专利名称：组合工程的制作方法
技术领域：
本发明系关于细胞培养技术之领域。其系关于核糖体RNA(rRNA)表达增加之生产宿主细胞系，该种增加系透过引入编码UBF之核酸或减少NoCR蛋白质(尤其系TIP-5)表达而达成。该等细胞系具有比对照细胞系改善之分泌及生长特性。
背景技术：
筛选出哺乳动物高效生产者细胞系仍然为生物医药制造工业中之主要挑战。自 DNA至产物翻译之过程为限制哺乳动物生产细胞系之比生产率之主要瓶颈。细胞能够上调蛋白质合成速率，其系藉由增加已存在之核糖体之翻译效力，或透过生成新的核糖体 (核糖体生物合成)而使翻译能力增加。由于约80%之核转录总量系用于合成核糖体 RNA(rRNA)，因此核糖体生物合成为哺乳动物细胞之其中一种主要新陈代谢活动。核糖体组装发生于核内，且需要四种rRNA05S前rRNA，其随后加工成18S、5. 8S、28S及5S rRNA)及约80种核糖体蛋白质(r-蛋白质)之协同表达。45S前rRNA系于核内由聚合酶I (Pol I) 转录，5S RNA系于核周边由Pol III转录且随后进入核内，且r-蛋白质系由PolII转录。 因此，核糖体生物合成需要在不同隔室由不同聚合酶进行一系列转录。哺乳动物细胞中之该等过禾呈大体上未知(Santoro,R.及Grummt,I. (2001). Molecular mechanisms mediating methyIation-dependent silencing of ribosomal gene transcription. Mol Cell 8, 719-725)。45S前rRNA之转录为核糖体生物合成之关键步骤。哺乳动物单倍体基因组包含约 200个核糖体RNA基因，其中仅一部份于任一指定时间转录，而其余则保持沉默(Santoro， R.，Li，J.，及 Grummt, I. (2002). The nucleolar remodeling complex NoRC mediates heterochromatin formation and silencing of ribosomal gene transcription. Nat Genet. 32，393-396)。可根据染色质构造区分活性及沉默基因活性基因具有常染色质结构，而沉默基因为异染色质的。活性rRNA基因之启动子无CpG甲基化，且系与乙酰基化之组蛋白相连。沉默基因则相反。转录沉默rRNA基因之存在为合成rRNA及产生核糖体之限制因素。已经建立假说认为细胞可藉由改变各基因之转录活性及/或藉由改变活性基因之数目而调节rDNA之转录水平。然而，在45S前rRNA合成水平与rRNA基因数目之间还未发现令人满意的相关性。 例如，于酿酒酵母(S. cerevisiae)中，使rRNA基因数目减少约三分之二不影响总rRNA生成。类似地，含有不同rRNA拷贝数目之玉米自交系及非整倍体鸡细胞显示出相同的rRNA 转录水平。由于rDNA代表核糖体之主要组分，该等基因之沉默导致核糖体生物合成受到限制，且蛋白质翻译因此受到限制，故而最终导致蛋白质合成减少。于生物医药生产细胞中，其对细胞之完全生产能力构成限制，其意指治疗用蛋白质产物之比生产率减少。因此会导致工业生产工艺之总蛋白质产量减少。除比生产率(PspJ以外之决定工艺产量(Y)之另一因素为IVC，即在产生期望蛋白质之时间内的活细胞之积分值。该关系系由如下公式表示Y = P_。*IVC。因此，迫切需要增强宿主细胞之生产能力或藉由改善细胞生长而增加生物反应器中之活细胞密度，或最理想地，同时提高这两个参数。发明概述本申请解决上述问题，且显示敲低TIP_5(NoRC(核仁重建复合物；McStay，B.及 Grummt, I. (2008). The epigenetics of rRNA genes from molecular to chromosome biology. Annu. Rev Cell Dev. Biol 24，131-157)之亚单位)可减少沉默rRNA基因之数目， 上调rRNA转录，促进核糖体合成，并增加重组蛋白质之生成。本申请解决上述问题，且显示引入转录因子UBF可上调rRNA转录，这可导致促进核糖体合成、并增加重组蛋白质之生成。本申请中之数据证实，能够转录之rRNA基因之数目限制核糖体合成。后生遗传工程处理核糖体RNA基因，为改善生物医药制造提供新的可能性，且提供了解主导翻译机制之复杂调节网络之新观点。本申请显示，敲低TIP-5可诱发rDNA重复序列上之抑制性染色质标记丧失，促进 rDNA转录，改变核结构，且促进细胞生长及增殖。