细胞与干细胞中经典Wnt/β-连环蛋白信号转导的抑制剂接触。这种抑制可以进一步促进干细胞对称分裂。在一些实施方案中， 所述组合物可以包含干细胞中经典Wnt/β -连环蛋白信号转导的多核苷酸或多肽抑制剂。本发明还提供了药物组合物，该药物组合物包含Wnt7a、Wnt7a的类似物、衍生物、变体或活性片段、PCP信号转导的另一种激活剂或效应分子以及药学可接受的稀释剂或赋形剂。所述药物组合物还可以任选地包含一种或多种干细胞调节剂、一种或多种干细胞或以上的组合。可以通过多种途径来给予药物组合物，给药途径取决于需要局部治疗还是全身治疗以及待治疗的区域。通常，将所述组合物以全身或局部的方式给予待治疗的区域。
可以进行局部给药(包括眼部和黏膜，包括阴道和直肠递送)、肺部给药(例如通过吸入或吹入粉末或气雾剂，包括通过喷雾器)、气管内给药、鼻内给药、表皮和经皮给药、 口服给药或肠胃外给药。肠胃外给药包括静脉内注射、动脉内注射、皮下注射、腹膜内注射或肌肉内注射(例如但不限于，心内注射或输注)或颅内给药(例如鞘内给药或脑室内给药)。在一些实施方案中，通过注射或输注给予组合物。 本发明的组合物可以与药学可接受的介质联合递送。优选地，这类介质可以增强稳定性和/或递送性质。其实例包括脂质体、微粒或微囊。在本发明的不同实施方案中，使用这类介质可以有利于实现活性组分的持续释放。当配制成用于肠胃外注射时，优选以含有其它溶质(例如，使溶液等渗的足够的盐或葡萄糖)的无菌溶液形式使用所述药物组合物。对于吸入或吹入给药，可以将所述药物组合物配制成水性溶液或部分水性的溶液，然后可以以气雾剂形式使用它们。对于局部使用，可以将调节剂或含有调节剂的药物组合物配制成药学可接受的介质中的喷粉、霜或洗液，然后将其应用于皮肤上受影响的部分。在一些实施方案中，当所述组合物包含棕榈酸酰化的蛋白，例如Wnt7a时，可以使用脂质载体。所述药物组合物的剂量要求根据所用的具体组合物、给药途径和待治疗的具体个体而不同。可以通过本领域技术人员已知的标准临床技术来确定剂量要求。治疗通常以小于每种化合物最佳剂量的较小剂量开始。然后，增加剂量直到达到最佳效果。通常，以通常能提供有效的结果而不引起任何有害的或不利的副作用的浓度给予药物组合物。给药可以是单一单位剂量的形式，或者如果需要，可以将剂量分成在一天当中给予合适的次数的方便的亚单位。当使用处理干细胞的离体方法时，可以通过多种方法将所述干细胞给予个体。通常，干细胞是局部给药。可以以药学可接受的液体介质中的细胞悬浮液的形式通过注射给予干细胞。或者，可以给予生物相容的介质中的干细胞，所述介质是或能原位变成半固体或固体基质。例如，所述基质可以是能在组织损伤或退变位点形成半固体凝胶的可注射的液体，例如含有胶原蛋白和/或其衍生物、聚乳酸或聚乙醇酸的基质，或者所述基质可以含有一层或多层可被植入其最终boron中的柔韧的固体基质，例如浸渍的纤维基质。这类基质在领域内是容易得到的(例如，可从Upjohn，Kalamazoo，Mich.获取的Gelfoam)，并且其功能是将细胞保持在损伤位点，这提高了所给予的细胞发生扩增并进而扩增成干细胞贮库的机会。所述干细胞可以在一定情况下冷藏保存或可以不冷藏保存。在一些实施方案中，干细胞和用于促进干细胞扩增的化合物一起给药，从而使移植后干细胞耗尽的风险最小化。在一些实施方案中，移植的干细胞已经过转化而能过表达 PCP信号转导的激活剂，例如内(17或Vangl2。在一些实施方案中，干细胞与已经过转化而能过表达并分泌Wnt7a的肌细胞或其它卫星细胞共同给药。在一些实施方案中，肌肉内注射干细胞。在优选的实施方案中，将卫星干细胞或包含卫星干细胞的组合物注射入肌肉组织，优选注射入邻近患病、受伤或受损组织的区域。然而，还考虑注射入血液循环或远端部位。还考虑心脏内给药。本发明还提供了用于促进干细胞扩增或促进组织(例如肌肉)形成、修复、再生或维持的试剂盒，其包含本文所述的组合物和一种或多种说明书。本发明还提供了包含药物组合物的治疗试剂盒，该药物组合物中含有干细胞PCP 通路的一种或多种调节剂。本发明还提供了包含药物组合物的治疗或诊断试剂盒，该药物组合物中含有 Wnt7a,ffnt7a的类似物、衍生物、变体或活性片段或PCP信号转导的另一种激活剂以及任选的一种或多种干细胞调节剂。可将试剂盒中的各组分包装进单独的容器中，并且这些容器上可以有由监管药品或生物制品的生产、使用或销售的政府机构所规定的形式的说明，说明中描述由该机构批准的用于人或动物给药的生产、使用或销售。当在一种或多种液体溶液中提供试剂盒的组分时，该液体溶液可以是水性溶液， 例如无菌的水性溶液。在这种情况下，容器本身可以是吸入器、注射器、移液管、滴眼管或可以将组合物给予患者的其它此类装置。还可以以干燥或冻干的形式提供试剂盒的组分，并且所述试剂盒还可以含有适于复原冻干组分的溶剂。无论容器的数量或种类是什么样的，本发明的试剂盒还可以含有协助将组合物给予患者的装置。这类装置可以是吸入器、注射器、移液管、镊子、量勺、滴眼管或任何这类医学许可的递送装置。此外，除了在移植物中使用干细胞之外，干细胞或包含干细胞的组合物可以用作研究工具和/或作为诊断分析或试剂盒的一部分。不希望受到限制，试剂盒可以包含肌肉干细胞、Wnt 7a信号转导的启动子、细胞培养物或生长培养基、细胞冻存培养基、一种或多种药学可接受的递送介质、一种或多种核苷酸序列或基因构建体、一种或多种用于将细胞植入或递送入有需要的个体中的装置、使用、递送、植入、培养、冻存本文所述的细胞或以上的任何组合的说明书。可以利用标准技术(包括但不限于本文所描述的那些技术)在体外或体内测试单独的Wnt7a、Wnt7a的类似物、衍生物、变体和活性片段或PCP激活剂或效应分子或它们与其它干细胞调节剂的组合的促进干细胞扩增的能力。还可以在体外或体内测定一种或多种抑制剂对干细胞扩增的抑制。还可以利用本领域技术人员已知的体外方法测试和鉴定干细胞扩增的候选激活剂和抑制剂。维持干细胞培养的方法是领域内已知的(参见例如，Madlambayan, G. J.，et al. , (2001) J. Hematother. Stem CellRes. 10,481-492 ；Hierlihy, A.M. , et al. , (2002) FEBSLett. 530,239-243 ；Asakura, A.，et al.，(2002) JCeII Biol. 159,123-134)。干细胞可以作为单培养物来单独培养，或者它们可以与驯化细胞共同培养。在培养阶段之前、之中或之后，筛选方法中可以包括其它步骤，例如鉴定或分离细胞群体或其它有助于成功测定的步骤。例如，可以利用生长因子或其它化合物来分离和扩增干细胞群体。如Gritti etal (J. Neurosci. (1999) 19 :3287-3297)所述，出于该目的将EGF和FGF用于神经干细胞，并且13cl-2已用于分离“肌肉干细胞”群体(参见美国专利第6，337，184号)。在一个实施方案中，所用的培养基是DMEM加10% FCS。可以利用领域内已知的各种筛选方法来鉴定Wnt7a或PCP通路的另一成员(例如 Vangl2)的候选激活剂。例如，可以通过监测用候选激活剂处理的细胞中靶基因表达的升高或降低来鉴定能上调或下调靶基因的激活剂。诸如Northern印迹分析、定量RT-PCR或微阵列分析的方法可用于该目的。或者，例如，可以通过Western印迹分析来监测对应的蛋白水平的升高或降低。对于与具体蛋白(例如i^Zd7)结合的多肽或肽激活剂(或对应于所述多肽的类似物、衍生物、变体或肽模拟化合物)，可以利用领域内已知的多种结合测定中的一种来测定结合能力(参见例如，Coligan et al.，(eds.)Current Protocols in Protein Science (当代蛋白科学技术)，J.Wiley & Sons，New York，NY)。对于抗体或抗体片段激活剂而言，可以使用多种免疫测定。为了鉴定干细胞对称分裂的潜在增强剂，可以培养干细胞群体，并将其暴露于多种受试化合物。此外，可以转染干细胞使其表达各种目的测试基因。或者，可以将干细胞与 “驯化”细胞共同培养，将所述驯化细胞暴露于受试化合物，随后监测干细胞中的至少一种扩增指示物。可以在共培养之前或之中将驯化细胞暴露于受试化合物。可以使用来源于各种组织的成体干细胞。实例包括但不限于，来源于心肌或骨骼肌、胰腺组织、神经组织、肝组织或骨髓、造血细胞、成肌细胞、肝细胞、胸腺细胞、心肌细胞等的干细胞。还可以使用胚胎干细胞。通常，测试一系列浓度的化合物，通常为约1000倍的范围，并且本领域技术人员能容易地确定合适的暴露方案。