合成性的多肽文库以及用于建立具有天然多样性的多肽变体的方法

专利名称：合成性的多肽文库以及用于建立具有天然多样性的多肽变体的方法
合成性的多肽文库以及用于建立具有天然多样性的多肽变
体的方法相关申请本申请要求享有申请日为2009年5月20日的美国临时申请No. 61/179850、申请日为2009年12月17日的美国临时申请Ν0.61Λ87336以及申请日为2010年3月17日的美国临时申请No. 61/314794所拥有的权益，上述每一篇申请中的全部内容整体被引入到本发明中作为参考。发明的领域本发明涉及到DNA序列文库的建立以及这样的文库所具有的用途，其中所述的 DNA序列能够编码同源性的多肽。本发明特别涉及到大量的合成性的抗体片段的建立，其中在所述的抗体片段中存在的一个或者几个互补决定区域(CDR)被一批来自于天然来源的相应的互补决定区域(CDR)进行了取代。本发明进一步的涉及到大量的抗体片段的建立以及它们的用途，其中所述的抗体片段中含有来自于一种经过免疫的动物的互补决定区域 (CDR)，所述的抗体可以被用来作为一种生成高亲和性的抗体片段的较佳来源。本发明进一步的涉及到对一部分多肽所进行的多样性处理，所述的多样性处理是通过插入一种合成来源的或者天然来源的具有多样性的序列的方式来实现的，这种处理不需要对所述的初始多肽编码序列进行修饰。发明的
背景技术：
抗体是由四个多肽组成的两条重链以及两条轻链。抗体所具有的所述的抗原结合部分是由所述的轻链可变结构域(VL)以及所述的重链可变结构域(VH)形成的。在这样的结构域的末端处由六个环形成了所述的抗原结合位点并且这也被称之为所述的互补决定区域(⑶R)。三个互补决定区域(⑶幻位于所述的重链可变(VH)结构域(H1，H2以及 H3)之上并且其余的三个存在于所述的轻链可变(VL)结构域(Li，L2以及L3)之上。在B 细胞的形成过程中，通过体细胞的重组作用能够形成一个唯一的免疫球蛋白区域，其中所述的体细胞重组被称之为V (D) J (可变基因(多样性基因)连接基因)重组。所述的免疫球蛋白的重链或者轻链所具有的可变区域是由不同的基因片段来进行编码的。所述的重链是由三个被称之为可变片段(V)，多样性片段(D)以及连接片段(J)的片段来进行编码的，而所述的轻链可变区域则仅仅是通过可变片段(V)以及连接片段(J)这两个片段的重组而形成的。通过在存在于所述的基因组之中的所述的多个拷贝的可变片段(V)，多样性片段(D) 以及连接片段(J)中的一个所进行的重组反应，能够建立大量的抗体互补位。所述的可变 (V)片段能够编码所述的互补决定区域I(CDRl)以及互补决定区域2(CDR2)而所述的互补决定区域3(CDR!3)是通过所述的重组事件来建立的。在所述的免疫应答的过程之中，通过一种方法能够向所述的抗原结合位点之中导入更多的多样性，其中所述的方法被称之为体细胞的超突变(SHM)。在这个方法过程中，基因点突变被导入到所述的重链以及轻链所具有的可变基因之中并且特别是被导入到能够编码所述的互补决定区域(CDR)的区域之中。这种额外的可变性允许进行B细胞表达抗体变体的筛选以及扩展，其中所述的B细胞表达抗体变体对于它们的同源性抗原而言具有提高的亲和性。
近几年来几种展示技术已经显现出来并且允许进行大批量的蛋白质或者肽的筛选。这些包括噬菌体展示，细菌展示，酵母展示以及核糖体展示(参见Smith GP.于1985 年6月14日在Science《科学》228 0705) :1315-7中发表的文章；Hanes J以及Pluckthun A.于1997年5月13日在Proc Natl Acad Sci USA《美国科学院院刊》94(10) :4937-42 中发表的文章；Daugherty PS等人于1998年9月在ftx)tein Eng.《蛋白质工程)》11 (9) 825-32 中发表的文章；Boder ET 以及 Wittrup KD.于 1997 年 6 月在 Nat Biotechnol.《自然生物技术》15(6) :553-7中发表的文章)。特别的，这些方法已经被广泛的应用在抗体及其片段之中。已经描述了许多的方法，用以建立多肽文库并且用以对具有期望的结合特性的成员进行筛选。第一种途径是通过基因的扩增作用从天然的全体个体(I^pertoires)中捕获经过重新排列的免疫球蛋白基因，其中使用到来自于人类或者其他哺乳动物的组织或者细胞作为一种遗传多样性的来源。在此之后对这些批量的经过重新排列的重链以及轻链(VH以及VL)进行组合，从而建立结合对文库，其中所述的结合对文库可以在细菌噬菌体上或者在其他的展示包上进行展示，其中所述的展示包例如是细菌，酵母或者是哺乳动物细胞。在这种情形下，在所述的供体中发现的很大一部分的所述免疫球蛋白个体(i^pertoire)可以被进行捕获。因此在这样的个体中可以找到由所述的供体生殖细胞系基因所编码的骨架以及多样性，其中所述的多样性是同时由可变片段(多样性片段)连接片段(V(D)J)的重组作用以及体细胞的超突变作用来建立的(参见Marks JD等人于1991年12月5日在J Mol Biol.《分子生物学杂志》222 (3) :581-97中发表的文章；McCaffety的美国专利 No.5969108)。天然存在的全部个体所具有的一个局限性是天然存在的抗体可能是以本身具有低稳定性的骨架为基础的，这种低稳定性能够限制它们的表达水平，货架期以及它们作为试剂或者治疗分子所具有的有效性。为了克服这样的局限性，已经研究出许多的方法用以建立合成性的抗体文库。在这些途径中，对唯一选定的抗体骨架或者有限数量的选定的抗体骨架进行筛选，其中所述的抗体骨架是通过它们相对应的生殖细胞系基因来进行编码的。对这些骨架所进行的筛选普遍情况下是基于它们的生物化学稳定性和/或它们在天然的抗体个体中所具有的表达频率来进行的。为了建立一批结合蛋白，在此之后向所有的互补决定区域(⑶幻之中或者互补决定区域(OTR)子集之中导入合成性的多样性。通常情况下，可以使用不同的策略对所述的整体的互补决定区域(CDR)或者所述互补决定区域 (CDR)的一部分进行多样性处理。在一些情形中将多样性导入到存在于所述的互补决定区域(OTR)之内的选定的位置上(参见Knappik A等人于2000年2月11日在J Mol Biol. 《分子生物学杂志》296(1) :57-86中发表的文章)。作为靶向的残基可以是经常参与抗原接触的那些残基，能够在天然的抗体个体中展示出最大程度的多样性的那些残基，或者甚至是在所述的天然的亲和性成熟过程中通过所述的细胞机构能够优先命中的那些残基，其中所述的细胞机构是参与了体细胞的超突变的发生的细胞机构(参见Balint RF,Larrick JW.于1993年12月17日在Gene《基因》137(1) 109-18中发表的文章)。已经使用过几种方法来对所述的抗体互补决定区域(OTR)进行多样性处理。重叠聚合酶链式反应(PCR)已经被广泛的用来对骨架以及互补决定区域(CDR)元件进行组装从而重新构建抗体基因，其中在所述的重叠聚合酶链式反应(PCR)之中使用了简并寡核苷酸。在另外一种途径中，已经在所述的骨架区域之中的每一个所述的互补决定区域(CDR) 的边界处设计了一个独特的限制性酶位点，所述的限制性酶位点能够允许通过由限制性酶介导的克隆方式来进行具有多样性的互补决定区域(CDR)的导入。无论在何种情况下，因为所述文库所具有的全部成员都是以具有选定的以及优选的特征的骨架为基础的，因而可以预期到的是，来自于这样的个体的所述抗体是更加稳定的并且是一种能够提供有效的试剂的较好的资源(参见Knappik的美国专利No. 6696248 ；Sidhu SS.等人于2000年在 Methods Enzymo 1.《酶学方法》328 :333-63中发表的文章；Lee CV等人于2004年7月23 日在J Mol Biol.《分子生物学杂志》340 (5) :1073-93中发表的文章)。然而，这样的合成性的文库所具有的一个重要的局限性是所述的文库成员中有相当大的比例是不被进行表达的，这是因为被随机的进行多样性处理的序列不能够允许所述的蛋白质进行恰当的表达和/或折叠。这个问题对于所述的重链所具有的互补决定区域
而言是格外显著的。的确，这个互补决定区域(OTR)在通常情况下提供了大部分的结合所述抗原所需的结合能力并且在长度以及序列上是存在高度多样性的。虽然所述的其他互补决定区域(OTR) (H1，H2，L1，L2以及L3)仅仅能够采用少数的三维构象，这些三维构象被称之为标准折叠，可以被所述的重链互补决定区域3 (CDR!3)所采用的所述构象的数量仍然存在太多的多样性而难以进行预测(参见Al-Lazikani B等人于1997年11月7日在J Mol Biol.《分子生物学杂志》273 (4) :927-48中发表的文章)。除此之外，所述的长的简并寡核苷酸的使用通常能够带来单个碱基对的缺失，其中所述的简并寡核苷酸常常被来对长的可变重链互补决定区域3 (CDR H3)进行覆盖。这些因素显著的降低了所述的合成性的个体所具有的功能规模。天然个体以及合成性的个体都具有优点以及局限性。在一个方面，这种依靠对所述的能够发生自然的重新排列的抗体可变基因所进行的捕获的策略并不是最理想的，这是因为它们能够将潜在的并不是有利的骨架囊括在所述的文库之中。一个积极的方面是这些经过重新排列的可变基因包括了这样的互补决定区域(CDR)，当它们在一种天然的抗体中被进行表达时，所述的互补决定区域(CDR)能够兼容恰当的结构域折叠。在另外一个方面， 这种基于筛选骨架以及插入合成性的多样性的策略能够通过所述的骨架所具有的提高的稳定性而获得益处，但是会受到所述的大量互补决定区域(CDR)序列的限制，其中所述的序列不能够与折叠和/或表达作用进行兼容并且能够使所述的整个结构域产生不稳定性 (附

图1A)。因此需要寻求一种新的途径，所述的途径应当能够将使用选定的骨架所带来的益处与期望的特征进行结合，并且将它们与适当折叠的互补决定区域(CDR)进行结合，其中所述的适当折叠的互补决定区域(CDR)例如是来自于天然个体的互补决定区域(CDR)。以上描述的全部途径是通过下述的方式之一来建立抗体文库的通过捕获经过自然的重新排列的抗体序列的方式或者通过合成的手段建立多样性的方式，上述的途径能够受到所述的移码突变的出现的限制，其中所述的移码突变能够形成非功能性的抗体序列。 这样的突变可能出现在所述的DNA编码所述抗体的分子操作的多个步骤中出现，例如在聚合酶链式反应(PCR)扩增和DNA片段的组合以及分子克隆的步骤中。所述的非功能性成员在抗体文库中出现的频率在通常情况下存在于15%至45%的范围之内，这取决于所使用到的用以进行捕获或者用以建立所述的抗体多样性的策略(参见Persson MA等人于1991 年3月15日在Natl Acad Sci USA.《美国科学院院刊》88 (6) J432-6中发表的文章；Schoonbroodt S.等人于 2005 年 5 月 19 日在 Nucleic Acids Res.《核酸研究》33 (9) e81中发表的文章；S0derling E等人于2000年8月在Nat Biotechnol.《自然生物技术》 18(8) 852-6中发表的文章；Rothe等人于2008年2月四日在J Mol Biol.《分子生物学杂志》376 ) :1182-200中发表的文章)。所述的序列所出现的频率对所述的抗体识别过程具有主要的影响，其中所述的序列是用以编码非功能性抗体的序列。首先，所述的文库所具有的功能规模被降低并且，因为在所述文库的繁殖过程中非功能性的克隆在通常情况下具有一种生长优势，它们能够扩展的更快速并且能够危及所述的抗体备选物的识别过程(参见De Bruin R等人于1999年4月17日在Nat Biotechnol《自然生物技术》397-399中发表的文章)。已经将这些问题认定为对于完全开发所述的抗体文库所具有的潜能而言是一种严重的限制。具有高度的功能性的文库的建立在本领域内仍然是一项挑战并且已经促使进行了很多努力用以对所述的过程进行改进。例如，已经使用了多种多样性处理的策略，其中所述的策略的目标在于模拟那些在天然的互补决定区域(CDR)序列中发现的所述氨基酸的用法，其目的在于对可能的序列组合所具有的巨大的多样性进行更为有效的尝试，其中所述的序列的组合是通过合成性的互补决定区域(CDR)来进行编码的(参见de Kruif等人于1995年4月21日在J Mol Biol.《分子生物学杂志》M8 (1) :97-105中发表的文章； Sidhu SS等人于2004年4月23日在J Mol Biol.《分子生物学杂志》338 O) :299-310中发表的文章)。另外一种途径是对所述的初始文库进行清理，其目的在于在以多样性损失为可能的代价的前提下除去非功能性的克隆。这种途径已经被应用在所述的合成性个体的预先筛选之中，这是通过使所述的抗体与一种一般性的配体进行结合的方式来实现的。这个步骤允许这样的文库成员进行富集，其中所述的文库成员能够进行恰当的表达以及折叠并且可以被用来重新建立一个具有更强的功能性的文库(参见Winter以及Tomlinson的美国专利No. 6696M5B》。无论是何种途径，任何的文库所具有的质量取决于被用来建立所述文库的所述的分子生物学方法所具有的效率，并且在一般情况下能够产生15%至45%的非功能性的文库成员。因此需要寻求新的以及高效率的途径，所述的途径能够使非功能性基因的出现频率最小化，并且能够使所述的文库所具有的功能性最大化，其中所述的非功能性基因的出现归因于在所述分子克隆步骤的过程中被导入的移码，使所述的文库所具有的功能性最大化是通过下述的方式来实现的捕获这样的互补决定区域(CDR)，所述的互补决定区域(CDR)具有被正确的叠加至抗体骨架之中的高度倾向并且具有期望的性质。此夕卜，需要寻求这样的途径，所述的途径能够允许从一种动物免疫个体中捕获所述的互补决定区域(CDR)序列并且将其捕获至一种治疗学上可以使用的环境之中，例如一种人类抗体骨架，其目的在于对高亲和性抗体的生成过程进行改进。发明概述本发明提供了用以建立核酸序列文库的方法，所述的方法能够将由稳定的骨架的筛选以及自然编码的互补决定区域(CDR)或者氨基酸序列的插入所带来的益处进行结合， 其中所述的氨基酸序列能够实现一种互补决定区域(CDR)所具备的功能，所述的互补决定区域(CDR)是在一种天然的功能性多肽例如一种抗体中被选定的互补决定区域(CDR)。本发明能够重新获得长的互补决定区域(CDR)或者氨基酸序列，其中所述的氨基酸序列能够实现一种互补决定区域(CDR)所具备的功能，所述的互补决定区域(CDR)是非常难以使用合成的途径来进行编码的互补决定区域(CDR)。本发明通过将稳定的骨架以及经过适当折叠的互补决定区域(CDR)或者氨基酸序列进行结合的方式，能够使存在于所述的文库之中的所述功能性抗体所占的比例最大化，并且因此使得所述的筛选过程的表现最优化以及所述的被选定的克隆物的质量最佳化，其中所述的氨基酸序列能够实现一种互补决定区域 (CDR)所具备的功能。本发明提供了一种方法，所述的方法能够从不同的种类中捕获那些经过了自然表达的互补决定区域(OTR)并且将它们插入到一种人类的抗体骨架之中。这允许对所述的可变重链互补决定区域3 (CDR H3)中的全部个体进行使用，当与所述的人类个体进行比较时，所述的重链互补决定区域3(CDR H3)中的全部个体之间在长度以及组成上存在显著性的差异。本发明能够进行所述的人类抗体片段的建立，其中所述的人类抗体片段的特征在于具有来自于其他种类的结构性个体(structural repertoires)并且因此具备所述的尝试不同的结构空间的能力。本发明所述的方法同样可以被用来以更高的成功率进行互补决定区域(CDR)或者氨基酸序列的导入，其中所述的互补决定区域(CDR)是合成性的来源的，所述的氨基酸序列能够实现一种互补决定区域(CDR)所具备的功能，所述的更高的成功率是相比较于能够向所述的编码序列中导入较少的引发错误的移码现象的可供选择的方法而言的。使用本发明中所述的方法建立起来的文库中含有高频率的功能性变体。依照这种方法建立起来的变体文库可以被用来进行筛选以及过滤，其中所述的筛选以及过滤可以通过任意已有描述的展示技术、筛选技术以及过滤技术来进行。