TIP-5活性受乙酰转移酶MOF (雄性最初缺失，males absent on the first)和脱乙酰基酶SIRTl (sirtuin-1)介导之可逆乙酰化控制。TIP-5于赖氨酸残基(小鼠TIP-5 中之K633、人类TIP-5中之K649)处之乙酰化导致促进结合rDNA基因、促进异染色质形成及rDNA沉默。相反，此赖氨酸残基之突变(例如成精氨酸)导致减少rDNA甲基化及促进 rRNA转录(Zhou et al. (2009)Nat. Cell Biol.，(8)11 ；1010-1017)。突变此赖氨酸残基或过表达携带该突变之TIP-5变体解决上文所述问题，作为本发明之另一实施方案。特定言之，突变TIP-5此赖氨酸残基与引入转录因子UBF的组合上调rRNA转录，其导致促进核糖体合成和增加生成重组蛋白质。为确定活性rRNA基因之数目增加是否会影响细胞生长及增殖，我们藉由流式细胞术(FACS)分析数种shRNA-TIP5细胞。我们于本申请中首次令人惊奇地显示，经工程处理使沉默rRNA基因数目减少能与rRNA及核糖体之生产增加，且因此与哺乳动物细胞之生产力提高相关。出人意料地，本申请还提供数据显示，于不同哺乳动物细胞系中敲低TIP-5均导致细胞周期行进加快且促进细胞增殖。此发现系与先前技术(W02009/017670)中所述者相反。先前技术曾判定TIP-5 之功能为在全面miRNA筛选中作为Fas的由Ras介导之后生遗传沉默效应器(RESE) (W02009/017670)。已知Ras为参与细胞转化及肿瘤生成之致癌基因，其在人类癌症中经常发生突变或过表达。因此，先前技术认为，减少诸如TIP-5之Ras效应器的表达导致抑制细胞增殖。为了确认此点，我们藉由流式细胞术(FACS)分析两种shRNA_TIP5细胞。然而，如图4A、B所示，shRNA-TIP-5细胞中处于S期之shRNA_TIP_5细胞的数目显著高于对照细胞。 与该等结果一致，shRNA TIP5细胞中显示，掺入至新生DNA的5-溴去氧尿苷(BrdU)增加， 且细胞周期蛋白A水平更高(图4C)。此外，我们已比较shRNA-TIP5细胞、shRNA-对照细胞及亲本NIH3T3及CH0-K1 细胞之间细胞增殖速率(图4D、F)。令人惊奇地出现与先前技术报导相反之结果，即表达miRNA-TIP5序列的NIH/3T3及CHO-Kl细胞的增殖速率皆比对照细胞更快。因此，沉默rRNA 基因数目减少确实影响细胞之新陈代谢。令人惊奇地，本发明显示，消减TIP5且因此导致 rDNA沉默降低，可加强细胞增殖。本申请证实，消减TIP-5之细胞中之蛋白质生成显著高于对照细胞系(参见实施例6及以下，图6)。消减TIP-5之细胞中之蛋白质生成比对照细胞系高2倍以上、高4倍以上、高5倍以上、高6倍以上、高10倍以上、在2-10倍之间。该等数据显示，消减TIP-5会增加异源性蛋白质生成。本申请显示，减少沉默rRNA基因数目会促进核糖体合成，并提高细胞产生重组蛋白质之潜力。于本发明中，我们提供一种藉由减少TIP-5及/或过表达UBF而促进rRNA转录、 核糖体生物合成及翻译的新颖方法，其效益为最终促进重组蛋白质分泌。此外，我们证实，TIP-5消减导致细胞周期行进加快，且改善细胞生长。或者，透过抑制TIP-5乙酰化，例如藉由过表达不能被SIRTl乙酰化之TIP-5突变体或藉由删除内源性TIP-5基因内之乙酰化受体位点可达成相同效果。本发明之一项特定实施方案为不能被SIRTl乙酰化之TIP-5突变体或删除内源性 TIP-5基因内之乙酰化受体位点，二者较佳与引入转录因子UBF组合。这导致rRNA转录上调，然后导致促进核糖体合成和增加重组蛋白质生成。一种特别合适的TIP-5突变体为具有小鼠TIP-5中之K633或人类TIP-5中之K649赖氨酸残基处之突变的TIP-5。改善细胞生长对生物医药生产工艺之许多方面具有深远影响-细胞生成时间缩短，导致细胞系开发之时间线缩短。生成时间较佳少于M小时， 较佳20至M小时，更佳15至M小时或15至22小时，最佳10至M小时。-单细胞克隆之后之效力增加，且此后之生长更快速。-扩大规模期间之时间范围缩短，尤其于大规模生物反应器中接种体的情况。-由于IVC与产物产量之间具有成比例之相关性，随每单位发酵时间之产物产量增加。相反，小的IVC导致产量较小及/或发酵时间较长。产量较佳增加10%，更佳增加 20%，最佳增加30%。此举使得基于真核细胞之生产工艺的蛋白质产量增加。