当使用共培养时，可以在最初将干细胞暴露于驯化细胞之前、之中或之后将干细胞暴露于化合物。或者，当受试化合物是多核苷酸或由多核苷酸所编码的化合物(例如多肽或肽) 时，可以利用本文和其它地方所述的标准方法，用核酸或包含多核苷酸的表达载体转染干细胞，使得内源产生所述受试化合物。此外，可以通过将干细胞与另一细胞系共培养来将所述干细胞暴露于受试化合物，所述另一细胞系已用多核苷酸或包含所述多核苷酸的表达载体转染并且表达所述受试化合物。如上文所指出，还考虑到不能将干细胞直接暴露于化合物的情况。例如，可以首先用化合物处理驯化细胞群体或第三细胞类型，然后将其与干细胞共培养。或者，可以通过添加已用这类细胞群体条件化的培养基来间接暴露干细胞，但是在共培养中不包含这类细胞群体。此外，考虑到可以将干细胞暴露于已经并入非液体培养基中的化合物，所述非液体培养基例如是固体、凝胶或诸如琼脂的半固体生长支持物、聚合物支架、基质或其它构造体。可以定性或定量监测干细胞扩增的指示物，所述指示物包括例如，总体形态、总细胞数、组织学、组织化学或免疫组化上的改变或者特定细胞标志物是否存在或其相对水平。 例如，可以通过组织化学技术、免疫学技术、电泳法、Western印迹分析、FACS分析、流式细胞术等来分析细胞标志物是否存在或其相对水平。或者，例如，使用PCR技术、Northern印迹分析或合适的寡核苷酸探针等可以检测编码细胞标志物蛋白的基因所表达的mRNA是否存在。
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对于用Wnt7a (或另一种PCP激活剂或效应分子)和干细胞调节剂两者处理的细胞，还可以在用调节剂处理之后监测干细胞群体中的一种或多种分化指示物。通常，通过上文所述的总体形态的改变或通过谱系特异性细胞标志物的存在来监测分化，这可以利用上文所指出的多种标准技术进行分析。可监测的合适的谱系特异性细胞标志物是领域内已知的。此外，可以利用筛选方法来鉴定能促进干细胞扩增或促进肌肉再生和修复的新的调节剂。本发明的一方面提供了筛选可用于肌肉修复或再生的化合物的方法。例如，所述方法可以包括(a)提供卫星干细胞群体；(b)用受试化合物处理所述干细胞；以及(c)与对照相比，确定所处理的干细胞中对称分裂与不对称分裂的比例，其中与对照相比对称分裂比例的提高表明所述化合物可用于肌肉的修复或再生。本发明的另一方面提供了筛选可用于肌肉修复或再生的化合物的方法。例如，所述方法可以包括(a)提供卫星干细胞群体；(b)用受试化合物处理所述干细胞；以及(c)确定所述化合物是否激活、刺激所处理的干细胞中的PCP信号转导，其中PCP信号转导的提高表明所述化合物可用于肌肉的修复或再生。在一些实施方案中，PCP信号转导的刺激通过内(17的激活而发生。在一些实施方案中，所述提高是至少约10 %、25 %、50 %、75 %或更大的提高。或者，Wnt7a、Wnt7a的类似物、衍生物、变体和活性片段或PCP信号转导的另一种激活剂或效应分子以及任选地与一种或多种干细胞调节剂的联合的促进干细胞扩增的能力可以在合适的实验动物中的驻留干细胞群体上进行体内测试。同样，可以在体内测试抑制剂。通常，将受试化合物直接给予待研究的组织，例如通过注射。在一段合适的时间之后， 从动物收获细胞，并按上述分析干细胞群体。如果需要，还可以测试抑制剂，例如经典Wnt/β-连环蛋白信号转导的抑制剂。可以同时向干细胞提供化合物和抑制剂，或者可以在提供抑制剂之前或之后提供化合物。在一个实施方案中，在鼠骨骼肌组织中体内测试化合物促进干细胞扩增的能力。 监测从处理的小鼠分离出的卫星干细胞的增加，并与未处理或用安慰剂(例如缓冲液或盐水)处理的对照小鼠中的卫星干细胞进行比较。按照本发明的一实施方案，当例如与对照相比，卫星干细胞群体增加至少约10%时，则认为该化合物促进干细胞扩增。另一种标准是对称分裂与不对称分裂比例的提高。在至少M小时的时间段并且更通常是至少96小时的时间段中测量干细胞的增加。可以在合适的动物模型中测试Wnt7a、Wnt7a的类似物、衍生物、变体和活性片段或其它PCP激活剂或效应分子的修复受损或功能障碍组织的能力。示例性的动物模型在 “方法”部分进行描述。例如，可以通过将化合物或治疗给予暴露于冷冻诱导的或心脏毒素诱导的肌肉损伤的小鼠并监测受损肌肉的修复来测试所述化合物或治疗的修复受损肌肉组织的能力(参见Megeney et al.，(1996) Genes Dev.，10 1 173-1 183 ；Asakura et al.， (2000)J=Cell Biol. ，159 :123-134)。已经证实，当与至少一种其它干细胞标志物联合使用时，Fzd7可以用作卫星干细胞的标志物。该特征可用于鉴定或分离干细胞，以用于随后的分析、治疗和/或移植。发现 Fzd7尤其在静止的卫星干细胞上表达。因此，Fzd7还可以用作干细胞增殖状态的标志物。
还证实，可以通过联合选择标志物Pax7+与YFP-或Myf-来鉴定或分离卫星干细胞。在一个实施方案中，提供了基于特征YFP_/Pax7+来鉴定或分离卫星干细胞的方法。所述方法可用于鉴定并分离细胞，以用于随后的分析、治疗和/或移植。实验发现的总结本部分是对以下实施例中所描述的研究发现的总结。本发明的范围不以任何方式受限于该部分总结或随后的实施例中的内容。本发明人之前鉴定出一小群卫星干细胞，并报道卫星细胞为干细胞与祖细胞的异质群体。已经证实，卫星干细胞在移植后能自我更新并长期重建卫星细胞龛(Kuang et al.，2007)。经过辛勤的研究工作，本发明人目前已经确定，非经典Wnt受体内(17在静止的卫星细胞中特异表达(图4)。检测了作为i^Zd7的候选配体的Wnt7a。通过实时PCR和免疫组化，我们发现，在再生性肌肉发生期间，Wnt7a在新形成的肌纤维中是显著上调的(图5B、 5E)，并且发现内(17受体是Wnt7a在肌原细胞表面的结合所必需的(图5C)。卫星干细胞经历顶端-基底端的不对称细胞分裂，从而产生表达Myf5的定向肌原细胞并通过自我更新维持它们的群体。或者，卫星干细胞可以经历平面对称细胞分裂来驱动它们群体的扩增 (Kuang et al.，2007)。重要的是，本发明人发现，重组Wnt7a蛋白能显著刺激卫星干细胞的对称扩增，并且该扩增需要1^(17和Vangl2 (图6和8)，Fzd7和Vangl2是平面细胞极性 (PCP)信号通路的两个成员。此外，Wnt7a以与Wnt7a激活PCP信号转导一致的方式来诱导 Vangl2极化定位于分裂细胞对的相对两极(图7)。肌肉再生过程中Wnt7a的过表达导致再生过程显著增强，从而产生更多较大径的纤维，这不依赖于对成肌细胞增殖或分化的作用(图幻。重要的是，Wnt7a过表达导致卫星干细胞群体大量扩增，且Wnt7a丧失导致卫星细胞室的维持受损(图10)。这些结果对卫星细胞自我更新的分子调节提供了重要的新的启示，并且首次表明成体干细胞功能调节中Wnt非经典PCP通路的作用。Wnt-PCP通路通过在组织内建立细胞极性而在模式定型中起作用，例如果蝇中上皮细胞的有组织定向(Zallen，2007)。在脊椎动物中，PCP信号转导、尤其是它的效应分子Vangl2(还被称为Strabismus)是耳蜗中静纤毛束极化(Montcouquiol et al. ,2003), 调节原肠胚形成和神经胚形成的会聚延伸(CE)运动(Torban et al.，2004)、神经管闭合 (Torban et al.，2008)和在发育肌节中调节调节肌细胞定向(Gros et al.，2009)所需的。 在斑马鱼神经胚形成期间，Vangl2的丧失通过阻止子代细胞重新嵌入神经上皮而消除神经龙骨细胞的极化，导致异位神经祖细胞的积累(Cirima et al.，2006)。基于本文的发现， 目前提出，PCP介导的干细胞分裂的轴的定向导致卫星干细胞的对称扩增。由于PCP是依赖于效应分子蛋白重新分布的定位信号转导，因此子代细胞相对两极上的PCP核心分子的极化允许两个细胞保持与基膜接触，并因而保持它们相对于龛的定向(图7)。显然，Wnt7a 诱导Vangl2和α 7_整联蛋白的极化分布(图7E)。α 7_整联蛋白的上调和极化分布允许两个子代细胞保持与基膜相连。相比之下，在顶端-基底端定向的细胞分裂中，α7_整联蛋白表达降低并均勻分布。被“推向”肌膜并因而丧失与基膜的接触的子代细胞激活Myf5 转录并定向为祖细胞状态(Kuang et al.，2007)。因此，这些数据提示，PCP通路与控制顶端-基底端细胞分裂和定向的机制相关，并通过促进与基膜附着的机制发挥功能。