在不同的研发阶段中，对来自于不同种类的所述的免疫个体所进行的分析，或者对存在于同一个种类之中的所述的免疫个体所进行的分析已经揭示出在所述的可变重链互补决定区域3 (CDR H3)的组成以及长度特征方面存在着一些显著性的差异。例如当与胎儿时期或者与新生儿进行比较时，在成人时期所述的人类可变重链互补决定区域3(CDRH3) 所具有的平均长度更长(参见khroeder Jr, HW等人于2001年在Blood《血液学》98 2745-2751中发表的文章)。有趣的是，虽然在人类以及灵长类的抗体生殖细胞系基因之间存在着很大程度的相似性，但是在生长发育过程中所述的可变重链互补决定区域3 (CDRH3) 的长度所发生的进化却存在不同(参见Link JM等人于2005年在Molecular Immunol.《分子免疫学》42 =943-955中发表的文章)。对在小鼠以及人类中发现的所述的可变重链互补决定区域3(CDR H3)序列所进行的比较清楚的表示出在小鼠中所述的平均长度明显更短 (参见Rock EP等人于1994年在J Exp Med《实验医学杂志》179 =323-328中发表的文章)。 在骨髓中，在早期的B细胞形成过程中，在小鼠体内所述的可变重链互补决定区域3(CDR H3)所具有的平均长度是增加的，而在人类体内其趋向于减小并且除此之外所述的鼠科动物的可变重链互补决定区域3 (OTR H3)个体以及人类的可变重链互补决定区域3 (OTR H3) 个体所具有的组成是存在差异的(参见kmlin M等人于2003年在J Mol Biol.《分子生物学杂志》334 =733-749中发表的文章；Ivanov I等人于2005年在J Imuunol《免疫学杂志》174 :7773-7780中发表的文章)。这些例子说明不同的种类能够表达不同范围的可变重链互补决定区域3 (OTR H3)个体(r印ertoires)，尽管事实是从整体上来看它们被暴露在相似类别的抗体之下，并且对这样的观察结果所具有的生物学显著性仍然需要进行进一步的研究。已经得到证实的是，直接作用于小抗原的抗体结合位点所具有的形状不同于那些直接作用于大的蛋白质的抗体结合位点所具有的形状，其中所述的小抗原例如是半抗原或者是肽，并且所述的结合位点所具有的形状受到所述的互补决定区域(CDR)所具有的长度以及组成的制约(参见Collis A等人于2003年在J Mol Biol《分子生物学杂志》325 :337-354中发表的文章)。通过这些发现，我们可以预期到的是，那些由不同的物种进行表达的所述的可变重链互补决定区域3 (CDR H3)个体具有不同的倾向性，从而针对不同的靶向类别进行有效的反应。在本发明中所提供的所述的方法以及抗体文库被设计成为用来开发所述的各种不同的个体，其中所述的个体是由不同的种类进行表达的，用以进行所述的治疗性抗体的建立。这些探索不同的三维空间的个体能够允许进行所述的抗体的建立，其中所述的抗体能够作用于多种不同的靶向类别以及表位。在本发明中对用以从天然动物或者经过免疫的动物中建立文库的方法进行了详细的描述，并且这些方法能够对所述的相应的个体进行捕获并且进行所述抗体的建立。然而，从这样的文库中获得的抗体并不是来自于人类的并且因此在不进行进一步的工程化处理的情况下并不能够特别适合进行人类的治疗，其中所述的工程化处理例如是人源化处理。因此需要寻求新的方法，用以对在所述的个体中表达的所述的多样性进行利用并且将这种多样性用在治疗学上可以使用的人类抗体的情形中，其中所述的个体是来自于不同的种类之中的。在本发明中提供的所述的方法以及抗体文库致力于解决在上文中所描述的几个局限性并且对于所述的现有技术而言是一种进步。首先，在本发明中提供的所述的方法能够将由稳定的骨架的筛选以及自然编码的互补决定区域(CDR)的插入所带来的益处进行结合，其中所述的互补决定区域(CDR)是在一种天然的功能性多肽中被选定的互补决定区域(CDR)。其次，所述的方法能够允许在一种抗体骨架之中将合成性的或者天然性的互补决定区域(CDR)序列进行高效率的插入，所述的插入能够使存在于所述的文库之中的所述的移码的数量发生显著性的最小化并且因此提高其质量。最后，本发明允许使用一种新的方法来利用天然存在的抗体的结构多样性，这是通过下述的方式来实现的从不同的种类中捕获那些经过自然表达的可变重链互补决定区域3 (OTR H3)个体并且将所述的个体插入到人类的抗体骨架之中去。以一种生产性的方式来利用这样的具有结构上的多样性的个体来进行所述抗体的建立因此成为可能，其中所述的抗体的建立是用于进行人类治疗的。在本发明中提供的所述方法能够建立这样的抗体，其中所述的抗体中含有一个稳定的骨架以及经过了正确折叠的互补决定区域(CDR)或者氨基酸序列，所述的氨基酸序列能够实现所述的互补决定区域(CDR)所具备的功能。所述的方法能够捕获到存在于稳定的骨架之中的所述序列所具有的天然多样性。在本发明提供的所述的方法中，用于骨架区域1，2以及3(FR1，FR2以及FR3)的所述的生殖细胞系序列是选自于所期望的生物体的，例如，是选自于所述的人类基因组的 (参见，例如，附图2以及6)。在这种方法的一种实施方式中，对选定的抗体可变结构域进行修饰，所述的修饰是通过下述的方式来实现的导入一种填充序列，所述的填充序列将被用来作为经过多样性处理的序列的整合位点。向存在于所述的免疫球蛋白编码区域之外的所述序列中导入多样性，其中所述的导入是通过下述的方式来实现的在一个期望的位置上导入限制性酶识别位点，例如，IIs型限制性位点，其中所述的期望的位置例如是所述的可变重链互补决定区域3 (⑶R H3)，所述的可变轻链互补决定区域3 (⑶R L3)，所述的可变重链互补决定区域1 (⑶R Hl)，所述的可变轻链互补决定区域1 (⑶R Li)，所述的可变重链互补决定区域2(CDR H2)或者所述的可变轻链互补决定区域2 (CDR L2)。虽然在本发明所提供的所述的例子中证实了存在于所述的互补决定区域3 (CDR3)区域内(存在于所述的可变重链区域和/或可变轻链区域内)的多样性，应当被理解的是多样性可以在任意期望的位置上实现，例如，但不局限于，所述的互补决定区域I(CDRl)区域(存在于所述的可变重链区域和/或可变轻链区域内)或者所述的互补决定区域2 (CDM)区域(存在于所述的可变重链区域和/或可变轻链区域内)。可以利用包括IIs型限制性位点的侧翼序列来建立经过多样性处理的DNA序列。在本发明中提供的所述的方法中，通过所述的限制性酶来生成的所述的粘性末端是具有兼容性的并且所述的阅读框仍然存在，因此允许所述的经过多样性处理的DNA片段连结至一个受体骨架之内。在本发明中提供的所述方法同样可以被用来进行氨基酸序列的建立，其中在所述的氨基酸序列中编码有多样性的区域。例如，在本发明提供的所述的方法中，所述的被编码的氨基酸所具有的非多样性部分中的序列可以选自期望的生物体，例如，选自所述的人类序列。所述的被编码的氨基酸序列所具有的一部分可以被进行修饰，其中所述的修饰是通过下述的方式来实现的导入一个填充序列，所述的填充序列将被用来作为经过多样性处理的序列的整合位点。通过在一个期望的位置上导入限制性酶的识别位点的方式，可以在所述的期望位置处将多样性导入到所述的序列之中，其中所述的限制性酶的识别位点例如是IIs型限制性位点，所述的期望位置是存在于所述的被编码的氨基酸序列之内的。可以利用包括IIs型限制性位点的侧翼序列来建立经过多样性处理的DNA序列。在本发明中提供的所述的方法中，通过所述的限制性酶来生成的所述的粘性末端是具有兼容性的并且所述的阅读框仍然存在，因此允许所述的经过多样性处理的DNA片段连结至一个受体骨架之内。在本发明提供的所述方法之中，“受体骨架”是通过使用一个DNA “填充片段”的方式来进行建立的，其中所述的DNA “填充片段”中含有两个IIs型限制性酶位点，并且优选的所述的DNA “填充片段”是通过两个IIs型限制性酶位点来进行连接的(参见，例如，附图6)。优选的，这两个IIs型限制性酶位点能够在期望具有多样性的所述的位点的边界上对序列进行消化，其中所述的期望的位置例如是所述的可变重链互补决定区域3 (CDR H3)， 所述的可变轻链互补决定区域3 (CDR L3)，所述的可变重链互补决定区域1 (CDR H1)，所述的可变轻链互补决定区域1 (CDR Li)，所述的可变重链互补决定区域2 (CDR H2)或者所述的可变轻链互补决定区域2 (CDR L2)。当在本发明中被进行使用时，所述的术语“受体骨架”指的是这样的一种核酸序列，所述的核酸序列包括编码所述的侧翼区域I(FRl)，侧翼区域2(FR2)，侧翼区域3(FR3)以及侧翼区域4(FR4)区域的核酸序列，编码两个互补决定区域(CDR)或者氨基酸序列的核酸序列，其中所述的氨基酸序列能够实现这些互补决定区域 (CDR)所具备的功能，并且“填充片段”被用来作为所述的经过多样性处理的核酸序列的整合位点。例如，当期望在所述的互补决定区域3 (CDR3)区域内(存在于所述的可变重链区域和/或所述的可变轻链区域内)存在多样性时，在这样的实施方式中，所述的受体骨架包括编码所述的侧翼区域1 (FRl)，侧翼区域2 (FR2)，侧翼区域3 (FR3)以及侧翼区域4 (FR4) 区域的核酸序列，编码所述的互补决定区域I(CDRl)或者互补决定区域2(CDR2)区域的核酸序列，并且“填充片段”被用来作为所述的经过多样性处理的核酸序列的整合位点。例如，当期望在所述的互补决定区域2 (CDM)区域内(存在于所述的可变重链区域和/或所述的可变轻链区域内)存在多样性时，在这样的实施方式中，所述的受体骨架包括编码所述的侧翼区域I(FRl)，侧翼区域2 (FR2)，侧翼区域3 (FR3)以及侧翼区域4(FR4)区域的核酸序列，编码所述的互补决定区域I(CDRl)或者互补决定区域3(CDR3)区域的核酸序列，并且“填充片段”被用来作为所述的经过多样性处理的核酸序列的整合位点。例如，当期望在所述的互补决定区域I(CDRl)区域内(存在于所述的可变重链区域和/或所述的可变轻链区域内)存在多样性时，在这样的实施方式中，所述的受体骨架包括编码所述的侧翼区域 1(FR1)，侧翼区域2(FR2)，侧翼区域3(FR3)以及侧翼区域4(FR4)区域的核酸序列，编码所述的互补决定区域2(CDR2)或者互补决定区域3(CDR3)区域的核酸序列，并且“填充片段” 被用来作为所述的经过多样性处理的核酸序列的整合位点。所述的术语“填充片段”，“填充DNA片段”以及“填充序列”或者是上述术语的任何合乎文法的变型可以在本发明中进行交替互换的使用，用以指的是这样的一种核酸序列， 所述的核酸序列包括至少两个IIs型识别位点以及一个经过多样性处理的序列。所述的受体骨架可以是一个可变的重链(VH)受体骨架或者是一个可变的轻链(VL)受体骨架。对所述的受体骨架以及在其中包含的所述的填充片段所进行的使用允许一种互补决定区域 (CDR)序列(天然的或者合成的)或者一种氨基酸序列在所述的受体骨架之内进行整合，其中在所述的受体骨架中不需要含有供体骨架核苷或者残基或者不需要为了整合而需要供体骨架核苷或者残基，所述的氨基酸序列能够实现所述的互补决定区域(CDR)所具备的功能。例如，对所述的受体骨架以及在其中包含的所述的填充片段所进行的使用允许一种互补决定区域(CDR)序列(天然的或者合成的)或者一种氨基酸序列在所述的受体骨架之内进行整合，其中在所述的受体骨架中不需要含有供体骨架核苷或者残基或者不需要为了整合而需要供体骨架核苷或者残基，所述的互补决定区域(CDR)序列选自于所述的可变重链互补决定区域3(CDR H3)，所述的可变轻链互补决定区域3 (CDR L3)，所述的可变重链互补决定区域2 (⑶R H2)，所述的可变轻链互补决定区域2 (⑶R L2)，所述的可变重链互补决定区域1 (CDR Hl)以及所述的可变轻链互补决定区域1 (CDR Li)，所述的氨基酸序列能够实现所述的互补决定区域(CDR)所具备的功能，其中所述的互补决定区域(CDR)选自所述的可变重链互补决定区域3 (⑶R H3)，所述的可变轻链互补决定区域3 (⑶R L3)，所述的可变重链互补决定区域2 (⑶R H2)，所述的可变轻链互补决定区域2 (⑶R L2)，所述的可变重链互补决定区域IKDR Hl)或者所述的可变轻链互补决定区域1 (OTR Li)。因此，通过整合作用，所述的填充片段被完全去除，并且所述的受体蛋白所具有的编码区域以及所插入的蛋白质片段(即，所述的互补决定区域(CDR))是完整无缺的。在本发明中提供的所述的方法中使用到了这样的引物，所述的引物被设计成为含有IIs型限制性酶的断裂位点，其中所述的断裂位点的位置处于期望具有多样性的所述的位点的边界上，例如是所述的可变重链互补决定区域3(CDR H3)区域，所述的可变轻链互补决定区域3 (CDR L3)区域，所述的可变重链互补决定区域2 (CDR H2)区域，所述的可变轻链互补决定区域2 (CDRU)区域，所述的可变重链互补决定区域1 (CDR Hl)区域或者所述的可变轻链互补决定区域1 (CDR Li)区域。将随机的、天然存在的互补决定区域(CDR)克隆(参见，例如，附图10)或者合成性的互补决定区域(CDR)序列(参见，例如，实施例6)或者氨基酸序列捕获至在本发明中所使用到的所述的受体骨架之中，其中所述的氨基酸序列能够实现所述的互补决定区域(CDR)所具备的功能。例如，当期望在所述的互补决定区域3 (CDR3) 区域内(存在于所述的可变重链区域和/或所述的可变轻链区域内)存在多样性时，在这样的实施方式中，可以将随机的、天然存在的互补决定区域3(CDR3)克隆(参见，例如，附图10)或者合成性的互补决定区域3(CDR!3)序列(参见，例如，实施例6)或者氨基酸序列捕获至在本发明中所使用到的所述的受体骨架之中，其中所述的氨基酸序列能够实现所述的互补决定区域3(CDR3)所具备的功能。例如，当期望在所述的互补决定区域2 (CDR2)区域内 (存在于所述的可变重链区域和/或所述的可变轻链区域内)存在多样性时，在这样的实施方式中，可以将随机的、天然存在的互补决定区域2(CDR2)克隆(参见，例如，在附图10中所示的方法)或者合成性的互补决定区域2 (CDR2)序列(参见，例如，在实施例6中所示的方法)或者氨基酸序列捕获至在本发明中所使用到的所述的受体骨架之中，其中所述的氨基酸序列能够实现所述的互补决定区域2 (CDR2)所具备的功能。例如，当期望在所述的互补决定区域1 (CDRl)区域内(存在于所述的可变重链区域和/或所述的可变轻链区域内) 存在多样性时，在这样的实施方式中，可以将随机的、天然存在的互补决定区域I(CDRl)克隆(参见，例如，在附图10中所示的方法)或者合成性的互补决定区域I(CDRl)序列(参见，例如，在实施例6中所示的方法)或者氨基酸序列捕获至在本发明中所使用到的所述的受体骨架之中，其中所述的氨基酸序列能够实现所述的互补决定区域I(CDRl)所具备的功能。作为一个例子，可以设计这样的寡核苷酸引物，所述的引物对一种DNA序列所具有的侧翼区域具有特异性，其中所述的DNA序列能够编码所述的免疫球蛋白的可变重链互补决定区域3 (CDR H3)，S卩，对所述的可变区域所具有的侧翼区域3 (FR3)以及侧翼区域4(FR4)具有特异性。同样可以设计这样的寡核苷酸引物，所述的引物对编码其他区域的所述的DNA 序列所具有的侧翼区域具有特异性，其中所述的其他区域例如是，所述的可变轻链互补决定区域3 (CDR L3)，所述的可变重链互补决定区域1 (CDR Hl)，所述的可变轻链互补决定区域1(CDR Li)，所述的可变重链互补决定区域2 (CDR H2)，或者所述的可变轻链互补决定区域2(⑶R U)。这样的寡核苷酸在其5’末端上含有一个IIs型限制性酶的位点，而其3’部分能够与所述的靶向DNA序列进行匹配。在一些实施方式中，所述的引物是一种核酸，所述的核酸选自由序列识别号 120-2M所组成的组中。在本发明所提供的所述的方法中利用IIs型限制性酶将天然的互补决定区域(CDR)序列插入到本发明所描述的所述的受体骨架之中，其中所述的限制性酶例如是 Fokl，所述的天然互补决定区域(CDR)序列例如是天然的可变重链互补决定区域3(CDR H3)，所述的可变轻链互补决定区域3 (CDR L3)，所述的可变重链互补决定区域1 (CDR Hl)， 所述的可变轻链互补决定区域1 (CDR Li)，所述的可变重链互补决定区域2 (CDR H2)，或者所述的可变轻链互补决定区域2 (CDR L2)序列。在本发明所提供的所述的方法中利用IIs 型限制性酶将合成性的互补决定区域(CDR)序列插入到本发明所描述的所述的受体骨架之中，其中所述的限制性酶例如是i^okl，所述的合成性的互补决定区域(CDR)序列例如是合成性的可变重链互补决定区域3 (CDR H3)，所述的可变轻链互补决定区域3 (CDR L3)，所述的可变重链互补决定区域1 (CDR Hl)，所述的可变轻链互补决定区域1 (CDR Li)，所述的可变重链互补决定区域2 (OTR H2)，或者所述的可变轻链互补决定区域2 (OTR L2)序列。 在本发明所提供的所述的方法中利用IIs型限制性酶将氨基酸序列插入到本发明所描述的所述的受体骨架之中，其中所述的限制性酶例如是i^okl，所述的氨基酸序列能够实现所述的天然的或者合成的可变重链互补决定区域3 (CDR H3)、可变轻链互补决定区域3 (CDR L3)、可变重链互补决定区域1 (⑶R Hl)、可变轻链互补决定区域1 (⑶R Li)、可变重链互补决定区域2(CDR H2)、或者可变轻链互补决定区域2 (CDR L2)区域所具备的功能。所述的 IIs型限制性酶是能够在它们的识别序列外侧进行切断使其存在于一边的酶类。这样的酶类具有适中的大小，通常情况下具有400-650个氨基酸的长度，并且它们能够对连续的序列以及不对称的序列进行识别。适合的IIs型限制性酶，同样也被称之为IIs型限制性内切酶，以及它们所识别的序列，在例如Szykilski等人(于1991年)在Gene《基因》第100 卷13- 中发表的文章“Class-IIS Restriction Enzymes《IIS型限制性酶》”中进行了描述，上述文献中的内容作为整体被引入到本发明中作为参考。初始文库包括一个重链可变(VH)的受体骨架以及一个固定的轻链可变(VL)的序列(同样被称之为一个“虚拟的轻链可变(VL) ”序列)，或者包括一个轻链可变(VL)的受体骨架以及一个固定的重链可变(VH)的序列(同样被称之为一个“虚拟的重链可变(VH) ” 序列)。