因此，降低该等工艺之生产成本，且同时使为了产生供研究、诊断、临床研究或市场供应治疗用蛋白质所需材料而需制造的生产批数减少。此外，本发明加快药物开发，因为产生供临床前研究之足量材料通常成为与时间线相关之一套重要工作。本发明可用于改善所有用于产生一种或数种特定蛋白质之真核细胞之性质，该等蛋白质系供诊断目的、研究目的(标靶鉴定、先导鉴定、先导优化)、或供制造用于出售或临床开发之治疗用蛋白质。由本发明提供之细胞系/宿主细胞有助于增加基于真核细胞之生产工艺的蛋白质产量。其降低该等工艺之生产成本，且同时减少为了产生供研究、诊断、临床研究或市场供应治疗用蛋白质所需要产生之材料而需制造之生产批数。此外，本发明加快药物开发，因为产生供临床前研究之足量材料通常成为与时间
线相关之一套重要工作。TIP-5表达减少及/或UBF水平升高之优化宿主细胞系可用于产生一种或多种特定蛋白质，供用于诊断目的、研究目的(标靶鉴定、先导鉴定、先导优化)，或用于制造供出售或临床开发之治疗用蛋白质。其同样可应用于表达或产生共享相同分泌途径且同样于脂质囊泡中运送的分泌型或膜结合型蛋白质，诸如表面受体、GPCR、金属蛋白酶或受体激酶。该等蛋白质随后可用于研究目的，其致力于细胞表面受体之功能表征，例如用于产生及随后纯化、结晶及/或分析表面蛋白质。其对开发新颖之人类药物疗法非常重要，因为细胞表面受体为主要类型之药物标靶。此外，其有利于研究与细胞表面受体相关之细胞内信号传导复合物，或分析部分藉由可溶性生长因子与其在相同细胞或另一细胞上之对应受体的相互作用所介导之细胞-细胞-交流(communication)。
图1 于啮齿动物及人类细胞系中敲低TIP-5(A、B)针对(A)稳定表达 shRNA-TIP5-l 及 TIP5-2 序列之 NIH/3T3 细胞中及(B) 稳定表达miRNA-TIP5-l及TIP5-2序列之HEI^93T细胞中之TIP5mRNA所进行之qRT-PCR。 数据系针对GAPDH mRNA水平标准化。(c)针对稳定之 shRNA-TIP5-l/2NIH/3T3、miRNA-TIP5-l/2HEK293T 及 miRNA-TIP5-l/2CH0-Kl 细胞中之 TIP5mRNA 所进行之半定量 RT-PCR。出示 GAPDH mRNA 之 qRT-PCR作为对照。图2 敲低TIP-5导致rDNA甲基化减少 (A-C)消减TIP5使rDNA启动子之CpG甲基化减少。上图包括所分析之HpaII (H) 位点的㈧小鼠、(B)人类及(C)中国仓鼠之rDNA启动子区域的图。黑色圆点指示CpG 二核苷酸。箭头表示用于扩增被HpaII消化之DNA的引物。下图于稳定表达shRNA-及/或miRNA TIP5-1/2及对照序列的(A)NIH/3T3、(B) HEK293T及(C)CHO-Kl细胞中所测定rDNA CpG甲基化水平。数据表示HpaII抗性rDNA之量，其已利用涵盖缺少HpaII位点之DNA序列之引物及未消化之DNA进行扩增，计算总rDNA 量来标准化。(D、E)消减TIP5减少rDNA CpG甲基化水平。分析(D)rDNA基因间及启动子区域，包括转录起始位点(+1)，及(E)编码区内之两个区域。图示代表单个小鼠rDNA重复序列及所分析之HpaII (H)位点。箭头表示用于扩增被HpaII消化之DNA的引物。数据表示 HpaII抗性rDNA之量，其已利用涵盖缺少HpaII位点之DNA序列之引物及未消化之DNA进行扩增，计算总rDNA来标准化。图3 敲低TIP-5之细胞中之rRNA水平增加(A)消减TIP5促进rRNA合成。稳定之NIH/3T3及HEK293T细胞系中基于qRT-PCR 之45S前rRNA水平已针对GAPDH mRNA水平标准化。(B)经过相同暴露时间之后，于原位掺入BrUTP，检测rDNA转录。于消减TIP-5之细胞中BrUTP信号(左图)较强，且可于核中特异性检测到(由相差影像(右图)所示核内之较暗区域)。图4 消减TIP-5导致促进增殖及细胞生长(A) shRNA TIP5 细胞之 FACS 分析(B)处于各细胞周期阶段之细胞百分比。于消减TIP5之细胞中，处于S期之细胞的数目或百分比增加，而处于Gl期之细胞的数目或百分比减少。增殖加强。(C) BrdU掺入测定法。细胞与10 μ M BrdU 一起温育30min，利用针对BrdU之抗体染色，并估测处于S期之细胞百分比。BrdU测定法显示TIP5细胞中之DNA合成增加。(D-F)稳定表达 miRNA-TIP5 及对照序列之(D)NIH/3T3、(E)HEK293T 及(F) CHO-Kl细胞的生长曲线。