基因完整诱导的多能细胞或转分化细胞及其产生方法

专利名称：基因完整诱导的多能细胞或转分化细胞及其产生方法
技术领域：
本公开涉及对受体细胞或受体细胞核(优选人体细胞或人体细胞核)重编程(去分化和转分化)的方法和材料。这些方法尤其应用于基于细胞的治疗、组织移植、建立细胞系和产生基因修饰细胞和嵌合体动物或转基因动物的情况。 另一方面，本公开涉及“去分化”和/或改变所需受体细胞(优选人体细胞)寿命的方法。这些方法尤其应用于基于细胞的治疗和产生基因修饰细胞的情况。另一方面，本公开涉及实现体细胞转分化的方法。转分化是将细胞由一种分化细胞类型转化为另一种分化细胞类型。另一方面，本公开通常涉及将动物体细胞由一种特定分化状态重编程为另一种状态的方法，和这种细胞和组织在治疗人疾病和年龄相关病状中的用途。更具体地讲，本公开涉及利用三步法的改进方法，由此首先将体细胞核的核被膜重塑为未分化细胞或生殖谱系细胞的核被膜，然后第二步将重塑的细胞核转移至卵母细胞或未分化细胞的细胞质中。该核重塑步骤明显提高了重塑细胞核转移至胚胎或生殖谱系细胞质内以便干细胞衍生时的细胞重建效率。另外，去除对分化细胞有特异性的核被膜组分(例如核纤层蛋白A)和重编程染色质导致端粒酶活性再激活，加长端粒长度和修复串联重复DNA序列的同源重组机制。当通过这些方法得到多能干细胞时，多能干细胞可用于治疗心脏、神经、内分泌、血管、视网膜、皮肤、肌肉骨骼病症和其它疾病的新型治疗策略中。2.相关技术描述干细胞技术的进展，例如人胚胎干(hES)细胞的分离和使用，已成为医学研究中的新的重要主题。hES细胞具有经证实分化为人体各种细胞类型(包括复合组织)的潜能。hES细胞的这种能力表明由细胞功能异常引起的许多疾病可通过施用各种分化类型的hES源细胞来进行治疗(Thomson 等，Science. 1998 年 11 月 6 日；282(5391) :1145-7)。核移植研究证明了可将分化的体细胞转化回全能状态，例如ES或ED细胞的全能状态(Cibelli等，Nat Biotechnol. 1998年7月；16(7) :642-6)。通过核移植将体细胞重编程回全能ES细胞状态的技术发展提供了一种递送具有患者核基因型的ES源体细胞的方法(Lanza等，Nat Med. 1999年9月；5(9) :975-7)。尽管存在同种异体线粒体，但期望此类细胞和组织不被排斥(Lanza等，Nat Biotechnol. 2002年7月；20(7) =689-96) 核移植还允许通过再激活早期胚胎中端粒酶催化组分来改造细胞中的端粒重复长度(Lanza等,Science. 2000年4月 28 日；288(5466) :665-9)。
由于获得足够数量的人卵母细胞相对困难，人们对确定其它生殖谱系细胞，例如培养的ES细胞或来自所述细胞的细胞质是否可用于重编程体细胞产生了极大兴趣。由于这种细胞可易于在数量上体外扩增，所以在作为诱导重编程的方式上优于卵母细胞很多。与ES细胞融合后，在体细胞中观察到至少一些测量的胚胎特异性基因的表达恢复(Do和 Scholer, Stem Cells. 2004 ；22 (6) :941-9 ；Do 和 Scholer, Reprod Fertil Dev. 2005 ；17(1-2) :143-9)。然而，所得到的细胞为杂种且通常具有四倍体基因型，因此不适合作为用于移植的正常或组织相容性细胞。实际上，提出的生成自体全能细胞的一个目的是为了防止排斥ES源细胞。使用这些公开研究中描述的技术，因此用于重编程患者细胞的ES细胞很可能增加可产生导致排斥的免疫反应的等位基因。尽管如此，ES细胞可重编程体细胞 染色体的证据令研究者兴奋并且形成了称为“融合生物学”的新研究领域(Dennis，Nature426 :490-491, (2003))。然而，ES细胞研究受到围绕使用非期望IVF胚胎生成ES细胞和并不打算用于受精和妊娠而用于替代性方法以生成患者免疫相容细胞供再生医学应用的捐赠卵母细胞的争论的阻碍。目前许多国家对胚胎干细胞研究加以限制，包括对可用国家基金的限制以及对卵母细胞和胚胎使用的严格方针，从而导致该领域进展缓慢。而且，基于ES细胞治疗的临床有用性将受限制，除非可用不同组织相容性细胞来匹配个体患者。能够重编程比人卵母细胞更具可用性的人体细胞的另一潜在细胞来源为动物物种的卵母细胞。可通过跨物种核移植恢复体细胞全能性的证实(Lanza等，Cloning. 2000 ；2(2) :79-90)为鉴定可易于获得用于重编程人细胞的动物卵母细胞开创了可能性(Byrne等，Curr Biol. 2003年7月15日；13(14) :1206-13)。然而，尽管跨物种核移植是可能的，但其通常比同物种核移植效率更低，这可能是由于物种间的分子差异。