因此，初始文库仅仅能够在所述的重链或者轻链之一上表现出多样性。次级文库是通过将一个重链可变(VH)的受体骨架与一个轻链可变(VL)的受体骨架连结在一起的方式来进行建立的(参见，例如，实施例7)。次级文库同时在所述的重链以及轻链之上具有多样性。本发明提供了用以制备大量核酸的方法，其中每一个核酸能够编码一个人类免疫球蛋白重链可变结构域，在所述的人类免疫球蛋白重链可变结构域中含有大量的重链互补决定区域3(CDR H3)，这些重链互补决定区域3 (CDR H3)是从来自于一种非人类的物种中的所述的免疫球蛋白可变结构域个体中分离得到的。在一些实施方式中，所述的方法包括下述的步骤(a)提供大量的受体骨架核酸序列，其中所述的核酸序列能够编码截然不同的人类免疫球蛋白重链可变结构域，每一个受体骨架核酸序列中含有第一个骨架区域(FRl)， 第二个骨架区域(FR2)，第三个骨架区域(FR3)，以及第四个骨架区域(FR4)，其中所述的骨架区域I(FRl)与骨架区域2(FR2)区域之间被一个互补决定区域1 (CDRl)进行了间隔，所述的骨架区域2(FR2)与骨架区域3(FR3)区域之间被一个互补决定区域2 (CDR2)进行了间隔，并且所述的骨架结构3 (FR3)以及骨架结构4(FR4)区域之间被一个填充核酸序列进行了间隔，其中所述的填充核酸序列中包括至少两个IIs型限制性酶识别位点，所述的两个限制性酶识别位点之间被一个随机的核酸序列进行了间隔；(b)提供大量的经过多样性处理的核酸序列，其中所述的核酸序列能够编码重链互补决定区域3(CDR H3)序列，所述的重链互补决定区域3(CDR H3)序列是从一种非人类的物种的免疫球蛋白个体中分离出来的， 其中所述的大量的经过多样性处理的核酸序列中的每一个序列在其每一个末端上包括一个IIs型限制性酶识别位点；(c)利用一种IIs型限制性酶对所述的大量的核酸序列中的每一个进行消化，其中所述的核酸序列能够编码所述的可变重链互补决定区域3 (CDR H3) 区域，并且所述的限制性酶能够与步骤(b)中所述的IIs型限制性酶识别位点进行结合，并且利用一种IIs型限制性酶对步骤(a)中所述的来自于所述的受体骨架之中的填充核酸序列进行消化，其中所述的限制性酶能够与步骤(a)中所述的IIs型限制性酶识别位点进行结合；以及(d)将所述的经过消化的核酸序列或者所述的来自于步骤(c)中的氨基酸序列连结至步骤(c)中所述的经过消化的受体骨架之中，其中所述的核酸序列能够编码所述的可变重链互补决定区域3 (CDR H3)区域，这样一来可以利用所述的核酸序列或者所述的氨基酸序列对所述的骨架区域3 (FR3)以及骨架区域4(FR4)区域之间进行间隔，其中所述的核酸序列能够编码所述的可变重链互补决定区域3 (CDR H3)区域，所述的氨基酸序列能够实现一种互补决定区域3(CDR3)区域所具备的功能，并且一个完整的免疫球蛋白可变结构域编码序列被得以重新建立，其中所述的编码序列中不含有步骤(a)以及(b)中所述的IIs 型限制性酶识别位点。在一些实施方式中，上文中所列出的步骤(b)是通过下述的方式来实现的使用寡核苷酸引物对来自于一种非人类的物种的所述可变重链互补决定区域3(CDR H3)序列进行扩增，其中在所述的寡核苷酸引物中含有一个IIs型限制性位点。在一些实施方式中，上文中所列出的步骤(b)是通过下述的方式来实现的使用寡核苷酸引物对来自于一种非人类的物种的所述可变重链互补决定区域3 (CDR H3)序列进行扩增，其中在所述的寡核苷酸引物中含有一个I^ok I IIs型限制性位点。在一些实施方式中，所述的非人类的物种是非人类的灵长动物类，啮齿动物类，犬科动物，猫科动物，羊类，山羊类，牛类，马类，或者猪类。本发明提供了用以制备一种核酸文库的方法，其中每一个核酸能够编码一个免疫球蛋白的可变结构域，所述的方法是通过下述的步骤来实现的(a)提供大量的受体骨架核酸序列，其中所述的核酸序列能够编码截然不同的免疫球蛋白可变结构域，每一个受体骨架核酸序列中含有第一个骨架区域(FRl)，第二个骨架区域(FR2)，第三个骨架区域 (FR3)，以及第四个骨架区域(FR4)，其中所述的骨架区域I(FRl)与骨架区域2(FR2)区域之间被一个互补决定区域I(CDRl)进行了间隔，所述的骨架区域2 (FR2)与骨架区域3(FR3) 区域之间被一个互补决定区域2 (CDR2)进行了间隔，并且所述的骨架结构3 (FR3)以及骨架结构4(FR4)区域之间被一个填充核酸序列进行了间隔，其中所述的填充核酸序列中包括至少两个IIs型限制性酶识别位点，所述的两个限制性酶识别位点之间被一个随机的核酸序列进行了间隔；(b)提供大量的经过多样性处理的核酸序列，其中所述的核酸序列能够编码互补决定区域3(CDR3)区域或者编码氨基酸序列，所述的氨基酸序列能够实现所述的互补决定区域3(CDR3)区域所具备的功能，其中所述的大量的经过多样性处理的核酸序列中的每一个序列在其每一个末端上包括一个IIs型限制性酶识别位点；(c)利用一种IIs 型限制性酶对所述的大量的核酸序列中的每一个或者对所述的氨基酸序列进行消化，其中所述的核酸序列能够编码所述的互补决定区域3 (CDR3)区域，所述的氨基酸序列能够实现所述的互补决定区域3(CDR3)区域所具备的功能，所述的限制性酶能够与步骤(b)中所述的IIs型限制性酶识别位点进行结合，并且利用一种IIs型限制性酶对步骤(a)中所述的来自于所述的受体骨架之中的填充核酸序列进行消化，其中所述的限制性酶能够与步骤 (a)中所述的IIs型限制性酶识别位点进行结合；以及(d)将所述的经过消化的核酸序列或者所述的氨基酸序列连结至步骤(c)中所述的经过消化的受体骨架之中，其中所述的核酸序列能够编码所述的互补决定区域3 (CDR3)区域，所述的氨基酸序列能够实现所述的互补决定区域3(CDR!3)所具备的功能，这样一来可以利用所述的核酸序列或者所述的氨基酸序列对所述的骨架区域3 (FR3)以及骨架区域4(FR4)区域之间进行间隔，其中所述的核酸序列能够编码所述的互补决定区域3 (CDR3)区域，所述的氨基酸序列能够实现一种互补决定区域3(CDR3)区域所具备的功能，并且一个完整的免疫球蛋白可变结构域编码序列被得以重新建立，其中所述的编码序列中不含有步骤(a)以及(b)中所述的IIs型限制性酶识别位点。在一些实施方式中，步骤(a)以及步骤(b)中所述的IIs型限制性酶识别位点可以被相同的IIs型限制性酶进行识别。在一些实施方式中，步骤(a)以及步骤(b)中所述的IIs型限制性酶识别位点可以被不同的IIs型限制性酶进行识别。例如，所述的IIs型限制性酶识别位点是i^okl识别位点，BsaI识别位点，和/或BsmBI识别位点。在一些实施方式中，所述的受体骨架核酸序列是来自于一种人类基因序列的。 例如，所述的人类序列是一种人类重链可变基因序列或者是一种来自于人类重链可变基因序列的序列。在一些实施方式中，所述的人类重链可变基因序列选自重链可变序列 1-2(VHH)，重链可变序列1-69 (VH1-69)，重链可变序列1-18 (VH1-18)，重链可变序列 3-30 (VH3-30)，重链可变序列3-48 (VH3-48)，重链可变序列3_23 (VH3-23)，以及重链可变序列5-51(VH5-51)。在一些实施方式中，所述的人类序列是一种人类κ轻链可变基因序列或者是一种来自于人类κ轻链可变基因序列的序列。例如，所述的人类κ轻链可变基因序列选自κ轻链可变序列1-33 (VK1-33)，κ轻链可变序列1-39 (VK1-39)，κ轻链可变序列3-11 (VK3-11)，κ轻链可变序列3-15 (VK3-15)，以及κ轻链可变序列3-20 (VK3-20)。 在一些实施方式中，所述的人类序列是一种人类λ轻链可变基因序列或者是一种来自于人类λ轻链可变基因序列的序列。例如，所述的人类λ轻链可变基因序列选自λ轻链可变序列l-44(VLl-44)以及λ轻链可变序列1-51(VL1-51)。在一种实施方式中，所述的大量的经过多样性处理的核酸能够编码互补决定区域 3 (CDR3)区域，并且所述的大量的经过多样性处理的核酸包括天然存在的序列以及来自于经过免疫的动物的序列。在一种实施方式中，所述的大量的经过多样性处理的核酸包括下述的序列，或者来自于下述的序列，所述的序列选自天然存在的互补决定区域3 (CDR3)序列，来自于人类的天然存在的免疫球蛋白(Ig)序列，来自于哺乳动物的天然存在的免疫球蛋白(Ig)序列， 来自于存在于哺乳动物中的T细胞受体所具有的环状区域内的天然存在的序列，以及其他的天然存在的大量的具有多样性的多肽。在一种实施方式中，所述的大量的经过多样性处理的核酸能够编码互补决定区域 3(CDR3)区域，并且所述的大量的经过多样性处理的核酸包括这样的免疫球蛋白序列，或者来自于这样的免疫球蛋白序列，其中所述的免疫球蛋白序列是天然存在于人类中的免疫球蛋白序列，所述的人类已经被暴露在一种特定的免疫原之下，或者是来自于动物中的序列， 所述的动物已经被认定为被暴露在一种特定的抗原之下。在一种实施方式中，所述的大量的经过多样性处理的核酸能够编码氨基酸序列， 其中所述的氨基酸序列能够实现一种互补决定区域3 (CDR3)区域所具备的功能，并且所述的大量的经过多样性处理的核酸包括合成性的序列。在另外一种实施方式中，所述的大量的经过多样性处理的核酸能够编码氨基酸序列，其中所述的氨基酸序列能够实现一种互补决定区域3 (CDR3)区域所具备的功能，并且所述的大量的经过多样性处理的核酸包括合成性的序列。在一些实施方式中，所述的大量的受体骨架核酸序列包括至少一种可变重链(VH) 受体骨架核酸序列以及至少一种可变轻链受体骨架核酸序列的混合。在一些实施方式中，在本发明中所提供的所述方法中包括所述另外的步骤(e) 在一个宿主细胞内对步骤(d)中所述的表达载体进行转化并且在足以能够使所述的大量的受体骨架序列进行表达的条件下对所述的宿主细胞进行培养。例如，所述的宿主细胞是大肠杆菌(E. coli)。在一些实施方式中，所述的表达载体是一种噬菌体载体。例如，所述的噬菌体载体是pNDSl。本发明同样提供了用以制备一种核酸文库的方法，其中每一个核酸能够编码一个免疫球蛋白的可变结构域，所述的方法是通过下述的步骤来实现的(a)提供大量的受体骨架核酸序列，其中所述的核酸序列能够编码截然不同的免疫球蛋白可变结构域，每一个受体骨架核酸序列中含有第一个骨架区域(FRl)，第二个骨架区域(FR2)，第三个骨架区域 (FR3)，以及第四个骨架区域(FR4)，其中所述的骨架区域I(FRl)与骨架区域2(FR2)区域之间被一个填充核酸序列进行了间隔，其中所述的填充核酸序列中包括至少两个IIs型限制性酶识别位点，所述的两个限制性酶识别位点之间被一个随机的核酸序列进行了间隔； 所述的骨架区域2(FR2)与骨架区域3(FR3)区域之间被一个互补决定区域2 (CDR2)进行了间隔，并且所述的骨架结构3 (FR3)以及骨架结构4(FR4)区域之间被一个互补决定区域 3(CDR3)进行了间隔；(b)提供大量的经过多样性处理的核酸序列，其中所述的核酸序列能够编码互补决定区域I(CDRl)区域或者编码氨基酸序列，所述的氨基酸序列能够实现所述的互补决定区域I(CDRl)区域所具备的功能，其中所述的大量的经过多样性处理的核酸序列中的每一个序列在其每一个末端上包括一个IIs型限制性酶识别位点；(c)利用一种 IIs型限制性酶对所述的大量的核酸序列中的每一个或者对所述的氨基酸序列进行消化， 其中所述的核酸序列能够编码所述的互补决定区域I(CDRl)区域，所述的氨基酸序列能够实现所述的互补决定区域I(CDRl)区域所具备的功能，所述的限制性酶能够与步骤(b)中所述的IIs型限制性酶识别位点进行结合，并且利用一种IIs型限制性酶对步骤(a)中所述的来自于所述的受体骨架之中的填充核酸序列进行消化，其中所述的限制性酶能够与步骤(a)中所述的IIs型限制性酶识别位点进行结合；以及(d)将所述的经过消化的核酸序列或者所述的氨基酸序列连结至步骤(c)中所述的经过消化的受体骨架之中，其中所述的核酸序列能够编码所述的互补决定区域I(CDRl)区域，所述的氨基酸序列能够实现所述的互补决定区域I(CDRl)所具备的功能，这样一来可以利用所述的核酸序列或者所述的氨基酸序列对所述的骨架区域I(FRl)以及骨架区域2 (FM)区域之间进行间隔，其中所述的核酸序列能够编码所述的互补决定区域I(CDRl)区域，所述的氨基酸序列能够实现一种互补决定区域I(CDRl)区域所具备的功能，并且一个完整的免疫球蛋白可变结构域编码序列被得以重新建立，其中所述的编码序列中不含有步骤(a)以及(b)中所述的IIs型限制性酶识别位点。在一些实施方式中，步骤(a)以及步骤(b)中所述的IIs型限制性酶识别位点可以被相同的IIs型限制性酶进行识别。在一些实施方式中，步骤(a)以及步骤(b)中所述的IIs型限制性酶识别位点可以被不同的IIs型限制性酶进行识别。例如，所述的IIs型限制性酶识别位点是i^okl识别位点，BsaI识别位点，和/或BsmBI识别位点。在一些实施方式中，所述的受体骨架核酸序列是来自于一种人类基因序列的。 例如，所述的人类序列是一种人类重链可变基因序列或者是一种来自于人类重链可变基因序列的序列。在一些实施方式中，所述的人类重链可变基因序列选自重链可变序列 1-2(VHH)，重链可变序列1-69 (VH1-69)，重链可变序列1-18 (VH1-18)，重链可变序列 3-30 (VH3-30)，重链可变序列3-48 (VH3-48)，重链可变序列3_23 (VH3-23)，以及重链可变序列5-51(VH5-51)。在一些实施方式中，所述的人类序列是一种人类κ轻链可变基因序列或者是一种来自于人类κ轻链可变基因序列的序列。例如，所述的人类κ轻链可变基
19因序列选自κ轻链可变序列l-33(VKl-33)，κ轻链可变序列1-39 (VK1-39)，κ轻链可变序列3-11 (VK3-11)，κ轻链可变序列3-15 (VK3-15)，以及κ轻链可变序列3-20 (VK3-20)。 在一些实施方式中，所述的人类序列是一种人类λ轻链可变基因序列或者是一种来自于人类λ轻链可变基因序列的序列。例如，所述的人类λ轻链可变基因序列选自λ轻链可变序列l-44(VLl-44)以及λ轻链可变序列1-51(VL1-51)。在一种实施方式中，所述的大量的经过多样性处理的核酸能够编码互补决定区域 1 (CDRl)区域，并且所述的大量的经过多样性处理的核酸包括天然存在的序列以及来自于经过免疫的动物的序列。在一种实施方式中，所述的大量的经过多样性处理的核酸包括下述的序列，或者来自于下述的序列，所述的序列选自天然存在的互补决定区域I(CDRl)序列，来自于人类的天然存在的免疫球蛋白(Ig)序列，来自于哺乳动物的天然存在的免疫球蛋白(Ig)序列， 来自于存在于哺乳动物中的T细胞受体所具有的环状区域内的天然存在的序列，以及其他的天然存在的大量的具有多样性的多肽。在一种实施方式中，所述的大量的经过多样性处理的核酸能够编码互补决定区域 1 (CDRl)区域，并且所述的大量的经过多样性处理的核酸包括这样的免疫球蛋白序列，或者来自于这样的免疫球蛋白序列，其中所述的免疫球蛋白序列是天然存在于人类中的免疫球蛋白序列，所述的人类已经被暴露在一种特定的免疫原之下，或者是来自于动物中的序列， 所述的动物已经被认定为被暴露在一种特定的抗原之下。在一种实施方式中，所述的大量的经过多样性处理的核酸能够编码氨基酸序列， 其中所述的氨基酸序列能够实现一种互补决定区域I(CDRl)区域所具备的功能，并且所述的大量的经过多样性处理的核酸包括合成性的序列。在另外一种实施方式中，所述的大量的经过多样性处理的核酸能够编码氨基酸序列，其中所述的氨基酸序列能够实现一种互补决定区域I(CDRl)区域所具备的功能，并且所述的大量的经过多样性处理的核酸包括合成性的序列。在一些实施方式中，所述的大量的受体骨架核酸序列包括至少一种可变重链(VH) 受体骨架核酸序列以及至少一种可变轻链受体骨架核酸序列的混合。在一些实施方式中，在本发明中所提供的所述方法中包括所述另外的步骤(e) 将步骤(d)中所述的核酸文库克隆至一种表达载体之中，其中所述的核酸能够编码免疫球蛋白的可变结构域，以及(f)在一个宿主细胞内对步骤(e)中所述的表达载体进行转化并且在足以能够使所述的大量的免疫球蛋白可变结构域进行表达的条件下对所述的宿主细胞进行培养，其中所述的免疫球蛋白可变结构域是由所述的文库来进行编码的。例如，所述的宿主细胞是大肠杆菌(E. coli)。在一些实施方式中，所述的表达载体是一种噬菌体载体。 例如，所述的噬菌体载体是PNDSl。