专利名称：包含可交联蛋白材料树脂的复合材料的制作方法
技术领域：
本发明涉及包括基于天然和/或可降解材料的可交联树脂的复合材料。
背景技术：
可交联树脂是公知的，并且经常用于需要高耐热性和高硬度的用途中。该树脂经常用于复合材料中，其中所述树脂粘合了颗粒、纤维或片材(在下文中也通称为填料)。与热塑性树脂相反，交联树脂不会熔化。这样的树脂可例如基于聚酯、丙烯酸树脂和/或氨基塑料树脂。由于交联，固化的树脂通常难以在自然界中分解。复合材料的很多用途需要存在这些有益性质，但同时通过使用生物学产生(biologically occurring)的材料使其环境冲击降到最低，所述生物学产生的材料优选为至少当由这些复合材料制成的产品被弃置时可降解的树脂。作为天然存在的和/或可降解的材料，已知使用例如聚乳酸、聚糖 (polycarbohydrate)或蛋白质。有些时候这些聚合物是经交联的。蛋白质可用醛来交联； 诸如甲醛、戊二醛等。这样的交联通常在加热树脂系统的情况下发生。其它系统可使用淀粉类物质，其可例如通过醚化或与聚异氰酸酯反应来交联。考虑到环境关系，需要进一步开发含有具有高硬度和/或强度的树脂系统的复合材料。
发明内容
本发明涉及包括多于50wt%填料和包含蛋白材料(proteinous material)的树脂的复合材料，所述蛋白材料含有可通过酶交联的蛋白质或多肽以及适用于所述交联的酶。含有交联树脂组合物(crosslinked resin composition)的复合材料可在干燥条件下以及在潮湿或湿润条件下交联。另一个优点是与热固化树脂相比使树脂交联的能量输入被显著降低了，并且对于交联反应来说不需要使用有害化学品。另外，本发明涉及这种复合材料用于铸型(foundry mould)或木面板(wood panel)的应用，并且涉及通过使由树脂和填料组成的复合材料成形来制造铸型或木面板的方法；所述树脂包括蛋白材料，所述蛋白材料含有可通过使用适当可用的酶经由酶促反应来交联的蛋白质或多肽。另外，本发明涉及粘合填料如纤维、颗粒或片材的方法，粘合剂(binder)包括蛋白材料，所述蛋白材料含有作为可交联物质的蛋白质或多肽以及作为催化剂的酶。在这种情况中，词语树脂与词语粘合剂互换使用。另夕卜，本发明涉及用于填料如木材或胶合板(veneer)的双组分胶粘剂 (adhesive)，其中一种组分是蛋白材料(含有蛋白质和/或多肽)，且第二种组分是能使所述蛋白材料中的蛋白质和/或多肽交联的酶。
将通过参考以下附图来理解本发明的特征和优点，其中图1是本发明实施方式的图解图；图2是本发明实施方式的图解图；图3是本发明实施方式的图解图；且图4是本发明实施方式的图解图。
具体实施例方式以下是本发明特定实施方式的描述，仅通过举例的方式并参考附图给出。含有可用酶交联的蛋白质或多肽的蛋白材料是已知的，但这些系统通常用于食品或饲料工业。意料不到的是，可交联的树脂系统实际上能用于高强度工业用途——甚至在其中使用了(非常)少量的蛋白材料的那些用途中也是如此(不同于食品和饲料工业，其中组合物通常含有多于50wt%干重的蛋白质)。在本申请中，交联意指共价键的形成。已知范德华相互作用或离子相互作用导致某些内聚力(cohesive force)，像在明胶中那样，但本发明的树脂系统是耐潮湿性的，并且可以显著较硬。用于粘合剂的蛋白材料可得自植物(包括藻类)、动物、真菌和/或微生物(细菌、 酵母菌)来源。该材料可部分地与其它源物质(source substances)(例如，多糖)分离或不与其分离。蛋白材料还可包括水解至不同程度的蛋白质以提供具有受控分子量的多肽或提供较短链或较多直链(优选由至少10个氨基酸组成)。