因此，各种重编程人体细胞的方法均存在困难。SCNT提供了令人满意的重编程水平，但受到研究者可用的人卵母细胞数量的限制。跨物种核移植和细胞融合技术通常不受用于重编程的细胞限制，但受成功重编程程度或所得到的重编程细胞的生长强度限制。使用供体细胞的细胞质进行去分化的替代方案是引入限定因子。为鉴定一组可使用的去分化因子，Takahashi和Yamanaka(2006年8月25日；126(4) :663-76)通过逆转录病毒转导将候选基因引入小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)。每个逆转录病毒载有单个候选基因，并且候选基因的组合通过多次感染引入。还对MEF进行工程改造，以在ES细胞特异性Fbxl5启动子的控制下表达选择性标记，使得在抗生素G418存在下的细胞存活依赖于成功去分 化。通过测试不同因子的组合，作者证实4种转录因子基因(0ct4、SOX2、c-Myc和Klf4)的组合产生称为诱导的多能(iPS)细胞的ES样多能细胞。Yu等使用类似方法(Science. 2007年 12 月 21 日；318(5858) :1917-20)、通过病毒整合编码 0ct4、Sox2、Nanog 和 Lin28 的基因生成人iPS细胞。虽然逆转录病毒转染是同时将多个基因递送至体细胞内的有效方法，但将其用于去分化出现安全忧虑。因为这些方法导致多个基因在多个位点整合，难以使用切除转基因(例如，Cre-Lox和FLP-FRT)的靶向技术，因为可能导致非期望的缺失和其它染色体内和染色体间基因组重排。而且，插入逆转录病毒载体可能威胁转染的细胞基因组的完整性，(例如)通过影响非靶向基因，通过整合非所需病毒序列和通过异常表达导致恶性肿瘤的整合基因。实际上，再激活逆转录病毒携带的c-Myc导致在约50%由iPS细胞培育的嵌合体小鼠体内形成肿瘤(Okita 等，Nature. 2007 年 7 月 19 日；448(7151) :313-7)。
鉴于上述，需要安全有效的方法对细胞去分化或转分化。所需方法要避免使用胚胎或胚胎源物质，并且还要避免非所需的基因组序列变异。尤其是需要提高重编程分化体细胞和生成重编程细胞的频率和质量的方法，所述重编程细胞能够体外扩增以获得可用数量的细胞进行研究、测试以便质量控制和用于基于细胞的治疗。优选地，这些方法提供了用于治疗的患者来源的细胞的可行来源。发明概述申请人:描述了用于对体细胞(优选人体细胞)重编程或转分化的方法和材料，所述体细胞可任选地经基因修饰，使其包含异种核酸序列，并且可通过新方法生成iPS细胞将基因组序列变异的风险降到最低，并且延长细胞寿命和减轻衰老。这些方法采用包含或编码一种或多种内源性或重组重编程因子或功能片段、变异体或融合多肽或细胞提取物的组合物，所述细胞提取物含有所述内源性重编程因子以“重编程”所需供体或受体细胞或细胞核或其染色体DNA，优选地人体细胞或细胞核或其染色体DNA。如以下所定义，本公开中“重编程”预期涵盖任何使用含有或编码一种或多种内源性或重组重编程因子或功能片段、变异体或含有的融合多肽的组合物将供体或受体细胞或细胞核转化为低分化或去分化或恢复细胞(例如，诱导的多能细胞或胚胎干细胞或成人干细胞或相对于亲本细胞寿命延长的细胞，证据为，例如，相对于亲本细胞端粒增多或细胞分裂增加)或将体细胞或细胞核转分化为含有所述细胞核的细胞或胞质体或不同细胞类型或谱系的细胞的方法。在示例性实施方案中，重编程因子包括内源性或重组的重编程多肽或功能片段、变异体或含有的融合多肽，例如其可构成供体细胞的细胞质，可经重组合成或生成，可任选包括一个或多个修饰，并且可任选被纯化。在某些实施方案中，重编程多肽包括Nanog、0ct4、Sox2、c-Myc、Klf4和Lin28的一个或多个多肽或含有的功能片段、变异体或融合多肽。另外，一个或多个重编程多肽可连接促进ES细胞进入和/或核易位的细胞核或蛋白质易位域。由这些方法制备的复原或转分化或重编程细胞和细胞核可用于许多应用，包括(例如)基于细胞的治疗和异源蛋白质的表达。用于基于细胞的治疗的细胞可源自患者或组织相容性供体。另外，用于基于细胞的治疗的细胞可被基因改造以改变其组织相容性特征。如前所述，细胞任选包括所需基因修饰，例如避免与特定遗传性疾病(例如囊性纤维化、ALD、镰刀形红细胞贫血病、癌症、自身免疫疾病)有关的基因异常的基因修饰，和/或基因修饰以供治疗多肽或免疫调节子表达(组成型、调节或组织特异性)。在一个优选实施方案中，本公开提供了通过用包含来自未分化或大体上未分化细胞(优选卵母细胞或卵裂球或另一胚细胞类型(例如，胚胎干细胞))的细胞质的细胞源性提取物并置或孵育供体细胞或其细胞核来生成已去分化和/或改变(延长)其寿命的重编程细胞核和细胞(优选哺乳动物细胞并且最优选人细胞)的新方法。