本发明同样提供了用以制备一种核酸文库的方法，其中每一个核酸能够编码一个免疫球蛋白的可变结构域，所述的方法是通过下述的步骤来实现的(a)提供大量的受体骨架核酸序列，其中所述的核酸序列能够编码截然不同的免疫球蛋白可变结构域，每一个受体骨架核酸序列中含有第一个骨架区域(FRl)，第二个骨架区域(FR2)，第三个骨架区域 (FR3)，以及第四个骨架区域(FR4)，其中所述的骨架区域I(FRl)与骨架区域2(FR2)区域之间被一个互补决定区域I(CDRl)区域进行了间隔；所述的骨架区域2(FR2)与骨架区域3(FR3)区域之间被一个填充核酸序列进行了间隔，其中所述的填充核酸序列中包括至少两个IIs型限制性酶识别位点，所述的两个限制性酶识别位点之间被一个随机的核酸序列进行了间隔；并且所述的骨架结构3 (FR3)以及骨架结构4(FR4)区域之间被一个互补决定区域3(CDR!3)进行了间隔；(b)提供大量的经过多样性处理的核酸序列，其中所述的核酸序列能够编码互补决定区域2 (CDM)区域或者编码氨基酸序列，所述的氨基酸序列能够实现所述的互补决定区域2(CDR2)区域所具备的功能，其中所述的大量的经过多样性处理的核酸序列中的每一个序列在其每一个末端上包括一个IIs型限制性酶识别位点；(c)利用一种 IIs型限制性酶对所述的大量的核酸序列中的每一个或者对所述的氨基酸序列进行消化， 其中所述的核酸序列能够编码所述的互补决定区域2 (CDR2)区域，所述的氨基酸序列能够实现所述的互补决定区域2 (CDR2)区域所具备的功能，所述的限制性酶能够与步骤(b)中所述的IIs型限制性酶识别位点进行结合，并且利用一种IIs型限制性酶对步骤(a)中所述的来自于所述的受体骨架之中的填充核酸序列进行消化，其中所述的限制性酶能够与步骤(a)中所述的IIs型限制性酶识别位点进行结合；以及(d)将所述的经过消化的核酸序列或者所述的氨基酸序列连结至步骤(c)中所述的经过消化的受体骨架之中，其中所述的核酸序列能够编码所述的互补决定区域2 (CDR2)区域，所述的氨基酸序列能够实现所述的互补决定区域2 (CDM)所具备的功能，这样一来可以利用所述的核酸序列或者所述的氨基酸序列对所述的骨架区域2 (FR2)以及骨架区域3(FR!3)区域之间进行间隔，其中所述的核酸序列能够编码所述的互补决定区域2 (CDR2)区域，所述的氨基酸序列能够实现一种互补决定区域2(CDR2)区域所具备的功能，并且一个完整的免疫球蛋白可变结构域编码序列被得以重新建立，其中所述的编码序列中不含有步骤(a)以及(b)中所述的IIs型限制性酶识别位点。在一些实施方式中，步骤(a)以及步骤(b)中所述的IIs型限制性酶识别位点可以被相同的IIs型限制性酶进行识别。在一些实施方式中，步骤(a)以及步骤(b)中所述的IIs型限制性酶识别位点可以被不同的IIs型限制性酶进行识别。例如，所述的IIs型限制性酶识别位点是i^okl识别位点，BsaI识别位点，和/或BsmBI识别位点。在一些实施方式中，所述的受体骨架核酸序列是来自于一种人类基因序列的。 例如，所述的人类序列是一种人类重链可变基因序列或者是一种来自于人类重链可变基因序列的序列。在一些实施方式中，所述的人类重链可变基因序列选自重链可变序列 1-2(VHH)，重链可变序列1-69 (VH1-69)，重链可变序列1-18 (VH1-18)，重链可变序列 3-30 (VH3-30)，重链可变序列3-48 (VH3-48)，重链可变序列3_23 (VH3-23)，以及重链可变序列5-51(VH5-51)。在一些实施方式中，所述的人类序列是一种人类κ轻链可变基因序列或者是一种来自于人类κ轻链可变基因序列的序列。例如，所述的人类κ轻链可变基因序列选自κ轻链可变序列1-33 (VK1-33)，κ轻链可变序列1-39 (VK1-39)，κ轻链可变序列3-11 (VK3-11)，κ轻链可变序列3-15 (VK3-15)，以及κ轻链可变序列3-20 (VK3-20)。 在一些实施方式中，所述的人类序列是一种人类λ轻链可变基因序列或者是一种来自于人类λ轻链可变基因序列的序列。例如，所述的人类λ轻链可变基因序列选自λ轻链可变序列l-44(VLl-44)以及λ轻链可变序列1-51(VL1-51)。在一种实施方式中，所述的大量的经过多样性处理的核酸能够编码互补决定区域 2 (CDR2)区域，并且所述的大量的经过多样性处理的核酸包括天然存在的序列以及来自于
21经过免疫的动物的序列。在一种实施方式中，所述的大量的经过多样性处理的核酸包括下述的序列，或者来自于下述的序列，所述的序列选自天然存在的互补决定区域2 (CDR2)序列，来自于人类的天然存在的免疫球蛋白(Ig)序列，来自于哺乳动物的天然存在的免疫球蛋白(Ig)序列， 来自于存在于哺乳动物中的T细胞受体所具有的环状区域内的天然存在的序列，以及其他的天然存在的大量的具有多样性的多肽。在一种实施方式中，所述的大量的经过多样性处理的核酸能够编码互补决定区域 2(CDR2)区域，并且所述的大量的经过多样性处理的核酸包括这样的免疫球蛋白序列，或者来自于这样的免疫球蛋白序列，其中所述的免疫球蛋白序列是天然存在于人类中的免疫球蛋白序列，所述的人类已经被暴露在一种特定的免疫原之下，或者是来自于动物中的序列， 所述的动物已经被认定为被暴露在一种特定的抗原之下。在另外一种实施方式中，所述的大量的经过多样性处理的核酸能够编码氨基酸序列，其中所述的氨基酸序列能够实现一种互补决定区域2 (CDR2)区域所具备的功能，并且所述的大量的经过多样性处理的核酸包括合成性的序列。在一些实施方式中，所述的大量的受体骨架核酸序列包括至少一种可变重链(VH) 受体骨架核酸序列以及至少一种可变轻链受体骨架核酸序列的混合。在一些实施方式中，在本发明中所提供的所述方法中包括所述另外的步骤(e) 将步骤(d)中所述的核酸文库克隆至一种表达载体之中，其中所述的核酸能够编码免疫球蛋白的可变结构域，以及(f)在一个宿主细胞内对步骤(e)中所述的表达载体进行转化并且在足以能够使所述的大量的免疫球蛋白可变结构域进行表达的条件下对所述的宿主细胞进行培养，其中所述的免疫球蛋白可变结构域是由所述的文库来进行编码的。例如，所述的宿主细胞是大肠杆菌(E. coli)。在一些实施方式中，所述的表达载体是一种噬菌体载体。 例如，所述的噬菌体载体是PNDSl。本发明同样提供了用以制备一种靶向特异性抗体、所述抗体的抗体可变区域或者所述抗体的一部分的方法，所述的方法是通过下述的步骤来实现的(a)提供大量的受体骨架核酸序列，其中所述的核酸序列能够编码截然不同的免疫球蛋白可变结构域，每一个受体骨架核酸序列中含有第一个骨架区域(FRl)，第二个骨架区域(FR2)，第三个骨架区域(FR3)，以及第四个骨架区域(FR4)，其中所述的骨架区域I(FRl)与骨架区域2(FR2)区域之间被一个互补决定区域I(CDRl)区域进行了间隔；所述的骨架区域2 (FR2)与骨架区域3(FR3)区域之间被一个互补决定区域2 (CDR2)区域进行了间隔；并且所述的骨架结构 3(FR3)以及骨架结构4(FR4)区域之间被一个填充核酸序列进行了间隔，其中所述的填充核酸序列中包括至少两个IIs型限制性酶识别位点，所述的两个限制性酶识别位点之间被一个随机的核酸序列进行了间隔；(b)提供大量的经过多样性处理的核酸序列，其中所述的核酸序列能够编码互补决定区域3 (CDR!3)区域或者编码氨基酸序列，所述的氨基酸序列能够实现所述的互补决定区域3 (CDR3)区域所具备的功能，其中所述的大量的经过多样性处理的核酸序列中的每一个序列在其每一个末端上包括一个IIs型限制性酶识别位点； (c)利用一种IIs型限制性酶对所述的大量的核酸序列中的每一个或者对所述的氨基酸序列进行消化，其中所述的核酸序列能够编码所述的互补决定区域3 (CDR!3)区域，所述的氨基酸序列能够实现所述的互补决定区域3 (CDR3)区域所具备的功能，所述的限制性酶能够与步骤(b)中所述的IIs型限制性酶识别位点进行结合，并且利用一种IIs型限制性酶对步骤(a)中所述的来自于所述的受体骨架之中的填充核酸序列进行消化，其中所述的限制性酶能够与步骤(a)中所述的IIs型限制性酶识别位点进行结合；(d)将所述的经过消化的核酸序列或者所述的氨基酸序列克隆至一种表达载体之中，其中所述的核酸序列能够编码所述的互补决定区域3 (CDR3)区域，所述的氨基酸序列能够实现所述的互补决定区域 3(CDR3)区域所具备的功能，并且将步骤(c)中所述的经过消化的核酸序列或者所述的氨基酸序列连结至所述的受体骨架之中，其中所述的核酸序列能够编码所述的互补决定区域 3(CDR3)区域，所述的氨基酸序列能够实现所述的互补决定区域3 (CDR!3)所具备的功能， 这样一来可以利用所述的核酸序列或者所述的氨基酸序列对所述的骨架区域3 (FR3)以及骨架区域4(FR4)区域之间进行间隔，其中所述的核酸序列能够编码所述的互补决定区域 3(CDR3)区域，所述的氨基酸序列能够实现一种互补决定区域3 (CDR3)区域所具备的功能， 并且一个完整的免疫球蛋白可变基因编码序列被得以重新建立；(e)在一个宿主细胞内对步骤(d)中所述的表达载体进行转化并且在足以能够使所述的大量的受体骨架序列进行表达的条件下对所述的宿主细胞进行培养；(f)利用一种靶向抗原与所述的宿主细胞进行接触；以及(g)确定哪些被表达的受体骨架序列能够与所述的靶向抗原进行结合。在一些实施方式中，步骤(a)以及步骤(b)中所述的IIs型限制性酶识别位点可以被相同的IIs型限制性酶进行识别。在一些实施方式中，步骤(a)以及步骤(b)中所述的IIs型限制性酶识别位点可以被不同的IIs型限制性酶进行识别。例如，所述的IIs型限制性酶识别位点是i^okl识别位点，BsaI识别位点，和/或BsmBI识别位点。在一些实施方式中，所述的受体骨架核酸序列是来自于一种人类基因序列的。 例如，所述的人类序列是一种人类重链可变基因序列或者是一种来自于人类重链可变基因序列的序列。在一些实施方式中，所述的人类重链可变基因序列选自重链可变序列 1-2(VHH)，重链可变序列1-69 (VH1-69)，重链可变序列1-18 (VH1-18)，重链可变序列 3-30 (VH3-30)，重链可变序列3-48 (VH3-48)，重链可变序列3_23 (VH3-23)，以及重链可变序列5-51(VH5-51)。在一些实施方式中，所述的人类序列是一种人类κ轻链可变基因序列或者是一种来自于人类κ轻链可变基因序列的序列。例如，所述的人类κ轻链可变基因序列选自κ轻链可变序列l-33(VKl-33)，κ轻链可变序列1-39 (VK1-39)，κ轻链可变序列3-11 (VK3-11)，κ轻链可变序列3-15 (VK3-15)，以及κ轻链可变序列3-20 (VK3-20)。 在一些实施方式中，所述的人类序列是一种人类λ轻链可变基因序列或者是一种来自于人类λ轻链可变基因序列的序列。例如，所述的人类λ轻链可变基因序列选自λ轻链可变序列l-44(VLl-44)以及λ轻链可变序列1-51(VL1-51)。在一种实施方式中，所述的大量的经过多样性处理的核酸能够编码互补决定区域 3 (CDR3)区域，并且所述的大量的经过多样性处理的核酸包括天然存在的序列以及来自于经过免疫的动物的序列。在一种实施方式中，所述的大量的经过多样性处理的核酸包括下述的序列，或者来自于下述的序列，所述的序列选自天然存在的互补决定区域3 (CDR3)序列，来自于人类的天然存在的免疫球蛋白(Ig)序列，来自于哺乳动物的天然存在的免疫球蛋白(Ig)序列， 来自于存在于哺乳动物中的T细胞受体所具有的环状区域内的天然存在的序列，以及其他的天然存在的大量的具有多样性的多肽。
在一种实施方式中，所述的大量的经过多样性处理的核酸能够编码互补决定区域 3(CDR3)区域，并且所述的大量的经过多样性处理的核酸包括这样的免疫球蛋白序列，或者来自于这样的免疫球蛋白序列，其中所述的免疫球蛋白序列是天然存在于人类中的免疫球蛋白序列，所述的人类已经被暴露在一种特定的免疫原之下，或者是来自于动物中的序列， 所述的动物已经被认定为被暴露在一种特定的抗原之下。在另外一种实施方式中，所述的大量的经过多样性处理的核酸能够编码氨基酸序列，其中所述的氨基酸序列能够实现一种互补决定区域3 (CDR3)区域所具备的功能，并且所述的大量的经过多样性处理的核酸包括合成性的序列。在一些实施方式中，所述的大量的受体骨架核酸序列包括至少一种可变重链(VH) 受体骨架核酸序列以及至少一种可变轻链受体骨架核酸序列的混合。在一些实施方式中，所述的表达载体是一种噬菌体载体。例如，所述的噬菌体载体是pNDSl。在一些实施方式中，所述的宿主细胞是大肠杆菌(E.coli)。在一些实施方式中，所述的方法包括下述的另外的步骤(i)对所述的免疫球蛋白可变结构域的编码序列进行测序，其中所述的编码序列能够与所述的靶向抗原进行结
I=I O本发明同样提供了用以制备一种靶向特异性抗体、所述抗体的抗体可变区域或者所述抗体的一部分的方法，所述的方法是通过下述的步骤来实现的(a)提供大量的受体骨架核酸序列，其中所述的核酸序列能够编码截然不同的免疫球蛋白可变结构域，每一个受体骨架核酸序列中含有第一个骨架区域(FRl)，第二个骨架区域(FR2)，第三个骨架区域 (FR3)，以及第四个骨架区域(FR4)，其中所述的骨架区域I(FRl)与骨架区域2(FR2)区域之间被一个填充核酸序列进行了间隔，其中所述的填充核酸序列中包括至少两个IIs型限制性酶识别位点，所述的两个限制性酶识别位点之间被一个随机的核酸序列进行了间隔； 所述的骨架区域2(FR2)与骨架区域3(FR3)区域之间被一个互补决定区域2 (CDR2)区域进行了间隔；并且所述的骨架结构3 (FR3)以及骨架结构4(FR4)区域之间被一个互补决定区域3(CDR!3)进行了间隔；(b)提供大量的经过多样性处理的核酸序列，其中所述的核酸序列能够编码互补决定区域I(CDRl)区域或者编码氨基酸序列，所述的氨基酸序列能够实现所述的互补决定区域I(CDRl)区域所具备的功能，其中所述的大量的经过多样性处理的核酸序列中的每一个序列在其每一个末端上包括一个IIs型限制性酶识别位点；(c)利用一种 IIs型限制性酶对所述的大量的核酸序列中的每一个或者对所述的氨基酸序列进行消化， 其中所述的核酸序列能够编码所述的互补决定区域I(CDRl)区域，所述的氨基酸序列能够实现所述的互补决定区域I(CDRl)区域所具备的功能，所述的限制性酶能够与步骤(b)中所述的IIs型限制性酶识别位点进行结合，并且利用一种IIs型限制性酶对步骤(a)中所述的来自于所述的受体骨架之中的填充核酸序列进行消化，其中所述的限制性酶能够与步骤(a)中所述的IIs型限制性酶识别位点进行结合；(d)将所述的经过消化的核酸序列或者所述的氨基酸序列克隆至一种表达载体之中，其中所述的核酸序列能够编码所述的互补决定区域I(CDRl)区域，所述的氨基酸序列能够实现所述的互补决定区域I(CDRl)区域所具备的功能，并且将步骤(c)中所述的经过消化的核酸序列或者所述的氨基酸序列连结至所述的受体骨架之中，其中所述的核酸序列能够编码所述的互补决定区域I(CDRl)区域， 所述的氨基酸序列能够实现所述的互补决定区域I(CDRl)所具备的功能，这样一来可以利
24用所述的核酸序列或者所述的氨基酸序列对所述的骨架区域1 (FRl)以及骨架区域2 (FR2) 区域之间进行间隔，其中所述的核酸序列能够编码所述的互补决定区域I(CDRl)区域，所述的氨基酸序列能够实现一种互补决定区域I(CDRl)区域所具备的功能，并且一个完整的免疫球蛋白可变基因编码序列被得以重新建立；(e)在一个宿主细胞内对步骤(d)中所述的表达载体进行转化并且在足以能够使所述的大量的受体骨架序列进行表达的条件下对所述的宿主细胞进行培养；(f)利用一种靶向抗原与所述的宿主细胞进行接触；以及(g)确定哪些被表达的受体骨架序列能够与所述的靶向抗原进行结合。在一些实施方式中，步骤(a)以及步骤(b)中所述的IIs型限制性酶识别位点可以被相同的IIs型限制性酶进行识别。在一些实施方式中，步骤(a)以及步骤(b)中所述的IIs型限制性酶识别位点可以被不同的IIs型限制性酶进行识别。例如，所述的IIs型限制性酶识别位点是i^okl识别位点，BsaI识别位点，和/或BsmBI识别位点。在一些实施方式中，所述的受体骨架核酸序列是来自于一种人类基因序列的。 例如，所述的人类序列是一种人类重链可变基因序列或者是一种来自于人类重链可变基因序列的序列。在一些实施方式中，所述的人类重链可变基因序列选自重链可变序列 1-2(VHH)，重链可变序列1-69 (VH1-69)，重链可变序列1-18 (VH1-18)，重链可变序列 3-30 (VH3-30)，重链可变序列3-48 (VH3-48)，重链可变序列3_23 (VH3-23)，以及重链可变序列5-51(VH5-51)。在一些实施方式中，所述的人类序列是一种人类κ轻链可变基因序列或者是一种来自于人类κ轻链可变基因序列的序列。例如，所述的人类κ轻链可变基因序列选自κ轻链可变序列l-33(VKl-33)，κ轻链可变序列1-39 (VK1-39)，κ轻链可变序列3-11 (VK3-11)，κ轻链可变序列3-15 (VK3-15)，以及κ轻链可变序列3-20 (VK3-20)。 在一些实施方式中，所述的人类序列是一种人类λ轻链可变基因序列或者是一种来自于人类λ轻链可变基因序列的序列。例如，所述的人类λ轻链可变基因序列选自λ轻链可变序列l-44(VLl-44)以及λ轻链可变序列1-51(VL1-51)。在一种实施方式中，所述的大量的经过多样性处理的核酸能够编码互补决定区域 1 (CDRl)区域，并且所述的大量的经过多样性处理的核酸包括天然存在的序列以及来自于经过免疫的动物的序列。在一种实施方式中，所述的大量的经过多样性处理的核酸包括下述的序列，或者来自于下述的序列，所述的序列选自天然存在的互补决定区域I(CDRl)序列，来自于人类的天然存在的免疫球蛋白(Ig)序列，来自于哺乳动物的天然存在的免疫球蛋白(Ig)序列， 来自于存在于哺乳动物中的T细胞受体所具有的环状区域内的天然存在的序列，以及其他的天然存在的大量的具有多样性的多肽。在一种实施方式中，所述的大量的经过多样性处理的核酸能够编码互补决定区域 1 (CDRl)区域，并且所述的大量的经过多样性处理的核酸包括这样的免疫球蛋白序列，或者来自于这样的免疫球蛋白序列，其中所述的免疫球蛋白序列是天然存在于人类中的免疫球蛋白序列，所述的人类已经被暴露在一种特定的免疫原之下，或者是来自于动物中的序列， 所述的动物已经被认定为被暴露在一种特定的抗原之下。在另外一种实施方式中，所述的大量的经过多样性处理的核酸能够编码氨基酸序列，其中所述的氨基酸序列能够实现一种互补决定区域I(CDRl)区域所具备的功能，并且所述的大量的经过多样性处理的核酸包括合成性的序列。