此外，可使用合成的多肽，如聚-赖氨酸或具有相对大量伯氨基基团的聚氨基酸。 取决于酶促系统的类型，可选择非胺的其它官能团。此外，所述材料可与其它可交联聚合物或低聚物组合，如氨基官能化的聚乙二醇、 氨基官能性的丙烯酸树脂、烷基二胺等。优选这样的混合物以少于树脂的40wt%的量存在， 优选少于20wt%。在本申请中，％或定义为在所述组合物或树脂中的干重。对于特定应用，希望组合物是可降解的，优选生物可降解的。优选含有蛋白材料的树脂中每克树脂包括0. 04 8. 3meq反应性基团，优选 0. 1 2. Omeq/g反应性基团。在本发明的优选实施方式中，用于交联的酶是谷氨酰胺转移酶 (transglutaminase) (EC 2.3.2.13)。该酶催化谷氨酰胺残基的Y-羧基基团和赖氨酸残基的ε -氨基基团的酰基重排(acyl rearrangement)。除了来自赖氨酸的ε-氨基基团之外，还可利用伯氨基官能团。因此，具有伯氨基基团的双或多官能化合物(来自合成、农业或天然来源)可与所述蛋白材料组合使用。在该实施方式中，蛋白材料含有赖氨酸和谷氨酰胺氨基酸。所述酶谷氨酰胺转移酶在食品工业中是已知的，在该领域中其用于使软食 (soft food)如鱼或肉制品交联(商品名例如 Activa WM, Ajinomoto Inc. , Japan) 谷氨酰胺转移酶可也从重组-DNA制备技术得到。例如，来自芽孢杆菌(Bacillus) 的谷氨酰胺转移酶(其是与Ca2+无关的)是合适的来源，并且在EP07^5317中描述，该文献通过引用并入本文。
很多其它酶可用于共价地交联蛋白质。合适的系统包括(i)蛋白二硫化物异构酶(EC 5. 3. 4. 1)，其催化二硫化物基团重组为反应性的巯基残基，然后氧化；(ii)巯基氧化酶(EC 1.8.3.2)或硫醇氧化酶，其在这里有助于上述氧化反应；(iii)多酚氧化酶(EC 1. 14. 18. 1 ；也称为例如儿茶酚氧化酶、酪氨酸氧化酶、酚氧化酶)，其催化苯酚到邻-联苯酚并随后到邻-二醌的氧化；所述二醌与巯基基团或与氨基基团反应形成蛋白质交联； (iv)赖氨酰氧化酶(EC 1.4.3. 13)或赖氨酰-蛋白_6_氧化酶，其是使胶原或弹性蛋白交联的酶，并且其催化赖氨酸到半-醛的氧化去氨基反应，所述半醛与其它氨基酸反应；以及 (ν)过氧化物酶(EC 1. 11. 1. 7)，其使得反应性物质通过羟基化或过氧化活性而能与其它蛋白交联。在本发明的优选实施方式中，用于交联的酶适于预想用途的优选反应条件。例如， 该酶可适于在室温或于50或80°C具有最高活性。在另一个优选实施方式中，谷氨酰胺转移酶从使系统在所需条件下发挥作用的基因修饰的微生物得到。设想所选的突变可使得酶能够在室温和室压(room temperature and pressure)下以较高的比活性工作，因此可得到自固化系统(self set system)。本发明复合材料中的填料可变化极大。合适的填料包括纤维、颗粒或片材。所述纤维、颗粒或片材可以是有机性质的或无机的。合适的填料是砂(sand)、粘土、颜料、木粉、木纤维、玻璃纤维、石纤维(stone fiber)、胶合板片(veneer sheet)、非织造纸或毡片(felt sheet)等。在优选实施方式中，所述填料是无机填料和/或木材。一些填料可含有蛋白材料。填料组分的尺寸可变。例如，可使用具有至少约0.5mm的合适尺寸的型砂 (foundry sand)。在另一个优选实施方式中，可使用含有直径尺寸为约至少大于0. 3mm且长度为数厘米的纤维的矿物(玻璃或石头)棉(mineral wool)()。