在一个特别优选的实施方案中，本发明将用于生成更具原始状态的细胞，尤其是胚胎干细胞或内细胞团细胞。另一方面，本公开提供了通过向这些细胞或其细胞核引入或使其接触含有来自更原始的低分化细胞类型(例如，卵母细胞或卵裂球或ES细胞)的细胞质的组合物来对所需“受体”细胞(例如，人体细胞)去分化或改变其寿命的方法。在示例性实施方案中，这些方法可用于通过使所需细胞受多次基因修饰而不衰老以生成胚胎干细胞并提高基因治疗功效。这种细胞质可分离和/或进行扣除杂交并且通过重组方法鉴定和生成活性物质(足以去分化)。另一方面，本申请提供用于对所需细胞重编程即“去分化”和/或改变其寿命的方法，(例如)通过向细胞或细胞核引入或以足以实现去分化或延长细胞或含有该细胞核的细胞的寿命的时间使其接触来自另一细胞(例如，低分化细胞)的细胞质，然后将去分化细胞或细胞核移植至替代胞质体，例如来自低分化细胞的ES细胞，优选卵母细胞或卵裂球或另一胚细胞类型。另一方面，本申请提供了在基因修饰之前、同时或之后改变所需细胞寿命和/或对所需细胞去分化的方法，所述所需细胞通常为哺乳动物分化细胞。另一方面，本申请提供了细胞治疗的改进方法，其中改进包括施用已经通过引入从低分化或未分化状态的细胞(优选卵母细胞或卵裂球)获得的细胞质去分化或寿命改变的细胞，或将来自所述体细胞的细胞核置于含有卵母细胞或卵裂球胚胎提取物或ES细胞或从中纯化的蛋白质的溶液中。
另一方面，本申请提供了(例如)通过分离或扣除杂交，即分离蛋白质、RNA或DNA来鉴定卵母细胞细胞质中负责去分化和/或改变细胞寿命的组分。另一方面，本申请提供了通过施用治疗有效量的从大体上未分化或未分化细胞(优选卵母细胞或卵裂球)获得的细胞质或其纯化活性组分来治疗(尤其皮肤)的方法。另一方面，本申请提供了供治疗、皮肤病学和/或美容使用的新型组合物，所述组合物含有从大体上未分化或未分化细胞，优选卵母细胞或卵裂球获得的细胞质或其纯化活性组分。另一方面，本申请提供了用于基于细胞的治疗的细胞，已通过引入包含来自大体上未分化或未分化细胞，优选卵母细胞或卵裂球获得的细胞质或其纯化活性组分而“去分化”所述细胞或改变其寿命。另一方面，本申请提供了通过核移植克隆的改进方法，其中所述改进包括将供体细胞或细胞核用作已通过接触包含来自大体上未分化或未分化细胞的细胞质或其纯化活性组分的组合物或用所述组合物孵育或向其中引入所述组合物而被去分化或其寿命被改变的细胞，或跨物种NT，其中表达所述纯化活性组分以促进重编程。另一方面，本申请提供了通过使细胞核接触包含来自卵母细胞、卵裂球、ES或其它胚胎细胞类型的细胞质的组合物而恢复细胞核的方法。另一方面，本申请提供了鉴定蛋白质或核酸序列的筛选测定，所述蛋白质或核酸序列是与细胞质或源自来自卵母细胞、卵裂球、ES细胞或所有重编程中涉及的其它胚胎细胞类型的细胞质成分接触后由分化细胞所释放。另一方面，本申请提供了筛选测定，例如差示杂交或扣除杂交以鉴定细胞编程中涉及的卵母细胞细胞质或胚胎细胞类型中表达的mRNA。所得的细胞用于基因和细胞治疗，并且作为供体细胞或细胞核用于核移植。本公开还提供了一种实现体细胞或细胞核转分化(即，将一种细胞类型的体细胞或细胞核转化为不同细胞类型的体细胞或细胞核)的方法。可通过在选自以下的至少一种试剂的存在下培养体细胞或细胞核来实施所述方法(a)细胞骨架抑制剂和(b)乙酰化抑制剂和(C)甲基化抑制剂；并且还在诱导分化为不同细胞类型的试剂或条件存在下培养细胞。所述方法可用于生成用于细胞治疗的组织相容性细胞。
本公开还涉及获得具有与哺乳动物发育胚胎或胎儿类似的基因表达模式的哺乳动物细胞和组织的方法，和这种细胞和组织在治疗人疾病和年龄相关病状中的用途。更特别地，本公开包括鉴定、在培养中扩增和制备基因表达模式不同于成人细胞的哺乳动物多能干细胞和分化细胞的方法，因此提出了提供治疗变性疾病的新型治疗策略的独特特征。本公开还提供了动物体细胞的重编程方法，衍生、制备方法和所得到的重编程细胞和工程化组织在预防和治疗疾病的治疗方案中的用途。更具体地讲，本公开提供了将分化细胞重编程为未分化状态、延长端粒长度并因此延长复制寿命，从而生成具有与原始分化细胞基因型相同的核基因型的多种干细胞和所得到的分化细胞的改进方法。本方法也可用于分析核重编程和/或生成供研究和治疗用的分化细胞的机制。所述方法代表现有技术的改进,例如人体细胞核移植(SCNT)，所述技术用于将动物体细胞去分化为胚胎状态，从而生成hES细胞。本公开提供了通过将细胞重编程分为至少2个单独步骤或优选3个单独步骤，将来自供体细胞源的细胞质组分用于一些所述步骤中改进现有技术的方法，其中所述供体源为来自与卵母细胞不同物种的分化细胞。