实验表明，Vangl2蛋白在一对子代细胞的极点处的极化分布允许两个细胞保持与基膜的附着，并因而维持干细胞状态，导致干细胞群体的扩增。随后的细胞分裂通过顶端-基底端不对称分裂而产生更多的定向子代细胞，这些子代细胞将经历正常的扩增和分化(图9)。我们之前注意到，在损伤后3周，Pax77Myf5_卫星干细胞的比例从10%增至约 30% (Kuang et al.，2007)，并且我们如今证实，Wnt7a的过表达进一步将该水平增至50% (图10CU0D)。相比之下，在损伤和再生后，Wnt7a缺陷的肌肉中卫星细胞数减少36% (图 10G)。这些数据提示，在再生性肌生成期间，Wnt7a通过调节卫星干细胞扩增的增加来调节卫星干细胞库的平衡维持，并且基础水平的PCP信号转导不足以将卫星细胞库维持在正常水平。已有充分的证据证明经典Wnt信号转导在调节肌原性生长和分化中起作用。本文所述的实验表明，利用Wnt3a激活Wnt/β -连环蛋白信号转导不会干扰卫星干细胞在定向和对称扩增之间的选择(图6B、6D)。尽管如此，Wnt3a的体内过表达似乎会损害再生，这可能是通过促进未成熟分化和尺寸减小的肌纤维的形成(图9)。事实上，如I^X77My0D+细胞数的显著增加(未显示)所证实，Wnt3a对单肌纤维上的卫星细胞的刺激驱动了它们的分化。然而，通过实时PCR在未受损的或再生的骨骼肌中没有检测到Wnt3a表达。可能的情况是，其它上调的Wnt，例如Wntl0a(图5B)可能发挥激活肌原细胞中Wnt/β-连环蛋白信号通路的功能。此外，在再生过程早期观察到Wnt-抑制剂sFRP的大量上调。这可能代表了抑制经典Wnt信号转导，从而允许肌原祖细胞增殖的生理反馈系统。因此，我们假定Wnt/ β-连环蛋白信号转导的抑制起到促进肌肉再生的作用。在非洲爪蟾的胚胎中，Vangl2的同源物Strabismus通过竞争蓬乱蛋白来抑制 Wnt/β-连环蛋白激活的转录(Park and Moon，200 。因此，不希望受理论的束缚，PCP信号转导还可以通过拮抗经典Wnt/β-连环蛋白信号转导而起到保持卫星干细胞处于非定向状态的作用。在果蝇的眼部发育中，Frizzled(Fzd)/PCP信号转导通过调节R4中Notch 的激活来诱导R3/R4光受体的细胞命运特化(del Alamo and Mlodzik，2006)。这增加了下述的可能性FriZZled/PCP和Notch通路之间的沟通以及Wnt/ β -连环蛋白通路起到协调卫星干细胞在自我更新/定向与扩增之间的选择。卫星干细胞的分子学表征为调节其功能的分子机制提供了重要的启示。本发明对Wnt7a/i^d7/Vangl2信号转导级联作用的鉴定揭示了 PCP通路在调节卫星干细胞对称扩增中的意料不到的作用。本发现代表了我们在卫星细胞生物学和肌肉再生的理解上的重大进步。下一步实验将研究利用调节PCP通路来增强肌肉再生，从而改善神经肌肉疾病中的肌肉功能丧失。
实施例实施例1 :FriZZled7在静止的卫星干细胞中是高表达的卫星细胞是由干细胞和定向祖细胞组成的异质群体。所有的卫星细胞都表达1^x7 和诸如CXCR4的标志物，然而，本发明人鉴定出Pax7+细胞中约10%的一亚类，它们在发育过程中从不表达Myf5 (图4A)。将该I^X77Myf5_卫星亚类鉴定为卫星细胞龛中的干细胞群体(Kuang et al.，2007)。为了对静止的卫星干细胞进行基因表达分析，本发明人首次开发了通过荧光激活细胞分选(FACQ来分离卫星细胞的改良方法，其在“方法”部分中会进行描述。正如通过1^x7和SyndecaM表达(图11B)所确定的，FACS纯化的细胞(⑶34+、 α 7-整联蛋白+、CD31_、CD45—、CDllb—、ScaD (图11A)中> 95%是卫星细胞，并且在体外表现出强的生长和分化潜能(图lie)。基于Myf5_条件化YFP荧光进一步分离FACS纯化的卫星细胞(图4B)。当维持在低密度时，体外培养的YFP_卫星细胞产生表达1^x7、但不表达YFP或Myf5蛋白的增殖细胞(图12)，因而证明YFP_细胞不表达和还没有表达Myf5。新鲜分选的细胞的实时PCR 分析证实分离的YFP+和YFP-卫星细胞中1^x7的表达(图4C)以及诸如cMet、Syndecan4、 Caveolinl和α7_整联蛋白(未示出)数种其它卫星细胞的标志物。此外，在YFP+卫星细胞中检测到YFP和Myf5转录物，而在YFP_卫星细胞中几乎没有检测到YFP和Myf5表达 (与RT对照差异不显著)(图4C)。利用cDNA的抑制消减杂交(SSH) (Diatchenko et al.， 1997)来鉴定静止的I^X77Myf5_卫星干细胞中特异表达的基因。明显地，差异性表达的克隆之一编码来自FriZZled7(!^d7)mRNA中的片段。内(17是属于多基因编码的蛋白家族的G 蛋白偶联跨膜Wnt受体(Egger-Adam and Katanaev, 2008)。实时PCR分析证实阼(17转录物在YFP_卫星细胞中大量表达，而在YFP+卫星细胞中仅可少量地检测到(表4C)。为了证实由实时PCR所表明的差异性表达，检测了从趾长伸肌(EDL)分离出之后立即固定的肌纤维中内(17的蛋白表达。免疫组化分析显示12士3%的1^x7+卫星细胞表达易于检测水平的Fzd7 (η = 3只小鼠，> 150个细胞/小鼠)。对从Myf5-Cre/R0SA26-YFP 的趾长伸肌分离出的肌纤维的分析表明，在不含可检测水平的YFP的卫星干细胞0^x7+/ Myf5_)中内(17是特异性上调的(图4D)。然而，悬浮培养纤维2天导致几乎所有卫星细胞 (99%，n = 3只小鼠，每只小鼠彡100细胞)中内(17的上调。此外，对从心脏毒素(CTX)诱导胫前(TA)肌损伤之后的趾长伸肌再生的肌纤维的检验(Kuang et al.，2007)表明Fzd7 在和 ^χ7+/Μγ 5+细胞对上表达(图4Ε)。总的来说，这些结果表明，在静止的肌肉中，Wnt受体内(17在静止的卫星干细胞中特异性表达。然而，Fzd7在增殖的卫星细胞和成肌细胞中也是上调的。因此，Fzd7受体可被认为是静止的肌肉中的静止卫星干细胞的标志物，并且尤其可与其它干细胞标志物联合用作静止卫星干细胞的标志物。例如，利用与内(17反应的抗体，Fzd7受体还可以用作纯化静止卫星干细胞的靶点。实施例2 肌肉再生过程中Wnt的表达本发明人假设Wnt7a是内(17受体的候选配体。已经报道在胚胎肌生成过程中内(17 和Wnt7a共同表达(Cossu and Borello，1999)，并且Wnt7a被提示是胚胎和成体肌生成的调节剂(Chen et al.，2005 ；Polesskaya et al.，2003 ；Tajbakhsh et al.，1998)。利用冷冻损伤的胫前肌的实时PCR阵列分析来证明再生性肌生成过程中Wnt的表达。选择肌肉的冷冻损伤是因为其于诸如心脏毒素(CTX)注射的其它方法相比，炎性应答显著较低。在损伤后3天、急性再生时期(其中大多数1^x7+细胞在增殖)和损伤后6天时(卫星细胞已返回静止的膜下位置)，分析基因表达的变化(图5A)。损伤后3天时，检测到31种转录物显著增加(与对侧腿相比，η = 3只小鼠，ρ < 0. 05)，包括多种 Wnt (Wnt-I、-2、-5b、-8b、-10a、-16a)、Frizzled 受体和 sFRP 抑制剂的转录物。明显地，在损伤后6天时，检测到Wnt7a和WntlOa的转录物水平显著增加(n = 3 只小鼠，P < 0. 05)(图5Β)。在再生的第3天和第6天时的分析中，Wnt3a水平低于检测限。 因此，在卫星干细胞补充驻留卫星细胞库时，Wnt7a mRNA显著上调。为了在另一肌肉损伤模型中证实Wnt7a在肌肉再生过程中的上调，对CTX-损伤的胫前肌(损伤4天后固定)和对侧静止的胫前肌的冷冻切片进行Wnt7a蛋白表达的免疫组化分析。在未损伤的肌肉中，Wnt7a未以可检测的水平表达(图5E，左)。相比之下， Wnt7a在再生的纤维(其尺寸小于完整的纤维并且含有成肌素+细胞核)中是显著上调的， 而CD144+内皮细胞不表达Wnt7a(图5E，右)。为了确定Wnt7a是否是内(17的配体，将培养的卫星细胞来源的成肌细胞与重组人 Wnt7a蛋白一起孵育30分钟，洗涤、固定并用抗Wnt7a的抗体进行免疫染色。与BSA —起孵育的细胞没有显示出Wnt7a蛋白的膜染色。相反，与Wnt7a蛋白一起孵育的细胞表现出膜上的免疫染色(图5C)。重要的是，Fzd7 siRNA的转染消除了 Wnt7a的结合(图2C)。