在一些实施方式中，所述的大量的受体骨架核酸序列包括至少一种可变重链(VH) 受体骨架核酸序列以及至少一种可变轻链受体骨架核酸序列的混合。在一些实施方式中，所述的表达载体是一种噬菌体载体。例如，所述的噬菌体载体是pNDSl。在一些实施方式中，所述的宿主细胞是大肠杆菌(E.coli)。在一些实施方式中，所述的方法包括下述的另外的步骤(i)对所述的免疫球蛋白可变结构域的编码序列进行测序，其中所述的编码序列能够与所述的靶向抗原进行结
I=I O本发明提供了用以制备一种靶向特异性抗体、所述抗体的抗体可变区域或者所述抗体的一部分的方法，所述的方法是通过下述的步骤来实现的(a)提供大量的受体骨架核酸序列，其中所述的核酸序列能够编码截然不同的免疫球蛋白可变结构域，每一个受体骨架核酸序列中含有第一个骨架区域(FRl)，第二个骨架区域(FR2)，第三个骨架区域 (FR3)，以及第四个骨架区域(FR4)，其中所述的骨架区域1 (FRl)与骨架区域2 (FR2)区域之间被互补决定区域I(CDRl)区域进行了间隔；所述的骨架区域2 (FR2)与骨架区域3(FR3) 区域之间被一个填充核酸序列进行了间隔，其中所述的填充核酸序列中包括至少两个IIs 型限制性酶识别位点，所述的两个限制性酶识别位点之间被一个随机的核酸序列进行了间隔；并且所述的骨架结构3(FR3)以及骨架结构4(FR4)区域之间被一个互补决定区域 3(CDR3)进行了间隔(b)提供大量的经过多样性处理的核酸序列，其中所述的核酸序列能够编码互补决定区域2 (CDR2)区域或者编码氨基酸序列，所述的氨基酸序列能够实现所述的互补决定区域2(CDR2)区域所具备的功能，其中所述的大量的经过多样性处理的核酸序列中的每一个序列在其每一个末端上包括一个IIs型限制性酶识别位点；(c)利用一种 IIs型限制性酶对所述的大量的核酸序列中的每一个或者对所述的氨基酸序列进行消化， 其中所述的核酸序列能够编码所述的互补决定区域2 (CDR2)区域，所述的氨基酸序列能够实现所述的互补决定区域2 (CDR2)区域所具备的功能，所述的限制性酶能够与步骤(b)中所述的IIs型限制性酶识别位点进行结合，并且利用一种IIs型限制性酶对步骤(a)中所述的来自于所述的受体骨架之中的填充核酸序列进行消化，其中所述的限制性酶能够与步骤(a)中所述的IIs型限制性酶识别位点进行结合；(d)将步骤(c)中所述的经过消化的核酸序列或者所述的氨基酸序列连结至步骤(c)中所述的经过消化的受体骨架之中，其中所述的核酸序列能够编码所述的互补决定区域2 (CDR2)区域，所述的氨基酸序列能够实现所述的互补决定区域2(CDR2)区域所具备的功能，这样一来可以利用所述的核酸序列或者所述的氨基酸序列对所述的骨架区域2 (FR2)以及骨架区域3(FR3)区域之间进行间隔，其中所述的核酸序列能够编码所述的互补决定区域2 (CDM)区域，所述的氨基酸序列能够实现一种互补决定区域2 (CDR2)区域所具备的功能，并且一个完整的免疫球蛋白可变基因编码序列被得以重新建立，其中所述的编码序列中不含有步骤(a)以及(b)中所述的IIs型限制性酶识别位点；(e)将步骤(d)中所述的核酸文库克隆至一种表达载体之中，其中所述的核酸序列能够编码免疫球蛋白的可变结构域；(f)在一个宿主细胞内对步骤(d)中所述的表达载体进行转化并且在足以能够使所述的免疫球蛋白可变结构域进行表达的条件下对所述的宿主细胞进行培养，其中所述的免疫球蛋白可变结构域是由所述的文库来进行编码的；(g)利用一种靶向抗原与步骤(f)中所述的大量的免疫球蛋白可变结构域进行接触； 以及(h)确定哪些被表达的免疫球蛋白可变结构域编码序列能够与所述的靶向抗原进行
在一些实施方式中，步骤(a)以及步骤(b)中所述的IIs型限制性酶识别位点可以被相同的IIs型限制性酶进行识别。在一些实施方式中，步骤(a)以及步骤(b)中所述的IIs型限制性酶识别位点可以被不同的IIs型限制性酶进行识别。例如，所述的IIs型限制性酶识别位点是i^okl识别位点，BsaI识别位点，和/或BsmBI识别位点。在一些实施方式中，所述的受体骨架核酸序列是来自于一种人类基因序列的。 例如，所述的人类序列是一种人类重链可变基因序列或者是一种来自于人类重链可变基因序列的序列。在一些实施方式中，所述的人类重链可变基因序列选自重链可变序列 1-2(VHH)，重链可变序列1-69 (VH1-69)，重链可变序列1-18 (VH1-18)，重链可变序列 3-30 (VH3-30)，重链可变序列3-48 (VH3-48)，重链可变序列3_23 (VH3-23)，以及重链可变序列5-51(VH5-51)。在一些实施方式中，所述的人类序列是一种人类κ轻链可变基因序列或者是一种来自于人类κ轻链可变基因序列的序列。例如，所述的人类κ轻链可变基因序列选自κ轻链可变序列1-33 (VK1-33)，κ轻链可变序列1-39 (VK1-39)，κ轻链可变序列3-11 (VK3-11)，κ轻链可变序列3-15 (VK3-15)，以及κ轻链可变序列3-20 (VK3-20)。 在一些实施方式中，所述的人类序列是一种人类λ轻链可变基因序列或者是一种来自于人类λ轻链可变基因序列的序列。例如，所述的人类λ轻链可变基因序列选自λ轻链可变序列l-44(VLl-44)以及λ轻链可变序列1-51(VL1-51)。在一种实施方式中，所述的大量的经过多样性处理的核酸能够编码互补决定区域 2 (CDR2)区域，并且所述的大量的经过多样性处理的核酸包括天然存在的序列以及来自于经过免疫的动物的序列。在一种实施方式中，所述的大量的经过多样性处理的核酸包括下述的序列，或者来自于下述的序列，所述的序列选自天然存在的互补决定区域2 (CDR2)序列，来自于人类的天然存在的免疫球蛋白(Ig)序列，来自于哺乳动物的天然存在的免疫球蛋白(Ig)序列， 来自于存在于哺乳动物中的T细胞受体所具有的环状区域内的天然存在的序列，以及其他的天然存在的大量的具有多样性的多肽。在一种实施方式中，所述的大量的经过多样性处理的核酸能够编码互补决定区域 2(CDR2)区域，并且所述的大量的经过多样性处理的核酸包括这样的免疫球蛋白序列，或者来自于这样的免疫球蛋白序列，其中所述的免疫球蛋白序列是天然存在于人类中的免疫球蛋白序列，所述的人类已经被暴露在一种特定的免疫原之下，或者是来自于动物中的序列， 所述的动物已经被认定为被暴露在一种特定的抗原之下。在一种实施方式中，所述的大量的经过多样性处理的核酸能够编码氨基酸序列， 其中所述的氨基酸序列能够实现一种互补决定区域2 (CDR2)区域所具备的功能，并且所述的大量的经过多样性处理的核酸包括合成性的序列。在另外一种实施方式中，所述的大量的经过多样性处理的核酸能够编码氨基酸序列，其中所述的氨基酸序列能够实现一种互补决定区域2 (CDR2)区域所具备的功能，并且所述的大量的经过多样性处理的核酸包括合成性的序列。在一些实施方式中，所述的大量的受体骨架核酸序列包括至少一种可变重链(VH) 受体骨架核酸序列以及至少一种可变轻链受体骨架核酸序列的混合。在一些实施方式中，所述的宿主细胞是大肠杆菌(E. coli) 0在一些实施方式中，所述的表达载体是一种噬菌体载体。例如，所述的噬菌体载体是PNDS1。在一些实施方式中，所述的方法包括下述的另外的步骤(i)对所述的免疫球蛋白可变结构域的编码序列进行测序，其中所述的编码序列能够与所述的靶向抗原进行结
I=I O本发明同样提供了用以制备一种核酸文库的方法，其中每一个核酸能够编码一个免疫球蛋白的可变结构域。这样的方法包括下述的步骤(a)提供大量的免疫球蛋白(Ig) 受体骨架核酸序列，在所述的核酸序列中导入一种多样性来源，其中所述的导入是在单一的互补决定区域(CDR)内进行的，所述的互补决定区域(CDR)选自由下述的互补决定区域 (OTR)所组成的组中互补决定区域1(⑶Rl)，互补决定区域2 (⑶R2)，以及互补决定区域 3(CDR3)，其中所述的免疫球蛋白(Ig)受体骨架序列包括一个填充核酸序列，所述的填充核酸序列中包括至少两个IIs型限制性酶识别位点，并且其中所述的多样性来源是一种互补决定区域(CDR)，所述的互补决定区域(CDR)选自含有IIs型限制性酶识别位点的天然存在的互补决定区域(CDR)序列，其中所述的限制性酶识别位点存在于所述的互补决定区域(CDR)区域之外，(b)向每一个免疫球蛋白(Ig)受体骨架之内导入所述的多样性来源， 其中所述的导入是通过利用一种IIs型限制性酶对所述的多样性来源以及所述的免疫球蛋白(Ig)受体骨架同时进行消化的方式来实现的；以及(c)将所述的经过消化的多样性来源连结至所述的免疫球蛋白(Ig)受体骨架之中，这样一来一个完整的免疫球蛋白可变结构域编码序列被得以重新建立，其中所述的编码序列中不含有步骤(a)以及(b)中所述的 IIs型限制性酶识别位点。所述的天然存在的互补决定区域(CDR)区域序列相对于它们的野生型而言在本质上是未发生改变的，即，天然状态。这些天然存在的互补决定区域(CDR)区域序列存在于氨基酸序列的侧翼，其中所述的氨基酸序列已经被进行了工程化处理(或者被进行了人工处理)，从而含有两个IIs型限制性酶识别位点，其中在所述的天然存在的互补决定区域 (CDR)区域序列的每一侧上存在一个IIs型限制性酶识别位点。所述的IIS型限制性酶识别位点存在于所述的互补决定区域(CDR)编码区域之外。在所述的互补决定区域(CDR)编码区域的边缘处上的所述的互补决定区域(CDR)区域序列没有发生改变——所述的限制性酶能够在到达所述的互补决定区域(CDR)编码区域的边缘的区域上进行识别以及接合，但是不能够在所述的互补决定区域(CDR)编码区域之内进行接合。在一些实施方式中，所述的IIs型限制性酶识别位点可以被相同的IIs型限制性酶进行识别，其中所述的限制性酶识别位点是存在于所述的填充核酸序列之内并且存在于所述的天然存在的互补决定区域(CDR)序列的侧翼上的。在一些实施方式中，所述的IIs型限制性酶识别位点可以被不同的IIs型限制性酶进行识别，其中所述的限制性酶识别位点是存在于所述的填充核酸序列之内并且存在于所述的天然存在的互补决定区域(CDR)序列的侧翼上的。例如，所述的IIs型限制性酶识别位点是R)kl识别位点，BsaI识别位点， 和/或BsmBI识别位点。在一些实施方式中，所述的免疫球蛋白(Ig)受体骨架核酸序列是来自于一种人类基因序列的。例如，所述的人类序列是一种人类重链可变基因序列或者是一种来自于人类重链可变基因序列的序列。在一些实施方式中，所述的人类重链可变基因序列选自重链可变序列1-2 (VH1-2)，重链可变序列1-69 (VH1-69)，重链可变序列1_18 (VH1-18)，重链CN 可变序列3-30 (VH3-30)，重链可变序列3-48 (VH3-48)，重链可变序列3_23 (VH3-23)，以及重链可变序列5-51 (VH5-51)。在一些实施方式中，所述的人类序列是一种人类κ轻链可变基因序列或者是一种来自于人类κ轻链可变基因序列的序列。例如，所述的人类κ轻链可变基因序列选自κ轻链可变序列1-33 (VK1-33)，κ轻链可变序列1-39 (VK1-39)， κ轻链可变序列3-11 (VK3-11)，κ轻链可变序列3-15(VK3-15)，以及κ轻链可变序列 3-20 (VK3-20)。在一些实施方式中，所述的人类序列是一种人类λ轻链可变基因序列或者是一种来自于人类λ轻链可变基因序列的序列。例如，所述的人类λ轻链可变基因序列选自λ轻链可变序列l-44(VLl-44)以及λ轻链可变序列1-51(VL1-51)。在一些实施方式中，所述的大量的天然存在的核酸包括下述的序列，或者来自于下述的序列，所述的序列选自天然存在的互补决定区域3(CDR!3)序列，来自于人类的天然存在的免疫球蛋白(Ig)序列，来自于哺乳动物的天然存在的免疫球蛋白(Ig)序列，来自于存在于哺乳动物中的T细胞受体所具有的环状区域内的天然存在的序列，以及其他的天然存在的大量的具有多样性的多肽。在一些实施方式中，所述的大量的天然存在的核酸能够编码互补决定区域 3(CDR3)区域，并且所述的大量的天然存在的核酸包括这样的免疫球蛋白序列，其中所述的免疫球蛋白序列是天然存在于人类中的免疫球蛋白序列，所述的人类已经被暴露在一种特定的免疫原之下，或者是来自于动物中的序列，所述的动物已经被认定为被暴露在一种特定的抗原之下。在一些实施方式中，所述的大量的天然存在的核酸包括下述的序列，或者来自于下述的序列，所述的序列选自天然存在的互补决定区域I(CDRl)序列，来自于人类的天然存在的免疫球蛋白(Ig)序列，来自于哺乳动物的天然存在的免疫球蛋白(Ig)序列，来自于存在于哺乳动物中的T细胞受体所具有的环状区域内的天然存在的序列，以及其他的天然存在的大量的具有多样性的多肽。在一些实施方式中，所述的大量的天然存在的核酸能够编码互补决定区域 1 (CDRl)区域，并且所述的大量的天然存在的核酸包括这样的免疫球蛋白序列，或者来自于这样的免疫球蛋白序列，其中所述的免疫球蛋白序列是天然存在于人类中的免疫球蛋白序列，所述的人类已经被暴露在一种特定的免疫原之下，或者是来自于动物中的序列，所述的动物已经被认定为被暴露在一种特定的抗原之下。在一些实施方式中，所述的大量的天然存在的核酸包括下述的序列，或者来自于下述的序列，所述的序列选自天然存在的互补决定区域2 (CDM)序列，来自于人类的天然存在的免疫球蛋白(Ig)序列，来自于哺乳动物的天然存在的免疫球蛋白(Ig)序列，来自于存在于哺乳动物中的T细胞受体所具有的环状区域内的天然存在的序列，以及其他的天然存在的大量的具有多样性的多肽。在一些实施方式中，所述的大量的天然存在的核酸能够编码互补决定区域 2(CDR2)区域，并且所述的大量的天然存在的核酸包括这样的免疫球蛋白序列，其中所述的免疫球蛋白序列是天然存在于人类中的免疫球蛋白序列，所述的人类已经被暴露在一种特定的免疫原之下，或者是来自于动物中的序列，所述的动物已经被认定为被暴露在一种特定的抗原之下。在一些实施方式中，所述的大量的免疫球蛋白(Ig)受体骨架核酸序列包括至少
29一种可变重链(VH)受体骨架核酸序列以及至少一种可变轻链(VL)受体骨架核酸序列的混