使用来自与卵母细胞不同物种的供体细胞源使易于进入重编程物质，降低成功重编程程度和分化细胞重编程 过程的扩大比例。在一个实施方案中，通过由以下3个步骤组成的新型重编程技术将分化体细胞重编程为未分化状态在第一步骤(称为核重塑步骤)中，提高了体细胞基因组的重编程程度，并且通过使用若干新型重编程方法的任一种或其组合缓和了进入与体细胞相同物种的卵母细胞的问题。在所有这些新方法中，重塑体细胞核以用未分化细胞组分代替核被膜组分。同时，或在足够早以防止体细胞分化组分并入核被膜的时间点，重编程所述细胞的染色质以表达未分化细胞的基因。第一步骤优于现有SCNT技术，因为不需要与体细胞相同物种的卵母细胞；进一步地，可达到更高的重编程质量。在第二步骤(本文称为细胞重建步骤)中，含第一步骤中的重塑核被膜的细胞核转移到未分化胚胎细胞的去核细胞质中，或与含有必需有丝分裂器的细胞质泡囊融合，所述有丝分裂器能够与转移的细胞核一起生成未分化干细胞群，例如能够增殖的ES或ED样细胞。第二步骤优于SCNT，因为第一步骤中重塑的大量细胞核或染色体团块可能同时与第二步骤的细胞质泡囊融合，以增加获得能够在体外成功增殖的重编程细胞的可能性，从而形成大量培养的重编程细胞。在第三步骤中，由第二步骤产生的一个或大量细胞产生的细胞集落特征在于重编程程度和核型正常，并且选择高质量的集落。虽然这第三步骤成功编程细胞并不需要并且在本方法的一些应用中并不必要，所述应用例如在分析用于多种用途的重编程分子机制中，例如当重编程用于人移植的细胞时，但优选包括第三步质量控制。通过重复步骤1-2或1-3可回收核型正常但重编程程度不足的重编程细胞集落。在另一个实施方案中，在第一步骤中通过将一个或大量渗透化或非渗透化体细胞转移至另一物种的卵母细胞中来重塑细胞核。然后去除所得到的重塑细胞核，并在第二步骤和第三步骤中进一步加工。在另一个实施方案中，在第一步骤中通过将分离的体细胞核暴露于来自有丝分裂细胞，例如中期II卵母细胞、中期生殖谱系细胞(例如EC细胞系NTera-2)的提取物或相同或不同物种的有丝分裂体细胞的提取物凝聚为染色体团块而重塑体细胞的基因组。然后在第二步骤和第三步骤中进一步加工所述染色体团块，并且如果细胞未显示可接受的重编程程度，则重复前述步骤。在另一个实施方案中，在第一步骤中通过将分离的体细胞核暴露于来自有丝分裂细胞，例如中期II卵母细胞、中期生殖谱系细胞(例如EC细胞系NTera-2)的提取物或相同或不同物种的有丝分裂体细胞的提取物凝聚为染色体团块而重塑体细胞的基因组。然后接着使用来自未分化细胞的提取物将所述染色体团块封装在体外的新核被膜中。然后在第二步骤和第三步骤中进一步加工所得到的重塑细胞核，如果细胞未显示可接受的重编程程度，则重复前述步骤。另外，重塑细胞核和细胞可用于分析重编程机制的测定中。在另一个实施方案中，未分化细胞(例如，EC细胞、ES细胞等)中表达的一个或多个因子在未分化细胞提取物中瞬时表达或过度表达，或者将步骤I和/或步骤2的细胞作为蛋白质加入所述细胞提取物中。这些因子的表 达可赋予体细胞未分化细胞的特征并且促进体细胞重编程。这种因子包括(例如)NAN0G、S0X2、DNMT3B、CR0C4、H2AFX、HIST1H2AB、HIST1H4J、HMGB2、LEFTB, MYBL2、MYC、MYCN、NANOG、0CT3/4 (P0U5F1)、0TX2、SALL4、TERFl、TERT、ZNF206或上述因子的任一组合或赋予未分化细胞状态的特征的任何其它因子(例如转录调节子)。尤其，可使用任何数量的上述因子或其组合，其选择可取决于重编程或去分化体细胞的谱系。在另一个实施方案中，本方法第一步骤中各种体外重编程用作核重编程的体外模型用于分析重编程的分子机制。例如，可向提取物加入或从其中去除特定分子组分以确定某些组分在重编程和细胞谱系确定中的作用。在另一个实施方案中，然后相应地将经确定在以上测定中或通过其它方式鉴定的重编程中起重要作用的各种组分并入重编程提取物或从其中去除以提高相同物种或跨物种重编程法中的重编程效率。这种分子包括但不限于人蛋白质组分、纯化RNA，包括来自卵母细胞、卵裂球、桑葚胚、ICM、胚盘、ES细胞、EG细胞、EC细胞或其它生殖谱系细胞的miRNA。在1-3任一步骤期间均可加入或去除所述组分。可通过例如免疫沉淀反应等方法去除特定组分。在另一个实施方案中，重复步骤1-2，如第一步骤，然后第二步骤，然后第一步骤，然后第二步骤，直至第三步骤中的表征证实体细胞重编程成功。另一方面，来自未分化或生殖谱系细胞的胞质体耗尽线粒体以使得在第二步骤之前、期间或之后向细胞系中加入供体细胞线粒体而产生重编程细胞，其中线粒体基因型以及核基因型与供体分化细胞相同。