在本发明的一个优选实施方式中，使用无机填料。优选地，平均粒径(用筛子测量)为约0. Imm或更大，更优选约0. 3mm或更大。通常粒径为约5mm或更小，优选约Imm或更小。在另一个优选实施方式中，使用木纤维。所用的木纤维优选具有以下粒径其中 70%的颗粒大于1.0mm。取决于用途，诸如制造颗粒碎屑板(particle chip board)，颗粒可大得多。木纤维或木屑的尺寸可至少为10cm，甚至高达20cm。通常，填料将包含约20%或更少的蛋白质量，优选约10wt%或更少，甚至约5wt% 或更少(相对于填料的干重)。另外，应意识到根据常规的蛋白制备技术，得到的产品含有少于10%的淀粉。例如，木材可包括一些蛋白材料。另外，本领域技术人员将意识到，在本申请的背景下，木材不被视为淀粉。然而，填料的蛋白材料(如果有的话)不会显著影响树脂的交联，因为其含量很低。复合材料中包含蛋白材料的树脂的量可变，优选介于0. 01到50wt%之间。更优选地，蛋白材料地量为30%或更少，甚至更优选10wt%或更少。优选地，蛋白材料的量为
0.更多。在一个实施方式中，基本所有的树脂是蛋白材料。在另一个实施方式中，多于 50wt%的树脂是蛋白材料，优选多于80wt%。在一个实施方式中，基本所有的蛋白材料由蛋白质和/或多肽组成。在另一个实施方式中，约5wt%的蛋白材料由蛋白质和/或多肽组成，优选多于10wt%，更优选多于 30wt%。蛋白材料中除蛋白质和/或多肽之外的组分的相对量不那么重要，因为其仅用作稀释剂(如果不是反应性的)。重要的是在具有一定量反应性基团(优选如上所定义)的反应性组分之间存在交联。酶活性优选介于0. 5到50单位/克蛋白材料之间。更优选地，酶活性介于1到25 单位/克蛋白材料之间。因此，酶的量可为少于lwt%，甚至少于0. lwt%。通常，酶被稀释到某个标准活性，并且应理解如果酶组合物以高活性使用，则可使用较少的组合物，反之亦然。酶促交联的动力学可通过酶活性、酶浓度、温度、pH、缓冲控制、离子强度和用合适的化学剂进行抑制来控制。还可通过加热、PH变化或其它抑制剂来钝化酶活性。通过这样， 可产生以下物质，其在诸如抗压强度、抗拉强度、抗挠强度和抗剪强度等的机械性质方面具有的体。填料的量可变，并且优选介于50到9. 99wt%之间。更优选地，填料的量为约 70wt%或更多，甚至更优选约85wt%或更多。最优选使用的量是约90wt%或更多。优选地，填料的量为99. 9%或更少。考虑到大填料量，可交联树脂主要用作粘合剂，但取决于填料的量和类型，所述树脂不会填满填料之间的所有空隙。同样地，所述树脂可用作木片材等地粘合剂或胶粘剂。在一个优选实施方式中，所述新型可交联系统用于铸型。对于目前的主流铸造粘合剂，存在很多健康、安全和环境问题。例如，已知的热箱(hotbox)和壳型铸造(shell moulding)树脂可产生显著的甲醛释放和气味；同时糠醇类自固化树脂伴随着日益增多的详细审查和公众讨论。根据本发明的系统避免了这些问题，因为该系统能基于生物材料，其可以排除了有害化学品排放的方式应用。在下文中，若干用途以铸型实施例进行了描述。然而本领域技术人员应理解，所述的技术可以其它无机或有机纤维、颗粒、片材等使用。可以若干方式进行酶添加，包括(i)在与砂混合之前制备蛋白质/肽溶液与酶 (干燥的或溶液)预混物；(ii)制备砂与蛋白质/肽溶液的预混物，向其中加入酶(干燥的或溶液)进行进一步混合；(iii)制备砂与酶(干燥的或溶液)的预混物，向其中加入蛋白质/肽溶液进行进一步混合。此外，当用含有蛋白酶的缓冲溶液清洗时，可通过交联蛋白来回收(reclaim)。