Π O在一些实施方式中，在本发明提供的所述的方法中包括下述的另外的步骤(e) 将步骤(d)中所述的核酸文库克隆至一种表达载体之中，其中所述的核酸序列能够编码免疫球蛋白的可变结构域，以及(f)在一个宿主细胞内对步骤(e)中所述的表达载体进行转化并且在足以能够使所述的大量的免疫球蛋白可变结构域进行表达的条件下对所述的宿主细胞进行培养，其中所述的免疫球蛋白可变结构域是由所述的文库来进行编码的。例如， 所述的宿主细胞是大肠杆菌(E.coli)。在一些实施方式中，所述的表达载体是一种噬菌体载体。例如，所述的噬菌体载体是PNDS1。本发明同样提供了用以制备一种核酸文库的方法，其中每一个核酸能够编码一个免疫球蛋白的可变结构域。这样的方法包括下述的步骤(a)提供大量的免疫球蛋白(Ig) 受体骨架核酸序列，在所述的核酸序列中导入一种多样性来源，其中所述的导入是在单一的互补决定区域(CDR)内进行的，所述的互补决定区域(CDR)选自由下述的互补决定区域 (OTR)所组成的组中互补决定区域1(⑶Rl)，互补决定区域2 (⑶R2)，以及互补决定区域 3(CDR3)，其中所述的免疫球蛋白(Ig)受体骨架序列包括一个填充核酸序列，所述的填充核酸序列中包括至少两个IIs型限制性酶识别位点，并且其中所述的多样性来源是一种互补决定区域(CDR)，所述的互补决定区域(CDR)选自含有IIs型限制性酶识别位点的通过合成方法制备得到的互补决定区域(CDR)序列，其中所述的限制性酶识别位点存在于所述的互补决定区域(CDR)区域之外，(b)向每一个免疫球蛋白(Ig)受体骨架之内导入所述的多样性来源，其中所述的导入是通过利用一种IIs型限制性酶对所述的多样性来源以及所述的免疫球蛋白(Ig)受体骨架同时进行消化的方式来实现的；以及(c)将所述的经过消化的多样性来源连结至所述的免疫球蛋白(Ig)受体骨架之中，这样一来一个完整的免疫球蛋白可变结构域编码序列被得以重新建立，其中所述的编码序列中不含有步骤(a)以及(b) 中所述的IIs型限制性酶识别位点。在一些实施方式中，所述的IIs型限制性酶识别位点可以被相同的IIs型限制性酶进行识别，其中所述的限制性酶识别位点是存在于所述的填充核酸序列之内并且存在于所述的通过合成方法制备得到的互补决定区域(CDR)序列之内的。在一些实施方式中，所述的IIs型限制性酶识别位点可以被不同的IIs型限制性酶进行识别，其中所述的限制性酶识别位点是存在于所述的填充核酸序列之内并且存在于所述的通过合成方法制备得到的互补决定区域(CDR)序列之内的。例如，所述的IIs型限制性酶识别位点是R)kl识别位点，BsaI识别位点，和/或BsmBI识别位点。在一些实施方式中，所述的免疫球蛋白(Ig)受体骨架核酸序列是来自于一种人类基因序列的。例如，所述的人类序列是一种人类重链可变基因序列或者是一种来自于人类重链可变基因序列的序列。在一些实施方式中，所述的人类重链可变基因序列选自重链可变序列1-2 (VH1-2)，重链可变序列1-69 (VH1-69)，重链可变序列1_18 (VH1-18)，重链可变序列3-30 (VH3-30)，重链可变序列3-48 (VH3-48)，重链可变序列3_23 (VH3-23)，以及重链可变序列5-51 (VH5-51)。在一些实施方式中，所述的人类序列是一种人类κ轻链可变基因序列或者是一种来自于人类κ轻链可变基因序列的序列。例如，所述的人类κ轻链可变基因序列选自κ轻链可变序列1-33 (VK1-33)，κ轻链可变序列1-39 (VK1-39)，κ轻链可变序列3-11 (VK3-11)，κ轻链可变序列3-15(VK3-15)，以及κ轻链可变序列 3-20 (VK3-20)。在一些实施方式中，所述的人类序列是一种人类λ轻链可变基因序列或者是一种来自于人类λ轻链可变基因序列的序列。例如，所述的人类λ轻链可变基因序列选自λ轻链可变序列l-44(VLl-44)以及λ轻链可变序列1-51(VL1-51)。在一些实施方式中，所述的大量的经过多样性处理的核酸能够编码氨基酸序列， 其中所述的氨基酸序列能够实现一种互补决定区域3 (CDR3)区域所具备的功能，并且所述的大量的经过多样性处理的核酸包括合成性的序列。在一些实施方式中，所述的大量的经过多样性处理的核酸能够编码氨基酸序列， 其中所述的氨基酸序列能够实现一种互补决定区域I(CDRl)区域所具备的功能，并且所述的大量的经过多样性处理的核酸包括合成性的序列。在一些实施方式中，所述的大量的经过多样性处理的核酸能够编码氨基酸序列， 其中所述的氨基酸序列能够实现一种互补决定区域2 (CDR2)区域所具备的功能，并且所述的大量的经过多样性处理的核酸包括合成性的序列。在一些实施方式中，所述的大量的免疫球蛋白(Ig)受体骨架核酸序列包括至少一种可变重链(VH)受体骨架核酸序列以及至少一种可变轻链受体骨架核酸序列的混合。在一些实施方式中，在本发明提供的所述的方法中包括下述的另外的步骤(e) 将步骤(d)中所述的核酸文库克隆至一种表达载体之中，其中所述的核酸序列能够编码免疫球蛋白的可变结构域，以及(f)在一个宿主细胞内对步骤(e)中所述的表达载体进行转化并且在足以能够使所述的大量的免疫球蛋白可变结构域进行表达的条件下对所述的宿主细胞进行培养，其中所述的免疫球蛋白可变结构域是由所述的文库来进行编码的。例如， 所述的宿主细胞是大肠杆菌(E.coli)。在一些实施方式中，所述的表达载体是一种噬菌体载体。例如，所述的噬菌体载体是PNDS1。本发明同样提供了用以制备一种免疫球蛋白多肽的方法。这样的方法包括下述的步骤(a)提供大量的免疫球蛋白(Ig)受体骨架核酸序列，在所述的核酸序列中导入一种多样性来源，其中所述的导入是在单一的互补决定区域(CDR)内进行的，所述的互补决定区域(OTR)选自由下述的互补决定区域(OTR)所组成的组中互补决定区域1(⑶R1)，互补决定区域2(CDR2)，以及互补决定区域3(CDR3)，其中所述的免疫球蛋白(Ig)受体骨架序列包括一个填充核酸序列，所述的填充核酸序列中包括至少两个IIs型限制性酶识别位点， 并且其中所述的多样性来源是一种互补决定区域(CDR)，所述的互补决定区域(CDR)选自含有IIs型限制性酶识别位点的天然存在的互补决定区域(CDR)序列，其中所述的限制性酶识别位点存在于所述的互补决定区域(CDR)区域之外，(b)向每一个免疫球蛋白(Ig)受体骨架之内导入所述的多样性来源，其中所述的导入是通过利用一种IIs型限制性酶对所述的多样性来源以及所述的免疫球蛋白(Ig)受体骨架同时进行消化的方式来实现的；(c) 将所述的经过消化的多样性来源连结至所述的免疫球蛋白(Ig)受体骨架之中，这样一来一个完整的免疫球蛋白可变基因编码序列被得以重新建立；以及(d)将来自于步骤(C)中的所述的完整的免疫球蛋白可变基因编码序列克隆至一个表达载体之中；以及(e)在一个宿主细胞内对步骤(d)中所述的表达载体进行转化并且在足以能够使所述的完整的免疫球蛋白基因编码序列进行表达的条件下对所述的宿主细胞进行培养，其中所述的免疫球蛋白基因编码序列中不含有所述的IIs型限制性酶识别位点。
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在这样的实施方式中，所述的天然存在的互补决定区域(CDR)区域序列相对于它们的野生型而言在本质上是未发生改变的，即，天然状态。这些天然存在的互补决定区域 (CDR)区域序列存在于氨基酸序列的侧翼，其中所述的氨基酸序列已经被进行了工程化处理(或者被进行了人工处理)，从而含有两个IIs型限制性酶识别位点，其中在所述的天然存在的互补决定区域(CDR)区域序列的每一例上存在有一个IIs型限制性酶识别位点。在一些实施方式中，所述的IIs型限制性酶识别位点可以被相同的IIs型限制性酶进行识别，其中所述的限制性酶识别位点是存在于所述的填充核酸序列之内并且存在于所述的天然存在的互补决定区域(CDR)序列的侧翼上的。在一些实施方式中，所述的IIs型限制性酶识别位点可以被不同的IIs型限制性酶进行识别，其中所述的限制性酶识别位点是存在于所述的填充核酸序列之内并且存在于所述的天然存在的互补决定区域(CDR)序列的侧翼上的。例如，所述的IIs型限制性酶识别位点是R)kl识别位点，BsaI识别位点， 和/或BsmBI识别位点。在一些实施方式中，所述的受体骨架核酸序列是来自于一种人类基因序列的。 例如，所述的人类序列是一种人类重链可变基因序列或者是一种来自于人类重链可变基因序列的序列。在一些实施方式中，所述的人类重链可变基因序列选自重链可变序列 1-2(VHH)，重链可变序列1-69 (VH1-69)，重链可变序列1-18 (VH1-18)，重链可变序列 3-30 (VH3-30)，重链可变序列3-48 (VH3-48)，重链可变序列3_23 (VH3-23)，以及重链可变序列5-51(VH5-51)。在一些实施方式中，所述的人类序列是一种人类κ轻链可变基因序列或者是一种来自于人类κ轻链可变基因序列的序列。例如，所述的人类κ轻链可变基因序列选自κ轻链可变序列1-33 (VK1-33)，κ轻链可变序列1-39 (VK1-39)，κ轻链可变序列3-11 (VK3-11)，κ轻链可变序列3-15 (VK3-15)，以及κ轻链可变序列3-20 (VK3-20)。 在一些实施方式中，所述的人类序列是一种人类λ轻链可变基因序列或者是一种来自于人类λ轻链可变基因序列的序列。例如，所述的人类λ轻链可变基因序列选自λ轻链可变序列l-44(VLl-44)以及λ轻链可变序列1-51(VL1-51)。在一些实施方式中，所述的大量的天然存在的核酸包括下述的序列，或者来自于下述的序列，所述的序列选自天然存在的互补决定区域3(CDR!3)序列，来自于人类的天然存在的免疫球蛋白(Ig)序列，来自于哺乳动物的天然存在的免疫球蛋白(Ig)序列，来自于存在于哺乳动物中的T细胞受体所具有的环状区域内的天然存在的序列，以及其他的天然存在的大量的具有多样性的多肽。在一些实施方式中，所述的大量的天然存在的核酸能够编码互补决定区域 3(CDR3)区域，并且所述的大量的天然存在的核酸包括这样的免疫球蛋白序列，其中所述的免疫球蛋白序列是天然存在于人类中的免疫球蛋白序列，所述的人类已经被暴露在一种特定的免疫原之下，或者是来自于动物中的序列，所述的动物已经被认定为被暴露在一种特定的抗原之下。在一些实施方式中，所述的大量的天然存在的核酸包括下述的序列，或者来自于下述的序列，所述的序列选自天然存在的互补决定区域I(CDRl)序列，来自于人类的天然存在的免疫球蛋白(Ig)序列，来自于哺乳动物的天然存在的免疫球蛋白(Ig)序列，来自于存在于哺乳动物中的T细胞受体所具有的环状区域内的天然存在的序列，以及其他的天然存在的大量的具有多样性的多肽。
在一些实施方式中，所述的大量的天然存在的核酸能够编码互补决定区域 1 (CDRl)区域，并且所述的大量的天然存在的核酸包括这样的免疫球蛋白序列，或者来自于这样的免疫球蛋白序列，其中所述的免疫球蛋白序列是天然存在于人类中的免疫球蛋白序列，所述的人类已经被暴露在一种特定的免疫原之下，或者是来自于动物中的序列，所述的动物已经被认定为被暴露在一种特定的抗原之下。在一些实施方式中，所述的大量的天然存在的核酸包括下述的序列，或者来自于下述的序列，所述的序列选自天然存在的互补决定区域2 (CDM)序列，来自于人类的天然存在的免疫球蛋白(Ig)序列，来自于哺乳动物的天然存在的免疫球蛋白(Ig)序列，来自于存在于哺乳动物中的T细胞受体所具有的环状区域内的天然存在的序列，以及其他的天然存在的大量的具有多样性的多肽。在一些实施方式中，所述的大量的天然存在的核酸能够编码互补决定区域 2(CDR2)区域，并且所述的大量的天然存在的核酸包括这样的免疫球蛋白序列，其中所述的免疫球蛋白序列是天然存在于人类中的免疫球蛋白序列，所述的人类已经被暴露在一种特定的免疫原之下，或者是来自于动物中的序列，所述的动物已经被认定为被暴露在一种特定的抗原之下。在一些实施方式中，所述的大量的受体骨架核酸序列包括至少一种可变重链(VH) 受体骨架核酸序列以及至少一种可变轻链受体骨架核酸序列的混合。在一些实施方式中，所述的表达载体是一种噬菌体载体。在一些实施方式中，所述的宿主细胞是大肠杆菌(E. coli)。在一些实施方式中，所述的方法同样包括下述的步骤利用一种靶向抗原与所述的宿主细胞进行接触，并且确定哪些被表达的完整的免疫球蛋白(Ig)可变基因编码序列能够与所述的靶向抗原进行结合，从而识别出靶向特异性的抗体，所述抗体所具有的抗体可变区域或者所述抗体的一部分。在一些实施方式中，所述的方法包括下述的另外的步骤 (i)对所述的免疫球蛋白可变结构域编码序列进行测序，其中所述的编码序列能够与所述的靶向抗原进行结合。本发明同样提供了用以制备一种免疫球蛋白多肽的方法。这样的方法包括下述的步骤(a)提供大量的免疫球蛋白(Ig)受体骨架核酸序列，在所述的核酸序列中导入一种多样性来源，其中所述的导入是在单一的互补决定区域(CDR)内进行的，所述的互补决定区域(OTR)选自由下述的互补决定区域(OTR)所组成的组中互补决定区域1(⑶R1)，互补决定区域2(CDR2)，以及互补决定区域3(CDR3)，其中所述的免疫球蛋白(Ig)受体骨架序列包括一个填充核酸序列，所述的填充核酸序列中包括至少两个IIs型限制性酶识别位点，并且其中所述的多样性来源是一种互补决定区域(CDR)，所述的互补决定区域(CDR)选自含有IIs型限制性酶识别位点的通过合成方法制备得到的互补决定区域(CDR)序列，其中所述的限制性酶识别位点存在于所述的互补决定区域(CDR)区域之外，(b)向每一个免疫球蛋白(Ig)受体骨架之内导入所述的多样性来源，其中所述的导入是通过利用一种IIs 型限制性酶对所述的多样性来源以及所述的免疫球蛋白(Ig)受体骨架同时进行消化的方式来实现的；(c)将所述的经过消化的多样性来源连结至所述的免疫球蛋白(Ig)受体骨架之中，这样一来一个完整的免疫球蛋白可变基因编码序列被得以重新建立；(d)将来自于步骤(c)中的所述的经过连结的免疫球蛋白(Ig)受体骨架克隆至一个表达载体之中；以及
33(e)在一个宿主细胞内对步骤(d)中所述的表达载体进行转化并且在足以能够使所述的完整的免疫球蛋白基因编码序列进行表达的条件下对所述的宿主细胞进行培养，其中所述的免疫球蛋白基因编码序列中不含有所述的IIs型限制性酶识别位点。在一些实施方式中，所述的IIs型限制性酶识别位点可以被相同的IIs型限制性酶进行识别，其中所述的限制性酶识别位点是存在于所述的填充核酸序列之内并且存在于所述的通过合成方法制备得到的互补决定区域(CDR)序列之内的。在一些实施方式中，所述的IIs型限制性酶识别位点可以被不同的IIs型限制性酶进行识别，其中所述的限制性酶识别位点是存在于所述的填充核酸序列之内并且存在于所述的通过合成方法制备得到的互补决定区域(CDR)序列之内的。例如，所述的IIs型限制性酶识别位点是R)kl识别位点，BsaI识别位点，和/或BsmBI识别位点。在一些实施方式中，所述的免疫球蛋白(Ig)受体骨架核酸序列是来自于一种人类基因序列的。例如，所述的人类序列是一种人类重链可变基因序列或者是一种来自于人类重链可变基因序列的序列。在一些实施方式中，所述的人类重链可变基因序列选自重链可变序列1-2 (VH1-2)，重链可变序列1-69 (VH1-69)，重链可变序列1_18 (VH1-18)，重链可变序列3-30 (VH3-30)，重链可变序列3-48 (VH3-48)，重链可变序列3_23 (VH3-23)，以及重链可变序列5-51 (VH5-51)。在一些实施方式中，所述的人类序列是一种人类κ轻链可变基因序列或者是一种来自于人类κ轻链可变基因序列的序列。例如，所述的人类κ轻链可变基因序列选自κ轻链可变序列1-33 (VK1-33)，κ轻链可变序列1-39 (VK1-39)， κ轻链可变序列3-11 (VK3-11)，κ轻链可变序列3-15(VK3-15)，以及κ轻链可变序列 3-20 (VK3-20)。在一些实施方式中，所述的人类序列是一种人类λ轻链可变基因序列或者是一种来自于人类λ轻链可变基因序列的序列。例如，所述的人类λ轻链可变基因序列选自λ轻链可变序列l-44(VLl-44)以及λ轻链可变序列1-51(VL1-51)。在一些实施方式中，所述的大量的经过多样性处理的核酸能够编码氨基酸序列， 其中所述的氨基酸序列能够实现一种互补决定区域3 (CDR3)区域所具备的功能，并且所述的大量的经过多样性处理的核酸包括合成性的序列。在一些实施方式中，所述的大量的经过多样性处理的核酸能够编码氨基酸序列， 其中所述的氨基酸序列能够实现一种互补决定区域I(CDRl)区域所具备的功能，并且所述的大量的经过多样性处理的核酸包括合成性的序列。在一些实施方式中，所述的大量的经过多样性处理的核酸能够编码氨基酸序列， 其中所述的氨基酸序列能够实现一种互补决定区域2 (CDR2)区域所具备的功能，并且所述的大量的经过多样性处理的核酸包括合成性的序列。在一些实施方式中，所述的大量的免疫球蛋白(Ig)受体骨架核酸序列包括至少一种可变重链(VH)受体骨架核酸序列以及至少一种可变轻链受体骨架核酸序列的混合。在一些实施方式中，所述的表达载体是一种噬菌体载体。在一些实施方式中，所述的宿主细胞是大肠杆菌(E. coli)。在一些实施方式中，所述的方法同样包括下述的步骤利用一种靶向抗原与所述的宿主细胞进行接触，并且确定哪些被表达的完整的免疫球蛋白(Ig)可变基因编码序列能够与所述的靶向抗原进行结合，从而识别出靶向特异性的抗体，所述抗体所具有的抗体可变区域或者所述抗体的一部分。在一些实施方式中，所述的方法包括下述的另外的步骤(i)对所述的免疫球蛋白可变结构域编码序列进行测序，其中所述的编码序列能够与所述的靶向抗原进行结合。本发明提供了用以制备大量核酸的方法，其中每一种核酸能够编码一个人类免疫球蛋白的可变结构域，所述的免疫球蛋白可变结构域中包括大量的互补决定区域3 (CDR3) 序列，所述的互补决定区域3(CDR!3)序列是分别从来自于一个哺乳动物物种的所述的免疫球蛋白可变结构域个体中分离得到的。本发明同样提供了用以制备大量核酸的方法，其中每一种核酸能够编码一个人类免疫球蛋白的可变结构域，所述的免疫球蛋白可变结构域中包括大量的互补决定区域2 (CDM)序列，所述的互补决定区域2 (CDM)序列是分别从来自于一个哺乳动物物种的所述的免疫球蛋白可变结构域个体中分离得到的。本发明同样提供了用以制备大量核酸的方法，其中每一种核酸能够编码一个人类免疫球蛋白的可变结构域，所述的免疫球蛋白可变结构域中包括大量的互补决定区域I(CDRl)序列，所述的互补决定区域I(CDRl)序列是分别从来自于一个哺乳动物物种的所述的免疫球蛋白可变结构域个体中分离得到的。本发明提供了用以制备大量核酸的方法，其中每一种核酸能够编码一个人类免疫球蛋白的可变结构域，所述的免疫球蛋白可变结构域中包括大量的互补决定区域3 (CDR3) 序列，所述的互补决定区域3(CDR!3)序列是分别从来自于一个非人类的哺乳动物物种的所述的免疫球蛋白可变结构域个体中分离得到的。本发明同样提供了用以制备大量核酸的方法，其中每一种核酸能够编码一个人类免疫球蛋白的可变结构域，所述的免疫球蛋白可变结构域中包括大量的互补决定区域2 (CDR2)序列，所述的互补决定区域2 (CDR2)序列是分别从来自于一个非人类的哺乳动物物种的所述的免疫球蛋白可变结构域个体中分离得到的。本发明同样提供了用以制备大量核酸的方法，其中每一种核酸能够编码一个人类免疫球蛋白的可变结构域，所述的免疫球蛋白可变结构域中包括大量的互补决定区域I(CDRl) 序列，所述的互补决定区域I(CDRl)序列是分别从来自于一个非人类的哺乳动物物种的所述的免疫球蛋白可变结构域个体中分离得到的。在一些实施方式中，所述的非人类的物种是非人类的灵长动物类，啮齿动物类，犬科动物类，猫科动物类，羊，山羊，牛类，马类，驼科的家族成员之一，美洲驼类，骆驼类，单峰骆驼类，或者是猪类。本发明提供了用以制备大量核酸的方法，其中每一种核酸能够编码一个人类免疫球蛋白的可变结构域，所述的免疫球蛋白可变结构域中包括大量的互补决定区域3 (CDR3) 序列，所述的互补决定区域3(CDR3)序列是分别从来自于人类的所述的免疫球蛋白可变结构域个体中分离得到的。本发明提供了用以制备大量核酸的方法，其中每一种核酸能够编码一个人类免疫球蛋白的可变结构域，所述的免疫球蛋白可变结构域中包括大量的互补决定区域2(CDM)序列，所述的互补决定区域2 (CDM)序列是分别从来自于人类的所述的免疫球蛋白可变结构域个体中分离得到的。本发明提供了用以制备大量核酸的方法，其中每一种核酸能够编码一个人类免疫球蛋白的可变结构域，所述的免疫球蛋白可变结构域中包括大量的互补决定区域I(CDRl)序列，所述的互补决定区域I(CDRl)序列是分别从来自于人类的所述的免疫球蛋白可变结构域个体中分离得到的。本发明提供了用以制备大量核酸的方法，其中每一种核酸能够编码一个人类免疫球蛋白的可变结构域，所述的免疫球蛋白可变结构域中包括大量的互补决定区域3 (CDR3)