Fzd7沉默是有效、特异性的，并且没有显著改变成肌细胞中表达的其它Frizzled转录物(图14A)。 总之，这些数据表明，在肌原细胞中，Fzd7是Wnt7a的受体。根据细胞类型和受体的情况，Wnt7a已被描述为经典的(Hirabayashi et al.， 2004)或非经典的Wnt (Kengaku et al.，1998)。为了评价Wnt7a作为经典Wnt的可能功能， 用Wnt7a和Wnt3a蛋白刺激卫星细胞来源的成肌细胞M小时。Wnt3a激活肌原细胞中的经典Wnt通路(Brack et al.，2008)，并且在本实验中，Wnt3a刺激导致β-连环蛋白/TCF靶基因的表达增加，例如TcfT和Axin2 mRNA分别增加5倍和50倍(n = 5，p < 0. 001)。相比之下，Wnt7a刺激没有导致Tcf7和Axin2水平的任何显著改变，其水平与BSA处理的样品相似(图5D)。此外，Wnt3a刺激强烈诱导激活的β _连环蛋白的稳定和细胞核定位(图 13)，而Wnt7a没有这样的效果；在瞬时转染实验中(未显示)，Wnt3a强烈激活β -连环蛋白荧光素酶报道子TOP-Flash，而Wnt7a没有这样的效果。总之，这些结果表明，在再生性肌生成期间新形成的肌纤维中，Wnt7a显著上调，与肌原细胞表面的内(17受体结合并且不利用经典Wnt/ β -连环蛋白信号通路。实施例3 :Wnt7a-Frizzled7调节卫星干细胞的分裂对称性静止的卫星干细胞中内(17的表达和肌肉再生过程中Wnt7a的显著上调提示 Wnt7a-FZd7信号转导参与调节肌肉干细胞功能。此外，Wnt7a对体外培养的原代成肌细胞的生长或分化没有影响(图16)。因此，为了研究卫星细胞中Wnt7a-FZd7信号转导的作用， 体外检测了重组Wnt7a改变卫星干细胞的细胞不对称分裂与细胞对称分裂之间比值的能力。从Myf5-Cre/R0SA^-YFP趾长伸肌分离肌纤维，并在非贴壁条件下培养。在培养体系中，静止的卫星细胞在从肌纤维分离之后立即被激活。卫星细胞离开它们的龛，迁移穿过基膜并以同步的方式进行首次细胞分裂。因此，通过对培养42小时之后的肌纤维进行固定和染色可观察到首次分裂的结果。重要的是，活体的成像分析证实卫星细胞在分裂之前不在肌纤维上移动，并且所记录的细胞对是克隆来源的(Kuang et al.，2007)。卫星干细胞(YFP_)经历细胞对称分裂而产生两个YFP_子代细胞，或者经历细胞不对称分裂而产生一个YFP_干细胞和一个YFP+定向祖细胞(图6A)。当用Wnt7a刺激时，观察到细胞对称分裂的比例从30%显著增加至67% (n = 3, η ^ 152对，ρ = 0. 009)。相比之下，Wnt3a处理没有诱导任何显著的改变(图6B)。因此，Wnt7a刺激卫星干细胞对称分裂的增加。实验分析表明，Wnt7a与受体特异性地结合(图5C、5D)。因此，为了确定 Wnt7a诱导的干细胞对称分裂是否需要内(17的存在，在分离的肌纤维上进行i^Zd7敲低实验。处理过的纤维的免疫染色表明42小时后内(17表达的广泛沉默(图5C)。重要的是，
46siRNA诱导的i^Zd7的敲低导致Wnt7a诱导卫星干细胞对称分裂的能力完全丧失(n = 3， 彡123对，ρ彡0. 02)。相比之下，杂乱对照siRNA处理没有显著影响Wnt7a的这种活性(图 6D)。与这些结果一致，在Wnt7a处理之后，第二次分裂之后(50小时)的卫星干细胞0^x7+/ YFP_)的比例显著增加13% (n = 3，彡1203个细胞，ρ < 0. 03)，这导致每个纤维中的干细胞数增加(图6Ε、14Β)。同样，Fzd7沉默有效阻断了 Wnt7a刺激的效应。每个纤维的1^x7+ 细胞总数在每种条件之间保持恒定，这证实Wnt7a不影响细胞增殖或分化(图14C)。这些结果表明，Wnt7a通过内(17传递信号来刺激卫星干细胞对称分裂并因而驱动卫星干细胞库的扩增。实施例4 :PCP成员Vangl2在卫星干细胞自我更新中的作用分析表明，Wnt7a不激活经典Wnt/ β -连环蛋白信号通路(图5D)，以及Wnt7a通过内(17受体传递信号来驱动卫星干细胞的对称分裂(图5C、6B、6D)。因此，假定Wnt7a通过内(17起到激活PCP通路和驱动卫星干细胞扩增的作用。为了研究Wnt7a是否激活PCP通路，对肌原细胞中一组核心PCP成员(Seifert and Mlodzik, 2007)的相对转录物水平进行分析。有趣的是，成肌细胞表达高水平的Dvl-2和-3、Fzd-3和-7、Pk-I和-2和Vangl-I 和-2以及低水平的Celsr2。所测试的其它PCP成员基因在30个循环后依然处于界限值之下(图4A)。此外，培养的卫星干细胞(YFP_)表达的所有PCP成员的水平显著较高(n = 3，ρ < 0. 05)，其中Vangl2显著上调，这与PCP信号转导在调节卫星干细胞功能中的作用一致。Vangl2是果蝇和脊椎动物中PCP和非经典Wnt信号转导的重要调节剂(Torban et al.，2004)。在具有激活的PCP信号转导的细胞中，Vangl2蛋白分布于极化轴的两个极，在 PCP突变体中这种分布丧失(Montcouquiol et al.，2006)。在分离的肌纤维上的静止的卫星细胞中没有检测到Vangl2蛋白，但是当卫星细胞经过M小时培养进入细胞周期而被激活时，Vangl2是上调的。48小时之后，所有Pax7+激活的卫星细胞对于Vangl2也是阳性的 (100%, η = 3只小鼠，每只小鼠彡100个细胞)(图7Β)。还证实了卫星细胞中与Vangl2 体内相互作用的I^ricklel和Celsr2蛋白的表达(未显示)。重要的是，在Wnt7a的存在下，培养的肌纤维上分裂的卫星细胞对的显著比例 ( 士4%，n = 3，彡240对，ρ ^ 0. 006)表现出Vangl2在子代细胞的相对两极的极化定位 (图7C、7D)。相比之下，在BSA(对照)或Wnt3a处理之后，Vangl2蛋白均勻地分散于卫星细胞对中(分别为90士2%和89士2%)(图7C、7D)。此外，用抗Vangl2和抗α 7-整联蛋白抗体的双重染色显示，Wnt7a似乎诱导Vangl2的膜定位的提高和α 7_整联蛋白的极化分布。在未处理的细胞或经历顶端-基底端细胞分裂的细胞中没有发生这种重新分布(图 7Ε)。总之，这些观察结果有力地支持下述主张Wnt7a诱导极性效应分子Vangl2和α 7-整联蛋白的重新分布以及α 7-整联蛋白在子代细胞极点的上调表达允许它们保持与基膜的附着和保持在干细胞龛中。为了研究Vangl2在卫星干细胞功能中的作用，在用Wnt7a刺激的单Myf5_Cre/ R0SA26-YFP肌纤维上进行Vangl2的siRNA沉默。首先用1^x7和Syndecan4抗体对肌纤维进行染色，从而允许能观察到卫星细胞分裂相对于纤维的平面，以及将细胞分裂记录为平面的或顶端-基底端的(图8A)。在首次细胞分裂后42小时时，Wnt7a刺激诱导了平面分裂并因而导致顶端-基底端细胞分裂下降12%。相比之下，Vangl2沉默使顶端-基底端细胞分裂的比例增加15% (n = 3，彡154对，ρ ( 0. 02)(图8Β)。用Pax7和YFP抗体对来自同一实验的肌纤维进行染色，并记录对称细胞分裂的百分比。观察到顶端-基底端细胞分裂与对称细胞分裂比例之间的密切负相关。Wnt7a刺激提高了对称细胞分裂的比例，而 Vangl2敲低显著损坏了 Wnt7a刺激对称细胞分裂的能力(n = 3，彡65对，ρ彡0. 02)(图 8C)。为了分析Vangl2在调节卫星细胞对称细胞分裂中的作用，将纤维培养50小时，并通过免疫染色评价Vangl2沉默(图8D)。其中，Vangl2敲低持续增加顶端-基底端细胞分裂的速率(n = 5，彡150对，ρ = 0. 001)(图8Ε)，同时耗尽卫星干细胞群体(n = 3，彡330 个细胞，P = 0. 03)(图8F)。这导致每个纤维的卫星细胞的总数显著减少(n = 5，彡500个细胞，ρ = 0. 001)(图8G)。在Vangl2敲低后3天(图8H)，观察到表达成肌素(分化的早期标志物)的细胞数翻倍(n = 4，彡550个细胞，ρ = ΙΟ"5)(图81)，以及丧失了纤维上的半数细胞(n = 4，彡550个细胞，ρ = 0. 001)(图8J)。对卫星细胞来源的成肌细胞进行的 Vangl2沉默导致1^x7和Myf5转录物水平的降低和成肌素水平的提高(n = 4，ρ彡0. 05) (图8Κ)。总之，这些数据表明，Vangl2是卫星干细胞的自我更新和短期扩增的成肌细胞的产生所必需的。