在本发明的优选实施方式中，使用蛋白溶液来涂布或部分涂布无机或有机纤维、 颗粒或片材。将蛋白溶液干燥，且产物可被存储、成形或以其它方式处理以进一步应用。在下一步中，优选成形的产品被重新水化，同时或然后，加入酶，诸如引起交联。在又一个优选实施方式中，将新鲜制备的包含酶的蛋白溶液与无机或有机纤维、 颗粒或片材混合，并迅速干燥以避免酶和蛋白质的大量反应。得到的产物可被存储、成形或以其它方式处理以进一步应用。在下一步中，优选成形的产品被重新水化，同时或然后，力口入酶，诸如引起交联。在加入酶之后，仍然存在一段链生长时间。最初这将允许一段“工作时间(work time)”，在这段时间内填料将被成形，然后是“脱模时间(strip time) ”，在这段时间内不应
6存在成形产品的扰动(disturbance)，由此使得粘合剂达到坚固的可操作强度。a)带有脱水和再水化的蛋白组合物+酶添加在本实施方式中，将含有两种蛋白基底材料的蛋白溶液和交联酶与砂，然后在混合的同时迅速干燥，其方法类似于砂的酚醛树脂涂层。然后将得到的带涂层的砂输送到铸造车间并存储以便在需要时使用。然后将带涂层的砂用水或者含有盐或缓冲剂的溶液或者水/溶剂(溶剂的例子包括醇、甘油、酯和烷氧基酯)的混合物或者有机溶剂混合物来重新水化/溶解，其程度为当冲击或锤击入模具或型芯盒中并随后经受合适的干燥或脱水过程时允许发生胶粘和交联反应。这样的干燥过程可类似于本领域中已知的热箱法(Hotbox process)或壳型铸造法(Shell moulding process) 0或者可选地，带有或不带有加热的真空可使粘合剂通过脱水而硬化。该系统相对于现有的酚醛树脂/四氮六甲圜系统的优点是不存在甲醛释放。b)再水化+酶，然后交联/以及可能的脱水本方法可如前段所述般应用，将蛋白溶液(没有交联酶)与砂混合，然后在混合的同时进行干燥。同样，将得到的带涂层的砂输送到铸造车间并存储以便在需要时使用。然后将带涂层的砂用水或者含有盐或缓冲剂的溶液或者水/溶剂(溶剂的例子包括醇、甘油、 酯和烷氧基酯)的混合物或者有机溶剂混合物来重新水化/溶解，其程度为当冲击或锤击入模具或型芯盒中并随后经受合适的干燥或脱水过程时允许发生胶粘和交联反应。在型砂混合器的辅助下向其中进行活性酶的装料并混合。该装料可以是干粉或者是在溶液中的酶。该酶可例如使蛋白质或肽链上的特定氨基酸官能团交联，从而得到大范围的交联蛋白网络。c)添加酶，然后交联/以及可能的脱水以类似于上面所述的方式，可将低粘度(< lOOOmPas)的蛋白或肽溶液与砂在铸造车间的位置混合。向其中添加酶，所述酶可特异性地使蛋白或肽链上的氨基酸官能团交联，从而得到大范围的交联蛋白网络。这种酶的添加可以是作为干粉或者作为溶液。然而， 在这种情况中，溶液是合适的(几乎没有或者缓慢的酶交联反应)，直到溶液的一些特征改变，从而提高酶促反应的速度。因此，酶可以在与蛋白/肽溶液组合时通过例如改变PiU^ 加辅酶或改变温度或离子强度而变成活性的。也可考虑对铸造实践做出一些修改，诸如通过施加热来脱水与酶交联的组合。可在热箱(hotbox)(约200°C )、温箱(warm box)(约50°C 80°C )来对实践进行干燥，和/ 或可在温室(约25 50°C )中自固化。除湿器也可有助于自固化温室法(Self Set Warm Room process)。将通过以下非限制性实施例来阐述本发明。实施例实施例1为制备加压检测试件，将IOOOg规格为H32的砂(石英砂)与IOg酪蛋白酸钠。随后将干燥的混合物与含有不同量的酶谷氨酰胺转移酶(TG，Activa WM,Ajnomoto Inc.比活性约为100U/g)的缓冲溶液(Tris/HCl，20mM，pH 7)混合。