在另一个实施方案中，将未分化细胞因子，例如S0X2、NANOG、DNMT3B、CR0C4、H2AFX、HIST1H2AB、HIST1H4J、HMGB2、LEFTB, MYBL2、MYC、MYCN、NANOG, 0CT3/4 (P0U5F1)、0TX2、SALL4、TERFUTERT、ZNF206加入到来自步骤2的未分化或生殖谱系细胞的胞质体或细胞质泡囊中。在特定实施方案中，向胞质体加入2、3、4或5种因子。在其它实施方案中，向胞质体加入6种或更多种因子。另一方面，由于使用步骤1-2或1-3产生的重编程细胞在若干体外、体内或体外分化条件下分化，以获得3种原胚层(内胚层、中胚层或外胚层)的任一种或其组合的细胞，包括复合组织，例如畸胎瘤内形成的组织。在某些实施方案中，分化细胞类型源自本方法的重编程细胞，而不生成ES细胞系。例如，通过在至少一种分化因子存在下培养未分化的重编程细胞并从培养物中选择分化细胞获得分化细胞。可根据表现型，例如表达分化细胞上存在的某些细胞标记，或者通过功能测定(例如，实现特定分化细胞类型的一种或多种功能的能力)。通过本方法获得的分化细胞包括但不限于成人干细胞、胰腺β细胞和胰腺前体细胞。在另一个实施方案中，通过添加、缺失或修饰其DNA序列对根据本方法重编程的细胞进行基因修饰。可通过任意并入外源载体，通过基因打靶或通过使用人工染色体进行这种修饰。在本方法的另一个实施方案中，通过加入来自已知同源重组水平较高的细胞(例如，DT40)的提取物修饰第一步骤中进行重塑的细胞核。步骤2重建和步骤3筛选之后，加入DNA靶向构建体和来自容许较高同源重组水平的细胞的提取物将获得具有所需基因修饰的细胞。另一个实施方案为将使用所述方法生成的细胞商业化的商业模型。商业模型包括将人分化体细胞转移至区域中心，其中进行重编程步骤1、2、1_2或1-3。在另一个实施方案中，冷冻储藏应用步骤1、2、1_2或1-3产生的分化体细胞或重编程细胞供将来使用。在另一个实施方案中，将应用步骤1、2、1_2或1-3产生的重编程细胞运至医疗机构，在那里将重编程细胞分化为用于研究和移植的医用细胞类型。在另一个实施方案中，将含有用于实施步骤1、2或3活动的成分的试剂盒运至研究、生物医学或医疗机构，在那里试剂盒用于将分化细胞重编程为用于研究和移植的细胞类型。在另一个实施方案中，在将应用步骤1、2、1_2或1-3产生的重编程细胞分化为有用细胞类型的组合物之后运送至医疗机构。尽管实施方案也可能实现比以上例示的全部优点更少的优点或与其不同的优点，但通过以下描述和权利要求，本发明的其它特征和优点将显而易见。
附图简述图I说明了用于某些重编程蛋白质的克隆和细菌表达的pTAT-HA载体。图2示出了染色电泳凝胶上经镍柱纯化的TAT_hOCT4和TAT_hNanog构建体。图3示出了染色电泳凝胶上经镍柱纯化的TAT-Klf4、TAT_Sox2和TAT_cMyc。图4示出了用TAT_h0ct4融合蛋白处理人ES细胞之后碱性磷酸酶的减少的强度。图5说明了用于某些重编程蛋白质的哺乳动物表达的pSecTag2B载体。图6示出了 pSecTag2B载体多克隆位点。图7示出了染色电泳凝胶上的0ct4和Nanog融合蛋白(由293细胞免疫纯化)。图8示出了蛋白质转染36h之后，0ct4和Nanog融合蛋白进入人新生儿皮肤成纤维细胞。图9使用优化方法通过SLO渗透化293T细胞摄取荧光若丹明标记的清蛋白。在若丹明标记的清蛋白存在下使用SLO渗透化的人293T细胞。左图明视场显微镜图像；右图相同视场的荧光显微镜视图。

图10未分化hES细胞培养物用于生成全细胞提取物的表征。通过(a)相差显微术；(b)碱性磷酸酶活性测定；和表达hES细胞标记的免疫荧光法；(c) Oct-4 ； (e) SSEA-3和(f)Tra-l-81检查hES细胞系ACT-4的培养物。图(d)描述了与(c)中0ct_4染色相同视场的细胞核的DAPI染料。图11使用hES细胞提取物和渗透化293T细胞重编程孵育物之后获得的细胞集落形态。涂于MEF饲养层之前，渗透化293T细胞并在hES细胞培养条件下用对照293T提取物(左列，图IIA和11C)或hES细胞提取物(右列，图IIB和11D)孵育293T细胞。通过相差显微术检查获得集落。所示结果来自两次实验(第一次实验，IlA-B ;第二次实验，11C-D)。放大倍数40X。图12和13 :通过以2. 5-7. 5 μ g/m CB处理胎牛成纤维细胞并且在诱导神经分化的条件下培养生成的具有神经元形态的细胞。通过相差显微术观察到图12中的细胞；通过DIC 观察到图 14 中的细胞。图 12 :⑷对照、(Β)2. 5μ g/ml、(C)5. 0μ g/ml、0))7. 5μ g/ml。图14和15 :通过以10. O μ g/m CB处理成牛成纤维细胞而生成的具有神经元形态的细胞并且其在诱导神经分化条件的培养。图16 :通过以5. O μ g/m CB处理人胎儿成纤维细胞而生成的具有神经元形态的细胞并且其在诱导神经分化条件的培养。(A)对照、(B) 2. 5 μ g/ml、(C) 5. O μ g/ml、(D) 7. 5 μ g/ml ο图17 :显示在经5. O μ g/m CB处理并且在诱导神经分化的条件下培养的人胎儿成纤维细胞中存在的神经特异性标记nestin和Tujl的照片。图18显示重塑一个卵母细胞内的多个体细胞核，然后溶解卵母细胞以恢复重塑的细胞核，并且其与ES细胞细胞质泡囊融合以获得ES细胞系。图19示出了显示分离染色体、染色质或细胞核的体外改变的图。纯化重组酶或无细胞提取物示为球形。