这些数据表明，通过内(17的Wnt7a信号转导需要Vangl2来诱导卫星干细胞库的对称扩增。Wnt7a还诱导Vangl2蛋白在经历对称性面细胞分裂的细胞的相对两极的极化分布。因此，Wnt7a利用平面细胞极性通路来控制卫星细胞分裂的方向和它们在龛中的命运。实施例5 :ffnt7a通过扩增干细胞库来增强肌肉再生为了研究Wnt7a-Fzd7_Vangl2通路在体内肌肉再生中的作用，通过将CMV_Wnt7a 表达质粒电穿孔入3月龄小鼠的胫前肌中而使Wnt7a过表达。对用CMV-LacZ质粒进行电穿孔的肌肉的组织学分析表明，大多数(> 80% )肌纤维表达半乳糖苷酶(图15Α)， 并且在用对照质粒电穿孔之后没有检测到再生缺陷(图15Β)。此外，免疫染色表明，用 CMV-ffnt7a质粒进行电穿孔的肌纤维易于分泌可检测水平的Wnt7a蛋白(图15C)。显然，用CMV-Wnt7a电穿孔的胫前肌在3周后表现出18士4%的质量增加(p = 0. 009,η = 8)。对电穿孔肌肉的连续切片的检验显示出，肌肉总体大小增加，并且整个肌肉体中纤维径的大小和纤维数量显著增加(图9)。相比之下，Wnt3a的过表达导致肌纤维数大大增加，但是这些肌纤维表现出横截面积显著减小，导致再生效率降低(图9)。未观察到Wnt7a过表达对肌肉组织的其它细胞类型的影响。然而，Wnt3a的过表达导致基质沉积异常，这提示成纤维细胞/平滑肌祖细胞增殖的增强，导致纤维化的增加(图9B)。总之，这些结果表明，Wnt7a的过表达显著增强肌肉再生，正如较大纤维的数量增加和肌肉量的显著增加所证实的。如同之前所注意到的，Wnt7a处理没有改变体外激活的卫星细胞或原代成肌细胞的生长或分化(图14C、16A、16C、16D)。此外，Wnt7a没有在分化的肌细胞中诱导MyoD或 Wnt/β-连环蛋白靶基因的表达(图16Β、16Ε)。然而，体外实验证实，Wnt7a-Fzd7_Vangl2 信号转导刺激卫星干细胞的对称扩增，其随后产生经历正常扩增和分化的短期扩增的祖细胞。因此，对具有祖细胞的正常增殖和分化速率的干细胞对称扩增的促进表明当与刺激增殖和分化相比，组织再生得到改善。这是很重要的发现并且也减轻了对干细胞耗尽的担忧。为了评价Wnt7a是否能相似地刺激卫星干细胞的体内扩增，在用CMV-Wnt7a电穿孔之后，对再生肌肉中的卫星细胞和卫星干细胞的数量进行评价。在电穿孔后3周，Wnt7a 的过表达导致切片上每个纤维的Pax7+卫星细胞数增加约2倍(p = 0. 03,η = 4)。相比之下，Wnt3a的过表达没有改变卫星细胞的数量(图10AU0B)。为了计算卫星干细胞的比例， 从电穿孔后3周的Myf5-Cre/R0SA^-YFP胫前肌分离FACS分离的卫星细胞，培养M小时， 然后进行1^x7和YFP的免疫染色(图10C)。与Wnt7a体外诱导卫星干细胞对称分裂的观察结果一致，观察到再生肌肉中Wnt7a的过表达导致I^X77YFP_卫星干细胞的比例增加约 20% (n = 5，p = 0. 0001)(图10C、10D)。因此，这些数据表明，Wnt7a在体外和体内对卫星干细胞室起到相似的作用。为了研究卫星干细胞在不存在^^7￡1下的功能，检验3月龄裸小鼠的再生表型(Miller and Mssoon，1998)。对从趾长伸肌新鲜分离的肌纤维上表达1^x7的卫星细胞的定量表明Wnt7a+裸小鼠表现出每个纤维的卫星细胞数量降低约18% (p = 0.03， η = 4)(图10Ε)。冷冻挤压损伤后3周，再生的Wnt7a+胫前肌外观总体正常(图10F)，然而在仔细检查后，纤维似乎显示出较不均勻的纤维径分布，且基膜厚度不规则，这符合再生中的缺陷。重要的是，对再生Wnt7a+胫前肌的切片检查表明卫星细胞数量显著减少36% (p = 0. 03，n = 3)(图10G)。该结果有力地支持下述观点即Wnt7a在调节卫星干细胞功能中起着至关重要的作用。肌肉中Wnt7a的过表达驱动卫星干细胞库的扩增，并且相反地，在不存在Wnt7a的条件下，卫星细胞室会变得枯竭。总之，这些数据表明Wnt7a通过PCP通路传递信号来刺激卫星干细胞对称细胞分裂从而驱动扩增的新的作用。因此，Wnt7a调节卫星干细胞室的平衡水平，并因而调节成体骨骼肌中再生性肌生成的效率。实施例6 将Wnt7a表达载体电穿孔入mdx小鼠中导致卫星细胞数增加和纤维直径增大Mdx小鼠是公知的杜兴氏肌营养不良的小鼠模型。Mdx小鼠在抗肌萎缩蛋白基因的外显子23内具有突变，导致终止密码子的产生。抗肌萎缩蛋白基因的突变导致DGC复合物(抗肌萎缩蛋白-糖蛋白复合物)的破坏，DGC复合物对于肌纤维的完整性是至关重要的。参照图17，将Wnt7a cDNA电穿孔入成年wt小鼠的胫前肌中导致了卫星细胞数和卫星干细胞数(myf5阴性、Pax7阳性)的增加。从图中可以看出，Wnt7a组中卫星干细胞的数量几乎翻倍。参照图18，在注射对照(IacZ)质粒或含有CMV启动子控制下的Wnt7a编码区的质粒之后，对mdx小鼠的胫前肌进行电穿孔。对卫星细胞(所有1^x7阳性细胞)以及卫星干细胞(myf5阴性的卫星细胞)的总数进行计数。在用含有Wnt7a的质粒电穿孔的mdx小鼠中，卫星细胞的数量显著增加(ρ = 0.005)。用含有Wnt7a编码区的质粒的电穿孔导致卫星细胞总数显著增加，而卫星干细胞与定向祖细胞的比例显示出下述趋势即用Wnt7a质粒电穿孔的mdx小鼠中存在更多的卫星干细胞。参照图19，用含有Wnt7a的质粒或IacZ对照质粒对mdx小鼠和年龄匹配的wt小鼠(3月龄，雄性)进行电穿孔。Wnt7a cDNA的电穿孔导致mdx和wt小鼠中纤维直径显著增加(P < 0. 001)。
总之，将Wnt7a cDNA电穿孔入wt和mdx小鼠的胫前肌中增加了卫星细胞的数量。 同时wt和mdx小鼠中的纤维直径增加。这些发现表明，Wnt7a通过增加卫星细胞的数量并进而防止卫星细胞库的耗尽而有可能能用于治疗杜兴氏肌营养不良。Wnt7a的应用还可以用来提高损伤或手术后骨骼肌的愈合。实施例7 给予Wnt7a重组蛋白产生与Wnt7a表达载体电穿孔相似的效应参照图20，将人Wnt7a蛋白注射入胫前肌中，并且在注射后2周发现肌纤维的大小显著增加(P < 0. 001)。所观察到的效应与CMV驱动的小鼠Wnt7a的电穿孔所产生的效应相似。实验方案小鼠和动物饲养通过敲入Myf5_Cre (Tallquist et al.，2000)杂合小鼠与 ROSA^-YFP (Shnivas et al. ,2001)纯合报告基因小鼠的杂交来获得成年(8_12周龄)Myf5_Cre/R0SA^-YFP小鼠。ROSA^-YFP小鼠用作野生型对照。通过杂合Wnt7a"_小鼠的杂交来获得Wnt7a裸小鼠和它们的同窝对照。将所有小鼠都饲养在屏障设施内，并按照渥太华大学动物饲养和管理条例进行实验。细胞分选从后肢肌肉分离单核的肌肉来源的细胞，并按以前所述进行染色(Ishibashi et al.，2005 ；Kuang et al. ,2007) 在配备有三种激光的 MoFlo 细胞仪(DakoCytomation)上分离细胞。通过Hoescht染色并通过前向和侧向散射谱的设门来排除死细胞和碎片(图 11)。肌纤维分离、培养和免疫组化如之前所述，从趾长伸肌分离单肌纤维(Charge et al.，2002)。在包被有马血清的6孔板中悬浮培养分离的肌纤维，以防止纤维贴壁(Kuang et al.，2006)。将纤维在由 15% FBS(Hyclone)和鸡胚浸液(CEE，Accurate Chemicals)的 DMEM 组成的接种培养基中孵育，所述DMEM含有2% L-谷氨酰胺、4. 5%葡萄糖和110mg/ml丙酮酸钠。对于成肌细胞培养，分选卫星细胞，并将其接种于包被了胶原蛋白的平板中的Ham' s FlO培养基中， 所述Ham' s FlO培养基补充有20% FBS和5ng/ml基础FGF(Invitrogen)。对于Wnt刺激，将重组Wnt7a或Wnt3a蛋白添加到接种培养基(25ng/ml，R&D Systems)中。对于卫星细胞的体内激活，通过将CTX注射入胫前肌中来诱导再生，并且4天之后，从邻近的趾长伸肌分离单肌纤维。按照之前的报道进行冷冻切片、肌纤维和细胞的免疫化学标记(Kuang et al.，2006)。所用的一抗列于增补的表1中。SiRNA 敲低对于趾长伸肌纤维，在解剖后4小时和M小时、用Lipofectamine 2000试剂 anvitrogen)、按照生产商的说明书、在接种培养基中进行转染。第二天早上，将纤维在新鲜培养基中进行再培养，并且培养42小时至72小时之后进行固定。对于卫星细胞来源的成肌细胞，在转染之前，将细胞再培养3小时，并在生长培养基中进行转染。转染后6小时， 洗涤细胞，并用Ham' s完全培养基进行再培养。转染后48小时收集RNA。siRNA双链体来自 Ambion siFzd7(ID S66314)、siVangl2 (ID S96802)，并且每种的使用终浓度为 IOnM0 用Cy3标记的siRNA监测转染效率。通过实时PCR评价敲低效率(图14A和13K)。