35序列，所述的互补决定区域3(CDR!3)序列是分别从来自于一种非人类的物种的所述的免疫球蛋白可变结构域个体中分离得到的。在一些实施方式中，这样的方法包括下述的步骤(a)提供大量的受体骨架核酸序列，其中所述的核酸序列能够编码截然不同的人类免疫球蛋白可变结构域，每一个受体骨架核酸序列中包括第一个骨架区域(FRl)，第二个骨架区域(FR2)，第三个骨架区域 (FR3)，以及第四个骨架区域(FR4)，其中所述的骨架区域I(FRl)与骨架区域2(FR2)区域之间被互补决定区域I(CDRl)区域进行了间隔；所述的骨架区域2(FR2)与骨架区域3(FR3) 区域之间被互补决定区域2 (CDR2)区域进行了间隔；并且所述的骨架结构3 (FR3)以及骨架结构4(FR4)区域之间被一个填充核酸序列进行了间隔，其中所述的填充核酸序列中包括至少两个IIs型限制性酶识别位点，所述的两个限制性酶识别位点之间被一个随机的核酸序列进行了间隔；(b)提供大量的经过多样性处理的核酸序列，其中所述的核酸序列能够编码互补决定区域3(CDR!3)序列，其中所述的互补决定区域3 (COR； )序列是从所述的哺乳动物物种的免疫球蛋白个体中分离得到的，其中所述的大量的经过多样性处理的核酸序列中的每一个序列在其每一个末端上包括一个IIs型限制性酶识别位点；(c)利用一种 IIs型限制性酶对所述的大量的核酸序列中的每一个进行消化，其中所述的核酸序列能够编码所述的互补决定区域3 (CDR3)区域，所述的限制性酶能够与步骤(b)中所述的IIs型限制性酶识别位点进行结合，并且利用一种IIs型限制性酶对步骤(a)中所述的来自于所述的受体骨架之中的填充核酸序列进行消化，其中所述的限制性酶能够与步骤(a)中所述的IIs型限制性酶识别位点进行结合；以及(d)将步骤(c)中所述的经过消化的核酸序列或者所述的氨基酸序列连结至步骤(c)中所述的经过消化的受体骨架之中，其中所述的核酸序列能够编码所述的互补决定区域3 (CDR3)区域，这样一来可以利用所述的核酸序列或者所述的氨基酸序列对所述的骨架区域3 (FR3)以及骨架区域4(FR4)区域之间进行间隔，其中所述的核酸序列能够编码所述的互补决定区域3 (CDR3)区域，所述的氨基酸序列能够实现一种互补决定区域3 (CDR3)区域所具备的功能，并且一个完整的免疫球蛋白可变结构域编码序列被得以重新建立，其中所述的编码序列中不含有步骤(a)以及(b)中所述的IIs型限制性酶识别位点。同样可以使用大量的经过多样性处理的核酸序列来实现这样的步骤，其中所述的核酸序列能够编码互补决定区域2 (CDM)序列，所述的互补决定区域 2(CDR2)序列是从所述的哺乳动物物种的免疫球蛋白个体中分离得到的。同样可以使用大量的经过多样性处理的核酸序列来实现这样的步骤，其中所述的核酸序列能够编码互补决定区域I(CDRl)序列，所述的互补决定区域I(CDRl)序列是从所述的哺乳动物物种的免疫球蛋白个体中分离得到的。在一些实施方式中，步骤(b)是通过下述的方式来实现的使用寡核苷酸引物对来自于一种哺乳动物物种中的所述的互补决定区域3(CDR;3)序列进行扩增，其中在所述的寡核苷酸引物中含有一个IIs型限制性位点。在一些实施方式中，对所述的寡核苷酸引物进行设计，从而增强所述的哺乳动物互补决定区域3 (CDR!3)序列以及所述的受体骨架之间所具有的兼容性，其中所述的受体骨架能够编码一种人类免疫球蛋白的可变结构域。在一些实施方式中，对所述的寡核苷酸引物进行设计，用以对存在于所述的哺乳动物的互补决定区域3(CDR!3)序列的边界上的所述序列进行修饰，从而允许经由具有兼容性的粘性末端而被有效的连结至所述的受体骨架之中，其中所述的受体骨架能够编码一种人类免疫球蛋白的可变结构域。在一些实施方式中，存在于所述的互补决定区域3(CDR3)区域的侧翼之上的所述的哺乳动物DNA序列可能并不是通过断裂作用来产生粘性末端的，其中所述的断裂作用是由IIS型限制性酶所产生的，所述的粘性末端能够与所述的经过消化的受体骨架所具有的粘性末端具有兼容性。在这样的情形中，可以对用来进行扩增的所述的寡核苷酸进行设计，从而对所述的靶向哺乳动物序列进行修饰，这样一来在利用一种IIS型限制性酶进行切断之后，所述的粘性末端是具备兼容性的并且可以进行有效的连结。同样可以通过使用寡核苷酸引物对所述的互补决定区域2 (CDM)序列进行扩增的方式来实现这样的步骤，其中所述的互补决定区域2 (CDM)序列来自于一种哺乳动物物种，所述的寡核苷酸引物中含有一种IIs型限制性位点。同样可以通过使用寡核苷酸引物对所述的互补决定区域I(CDRl)序列进行扩增的方式来实现这样的步骤，其中所述的互补决定区域I(CDRl)序列来自于一种哺乳动物物种，所述的寡核苷酸引物中含有一种IIs型限制性位点。在一些实施方式中，步骤(b)是通过下述的方式来实现的使用寡核苷酸引物对来自于一种非人类的物种中的所述的互补决定区域3(CDR;3)序列进行扩增，其中在所述的寡核苷酸引物中含有一个i^ok I IIs型限制性位点。这样的步骤同样可以通过下述的方式来实现使用寡核苷酸引物对来自于一种哺乳动物物种中的所述的互补决定区域2(CDR2) 序列进行扩增，其中在所述的寡核苷酸引物中含有一个i^ok I IIs型限制性位点。这样的步骤同样可以通过下述的方式来实现使用寡核苷酸引物对来自于一种哺乳动物物种中的所述的互补决定区域I(CDRl)序列进行扩增，其中在所述的寡核苷酸引物中含有一个I IIs型限制性位点。在一些实施方式中，在步骤(a)以及步骤(b)中所述的IIs型限制性酶识别位点可以被不同的IIs型限制性酶进行识别。在一些实施方式中，所述的IIs型限制性酶识别位点是MmBI识别位点，BsaI识别位点，FokI识别位点或者是上述识别位点的组合。在一些实施方式中，所述的经过多样性处理的编码互补决定区域3(⑶旧)序列的核酸序列能够编码重链互补决定区域3 (OTR H3)序列。在一些实施方式中，所述的经过多样性处理的编码互补决定区域3 (CDR3)序列的核酸序列能够编码轻链互补决定区域3 (CDR L3)序列。在一些实施方式中，所述的经过多样性处理的编码互补决定区域2 (CDM)序列的核酸序列能够编码重链互补决定区域2 (OTR H2)序列。在一些实施方式中，所述的经过多样性处理的编码互补决定区域2 (CDR2)序列的核酸序列能够编码轻链互补决定区域2 (CDR L2)序列。在一些实施方式中，所述的经过多样性处理的编码互补决定区域1 (⑶Rl)序列的核酸序列能够编码重链互补决定区域1 (OTR Hl)序列。在一些实施方式中，所述的经过多样性处理的编码互补决定区域I(CDRl)序列的核酸序列能够编码轻链互补决定区域1 (CDR Li)序列。在一些实施方式中，所述的受体骨架核酸序列包括这样的序列，或者来自于这样的序列，所述的序列是一种人类重链可变基因序列中的至少一部分，其中所述的人类重链可变基因序列选自重链可变序列1_2(VH1D，重链可变序列l-69(VHl-69)，重链可变序列1-18 (VH1-18)，重链可变序列3-30 (VH3-30)，重链可变序列3_48 (VH3-48)，重链可变序列3-23 (VH3-23)，以及重链可变序列5_51 (VH5-51)。在一些实施方式中，所述的受体骨架核酸序列包括这样的序列，或者来自于这样的序列，所述的序列是一种人类κ轻链可变基因序列中的至少一部分。例如，所述的人类κ轻链可变基因序列选自K轻链可变序列l-33(VKl-33)，κ轻链可变序列l-39(VKl-39)，κ轻链可变序列3-11 (VK3-11)，κ轻链可变序列3-15(VK3-15)，以及κ轻链可变序列3-20 (VK3-20)。在一些实施方式中，所述的受体骨架核酸序列包括这样的序列，或者来自于这样的序列，所述的序列是一种人类λ轻链可变基因序列中的至少一部分。例如，所述的人类λ轻链可变基因序列选自λ轻链可变序列l-44(VLl-44)以及λ轻链可变序列1-51(VL1-51)。在一些实施方式中，所述的大量的受体骨架核酸序列包括至少一种可变重链(VH) 受体骨架核酸序列以及至少一种可变轻链受体骨架核酸序列的混合。在一些实施方式中，在本发明描述的所述方法中同样包括下述的步骤(e)将步骤(d)中所述的核酸文库克隆至一种表达载体之中，其中所述的核酸文库能够编码免疫球蛋白的可变结构域，以及(f)在一个宿主细胞内对步骤(e)中所述的表达载体进行转化并且在足以能够使所述的大量的免疫球蛋白可变结构域进行表达的条件下对所述的宿主细胞进行培养，其中所述的免疫球蛋白可变结构域是由所述的文库进行编码的。在一些实施方式中，所述的表达载体是一种噬菌体或者或者是噬菌体载体。在一些实施方式中，所述的宿主细胞是大肠杆菌(E. coli)。本发明提供了用以制备大量核酸的方法，其中每一种核酸能够编码一个人类免疫球蛋白的可变结构域，所述的免疫球蛋白可变结构域中包括大量的互补决定区域3 (CDR3) 序列，所述的互补决定区域3(CDR!3)序列是分别从来自于一个经过免疫的非人类的哺乳动物物种或者非人类的物种的所述的免疫球蛋白可变结构域中分离得到的。本发明同样提供了用以制备大量核酸的方法，其中每一种核酸能够编码一个人类免疫球蛋白的可变结构域，所述的免疫球蛋白可变结构域中包括大量的互补决定区域2(CDM)序列，所述的互补决定区域2 (CDM)序列是分别从来自于一个经过免疫的非人类的哺乳动物物种的所述的免疫球蛋白可变结构域中分离得到的。本发明同样提供了用以制备大量核酸的方法，其中每一种核酸能够编码一个人类免疫球蛋白的可变结构域，所述的免疫球蛋白可变结构域中包括大量的互补决定区域I(CDRl)序列，所述的互补决定区域I(CDRl)序列是分别从来自于一个经过免疫的非人类的哺乳动物物种的所述的免疫球蛋白可变结构域中分离得到的。在一些实施方式中，所述的非人类的物种是非人类的灵长动物类，啮齿动物类，犬科动物类，猫科动物类，羊，山羊，牛类，马类，驼科的家族成员之一，美洲驼类，骆驼类，单峰骆驼类，或者是猪类。在一些实施方式中，所述的方法包括下述的步骤(a)提供大量的受体骨架核酸序列，其中所述的核酸序列能够编码截然不同的人类免疫球蛋白可变结构域，每一个受体骨架核酸序列中包括第一个骨架区域(FRl)，第二个骨架区域(FR2)，第三个骨架区域 (FR3)，以及第四个骨架区域(FR4)，其中所述的骨架区域I(FRl)与骨架区域2(FR2)区域之间被互补决定区域I(CDRl)区域进行了间隔；所述的骨架区域2 (FR2)与骨架区域3(FR3) 区域之间被互补决定区域2 (CDR2)区域进行了间隔；并且所述的骨架结构3 (FR3)以及骨架结构4(FR4)区域之间被一个填充核酸序列进行了间隔，其中所述的填充核酸序列中包括至少两个IIs型限制性酶识别位点，所述的两个限制性酶识别位点之间被一个随机的核酸序列进行了间隔；(b)提供大量的经过多样性处理的核酸序列，其中所述的核酸序列能够编码互补决定区域3 (⑶旧)序列，其中所述的互补决定区域3 (⑶旧)序列是从所述的经过免疫的非人类的哺乳动物中分离得到的，其中所述的大量的经过多样性处理的核酸序列中的每一个序列在其每一个末端上包括一个IIs型限制性酶识别位点；(c)利用一种IIs型限制性酶对所述的大量的核酸序列中的每一个进行消化，其中所述的核酸序列能够编码所述的互补决定区域3(CDR3)区域，所述的限制性酶能够与步骤(b)中所述的IIs型限制性酶识别位点进行结合，并且利用一种IIs型限制性酶对步骤(a)中所述的来自于所述的受体骨架之中的填充核酸序列进行消化，其中所述的限制性酶能够与步骤(a)中所述的IIs 型限制性酶识别位点进行结合；以及(d)将步骤(c)中所述的经过消化的核酸序列或者所述的氨基酸序列连结至步骤(c)中所述的经过消化的受体骨架之中，其中所述的核酸序列能够编码所述的互补决定区域3 (CDR!3)区域，这样一来可以利用所述的核酸序列或者所述的氨基酸序列对所述的骨架区域3 (FR3)以及骨架区域4(FR4)区域之间进行间隔，其中所述的核酸序列能够编码所述的互补决定区域3 (CDR3)区域，所述的氨基酸序列能够实现一种互补决定区域3(CDR3)区域所具备的功能，并且一个完整的免疫球蛋白可变结构域编码序列被得以重新建立，其中所述的编码序列中不含有步骤(a)以及(b)中所述的IIs型限制性酶识别位点。同样可以使用大量的经过多样性处理的核酸序列来实现这样的步骤， 其中所述的核酸序列能够编码互补决定区域2 (CDM)序列，所述的互补决定区域2 (CDR2) 序列是从所述的经过免疫的非人类的哺乳动物中分离得到的。同样可以使用大量的经过多样性处理的核酸序列来实现这样的步骤，其中所述的核酸序列能够编码互补决定区域 1 (CDRl)序列，所述的互补决定区域I(CDRl)序列是从所述的经过免疫的非人类的哺乳动物中分离得到的。在一些实施方式中，步骤(b)是通过下述的方式来实现的使用寡核苷酸引物对来自于一种经过免疫的非人类的哺乳动物中的所述的互补决定区域3 (CDR!3)序列进行扩增，其中在所述的寡核苷酸引物中含有一个i^ok I IIs型限制性位点。在一些实施方式中， 对所述的寡核苷酸引物进行设计，从而增强所述的哺乳动物互补决定区域3 (CDR!3)序列以及所述的受体骨架之间所具有的兼容性，其中所述的受体骨架能够编码一种人类免疫球蛋白的可变结构域。在一些实施方式中，对所述的寡核苷酸引物进行设计，用以对存在于所述的哺乳动物的互补决定区域3(CDR!3)序列的边界上的所述序列进行修饰，从而允许经由具有兼容性的粘性末端而被有效的连结至所述的受体骨架之中，其中所述的受体骨架能够编码一种人类免疫球蛋白的可变结构域。在一些实施方式中存在于所述的互补决定区域 3 (CDR3)区域的侧翼之上的所述的哺乳动物的DNA序列可能并不是通过断裂作用来产生粘性末端的，其中所述的断裂作用是由IIS型限制性酶所产生的，所述的粘性末端能够与所述的经过消化的受体骨架所具有的粘性末端具有兼容性。在这样的情形中，可以对用来进行扩增的所述的寡核苷酸进行设计，从而对所述的靶向哺乳动物序列进行修饰，这样一来在利用一种IIS型限制性酶进行切断之后，所述的粘性末端是具备兼容性的并且可以进行有效的连结。同样可以通过使用寡核苷酸引物对所述的互补决定区域2 (⑶似)序列进行扩增的方式来实现这样的步骤，其中所述的互补决定区域2 (CDR2)序列来自于所述的经过免疫的非人类的哺乳动物，所述的寡核苷酸引物中含有一种IIs型限制性位点。同样可以通过使用寡核苷酸引物对所述的互补决定区域I(CDRl)序列进行扩增的方式来实现这样的步骤，其中所述的互补决定区域I(CDRl)序列来自于一种经过免疫的非人类的哺乳动物， 所述的寡核苷酸引物中含有一种IIs型限制性位点。在一些实施方式中，步骤(b)是通过下述的方式来实现的使用寡核苷酸引物对来自于所述的非人类的哺乳动物中的所述的可变重链互补决定区域3(CDR H3)序列进行扩增，其中在所述的寡核苷酸引物中含有一个i^ok I IIs型限制性位点。这样的步骤同样可以通过下述的方式来实现使用寡核苷酸引物对来自于所述的非人类的哺乳动物中的所述的互补决定区域2(CDM)序列进行扩增，其中在所述的寡核苷酸引物中含有一个I IIs 型限制性位点。这样的步骤同样可以通过下述的方式来实现使用寡核苷酸引物对来自于所述的非人类的哺乳动物中的所述的互补决定区域I(CDRl)序列进行扩增，其中在所述的寡核苷酸引物中含有一个i^ok I IIs型限制性位点。在一些实施方式中，在步骤(a)以及步骤(b)中所述的IIs型限制性酶识别位点可以被不同的IIs型限制性酶进行识别。在一些实施方式中，所述的IIs型限制性酶识别位点是MmBI识别位点，BsaI识别位点，FokI识别位点或者是上述识别位点的组合。在一些实施方式中，所述的编码互补决定区域3(⑶旧)序列的经过多样性处理的核酸序列能够编码重链互补决定区域3 (⑶R3) (OTR H3)序列。在一些实施方式中，所述的编码互补决定区域3(CDR!3)序列的经过多样性处理的核酸序列能够编码轻链互补决定区域3(⑶R3)(⑶R L3)序列。