发明详述
重编程试剂如上所述，本文的“重编程”指通过向所需受体或供体细胞或受体细胞核或其染色体DNA引入含有或编码一种或多种重编程因子的组合物或用所述组合物孵育，将所需受体或供体细胞或受体细胞核或其染色体DNA转化为低分化细胞或细胞核(例如,包含所述重编程细胞或细胞核的去分化细胞(例如，iPS或ESC或成人干细胞))或不同类型或谱系的细胞的方法。由原始细胞细胞质诱导去分化或转分化的体细胞和体细胞核的成功去分化和转分化确认了其中存在能够促进或引起细胞或细胞核重编程的物质或因子。已显示当原始细胞中表达的某些基因产物(包括0ct4)的量足够且存在时间足够长时，这些基因产物足以引起体细胞和体细胞核去分化，例如其中通过病毒转化诱导这些基因产物表达。这些结果已证实早期发育状态或原始状态下的细胞的细胞质含有足以引起或促进细胞分化的基因。可用于本文所述方法的示例性重编程试剂包括重编程多肽和小分子，并且任选包括促进剂。重编程多肽包括0ct4、Sox2、Nanog、c-Myc、Klf4和Lin28以及含有上述的任何功能片段、变异体和融合物。编码这些和其它重编程多肽的基因分别示于表I和2。这些重 编程多肽可单独或组合使用。在一个示例性实施方案中，可通过本文所述方法测试不同重编程多肽的组合以鉴定哪些单独或组合的重编程多肽引起特定供体或受体细胞或细胞核成功重编程。尽管可能组合的数量很多，但可使用合并法以大大降低鉴定有效组合所需的工作强度。例如，上文Takahashi和Yamanaka使用含有多达24个基因的逆转录酶病毒混合物去分化体细胞；随后，“留一法(leave one out) ”实验允许鉴定有效基因组。可使用类似方法鉴定起作用的重组重编程多肽及其混合物。一种补充方法采用类似逆转录病毒法，但利用了分化细胞群体异种性的优点，通过测试所得到的去分化细胞鉴定哪些逆转录病毒组合实际上并入每个去分化细胞系。本领域已知的方法，尤其是高通量法(例如微阵列和PCR)(使用逆转录病毒构建体内包含的候选基因特异性序列和/或条码)可用于鉴定引起去分化细胞的整合构建体组合。例如，基于病毒的方法可用于鉴定重编程基因的有效组合，然后可使用不会引起基因组序列修饰的方法，例如通过接触这些基因编码的多肽，使用有效组合重编程细胞。使用这些方法，可由一种或多种重编程试剂及其组合最有效地重编程不同类型的体细胞和不同物种的细胞。本文所述方法将使这种物种特异性和细胞类型特异性重编程试剂组合易于鉴别。在鉴定起作用的重编程因子组合的同时，这些方法可依据待重编程的特定细胞产生不同结果。例如，因为某些受体细胞(例如成人干细胞)可内源性表达一种或多种重编程多肽(重编程水平足以实现，而无需外源添加重编程多肽)，使用很少(例如，单个)重编程因子就可重编程这些细胞。相反，重编程不会内源性表达任何重编程因子的细胞可能需要使用含若干重编程因子的混合物。例如，已证实神经祖细胞和星形神经胶质内源性表达 Sox2 (Komitova 和 Eriksson, Neurosci Lett. 2004 年 10 月 7 日；369 (I) :24_7 ；Ellis 等，Dev Neurosci. 2004 年 3 月-8 月；26 (2-4) :148-65 ;Avilion 等，Genes Dev. 2003年 I 月 I 日；17(1) :126-40 ;D，Amour 和 Gage，Proc Natl Acad Sci U S A. 2003 年 9 月 30H ；100Suppl I :11866-72 ;Miyagi 等，Mol Cell Biol. 2004 年 5 月；24(10) :4207-20)，因此期望在不添加外源Sox2情况下被有效重编程。本方法的其它示例性重编程试剂包括引起候选重编程多肽表达的试剂。这些包括诱导基因表达的传统方法，例如mRNA、逆转录病毒以及可诱导细胞表达重编程基因的小分 子。例如，使用SiRN技术可抑制重编程基因表达的抑制基因。可通过筛选法，优选本领域熟知的高通量筛选法鉴定这些试剂。在某些示例性实施方案中，重编程试剂可包括一种或多种促进重编程的试剂(“重编程促进剂”)。