生长曲线证实，消减TIP-5之细胞之生长至少与对照细胞一样快 (HEK293)，或甚至比对照细胞更快(NIH3T3及CH0-K1)。图5 敲低TIP-5之细胞的核糖体分析(A-C) (A)稳定之 NIH/3T3、(B)HEK293T 及(C)CHO-Kl 细胞中之细胞质 RNA/ 细胞的相对量。数据表示一式三份进行之两次实验的平均值。(D)稳定之HEK293T的核糖体曲线及(E)CHO-Kl 细胞系。敲低TIP5之细胞含有更多核糖体。图6 敲低TIP-5导致促进产生受体蛋白质(A-C)经组成性SEAP表达载体pCAG_SEAP工程处理之(A)稳定之NIH/3T3、(B) HEK293T及(C)CHO-Kl细胞系的SEAP表达。(D、E)经组成性萤光素酶表达载体pCMV-萤光素酶工程处理之⑶稳定之 NIH/3T3及(E)HEK293T细胞系的萤光素酶表达。图7 过表达UBF促进rRNA合成(A, B)表达渐增量之 UBF (pCMV-UBF)后(A)HEI^93T 和(B)HeLa 中 45SrRNA 水平之qRT-PCR。rRNA水平系针对GAPDH mRNA数量来标准化。发明详述TIP-5 之敲低为了工程处理细胞，使其增加合成重组蛋白质，我们需决定减少沉默rRNA基因数目是否会增加45S前rRNA合成，且因此亦刺激核糖体生物合成，并增加能够翻译之核糖体之数目。因此，我们利用特异针对TIP5之两个不同区域(TIP5-1及TIP5D之shRNA/miRNA 序列进行RNA干扰，敲低TIP5表达，并构建经稳定转基因之表达shRNA之NIH/3T3或表达 miRNA之HEK293T及CHO-Kl。使用表达混合shRNA及miRNA序列之稳定细胞系作为对照。 利用表达shRNA-TIP5或miRNA-TIP5序列之质粒产生稳定细胞系而不是进行瞬时转染有两个理由。第一，诸如CpG甲基化之抑制性后生遗传学标记之丧失为一种被动机制，需要多次细胞分裂。第二，虽然可相对容易地转染HEK293T细胞，但是NIH/3T3及CHO-Kl细胞的转染效力差会妨碍随后针对内源性rRNA、核糖体水平及细胞生长性质之分析。为了确定所选择克隆中敲低TIP5之效力，我们藉由逆转录酶所介导定量性及半定量性PCR测定TIP5mRNA 水平(图1)。与对照细胞比较，NIH/3T3/shRNA-TIP5-l及-2细胞中之TIP5表达减少约 70-80% (图1A)。在稳定之HEK293T中，观察到类似的TIP5mRNA水平减少(图1B)。仅可由半定量性PCR测得衍生自CHO-Kl之细胞中之TIP5mRNA水平(图1C)，但其TIP5mRNA之减少类似稳定之NIH/3T3及HEK293T细胞的。该等结果证实，经建立之细胞系含有低水平之 TIP5。敲低TIP-5导致rDNA甲基化减少小鼠rDNA启动子的CpG甲基化减少基本转录因子UBF之结合，且防止形成起始前复合物(Sani j, Ε. , Poortinga, G. , Sharkey, K. , Hung, S. , Holloway, Τ. P. , Quin, J. , Robb, Ε. , Wong, L. H. , Thomas, W. G. , Stefanovsky, V. , Moss, Τ. , Rothblum, L. , Hannan, K. Μ., McArthur,G. A. ,Pearson,R. B.,及Hannan, R. D. (2008). UBF levels determine the number of active ribosome RNA genes in mammals. J. Cell Biol 183,1259—1274)。于 NIH/3T3 细胞中，约40%至50%之rRNA基因含有CpG-甲基化序列，且呈转录沉默。人类、小鼠及中国仓鼠中之rDNA启动子之序列及CpG密度差异显著。人类之rDNA启动子含有23个CpG， 而小鼠及中国仓鼠分别含有3个及8个CpG (图2A-C)。为了证实敲低TIP5可影响rDNA沉默，我们测定CCGG序列中之meCpG量，以判定rDNA甲基化水平。以HpaII消化基因组DNA， 且利用涵盖HpaII序列(CCGG)之引物进行定量性实时PCR，测定对消化之抗性(亦即CpG 甲基化)。在所有敲低TIP5之细胞系中，大部份rRNA基因中之启动子区域内之CpG甲基化减少，证实TIP5对促进rDNA沉默具有关键作用(图2)。