实时PCR按照生产商的说明书，用RNEasy试剂盒^jiagen)分离RNA并在柱上进行DNase 消化。用Superscript III逆转录酶和随机六聚体引物(Invitrogen)进行cDNA的合成。 按之前所述进行实时PCRdshikishi et al.，2005)。将转录物水平以GAPDH转录物水平标准化。使用Δ Δ CT法(CT值< 30)计算表达的相对倍数变化。对于相对转录物定量，为了确保彡95%的PCR效率，在5点标准曲线上运行每个cDNA样品。Wnt信号通路PCR阵列从 Superarray Bioscience Corporation (PAMM-043)购买，并按照生产商的说明书进行分析。 参见表2的引物序列。统计学分析对于所给出的试验，进行最少3次至最多5次的重复。将数据表示为平均值的标准误。利用Mudent' s T检验(Microsoft Excel)对结果的统计学差异进行评价，并且在ρ < 0. 05的水平时认为差异在统计学上是显著的。以下表1列出实施与本发明相关的各实验所用的抗体。以下表2列出实施与本发明相关的各实验所用的PCR引物。肌肉损伤对于冷冻诱导的肌肉再生，切开麻醉小鼠的皮肤和筋膜，并用液氮冷却的金属棒对胫前肌进行三次连续的冻融循环，并用缝线缝合伤口。对于CTX诱导的肌肉再生，将 25 μ 1稀释的心脏毒素直接注射入胫前肌中，而不切开皮肤。体内电穿孔将配制于0.9% NaCl中的40 μ g质粒DNA或0. 9 % NaCl (盐水)直接注射入麻醉小鼠的通过皮肤切口而暴露的左侧胫前肌中。注射之后，立即通过脉冲发生器(ECM 830，BTX)，用5mm针状电极(BTX)，以20ms的固定时间和200ms的间隔，直接向胫前肌施加 100-150伏的6次脉冲电刺激。分离实验胫前肌和对侧胫前肌，将其包埋入0WNT7A5%蔗糖 (Tissue-Tek)中，并用液氮冷却的异戊烷冷冻。mdx小鼠的体内电穿孔我们用40yg含有Wnt7a蛋白编码区(该编码区与HA (血凝素)表位的序列连接， 并受CMV启动子的控制)的载体(pHANpuro-Wnt7a-HA)或作为对照的pSP0RT6_lacZ载体 (Invitrogen)对mdx小鼠(3月龄，雄性，每组3只动物)进行电穿孔。后一种载体还用于确定电穿孔的效率。如LeGrand et al. 2009所述进行电穿孔，电穿孔后2周处死小鼠。用胫前(TA)肌进行电穿孔。将用于电穿孔的质粒溶于0.9% NaCl中，每个胫前肌的总体积是 40μ 1。对于实验而言，仅对一个胫前肌进行注射和电穿孔，另一个胫前肌用作对照。对胫前肌切片(14 μ m)进行1^x7 (所有卫星细胞的标志物)和myf5 (定向祖细胞的标志物)的染色。将对于两种标志物蛋白均为阳性染色的细胞计为定向祖细胞，而将仅 Pax7阳性的细胞计为卫星干细胞。组织学和定量用冰冻切片机(Leica CM 1850)切出实验肌肉和对侧肌肉的横向切片(8 μ m)。为了在连续切片的相同水平上比较实验肌肉和对侧肌肉，将整个胫前肌进行切片(每个胫前肌获得大约400个切片)。对于LacZ反应，用0. 1 %戊二醛固定冷冻切片，并将其暴露于 X-gal溶液中。对于H&E和免疫染色，用4%多聚甲醛固定切片。对于纤维计数，将层粘连蛋白染色的冷冻切片的图片组合，并在Adobe Photoshop CS2上进行计数。用ImageJ对肌纤维径进行定量。在Photoshop上对在再生区域中采集的1^x7和层粘连蛋白共免疫染色的冷冻切片的图片进行卫星细胞的计数，在再生区域中所有纤维都具有中心定位的细胞核。“卫星细胞含量”代表以每个纤维数和对侧腿标准化的膜下Pax7+卫星细胞的数量。消减杂交用Super-SMART cDNA扩增试剂盒(Clontech)、按照所提供的方案，扩增来自分选的YFP+和YFP_卫星细胞的RNA样品(IOng)。用PCRIelect试剂盒(Clontech)、按照生产商的说明书，用来自每个样品的2μ g代表性的cDNA来产生消减文库。来自分选的YFP_的扩增cDNA用作“检测物”，并将来自分选的YFP+的扩增cDNA用作“驱动物”。用胫前肌克隆试剂盒(Invitrogen)将SSH产物克隆入pCR2. 1载体中，并利用ABI 3730 DNA分析仪 (Applied Biosystems)、按照生产商的方案和手册、用巢式引物对来自SSH文库的200个克隆进行测序。表1:抗体稀释供应商目录号
α7-整联蛋白1/200MBL InternationalK0046-3
活性-β-连环蛋白1/500Millipore Corp05-665
CDllb1/200eBiosciences12-0112
CD1441/200BD Biosciences555289
CD311/200eBiosciences12-0451
CD341/50BD Biosciences553732
CD451/200eBiosciences12-0311
Celsr21/200MBL InternationalLS-Al 943
CXCR41/100BD Biosciences551968
Frizzled71/100R&D SystemsMAB-1981
GFP1/500InvitrogenA21311
层粘连蛋白 a21/200Alexis BiochemicalsALX-804-190
Myf51/50Santa Cruz Biotechnology Incsc-302
MyoD1/50Santa Cruz Biotechnology Incsc-304
成月几素1/100Santa Cruz Biotechnology Incsc-578
肌球蛋白重链1/20DSHBMF20
Pax71/10DSHBPAX7
Pricklei1/100AbeamAb 15577
Seal1/202eBiosciences12-5981
Syndecan41/5000由 Brad Olwin 赠送
Vangl21/200Santa Cruz Biotechnology Incsc-46561
Wnt7a1/100Santa Cruz Biotechnology Incsc-26360表2:PCR 引物引物序列外显予扩增子SEQ ID NO
Axsn2_FAAGAG.AAGCGACCCAGTCAA2198 13
Axin2_RGTGCGATGCATCTCTCTCTG314
Celsr1_FGGGGACTACTGCGAGACTGA2177 15
Celsr1_RCCCGTTTTTGCATACTCCAC316
Celsr2_FCCGAGGTGGACCTCTGTTAC2186 17
Gejsr2_RCCACC AACAGGTTGACACAG318
Celsr3_FATGACCCGGATGTCTCTGAC1216 19
C#S$r3J^ACTCCTCCGTGATGATGACC220
Dv"—FCTTACCAGGACCCTGGCTTC11246 21
DvIIJ^CCTGACTTCGAGGGCTACTG1222
Dvi2_FTATGTCTTCGGGGACCTCAG13212 23
DvI2_RCGAAGAAA.GCTCGTGGT.AeG1424
DvI3 FGCCTATGGCTTTCCCTTACC14198 25
DvI3_RACTTGGAGTCCCCAGCTTTT1526
FzdIJrC.AAGGTTTACGGGCTCATGT1180 27
Fzd 1_RGTAACAGCCGGACAGGAAAA.128
Fzil3 FCCTTG AGGATGTGCCAAG AT2178 29
FzcK—RGCTAT AGGCACGCTGACACA330
Fzcf^FAACCTCGGCTACAACGTGAC1150 31
Fzd4_RTGGCACATAAACCGAACAAA232
Fzd6一 F:AATGGACACTTTTGGCATCC3223 33