示例性重编程促进剂有助于促进重编程期间发生的后生变化。示例性重编程促进剂包括脱乙酰基酶抑制剂和DNA甲基化抑制剂，例如组蛋白脱乙酰基化和DNA甲基化中涉及的RNAi靶向基因。脱乙酰基酶抑制剂还包括制滴菌素A(Yoshida等，Bioessays. 1995 年 5 月；17 (5) :423-30)、伏立诺他(Zolinza,可从 Merck & Co. , Inc.购买)和丙戊酸。DNA甲基化抑制剂包括甲基转移酶抑制剂，例如5-氮杂-胞苷(Boukamp，Semin Cell Biol. 1995 年 6 月；6(3) : 157-63)和 5-氮杂-2'-脱氧胞苷。表I小鼠候选重编程基因
权利要求
1.一种将非多潜能或非多能受体人或非人动物体细胞或其细胞核转化为多潜能或多能细胞或转化为细胞核或转化为不同细胞命运或细胞谱系的细胞或细胞核的方法，其包括: 提供非多潜能或非多能受体人或非人动物体细胞或非多潜能或非多能受体人或非人动物体细胞的细胞核；和 用包含至少一种重编程因子的至少一种重编程组合物处理所述受体细胞或所述非多潜能或非多能受体人或非人动物体细胞的细胞核，处理时间足以将所述人或非人动物受体细胞或含有所述经处理细胞核的胞质体转化为多潜能细胞或转化为不同细胞命运或细胞谱系的细胞。
2.根据权利要求I所述的方法，其中至少一种所述重编程因子由将至少一种重编程因子分泌至含有所述受体细胞或细胞核的水介质中的源细胞提供或者其中至少一种所述重编程因子由从多能细胞获得的细胞提取物提供。
3.根据权利要求I所述的方法，其中所述用重编程组合物处理所述受体细胞或细胞核的步骤包括使所述受体细胞接触所述重编程组合物不止一次和/或延长孵育期。
4.根据权利要求3所述的方法，其进一步包括对所述受体细胞或细胞核进行表型监测以测量其出现一种或多种与多潜能或多能细胞有关的表型。
5.根据权利要求4所述的方法，其中所述表型监测包括选自以下的一项或多项测量检测与多潜能或多能细胞有关的一个或多个基因的表达；检测一个或多个与多潜能状态有关的基因的启动子的甲基化状态和/或组蛋白乙酰化状态；测量工程化多潜能性或多能性报告子构建体的表达；和检测细胞形态。
6.根据权利要求I所述的方法，其中所述重编程组合物包含0ct4多肽。
7.根据权利要求I所述的方法，其中所述重编程组合物包含0ct4和/或Nanog，所述0ct4和/或Nanog含有与报告子和/或促进所述多肽内化于所述细胞核中的部分任选地融合的多肽。
8.根据权利要求6所述的方法，其中所述工程化多潜能性或多能性报告子构建体为P0CT4-GFP 构建体。
9.根据权利要求6所述的方法，其中通过所述表型监测确定使所述受体细胞或细胞核接触所述重编程组合物的间隔，以将所述受体细胞变成多潜能细胞所需的总持续时间缩到最短。
10.根据权利要求I所述的方法，其中所述重编程因子基本上不含能够对所述受体细胞进行基因修饰的病毒。
11.根据权利要求I所述的方法，其中所述重编程组合物包含重编程多肽。
12.根据权利要求11所述的方法，其中所述重编程多肽基本上不含编码所述重编程多肽的多核苷酸。
13.根据权利要求11所述的方法，其中所述重编程多肽包括至少一种促进所述重编程多肽进入所述受体细胞和/或促进所述重编程多肽进入所述受体细胞核中的蛋白质转导域。
14.根据权利要求13所述的方法，其中每个蛋白质转导域均包括独立选自SEQID NO1-10的任一多肽或其任一组合的多肽。
15.根据权利要求13所述的方法，其中所述重编程多肽基本上不含能够对所述受体细胞进行基因修饰的病毒、转染培养基、链球菌溶血素O、毛地黄皂苷、阴离子两亲性化合物、脂质体和促进多核苷酸进入受体细胞的其它组分。
16.根据权利要求11所述的方法，其中所述重编程组合物包含一种或多种选自以下的多妝Nanog、c_Myc、0ct4、Klf4> Sox2 和 Lin28。
17.根据权利要求11所述的方法，其中所述重编程组合物包含0ct4或至少一种选自Nanog、c_Myc、Klf4、Sox2 和 Lin28 的重编程多妝。
18.根据权利要求11所述的方法，其中所述重编程多肽包含于供体细胞的细胞质中。
19.根据权利要求18所述的方法，其中所述供体细胞选自卵母细胞、内细胞团细胞、桑葚胚细胞、胚泡细胞、ES细胞、成人干细胞和原生殖细胞。
20.根据权利要求19所述的方法，其中所述供体细胞已经过基因修饰以增强一种或多种选自Nanog、c-Myc、Klf4、Sox2和Lin28的重编程多肽的表达。
21.根据权利要求18所述的方法，其中所述供体细胞的细胞质与所述受体细胞或细胞核为相同物种。
22.根据权利要求18所述的方法，其中所述供体细胞的细胞质与所述受体细胞或细胞核为不同物种。