注意，虽然TIP5结合及重新甲基化局限于rDNA启动子序列内，但是TIP-5减少之 NIH3T3细胞的整个rDNA基因(基因间、启动子及编码区域；图2D、E)的CpG甲基化量均减少，说明一旦TIP5与rDNA启动子结合，其即启动在整个rDNA基因座建立沉默后生遗传标记的传播机制。敲低TIP-5之细胞中之rRNA水平增加为了判定沉默基因数目之减少是否会影响rRNA转录物之量，我们藉由使用涵盖第一 rRNA加工位点之引物之qRT-PCR(图3A)且藉由活体内BrUTP掺入(图，测定45S 前rRNA合成。在两个分析中皆测得，消减TIP5之NIH/3T3及HEK293T细胞的rRNA产生皆比对照细胞系高。消减TIP-5导致促进增殖及细胞生长已知Ras为涉及细胞转化及肿瘤形成之致癌基因，其在人类癌症中经常发生突变或过表达。Green等人，在W02009/017670中记载已鉴定TIP-5之功能为在全面miRNA筛选中作为Fas之由Ras所介导后生遗传沉默效应器(RESE)。该出版物记载，减少诸如TIP-5 之Ras效应器之表达导致抑制细胞增殖。我们已藉由流式细胞术(FACS)分析两种shRNA_TIP5细胞。如图4A、B所示，两种 shRNA-TIP5细胞中处于S期之细胞数目显著高于对照细胞。NIH3T3细胞在感染逆转录病毒 (其表达针对TIP5序列之miRNA) 10天后，获得类似曲线。与该等结果一致，shRNA TIP5细胞显示，新生DNA的5-溴脱氧尿苷(BrdU)掺入增加，且细胞周期蛋白A水平较高(图4C)。最后，我们比较shRNA-TIP5、shRNA-对照及亲本 NIH3T3、HEK293 及 CH0-K1 细胞之细胞增殖速率(图4D-F)。令人惊奇地，与先前技术报导相反，表达miRNA-TIP5序列之 NIH/3T3及CH0-K1细胞二者的增殖速率比对照细胞快，说明沉默rRNA基因数目之减少确实影响细胞新陈代谢。HEK293T中之TIP5消减并未显著影响细胞增殖，此系因为该等细胞已到达彼等之最大增殖速率。令人惊奇地，该等数据显示，TIP5消减及随之rDNA沉默之减少会加快细胞增殖。敲低TIP-5之细胞之核糖体分析于哺乳动物细胞培养中，蛋白质合成速率为与产量直接相关的重要参数。为了确定TIP5消减及随之rDNA沉默之减少是否会增加细胞中能够翻译之核糖体之数目，我们首先测定细胞质rRNA水平。在细胞质中，大多数RNA系由组装成核糖体之经加工rRNA组成。
9如图5A-C所示，所有消减TIP5之细胞系中之每一个细胞均含有更多之细胞质RNA，说明该等细胞会产生更多核糖体。多核糖体曲线之分析亦显示，消减TIP5之HEK293及CHO-Kl细胞所含有之核糖体亚单位G0S、60S及80 比对照细胞更多(图5D)。敲低TIP-5导致促进产生受体蛋白质为了确定消减TIP5及减少rDNA沉默是否会促进异源性蛋白质产生，我们以促进组成性表达人类胎盘分泌之碱性磷酸酶SEAP(pCAG-SEAP;图6A-C)或萤光素酶(pCMV-萤光素酶；图6D、Ε)之表达载体转染稳定之消减ΤΙΡ5之ΝΙΗ/3Τ3、ΗΕΚ293Τ及CHO-Kl衍生物。4 之后，定量蛋白质生成，发现消减TIP5之细胞中之SEAP及萤光素酶生成皆比对照细胞系多二至四倍，说明消减TIP5使异源性蛋白质生成增加。所有该等结果说明，减少沉默rRNA基因数目会促进核糖体合成，并增强细胞产生重组蛋白质之潜力。敲除TIP5增加单核细胞趋化蛋白1 (MCP-I)之生物医药生成，并增加治疗性抗体之生成a)以空载体(模拟对照)或设计用于敲低TIP-5表达之小型RNA (shRNA或RNAi) 转染会分泌单核细胞趋化蛋白I(MCP-I)或治疗性抗体之CHO细胞系(CHO DG44)。于TIP-5 消减效率最高之细胞群中观察到最高之MCP-I滴度，而在模拟转染之细胞或亲本细胞系中，蛋白质浓度显著更低。b)首先以短RNA序列(shRNA或RNAi)转染CHO宿主细胞(CHO DG44)，以减少 TIP-5表达，且产生稳定之消减TIP-5宿主细胞系。随后以编码作为感兴趣基因之单核细胞趋化蛋白I(MCP-I)或治疗性抗体之载体转染该等细胞系及平行之CHO DG44野生型细胞。 于TIP-5消减效率最高之细胞群中观察到最高MCP-I滴度及生产率，而模拟转染之细胞或亲本细胞系中之蛋白质浓度显著较低。c)当以a)或b)中所述相同细胞进行分批或补料-分批发酵时，总MCP-I滴度或抗体滴度之差异甚至更显著因为经减少表达之TIP-5转染之细胞更快速生长，且每单位细胞及每单位时间亦产生更多蛋白质，因此其在相同时间内具有更高IVC且显示更高生产率。