将所有组分预先冷却到4°C的温度以防止交联过快发生。对于每个试件，将163g混合物装入金属模具中并用锤(3次撞击)压紧以形成柱状的样品体，其尺寸为50X50mm(高度和直径)。将模具封闭以防止蒸发，然后将其置于干燥烘箱中，于50°C放置1小时。在Zwick公司的材料检测装置(Zwick Z020)上进行机械测试。将仍然湿润的样品体固定在下部压板上，然后用50mm/分钟的速度加压，直到破坏。(上部压板以Imm/分钟向下移动，直到达到5N的预负荷)。当不使用酶时，不需施加可测量的力即可将该柱压缩，然而当加入0. 175质量％ (基于砂的质量)的酶(等于17. 5U/g蛋白)时抗压强度可升至高达175N(见图1)。图1显示了湿润状态的柱状检测试件(直径50mm，高度50mm)的抗压强度，该试件是用砂、1 %酪蛋白酸钠和酶谷氨酰胺转移酶制成的(b. ο. s.，基于砂，wt%，基于干物质)。实施例2以下述方式制备蛋白提取物将Emvital E 7 (豌豆蛋白(pea protein), EmslandStarkeGmbH)悬浮在水中，并且在不溶物质沉淀之后，将上清液离心以进行进一步纯化。将得到的澄清的蛋白质溶液与丙酮(工业级，95%)以体积比1 2(蛋白质溶液/ 丙酮)混合以沉淀蛋白质。将悬浮液再次离心以得到沉淀的蛋白。再次用丙酮洗涤该蛋白组分，并在沉淀之后去除上层的丙酮。通过将沉淀的蛋白在特富龙片上室温存储来蒸发掉剩余的丙酮。在干燥之后，将蛋白质研磨成细粉并备用。将干蛋白粉与干燥状态的砂(1.3% b.o.s.)混合。然后，向砂-蛋白混合物中加入5% (b.o.s.)的缓冲溶液(Tris/HCl，pH 7，20mM)，在该缓冲溶液中含有0. 25 % b.o.s.的Activa WM。通过以下方式制造加压试件(柱形，50mmX 50mm)在对开试件管 (split specimen tube)中称量163g砂混合物，用3次锤冲击(ram blow)将其压紧。然后将加盖的模具(防止缓冲液蒸发)放置在(预热的)干燥烘箱内，温度为50°C。以10分钟的时间间隔(在20分钟之后开始)，从烘箱中取出试件并立即在加压实验中检测。检测速度设为50mm/分钟。交联反应使得加压试件的强度升高(见图2)。实施例3将明胶与缓冲液混合并于室温保持2小时以使明胶适当膨胀。在此之后，将胶状混合物(jelly mixture)加热直至50°C以形成均勻的明胶溶液。将温溶液添加到干砂 (H32)中，其中已在之前混合了 0. 25% (b. ο. s.) Activa WM，且调整为5%缓冲液(b. o. s.) 和明胶(b.o.s.)的最终浓度。得到的酶活性为25U/g明胶。通过以下方式形成加压试件在对开试件管中称量163g混合物，并用三次锤冲击(ram blow)使其压紧。然后将加盖的管置于(预热的)干燥烘箱中，温度为50°C。以10分钟的时间间隔(从30分钟后开始)，测量潮湿的加压试件的强度。存在因凝胶交联而导致的试件强度提高(见图3)。实施例4通过由大肠杆菌表达和纯化的重组谷氨酰胺转移酶O位处的脯氨酸更换为丝氨酸)的交联将豌豆蛋白提取物(如实施例2中所述制备)与干燥状态的砂和含有活性为66U/ g酪蛋白酸盐的谷氨酰胺转移酶S2P的缓冲液混合。在混合之后，形成加压试件并如实施例 1所述的测试。在图4中展示了因豌豆蛋白提取物而得到的试件的强度提高。实施例5和对比实验A D通过ABES(自动粘合评价系统，US 5，176,028中描述的用于测试胶粘粘合的设
8备，其通过引用并入本文)来检测用酶交联的蛋白作为木材用粘合剂的可用性。