23.根据权利要求22所述的方法，其中对于所述Nanog、c-Myc,0ct4、Klf4、Sox2和Lin28多肽而言，所述供体和受体细胞或细胞核物种之间蛋白质序列相似性的平均程度为至少95%。
24.根据权利要求I或18中任一项所述的方法，其中所述受体细胞或细胞核为人的，而所述供体细胞的细胞质或编程因子为人或非人灵长类来源。
25.根据权利要求24所述的方法，其中所述非人灵长类选自人、黑猩猩、狒狒、猩猩、猕猴和大猩猩。
26.根据权利要求I所述的方法，其中用重编程组合物处理所述受体细胞或细胞核的所述步骤选自以下与脂质体融合；与去核的供体细胞融合；与含有至少一种重编程因子的细胞质泡囊融合或接触；电穿孔；显微注射；和在含有所述重编程组合物且任选包含细胞和/或细胞核进入试剂的培养基中培养所述受体细胞或细胞核。
27.根据权利要求26所述的方法，其中所述细胞和/或细胞核进入试剂选自链球菌溶血素O、毛地黄皂苷和阴离子两亲性化合物。
28.根据权利要求I所述的方法，其中所述受体细胞为原代细胞或者其中所述受体细胞核源自原代细胞。
29.根据权利要求I所述的方法，其中所述受体细胞选自成纤维细胞、神经细胞、星形细胞、胶质细胞和Sox2表达细胞。
30.根据权利要求I所述的方法，其进一步包括用一种或多种选自以下的方法测试所述多潜能或多能细胞 测量DNA甲基化、测量组蛋白乙酰化、核型分析、基因组测序、测量基因表达等， 由此确认所述多潜能细胞的同一性。
31.根据权利要求I所述的方法，其中所述受体细胞或细胞核为人的，并且所述方法产生多能人干细胞或干细胞样细胞。
32.—种治疗疾病的方法，其包括 提供源自细胞供体的受体细胞或细胞核； 通过根据权利要求I至31中任一项所述的方法使所述受体细胞转变为多潜能或多能细胞； 任选地，对所述多潜能或多能细胞进行基因修饰； 任选地，通过引起、促进和/或加强分化为一种或多种细胞类型的处理来处理所述多潜能或多能细胞；和 将所述多潜能或多能细胞或源自其的分化细胞引入需要其的人或非人动物患者中； 其中所述多潜能或多能细胞与所述患者具有组织相容性。
33.根据权利要求32所述的方法，其中所述细胞供体和所述患者为相同个体。
34.根据权利要求32所述的方法，其中所述细胞供体和所述患者为不同个体。
35.根据权利要求32所述的方法，其中所述多潜能或多能细胞的基因修饰包括提高与所述患者的组织相容性的修饰。
36.一种重编程组合物,其包含至少两种选自Nanog、c-Myc、Oct4、Klf4、Sox2和Lin28的重编程多肽。
37.根据权利要求36所述的重编程组合物，其包含0ct4和至少一种选自Nanog、c-Myc、Klf4、Sox2和Lin28的重编程多肽。
38.根据权利要求36或37中任一项所述的重编程组合物，其进一步包含受体细胞或受体细胞核。
39.根据权利要求36或37中任一项所述的重编程组合物，其中一种或多种所述重编程多肽连接至少一个蛋白质转导域。
40.根据权利要求39所述的重编程组合物，其中每个所述蛋白质转导域均独立选自SEQ ID NO :1-10的任一多肽或其任一组合的多肽。
41.根据权利要求36或37中任一项所述的重编程组合物，其中所述重编程多肽包含于供体细胞的细胞质中。
42.根据权利要求41所述的重编程组合物，其中所述供体细胞的细胞质源自选自以下的细胞未受精卵母细胞、受精卵母细胞、胚胎干细胞、iPS细胞、畸胎瘤细胞、卵裂球和内细胞团细胞。
43.根据权利要求41或42中任一项所述的重编程组合物，其中所述供体细胞的细胞质源自经处理而引起一种或多种选自Nanog、c-Myc、0ct4、Klf4、Sox2和Lin28的重编程多肽表达的细胞。
44.根据权利要求41所述的重编程组合物，其中所述供体细胞的细胞质与所述受体细胞或细胞核为相同物种。
45.根据权利要求41所述的方法,其中所述供体细胞的细胞质与所述受体细胞或细胞核为不同物种。
46.根据权利要求45所述的方法,其中对于所述Nanog、c-Myc>0ct4、Klf4、Sox2和Lin28多肽而言，供体和受体细胞物种之间蛋白质序列相似性的平均程度为至少95%。
47.根据权利要求I所述的方法，其产生多能人细胞或细胞核。
全文摘要
本公开涉及对受体细胞(优选人体细胞)去分化和转分化的方法。这些方法将非所需基因组序列变异的风险降到最低。这些方法采用可单独使用或相互以某些组合方式使用的重编程因子。这些方法尤其应用于基于细胞的治疗、建立细胞系和产生基因修饰细胞的情况。
文档编号C12N5/07GK102803473SQ201080031517
公开日2012年11月28日 申请日期2010年5月25日 优先权日2009年5月27日
发明者I·克利曼斯卡雅, S-J·陆, R·兰扎 申请人:先进细胞技术公司