两种性质皆正面影响总工艺产量。因此，消减TIP-5之细胞具有显著更高之MCP-I或抗体收获滴度，且导致更高效率之生产工艺。删除SNF2H之细胞同样具有显著更高之IgG收获滴度，且导致更高效率之生产工艺。敲除TIP-5基因可最高效促进rRNA转录且促进增殖产生具有恒定降低水平之TIP-5表达之改良生产宿主细胞系的最有效方法为完全敲除TIP-5基因。为此，可利用同源性重组或利用锌指核酸酶(ZFN)技术破坏TIP-5基因，防止其表达。由于CHO细胞之同源性重组效率不高，因此我们设计一种在TIP-5基因内部引入双链断裂之ZFN，藉此破坏功能。为了控制有效敲除TIP-5，利用抗TIP-5抗体进行 Western印迹。在膜上，敲除TIP-5之细胞不会检测到TIP-5表达，而亲本CHO细胞系则显示对应于TIP-5蛋白质之清晰信号。随后，分析敲除TIP-5之CHO细胞及亲本CHO细胞系之rRNA转录。该测定法证实， 敲除TIP-5之细胞中之rRNA合成水平及核糖体数目皆高于亲本细胞及仅减少TIP-5表达水平之细胞。此外，在补料-分批工艺中，TIP-5缺陷之细胞增殖比TIP5野生型细胞及其中仅藉由引入干扰RNA (诸如shRNA或RNAi)而减少TIP-5表达之细胞系更快速，且细胞数目更
尚ο过表达UBF促进rRNA合成核糖体生成需要rRNA和r-蛋白质之协同表达和装配。UBF与活性rRNA基因结合，促进转录起始并调节延伸速率。如图7中所示，于HEK293和HeLa细胞系二者中UBF均以剂量依赖性方式刺激45S前rRNA合成。因此，UBF过表达以及敲低TIP-5共享rRNA合成增加之作用。UBF过表达也促进了核糖体生物合成和蛋白质生成。UBF过表达增加了抗体的生物医药蛋白质生成a)于UBF过表达细胞群中于分泌人源化抗⑶44v6IgG抗体BIWA 4之抗体产生CHO 细胞系(CHO DG44)中观察到最高比生产率值，其中相较于模拟或未转染细胞而言显著促进 IgG表达。若用稳定转染子进行分批或补料-分批发酵可以得到非常相似的结果。在这些设定之每一个中，UBF过表达导致抗体分泌增加，显示了 UBF能促进在连续培养或生物反应器分批或补料分批培养中生长之细胞的比生产能力。b)首先以编码UBF之载体转染CHO宿主细胞(CHO DG44)，施加选择压力并挑选证实UBF异源性表达之细胞系。随后该等细胞系及平行之CH0DG44野生型细胞以编码作为感兴趣基因之人源化抗⑶44v6IgG抗体BIWA4的载体转染。再一次，相较于对照而言于UBF 过表达培养物中IgG滴度显著提高。此外于补料-分批培养中，UBF之异源性表达导致了 IgG生成增加。这些数据合起来显示了 UBF之过表达能促进连续培养或生物反应器分批或补料分批培养中生长之细胞的比生产能力。敲除TIP-5和过表达UBF协同作用促进rRNA合成和治疗用蛋白质生成于本发明中，我们提供了消减TIP-5表达和过表达UBF导致rRNA合成提高之证据。我们还显示了 TIP-5删除导致rDNA基因甲基化减少。由于去甲基化是募集染色质修饰因子诸如组蛋白乙酰化酶和结合转录因子诸如UBF的先决条件，我们假设是否两种方法可能协同作用于rRNA合成，由此TIP-5消减介导之甲基化减少为随后的UBF募集和结合提供了 rRNA基因之易接近性。(A)为了检验此假设，我们生成组合了 TIP-5消减和UBF过表达的细胞系。当于或者过表达UBF或者TIP-5删除的彼等细胞系、细胞和未修饰亲本细胞系之间比较rRNA合成时，于TIP-5消减细胞内以及于UBF过表达细胞系内之rRNA合成再次高于对照。重要的是，组合之TIP-5删除和UBF过表达导致了甚至更高的rDNA基因转录以及更高的核糖体合成。这显示了 TIP-5消减和UBF过表达两种方法的组合令人惊讶地对rRNA合成具有协同效应。(B)当用编码感兴趣蛋白质之表达构建物转染(A)中生成之细胞并比较彼等细胞之培养液中该蛋白质之浓度时，同时具有UBF过表达和TIP-5敲除的细胞之培养物中测定到最高滴度。排列在其次的是具有或者TIP-5消减或者UBF过表达的细胞，而未修饰亲本细胞系中感兴趣蛋白质之滴度最低。藉由后生遗传和分泌工程之组合协同促进蛋白质生成本发明中所述方法，即消减TIP-5或SNFH2以及过表达UBF，均藉由促进rRNA合成、核糖体生物合成以及由此的蛋白质翻译来促进重组蛋白质生成。然而，蛋白质生成不仅要求优化翻译机制还要求蛋白质转运和分泌之翻译后步骤的效率。