于50°C将两片榉木胶合板(每片为173mmX20mm)在一起加压15分钟，交迭面积为5mmX 20mm，其间使用1滴粘合剂(0. 15 0. 20mg)。随后，在6分钟内将温度升高到 110°C并于该温度保持5分钟以去除水。然后，释放压力，将胶合板片拉开，并测量所需的力。表1显示了 10次测量的平均值。
表1 用ABES评价粘合剂
权利要求
1.复合材料，其包括多于50wt%(干对干)的填料，并且还包括包含蛋白材料的树脂， 所述蛋白材料含有能通过酶交联的蛋白质和/或多肽以及适用于所述交联的酶。
2.如权利要求1所述的复合材料，其中所述填料是无机或有机性质的，并且具有纤维、 颗粒或片材的形式。
3.如权利要求1-2中任一项所述的复合材料，其中填料的量介于80到99.9wt%之间。
4.如权利要求1-3中任一项所述的复合材料，其中所述填料含有少于20wt%(相对于所述填料)的蛋白材料。
5.如权利要求1-4中任一项所述的复合材料，其中所用的蛋白材料来自植物(包括藻类)、动物、真菌和/或微生物(细菌、酵母菌)来源。
6.如权利要求1-5中任一项所述的复合材料，其中所述蛋白材料通过以下方式进行富集将所述蛋白和/或多肽与其它源物质如多糖至少部分分离。
7.如权利要求1-6中任一项所述的复合材料，其中所述蛋白材料被水解以提供多肽。
8.如权利要求1-7中任一项所述的复合材料，其中所述用于交联的酶适于预想的反应条件，诸如用于预想用途的温度、PH、缓冲控制、离子强度和/或用化学剂进行的抑制。
9.如权利要求1-8中任一项所述的复合材料，其中所述交联酶是谷氨酰胺转移酶(EC 2 ■ 3 ■ 2 ■ 13)ο
10.如权利要求1-9中任一项所述的复合材料，其中所述填料包括至少约0.2mm的粒径。
11.通过使权利要求1-10中任一项所述的复合材料中所述的树脂交联而得到的复合产物。
12.如权利要求11所述的复合产物，其中所述复合产物在机械性质方面具有梯度。
13.如权利要求1-10中任一项所述的复合材料在制造铸型中的应用。
14.如权利要求1-10中任一项所述的复合材料在制造木面板中的应用。
15.通过使权利要求1-10中任一项所述的复合材料成形来制造铸型的方法，其中所述填料为砂，且其中所述含有蛋白质和/或多肽的蛋白材料通过酶促反应进行交联。
16.通过使权利要求1-10中任一项所述的复合材料成形来制造木面板的方法，其中所述填料为木纤维、木粉和/或胶合板，且其中所述含有蛋白质和/或多肽的蛋白材料通过酶促反应进行交联。
17.用包含可交联蛋白质或蛋白材料的树脂粘合填料如砂、木纤维、木粉或片材材料并用酶使所述蛋白材料交联的方法，其中所述蛋白材料含有蛋白质和/或多肽，其中填料的量大于50wt%。
18.用于填料如砂、木或胶合板的双组分胶粘剂，其中一种组分包括含有蛋白质和/或多肽的蛋白材料，且第二种组分是能够使所述蛋白材料中的蛋白质和/或多肽交联的酶。
19.包括多于50wt%(干对干)填料并且还包含蛋白材料的复合材料，其中所述填料是无机填料和木材中的至少一种，所述蛋白材料含有能通过酶交联的蛋白质和/或多肽以及适用于所述交联的酶。
全文摘要
本发明涉及一种复合材料，其包括多于50wt％的填料以及含有蛋白材料的树脂，该蛋白材料包含可通过酶交联的蛋白质或多肽以及适用于所述交联的酶。该复合材料非常有用于制备铸型或木面板。
文档编号C12N9/10GK102459320SQ201080029271
公开日2012年5月16日 申请日期2010年4月29日 优先权日2009年4月29日
发明者A.乔伯, H.W.G.范赫维杰南, M.皮特奇, M.雅各布 申请人:太尔公司