Fzd6_RAGGGGCACACTGTTCAATTC434
FzdTJrGCTTCCTAGGTGAGCGTGAC1216 35
Fzd7_RAACCCGACAGGAAGATGATG136
GapdhJFATGCCAGTGAGCTTCCCGTC1470 37
Gapdh—RCATCACCATCTTCCAGGAGC138
Myf5_FTGAAGGATGGACATGACGGACG1133 39
Myf5_RTTGTGTGCTCCG.AAGGCTGCTA140
yyoD_FTACCCAAGGTGG AG ATCCTG1200 41
_D一 RCATCATGCCATCAGAGCAGT142
43
成 lit 素G.AAAGTGAAT GAG GCCTTC G1248
成. 素 RACGATGGACGTAAGGGAGTG344
NotC:h3—F G ATG AC AC ATC AG CC AGC AT32 24845
Notch3_R GAGCGGTTCCTGATGAGAAT3346
Pax7_F CTGGATGAGQGCTCAGATGT3 24547
Pax7_R GGTTAGCTCCTGC CTGCTTA448
Tcf7 一 F CCCCAGCTTTCTCCACTCTA4 16549
Tcf7_R TCACAGTATGGGGGAGCTGT550
Va_1—F GCACTACCACAGCATGGAGA7 23551
Va_-R ATTGACCACGAGGCTGAAGT852
Van§l2_F CCCOAGTTCACACTCAAGGT4 15 53
Vangi2_R ACTTGeGCAGeTTGAGGAG554
GCACGACTTCTTCAAGTCCGCCATG55
Yfp_FCC1 263
GCGGATCTTGAA.GTTCACCTTGATG56
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权利要求
1.用于调节干细胞的分裂对称性的组合物，包含作为活性剂的干细胞平面细胞极性 (PCP)信号转导的调节剂。
2.如权利要求1所述的组合物，其中所述活性剂是能促进干细胞对称分裂的PCP信号转导的激活剂。
3.如权利要求1或2所述的组合物，其中所述活性剂包含或衍生自小分子、多核苷酸、 肽、多肽、大分子、抗体或以上的组合。
4.如权利要求1至3中任一项所述的组合物，其中所述活性剂包含以下中的一种或多种(a)能结合和/或激活内(17的肽或多肽；(b)编码能结合和/或激活内(17的肽或多肽的多核苷酸；(c)能结合和/或激活内(17的小分子；(d)能上调干细胞上内(17的表达的多核苷酸或多肽；或(e)能诱导或激活PCP通路中的效应分子进而促进对称分裂的多核苷酸或多肽。
5.如权利要求4所述的组合物，其中所述活性剂包含(a)Wnt7a多肽或Wnt7a多肽的能结合并激活内(17的活性变体、片段、类似物或衍生物，或(b)编码Wnt7a多肽或Wnt7a多肽的能结合并激活内(17的活性变体、片段、类似物或衍生物的多核苷酸。
6.如权利要求1至5中任一项所述的组合物，其中所述活性剂包含Wnt7a多肽。
7.如权利要求1至5中任一项所述的组合物，其中所述活性剂包含编码Wnt7a多肽的多核苷酸。
8.如权利要求5所述的组合物，其中所述多核苷酸位于表达载体中。
9.如权利要求4所述的组合物，其中所述效应分子是Vangl2、α7_整联蛋白、Pricklel 或 Celsr2。
10.如权利要求4所述的组合物，其中所述能调节PCP通路的多核苷酸或多肽诱导 Vangl2在细胞膜中的表达或极化分布。
11.如权利要求1至10中任一项所述的组合物，还包含干细胞或干细胞群体。
12.如权利要求1至11中任一项所述的组合物，还包含干细胞中经典Wnt/β-连环蛋白信号转导的抑制剂。
13.如权利要求1至12中任一项所述的组合物，还包含一种或多种干细胞调节剂。
14.如权利要求13所述的组合物，其中所述调节剂能增加干细胞分裂的速率。
15.如权利要求1至14中任一项所述的组合物，其中所述干细胞是成体干细胞。
16.如权利要求15所述的组合物，其中所述成体干细胞是卫星干细胞。
17.权利要求1至16中任一项所述的组合物，其用于促进组织形成、再生、维持或修复。
18.如权利要求17所述的组合物，其中所述组织是肌肉。
19.如权利要求17所述的组合物，其中所述肌肉是骨骼肌。
20.用于增强哺乳动物中组织形成、再生或修复的组合物，包含作为活性剂的(a) Wnt7a多肽或Wnt7a多肽的能结合并激活i^Zd7的活性变体、片段、类似物或衍生物，或(b) 编码Wnt7a多肽或Wnt7a多肽的能结合并激活i^Zd7的活性变体、片段、类似物或衍生物的多核苷酸。
21.如权利要求1至20中任一项所述的组合物，其与生理学可接受的载体或稀释剂混口 O
22.如权利要求1至21中任一项所述的组合物，其被配制成用于注射。
23.如权利要求22所述的组合物，其被配制成用于静脉内注射、肌肉内注射、心内注射、皮下注射或腹膜内注射中的一种或多种。
24.如前述权利要求中任一项所述的组合物，其用于促进有需要的人类个体中骨骼肌的形成、维持、修复或再生。
25.如权利要求M所述的组合物，其中所述个体患有、疑似患有或有风险患有退行性疾病。
26.如权利要求25所述的组合物，其中所述退行性疾病是肌营养不良。
27.如权利要求沈所述的组合物，其中肌营养不良选自杜兴氏肌营养不良(DMD)、贝克肌营养不良(BMD)、埃-德二氏肌营养不良、兰迪二氏肌营养不良、面肩胛肱型肌营养不良 (FSH)、肢带型肌营养不良、冯·格雷菲-福克斯肌营养不良、眼咽型肌营养不良(OPMD)JS 直性肌营养不良(斯太纳特病)和先天性肌营养不良。
28.如权利要求M所述的组合物，其中所述肌营养不良是杜兴氏肌营养不良(DMD)。
29.如权利要求M所述的组合物，其中所述个体患有、疑似患有或有风险患有影响肌肉的疾病或疾病状态。
30.如权利要求四所述的组合物，其中所述影响肌肉的疾病或疾病状态是消耗性疾病 (例如恶病质，其可以与诸如癌症或AIDS的疾病相关)、肌肉弱化或萎缩(例如少肌症，其可以与衰老相关)、ICU导致的虚弱、长期废用(例如昏迷、损伤、瘫痪)、手术导致的虚弱 (例如，膝关节或髋关节置换术之后)或肌肉退行性疾病(例如肌营养不良)。
31.如权利要求M所述的组合物，其中所述个体患有、疑似患有或有风险发展出与损伤或疾病相关的肌肉消耗或萎缩。
32.调节干细胞分裂对称性的方法，包括将所述干细胞与组合物接触，所述组合物包含作为活性剂的干细胞平面细胞极性(PCP)信号转导的调节剂。
33.如权利要求32所述的方法，其中所述活性剂是能促进干细胞对称分裂的PCP信号转导的激活剂。
34.如权利要求32或33所述的方法，其中所述活性剂包含或衍生自小分子、多核苷酸、 肽、多肽或以上的组合。
35.如权利要求32至34中任一项所述的方法，其中所述活性剂包含以下中的一种或多种(a)能结合和/或激活内(17的肽或多肽；(b)编码能结合和/或激活内(17的肽或多肽的多核苷酸；(c)能结合和/或激活内(17的小分子；(d)能上调干细胞上内(17的表达的多核苷酸或多肽；或(e)能诱导或激活PCP通路中的效应分子进而促进对称分裂的多核苷酸或多肽。
36.如权利要求35所述的方法，其中所述活性剂包含(a)Wnt7a多肽或Wnt7a多肽的能结合并激活内(17的活性变体、片段、类似物或衍生物，或(b)编码Wnt7a多肽或Wnt7a多肽的能结合并激活内(17的活性变体、片段、类似物或衍生物的多核苷酸。
37.如权利要求32至36中任一项所述的方法，其中所述活性剂包含Wnt7a多肽。
38.如权利要求32至36中任一项所述的方法，其中所述活性剂包含编码Wnt7a多肽的多核苷酸。
39.如权利要求38所述的方法，其中所述多核苷酸位于表达载体中。
40.如权利要求31所述的方法，其中所述效应分子包含Vangl2、α7_整联蛋白、 Pricklel 或 Celsr2。
41.如权利要求35所述的方法，其中所述能调节PCP通路的多核苷酸或多肽诱导 Vangl2在细胞膜中的表达或极化分布。
42.如权利要求27至36中任一项所述的方法，还包括将所述干细胞与干细胞中经典 Wnt/ β -连环蛋白信号转导的抑制剂接触。
43.如权利要求27至37中任一项所述的方法，还包括将所述干细胞与一种或多种干细胞调节剂接触。
44.如权利要求38所述的方法，其中所述调节剂能增加干细胞分裂的速率。
45.如权利要求33至44中任一项所述的方法，其是体内方法，并且其中将所述组合物给予有需要的个体.