因此，我们开始着手藉由于细胞内删除TIP-5和过表达促分泌基因CERT来同时改造翻译和转运两个机制。为此目的，用编码人CERT蛋白质之突变体(CERT krl32 — Ala)的转基因转染 TIP-5表达遭到破坏之CH0-DG44细胞。于第二转染步骤中，将编码单克隆IgG亚型抗体的表达构建物引入该等细胞中并产生稳定之细胞群体。接着，将产生的稳定细胞群体进行接种和补料-分批培养以分析比IgG生产率以及获得的总抗体滴度。有趣的是，于双重改造细胞中获得了最高抗体滴度和比生产率。具有TIP-5删除和CERT过表达二者之细胞所产生之抗体浓度显著高于单一改造细胞。这表明分泌途径中两个步骤之组合改造，即经由TIP-5删除的翻译工程和经由CERT的分泌工程，是更进一步促进分泌型蛋白质生成和产生具有最佳生产能力之哺乳动物宿主细胞系的方法。类似地， 藉由组合UBF和CERT优选CERT Serl32 — Ala之表达可获得协同效应。一般实施方案“包括”或“包含”涵盖更特定之实施方案“由...组成”。此外，单数及复数形式之使用方式没有限制。本发明过程中所用之术语具有如下含意。术语“后生遗传工程”意指影响染色质之后生遗传修饰，而不影响核酸序列。后生遗传修饰包括组蛋白或DNA核苷酸之甲基化或乙酰基化改变、及烷基化。于本发明中，“后生遗传工程”主要系指DNA甲基化之工程处理。“NoRC” (核仁重建复合物)为rDNA沉默之关键决定物，且系由TIP-5 (TTF-1-相互作用蛋白质5)及ATP酶SNF^1组成。NoRC系与沉默基因之rDNA启动子结合，且透过组蛋白修饰及DNA甲基化活性抑制rDNA转录。“TIP-5”或“TIP5”(转录终止因子I(TTFl)-相互作用蛋白质5)为大于200kD之核仁蛋白质，且系藉由与DNA-甲基-转移酶(DNMT)及组蛋白去乙酰基化酶(HDAC)及其它染色质修饰因子相互作用，为rDNA募集组蛋白去乙酰基化酶活性。其它同义词为BAZ2A、 WALp3、FLJ13768、FLJ13780、FLJ45876、KIAA0314 及 DKFZp781B109。“ SNF^1 ”属于SWI/SNF蛋白质家族成员，且具有解螺旋酶及ATP酶活性。SNF^1为 NoRC之组分，且参与核小体转移成封闭之异染色质状态。SNF^i之官方名称为SMARCA5 (表示与SWI/SNF相关，与基质相连，染色质之肌动蛋白依赖性调节剂、a子家族、第五个成员)。 其它名称为 ISWI、hISWI、hSNF2H 及 WCRF135。上游结合因子(“UBF”)系一种具有DNA结合和反式激活域二者的核仁磷蛋白，作为18S、5. 8S、和28S核糖体RNA表达所需之转录因子发挥功能。UBF也称作UBTF或N0R-90。表述“减少核糖体RNA基因(rDNA)沉默”意指影响编码核糖体RNA的DNA或该特定区域中之染色质的甲基化及/或乙酰基化，导致rRNA基因转录解除抑制。更特定言之， 于本发明中，该术语系指减少rRNA基因甲基化之方法，导致基因更易于获得转录因子，且使相应基因合成更多rRNA。文中之“rDNA沉默”明确言之系指rRNA基因沉默。其不包括不受NoRC所介导之非特异性、全基因组沉默机制(genome-wide silencing mechanism)。可藉由如下测定法测定/监测rDNA沉默rDNA沉默导致减少rRNA转录，其可由定量性或半定量性PCR分析(例如，如材料及方法部份所述，利用针对45S前RNA之寡核苷酸引物)。
rDNA基因启动子之甲基化之分析方法为以甲基化敏感性限制酶消化基因组DNA， 且随后进行Southern印迹，产生甲基化及未甲基化状态的差异性条带样式。或者，可由如下定量由甲基化诱导之rDNA沉默利用甲基化敏感性限制酶消化基因组DNA，且随后利用横跨裂解位点之引物进行qPCR(如材料及方法部份中所述，且示于图 2)。如文中所用，关于基因表达之术语“敲低”或“消减”系指导致指定基因之表达比对照细胞表达减少之实验方法。可藉由多种实验方法达成基因敲低，诸如向细胞引入会与基因之部份mRNA杂交之核酸分子，导致其降解(例如shRNA、RNAi, miRNA)，或以一种导致转录减少、mRNA稳定性降低或mRNA翻译减少之方式改变基因序列。完全抑制指定基因表达系称为“敲除”。敲除基因意指该基因不会合成功能性转
录物，导致该基因正常提供之功能丧失。敲除基因之方法为改变DNA序列，导致该基因或
其调节序列被破坏或删除。敲除技术包括使用同源性重组技术，以置换、间断或删除关键部