在一些实施方式中，所述的编码互补决定区域2(^似)序列的经过多样性处理的核酸序列能够编码重链互补决定区域2 (⑶R2)(⑶R H2)序列。在一些实施方式中，所述的编码互补决定区域2(CDM)序列的经过多样性处理的核酸序列能够编码轻链互补决定区域2 (⑶R2) (OTR L2)序列。在一些实施方式中，所述的编码互补决定区域 I(OTRl)序列的经过多样性处理的核酸序列能够编码重链互补决定区域I(OTRl)(⑶R Hl) 序列。在一些实施方式中，所述的编码互补决定区域I(OTRl)序列的经过多样性处理的核酸序列能够编码轻链互补决定区域I(OTRl)(⑶R Li)序列。在一些实施方式中，所述的受体骨架核酸序列包括这样的序列，或者来自于这样的序列，所述的序列是一种人类重链可变基因序列中的至少一部分，其中所述的人类重链可变基因序列选自重链可变序列1_2(VH1D，重链可变序列l-69(VHl-69)，重链可变序列1-18 (VH1-18)，重链可变序列3-30 (VH3-30)，重链可变序列3_48 (VH3-48)，重链可变序列3-23 (VH3-23)，以及重链可变序列5_51 (VH5-51)。在一些实施方式中，所述的受体骨架核酸序列包括这样的序列，或者来自于这样的序列，所述的序列是一种人类κ轻链可变基因序列中的至少一部分。例如，所述的人类κ轻链可变基因序列选自K轻链可变序列l-33(VKl-33)，κ轻链可变序列 l-39(VKl-39)，κ轻链可变序列3-11 (VK3-11)，κ轻链可变序列3_15(VK3_15)，以及κ轻链可变序列3-20 (VK3-20)。在一些实施方式中，所述的受体骨架核酸序列包括这样的序列， 或者来自于这样的序列，所述的序列是一种人类λ轻链可变基因序列中的至少一部分。例如，所述的人类λ轻链可变基因序列选自λ轻链可变序列l-44(VLl-44)以及λ轻链可变序列 1-51(VL1-51)。在一些实施方式中，所述的大量的受体骨架核酸序列包括至少一种可变重链(VH) 受体骨架核酸序列以及至少一种可变轻链受体骨架核酸序列的混合。在一些实施方式中，所述的方法中同样包括下述的步骤(e)将步骤(d)中所述的核酸文库克隆至一种表达载体之中，其中所述的核酸文库能够编码免疫球蛋白的可变结构域，以及(f)在一个宿主细胞内对步骤(e)中所述的表达载体进行转化并且在足以能够使所述的大量的免疫球蛋白可变结构域进行表达的条件下对所述的宿主细胞进行培养，其中所述的免疫球蛋白可变结构域是由所述的文库进行编码的。在一些实施方式中，所述的宿主细胞是大肠杆菌(E.coli)。在一些实施方式中，所述的表达载体是一种噬菌体或者是噬菌体载体。附图的简要说明附图IA是一种蛋白质结构域的示意图，其中所述的蛋白质结构域中具有一个骨架以及环，所述的环能够提供与另外一种蛋白质或者分子进行接触的残基。对几个位置进行了描述一个具有经过了适当折叠的区域的稳定的蛋白质结构域；经过适当折叠的环， 其中所述的环被插入到一个具有有限的内在稳定性的结构域之内；一个本身固有的稳定的蛋白质结构域，其中所述的结构域所具有的稳定性受到所述的环区域的影响。附图IB是不同类型的蛋白质个体文库的示意图，其中所述的文库是使用不同的多样性策略来进行建立的。附图2是一种抗体可变受体骨架的示意图。指示出了骨架区域，互补决定区域 (CDR)以及IIS-RM型限制性位点。附图3是一种策略的示意图，其中所述的策略被用来从天然的个体中捕获可变重链的互补决定区域3(CDRH3)序列。附图4是一种使用含有IIS-RM型限制性酶的引物所带来的益处的示意图，其中所述的限制性酶被用来进行所述的扩增作用以及天然的互补决定区域(CDR)在受体骨架中的插入。附图5是一幅示意图，描述的是所选择的可变重链以及轻链所具有的生殖细胞系基因序列，其中所述的生殖细胞系基因序列被用来进行所述的受体骨架的建立。附图6是一种扩增策略的示意图，所述的策略被用来进行所述的受体骨架的建立，所述的建立是通过向所述的生殖细胞系序列中加入一个填充片段以及一个骨架区域 4(FR4)区域的方式来实现的。附图7，上栏是一幅示意图，描述的是所述的重链可变(VH)受体骨架的填充片段所具有的序列详细信息。由所述的限制性酶BsmBI进行识别以及切断的DNA序列分别被表示在红色的框内以及黑色的框内并且被表示在所述附图的下栏中。带有下划线的是与所述的抗体可变序列相对应的所述的阅读框。附图8是一个示意图，描述的是所述的20个受体骨架所具有的序列。附图9是所述的pNDS 1载体的示意图，所述的示意图是所述载体单独的示意图或者是与一种虚拟的重链可变区域或者一种虚拟的轻链可变区域进行结合了的示意图。附图10是一个表格，描述的是所述的可变重链的互补决定区域3 (⑶RH3)序列所具有的序列，其中所述的序列是从一种人类cDNA来源中重新获得的并且被插入到人类的受体骨架之内。附图11是一个表格，表示的是对用于可变重链(VH)，可变κ轻链(VK)以及可变 λ轻链(νλ)中的合成性的互补决定区域(CDR)序列所进行的设计。根据所述的Kabat编号方案对所述的位置进行了编号。通过使用一种指定的密码子多样性处理策略(NNS，NVK， NVT, DVT)对所述的互补决定区域(CDR)所具备的理论上的多样性进行了表示。在框内表示的是在可变重链(VH)的互补决定区域(CDR)合成中所采用的所述策略。附图12是一个示意图，表示的是被插入到一种受体骨架之中的合成性的互补决定区域(CDR)所具有的序列详细信息。附图13是一个示意图，表示的是初始文库以及为了建立次级文库所进行的所述的链的重新结合。附图14是一个示意图，表示的是与可变轻链(VL)的合成性文库进行结合的所述的受体可变重链(VH)文库的建立，以及对所述的可变重链互补决定区域3 (CDRro)个体的捕获，其中所述的个体是来源于人类或者非人类的。附图15是一个示意图，表示的是所述的MnA、MiB以及MiC文库的建立，其中使用了所述的可变重链互补决定区域3 (CDRH3)个体作为一种多样性的来源，所述的个体来自于天然的小鼠或者来自于利用人类干扰素Y (hIFNy)或者人类正常T细胞表达和分泌因子(hCCL5/RANTEQ进行免疫的小鼠。所述的文库所具备的大小在上栏中被进行了表示。所述的下栏表示的是在这些文库中发现的所述的可变重链互补决定区域3 (CDRH3)的长度分布。附图16是一系列的图表，描述的是在利用所述的次级文库ADl以及AEl对人类干扰素Y (hIFN γ)进行筛选的过程中所述的噬菌体输出量滴定(phage output titration)。附图17是一系列的图表，描述的是在利用所述的次级文库ADl以及AEl对单克隆抗体5E3进行筛选的过程中所述的噬菌体输出量滴定(phage output titration)。附图18是一系列的图表，描述的是在所述的AEl以及ADl文库中发现的所述的可变重链互补决定区域3 (CDR H3)的长度所具有的频率以及在经历过三轮针对所述的单克隆抗体5E3所进行的筛选之后所述的可变重链互补决定区域3 (CDR H3)的长度所具有的频率。已经表示出了所述的每一种可变重链互补决定区域3 (CDR H3)所具有的长度在所述的不同的重链可变(VH)家族中所具有的分布。然而，当可变重链互补决定区域3 (CDR H3)具有超过16个氨基酸的长度时，由所述的Illumina测序平台所提供的70bp的序列不能够覆盖足够的骨架序列用以明确的识别出所述的重链可变I(VHl)家族，并且因此所述的重链可变(VH)家族被表示为未确定。附图19是一系列的图表，描述的是使用经过纯化的6种单链抗体片段(scFv)制剂所得到的剂量应答酶联免疫吸附检测(ELISA)，其中所述的制剂能够作用于小鼠的5E3 或者一种不相关的小鼠抗体1A16。所述的七个克隆能够编码不同的单链抗体片段(scFv)。 克隆A6是一种对人类干扰素γ (hIFNy)具有特异性的单链抗体片段(scFv)并且被用来作为一种阴性对照。附图20是一个图表，描述的是使用经过纯化的单链抗体片段(scFv)制剂所得到的剂量应答酶联免疫吸附检测(ELISA)，其中所述的制剂能够作用于人类干扰素 Y (hlFNY)，以及与一种对人类干扰素γ (hIFNy)具有特异性的阳性单链抗体片段 (scFv)所进行的比较(A6)。附图21是一个图表，描述的是所述的经过纯化的单链抗体片段(scFv)制剂在一项荧光素酶报告基因检测中所具有的抑制性作用，其中所述的荧光素酶报告基因检测是由人类干扰素Y (hIFNy)来进行驱动的。将两种单链抗体片段(scFv)备选物(AD1R4P1A9 以及AE14R3P2E4)所具有的抑制活性与所述的一种阳性对照单链抗体片段(scFv) (G9)以及一种阴性对照单链抗体片段(scFv) (Dll)所具有的活性进行了比较。附图22是一个图表，描述的是所述的经过纯化的单链抗体片段(scFv)制剂在一项II类主要组织相容性复合体(MHCII)诱导检测中所具有的抑制性作用，其中所述的抑制性作用是针对人类干扰素Y (hIFNy)所进行的应答。将所述的两种单链抗体片段(scFv) 备选物(AD1R4P1A9以及AE14R3P2E4)所具有的抑制活性与所述的一种阴性对照单链抗体片段(scFv) (Dll)所具有的活性进行了比较。附图23是一系列的图表，描述的是所述的两种备选物AD1R4P1A9以及AE14R3P2E4 在一项荧光素酶报告基因检测中所具有的抑制性作用，其中所述的荧光素酶报告基因检测是由人类干扰素Y (hIFNy)来进行驱动的，所述的两种备选物被重新格式化成为免疫球蛋白G(IgG)。将所述的两种免疫球蛋白(Ig)所具有的抑制活性与一种不相关的免疫球蛋白G(IgG)所具有的活性进行了比较，其中所述的不相关的免疫球蛋白G(IgG)能够直接作用于人类正常T细胞表达和分泌因子(RANTES) (NI-0701)。附图M是一系列的图表，描述的是使用所述的免疫球蛋白G(IgG)Gll以及DA4所得到的剂量应答酶联免疫吸附检测(ELISA)，其中所述的免疫球蛋白G(IgG)Gll以及DA4能够作用于小鼠的5E3，嵌合型大鼠的5E3以及所述相对应的小鼠和大鼠的同型抗体。附图25是一系列的图表，描述的是一种用于在不同稀释度的小鼠血清内对所述的小鼠5E3进行检测的酶联免疫吸附检测(ELISA)，其中在所述的检测中使用所述的抗个体基因型的免疫球蛋白(IgG)Gll以及DA4作为捕获抗体。附图沈是一个图表，描述的是在利用所述的文库MnA以及MiB针对人类干扰素
Y(hIFNy)进行筛选的过程中噬菌体的输出/输入比例。附图27是一个图表，描述的是在一项单链抗体片段(scFv)的酶联免疫吸附检测(ELISA)中获得的所述命中率，其中所述的酶联免疫吸附检测(ELISA)是利用来自于所述的MnA、MiB以及MiC文库中的克隆进行筛选的，并且是在每一轮针对人类干扰素
Y(hIFNy)所进行的筛选之后进行的。将所述的阈值设定为利用所述的A6对照单链抗体片段(scFv)所获得的信号的一半。附图观是一个图表，表示的是在结合试验中给出不同水平的信号的所述单链抗体片段(scFv)所具有的分布频率，其中所述的结合是针对人类干扰素Y (hIFNy)而言的， 其是通过利用来自于所述的MnA以及MiB文库中的克隆而获得的。附图四是一个图表，描述的是使用经过纯化的单链抗体片段(scFv)制剂所得到的剂量应答酶联免疫吸附检测(ELISA)，其中所述的制剂能够作用于人类干扰素
Y(hIFN y )，并且是从来自于所述的MnA以及MiB文库中的克隆中获得的，以及与一种对人类干扰素Y (hIFNy)具有特异性的阳性单链抗体片段(scFv)所进行的比较(A6)。发明详述合成性的蛋白质文库并且特别是合成性的抗体文库是具有吸引力的，因为在所述的文库建立的过程中可能能够选择所述的构建单元，其中所述的构建单元用于组成这样的合成性的蛋白质并且包含了所期望的特征。然而，一个很重要的局限性是这样的合成性蛋白质的所述部分所具有的随机性能够生成大量的变体，这通常能够导致非功能性的蛋白质并且因此能够显著的降低所述的功能性文库的大小及其性能。合成性多样性所具有的另外一个局限性是用来对所述的随机的氨基酸延伸所具有的理论上的多样性进行覆盖所需要的所述文库的大小并不能够被覆盖，这归因于实际应用上的局限性。即使利用展示系统例如一种核糖体展示，可以建立并且采用一种IO13至IO14的多样性，其中所述的多样性能够最大程度的覆盖所述的具有9个氨基酸延伸的全部的随机选择。由于所述的天然可变重链互补决定区域3(⑶R H3)(在本发明中同样也被称之为所述的重链互补决定区域3或者VH CDR3)所具有的平均尺寸在9以上并且可以具有超过20个氨基酸的长度，合成性的多样性并不是一个用以建立这样的互补决定区域(⑶幻的可行性途径。某些方法的组合能够在所述的DNA序列中导入错误，其中所述的被组合的方法是一般情况下被用来进行DNA操作的方法以及那些被用在一种蛋白质文库的建立过程中的方法。这样的错误能够导致在所述的DNA所具有的阅读框内发生的改变，使所述的DNA将不再编码一种功能性的多肽。通常情况下，通过使用DNA片段的组装而建立起来的抗体文库中含有15%至45%的这样的序列，所述的序列在进行蛋白质的翻译时没有存在于所述的正确的阅读框之内，其中所述的DNA片段的组装是通过聚合酶链式反应(PCR)和/或限制性克隆的方式来进行的。这些非功能性的文库成员能够危及所述的抗体筛选以及识别过程所具有的效率并且因此被认为是上述领域中的一种局限性。在本发明中描述的所述方法允许向一种抗体文库中进行一种更为强有力的导入，这种强有力的导入是通过使用一种可供选择的克隆策略的方式来实现的。通常情况下所述的骨架内序列所具有的频率大约为 90%。本发明所具有的另外一个优点是能够将选定的受体抗体可变骨架与互补决定区域 (CDR)环进行组合，其中所述的互补决定区域(CDR)环具有进行正确折叠的高度概率。所述的方法允许对所述的长互补决定区域(CDR)进行捕获，其中难以利用合成性的随机选择途径对所述的长互补决定区域(CDR)进行覆盖。此外在本发明所描述的所述方法中不需要在所述的受体抗体可变编码区域内进行任何的修饰，用于对所述的经过多样性处理的序列进行克隆。这种方法所具备的另外一个优点是可以在同一组所述的受体抗体骨架内捕获到几种多样性的来源。这样的来源包括但不局限于来自于人类或者其他的哺乳动物的天然抗体互补决定区域(CDR)，来自于鸡抗体的互补决定区域(CDR)，抗体样分子所具有的互补决定区域(CDR)，来自于T细胞受体的可变环，其中所述的抗体样分子例如是来自于骆驼的 VHH，来自于鲨鱼的免疫球蛋白NAR(IgNAR)。除此之外，天然的互补决定区域(OTR)可以来自于天然的动物或者经过免疫的动物。在后者的情形中，所述的重新获得的互补决定区域 (CDR)被富集在所述的序列中，其中所述的序列是参与到所述抗原的识别过程中的序列，所述的抗原是用于进行免疫的抗原。在本发明中描述的所述方法具有的一个独特的特征是能够从非人类的物种中对所述的重链互补决定区域3(CDR!3)编码序列进行有效的捕获并且将它们插入到人类免疫球蛋白骨架内。使用这样的方法因此可能能够建立不同的抗体结合位点并且允许尝试一种不同的三维空间，其中所述的抗体结合位点适合来自于另外一个物种的所述的被捕获的可变重链互补决定区域3 (CDRro)个体。这样的方法允许建立具有新的特异性的人类抗体，与人类可变重链互补决定区域3 (CDRro)个体可以利用的靶向相比，其中所述的人类抗体能够作用于一种不同范围的靶向类别以及表位。此外，这样的新的抗体能够编码人类骨架以及互补决定区域I(CDRl)以及互补决定区域2(CDR2)区域并且因此适合用于进行人类的治疗。在这个方法中，被选定的蛋白质结构域，例如是抗体可变结构域，可以是被进行过修饰的，其中所述的修饰是通过导入一种填充序列的方式来实现的，所述的填充序列将可以被用来作为经过多样性处理的序列的整合位点。经过整合作用，所述的填充片段可以被
44完全的去除，因此留下完整的所述的受体蛋白质的编码区域以及所述被插入的蛋白质片段 (即，所述的互补决定区域(CDR))。这种整合事件是由一种IIs型限制性酶的使用来进行介导的，其中所述的限制性酶能够对存在于所述的DNA序列之中的一个指定的位点进行识别但是在距离这一位点指定的距离处对所述的DNA进行切断。这种途径具有两个主要的优点(1)它能够允许对所述的受体骨架进行消化但是不会对它们的编码序列产生影响(不需要进行工程化处理来添加沉默的限制性位点)；以及( 它能够允许所述的天然的经过多样性处理的序列进行消化以及克隆，而明显不会占有具有兼容性的限制性位点。正如上文中所描述的，为了建立抗体序列的文库和/或进行抗体序列的展示所进行的先前的尝试与本发明中提供的所述方法存在不同。例如，一些方法需要对所述的每一个互补决定区域(CDR)进行移植，例如在美国专利No. 6300064中描述的方法，在所述的方法中需要在所述的每一个互补决定区域(CDR)的边界上进行工程化处理来建立限制性酶位点，而不仅仅是在所述的可变重链互补决定区域3 (CDR H3)区域内。在其他的方法中，对来自于天然来源的互补决定区域(CDR)序列进行扩增以及重新排列，正如在例如美国专利 No. 6989250中所描述的。在一些方法中，例如在美国专利申请
发明者F·格内尤, M·科斯库-维尔博斯, N·费希尔, S·韦内-博诺, U·拉文 申请人:诺维莫尼公司