46.如权利要求45所述的方法，还包括将干细胞给予所述个体。
47.如权利要求45所述的方法，其中所述干细胞与所述组合物同时给予或相继给予。
48.如权利要求33至45中任一项所述的方法，其中所述组合物包含干细胞。
49.如权利要求48所述的方法，其中所述干细胞包含表达载体，所述表达载体包含编码或能促进对称分裂的PCP信号转导的调节剂的多核苷酸。
50.如权利要求45所述的方法，还包括将辅助细胞给予个体。
51.如权利要求50所述的方法，其中所述辅助细胞与所述组合物同时给予或相继给予。
52.如权利要求51所述的方法，其中所述组合物包含辅助细胞。
53.如权利要求50至52中任一项所述的方法，其中所述辅助细胞包含表达载体，所述表达载体包含编码Wnt7a蛋白或Wnt7a蛋白的能从所述辅助细胞分泌并结合和/或激活 Fzd7的活性片段、变体、类似物或衍生物的多核苷酸。
54.如权利要求32至53中任一项所述的方法，其中所述干细胞包含成体干细胞。
55.如权利要求51所述的方法，其中所述成体干细胞包含卫星干细胞。
56.如权利要求32至52中任一项所述的方法，其用于促进组织形成、再生、维持或修复。
57.如权利要求56所述的方法，其中所述组织是肌肉。
58.如权利要求57所述的方法，其中所述肌肉是骨骼肌。
59.增强哺乳动物中的组织形成、再生、维持或修复的方法，包括给予个体组合物，所述组合物包含作为活性剂的(a)Wnt7a多肽或Wnt7a多肽的能结合并激活内(17的活性变体、 片段、类似物或衍生物，或(b)编码Wnt7a多肽或Wnt7a多肽的能结合并激活内(17的活性变体、片段、类似物或衍生物的多核苷酸。
60.如权利要求32至59中任一项所述的方法，其中所述组合物包含生理学可接受的载体或稀释剂。
61.如权利要求60所述的方法，其中所述组合物被配制成用于注射。
62.如权利要求61所述的方法，其中所述组合物被配制成用于静脉内注射、肌肉内注射、心内注射、皮下注射或腹膜内注射中的一种或多种。
63.如权利要求32至62中任一项所述的方法，其用于促进有需要的人类个体中骨骼肌的形成、维持、修复或再生。
64.如权利要求63所述的方法，其中所述个体患有退行性疾病。
65.如权利要求64所述的方法，其中所述退行性疾病是肌营养不良。
66.如权利要求65所述的方法，其中肌营养不良选自杜兴氏肌营养不良(DMD)、贝克肌营养不良(BMD)、埃-德二氏肌营养不良、兰迪二氏肌营养不良、面肩胛肱型肌营养不良 (FSH)、肢带型肌营养不良、冯·格雷菲-福克斯肌营养不良、眼咽型肌营养不良(OPMD)、强直性肌营养不良(斯太纳特病)和先天性肌营养不良。
67.如权利要求66所述的方法，其中所述肌营养不良是杜兴氏肌营养不良(DMD)。
68.如权利要求63所述的组合物，其中所述个体患有影响肌肉的疾病或疾病状态。
69.如权利要求68所述的组合物，其中所述影响肌肉的疾病或疾病状态是消耗性疾病 (例如恶病质，其可以与诸如癌症或AIDS的疾病相关)、肌肉弱化或萎缩(例如少肌症，其可以与衰老相关)、ICU导致的虚弱、长期废用(例如昏迷、损伤、瘫痪)、手术导致的虚弱 (例如，膝关节或髋关节置换术之后)或肌肉退行性疾病(例如肌营养不良)。
70.如权利要求63所述的组合物，其中所述个体患有与损伤或疾病相关的肌肉消耗或萎缩。
71.促进哺乳动物中肌肉形成、再生、维持或修复的方法，包括给予所述哺乳动物治疗有效量的权利要求1-31中任一项所定义的组合物。
72.促进有需要的个体中肌肉形成、再生或修复的方法，包括给予所述个体组合物，所述组合物包含作为活性剂的(a)Wnt7a多肽或Wnt7a多肽的能结合并激活内(17的活性变体、片段、类似物或衍生物，或(b)编码Wnt7a多肽或Wnt7a多肽的能结合并激活i^Zd7的活性变体、片段、类似物或衍生物的多核苷酸。
73.预防有需要的个体中肌肉消耗、萎缩或退变的方法，包括给予所述个体治疗有效量的组合物，所述组合物包含(a)Wnt7a多肽或Wnt7a多肽的能结合并激活的活性变体、 片段、类似物或衍生物，或(b)编码Wnt7a多肽或Wnt7a多肽的能结合并激活内(17的活性变体、片段、类似物或衍生物的多核苷酸。
74.在体内或体外扩增卫星干细胞群体的方法，包括将所述干细胞与有效量的组合物接触，所述组合物包含(a)Wnt7a多肽或Wnt7a多肽的能结合并激活内(17的活性变体、片段、类似物或衍生物，或(b)编码Wnt7a多肽或Wnt7a多肽的能结合并激活i^Zd7的活性变体、片段、类似物或衍生物的多核苷酸。
75.如权利要求72至74中任一项所述的方法，其中所述组合物包含生理学可接受的载体或稀释剂。
76.如权利要求75所述的方法，其中所述组合物被配制成用于注射。
77.如权利要求76所述的方法，其中所述组合物被配制成用于静脉内注射、肌肉内注射、心内注射、皮下注射或腹膜内注射。
78.如权利要求74所述的方法，其中在体外扩增所述卫星干细胞。
79.如权利要求78所述的方法，其中随后将所述卫星干细胞给予有需要的个体。
80.促进卫星干细胞扩增的方法，包括将所述干细胞与Wnt7a或Wnt7a的能激活i^Zd7 的活性片段、变体、类似物或衍生物接触。
81.权利要求1至31中任一项所述的组合物在促进有需要的个体的肌肉的形成、维持、 修复或再生中的用途。
82.权利要求1至31中任一项所述的组合物在制备用于促进有需要的个体的肌肉的形成、维持、修复或再生的药物中的用途。
83.作为静止的卫星细胞的标志物的用途，其中所述标志物与另一干细胞标志物组合使用。
84.鉴定或分离卫星干细胞的方法，包括选择标志物Pax7+与YFP-或Myf-的组合。
85.如权利要求1所述的组合物，其中所述活性剂是能抑制干细胞对称分裂的PCP信号转导的抑制剂。
86.如权利要求85所述的组合物，其中所述抑制剂是能通过抑制Wnt7a、i^d7或PCP通路中的效应分子而直接或间接抑制PCP信号转导的肽、多肽、多核苷酸或小分子。
87.如权利要求86所述的组合物，其中所述PCP通路中的效应分子是Vangl2、α7-整联蛋白、Pricklel 或 Celsr2。
88.如权利要求86所述的组合物，其中所述抑制剂是能抑制Wnt7a、Fzd7或PCP通路中的效应分子的表达的多核苷酸。
89.如权利要求87或88所述的组合物，其中所述抑制剂是siRNA。
90.用于促进干细胞对称分裂的组合物，包含作为活性剂的一种或多种受体激活剂。
91.如权利要求90所述的组合物，其中所述干细胞是卫星干细胞。
92.筛选可用于肌肉修复或再生的化合物的方法，包括(a)提供卫星干细胞群体；(b)用受试化合物处理所述干细胞；以及(c)与对照相比，确定所处理的干细胞中对称分裂与不对称分裂的比例。 其中与对照相比，对称分裂比例的提高表明所述化合物可用于肌肉的修复或再生。
93.筛选可用于肌肉修复或再生的化合物的方法，包括(a)提供卫星干细胞群体；(b)用受试化合物处理所述干细胞；以及(c)确定所述化合物是否激活、刺激所处理的干细胞中的PCP信号转导， 其中PCP信号转导的提高表明所述化合物可用于肌肉的修复或再生。
94.如权利要求93所述的方法，其中所述PCP信号转导的刺激是通过内(17的激活而发生。
95.如权利要求92或93所述的方法，其中所述提高是至少约10%,25^^50^^75%或更大的提高。
96.防止卫星干细胞耗尽的方法，包括将所述干细胞与以下接触(a)ffnt7a多肽或 Wnt7a多肽的能结合并激活的活性变体、片段、类似物或衍生物，或(b)编码Wnt7a多肽或Wnt7a多肽的能结合并激活内(17的活性变体、片段、类似物或衍生物的多核苷酸。
全文摘要
提供了用于调节干细胞分裂决定、尤其是分裂对称性的组合物和方法。已经证实，wnt7a通过诸如卫星干细胞的成体干细胞的表面上所表达的Frizzled-7受体来激活平面细胞极性(PCP)通路，从而促进干细胞的对称扩增。本发明的组合物和方法可用于例如在体外和体内调节干细胞的分裂对称性、补充和扩增干细胞库以及促进组织的形成、维持、修复和再生。
文档编号C12N15/09GK102459576SQ201080028872
公开日2012年5月16日 申请日期2010年4月27日 优先权日2009年4月27日
发明者法比恩·莱·格朗, 迈克尔·A·鲁德尼茨基 申请人:渥太华医院研究所