份或整段基因序列，或使用诸如锌指核酸酶之DNA修饰酶，于标靶基因之DNA中引入双链断 m农。有许多种监测/证实基因之敲低或敲除之测定法例如，采用Northern印迹杂交、核糖核酸酶RNA保护、与细胞RNA原位杂交、或藉由PCR定量所选择基因中转录之mRNA减少/流失。可藉由多种方法定量选择之基因所编码对应蛋白质的减少/流失，例如ELISAJestern印迹、放射免疫测定法、免疫沉淀、测定蛋白质之生物学活性、对蛋白质免疫染色后进行FACS分析、或均相时间分辨荧光(HTRF)测定法。如本发明所用术语“衍生物”意指与原始序列或其互补序列具有至少70%序列一致性之多肽分子或核酸分子。较佳地，多肽分子或核酸分子与原始序列或其互补序列具有至少80%之序列一致性。更佳地，多肽分子或核酸分子与原始序列或其互补序列具有至少 90%序列一致性。最佳地，多肽分子或核酸分子与原始序列或其互补序列具有至少95%序列一致性，且对分泌显示与原始序列相同或类似之影响。序列差异可源自不同生物体同源性序列之间的差异。序列差异亦可源于由于置换、插入或删除一个或多个核苷酸或氨基酸(较佳1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个)，对序列进行之靶定修饰。可利用位点特异性诱变及/或基于PCR之诱变技术产生删除、插入或置换突变体。相关方法说明于(Lottspeich及hrbas，1998)之第36. 1章中及其它参考文献。于本发明中，“宿主细胞”意指真核细胞，较佳为哺乳动物细胞，最佳为啮齿动物细胞，诸如仓鼠细胞。较佳细胞为 BHK21、BHK ΤΓ、CHO、CHO-KU CHO-DUKX, CHO-DUKX Bi、 及CH0-DG44细胞或其中任一种细胞系之衍生物/后代。特别佳者为CH0-DG44、CH0-DUKX、 CHO-Kl及BHK21，且更佳者为CH0-DG44及CHO-DUKX细胞。最佳者为CH0-DG44细胞。于本发明之一项特定实施方案中，宿主细胞意指鼠科动物骨髓瘤细胞，较佳为NSO及Sp2/0细胞或其中任一种细胞系之衍生物/后代。可用于本发明含意的鼠科动物及仓鼠细胞实例亦概括于表1中。然而，该等细胞之衍生物/后代、其它哺乳动物细胞(包括但不限于人类、小鼠、大鼠、猴、及啮齿动物细胞系)、或真核细胞(包括但不限于酵母、昆虫及植物细胞)亦可用于本发明之含意，特定言之用于产生生物医药蛋白质。表1:真核生产细胞系
权利要求
1.一种于细胞中增加重组蛋白质表达之方法，包含a.提供一种细胞，b.减少该细胞中之核糖体RNA基因(rDNA)沉默，c.藉由增加转录因子之表达来增加该细胞中之核糖体RNA转录，及d.该细胞于允许蛋白质表达之条件下培养。
2.如权利要求1之方法，其中该细胞中之重组蛋白质表达比未减少rDNA沉默之细胞增加，该增加较佳为20 %至100 %，更佳为20 %至300 %，最佳大于20 %。
3.如权利要求1或2之方法，其中步骤b)包含敲低或敲除核仁重建复合物(NoRC)之一种组分且步骤c)包含过表达转录因子。
4.如权利要求1至3任一之方法，其中该转录因子为上游结合因子(UBF)。
5.如权利要求3之方法，其中该NoRC组分为TIP-5或SNF2H，以TIP-5较佳。
6.如权利要求1至5任一之方法，其中敲除TIP-5。
7.如权利要求5或6之方法，其中TIP-5沉默载体包含a.如SEQ ID NO :1、SEQ ID NO :2、SEQ ID NO 8 或 SEQ ID NO 9 之 shRNA，或b.如SEQ ID NO 3, SEQ ID NO :4、SEQ ID NO: 10 或 SEQ ID N0:11 之 miRNA。
8.如权利要求1或2之方法，其中步骤b包含藉由删除或突变或藉由过表达不能乙酰化之TIP-5变体，较佳藉由过表达TIP-5之赖氨酸突变体K633或K649来阻止TIP-5乙酰化。
9.如权利要求1至5任一之方法，其中敲除SNF2H。
10.如权利要求1至3任一之方法，其中于步骤b)中敲低TIP-5且于步骤c)中过表达UBF。
11.如权利要求1、2或8之方法，其中于步骤b)中藉由删除或突变或藉由过表达不能乙酰化之TIP-5变体，较佳藉由过表达TIP-5之赖氨酸突变体K633或K649来阻止TIP-5 乙酰化及于步骤c)中过表达raF。
12.如权利要求1至11任一之方法，其中另外于该细胞中增加神经酰胺转移蛋白 (CERT)之表达，其中CERT较佳为CERT野生型或CERT Serl32_ > Ala突变体。
13.—种于细胞中产生感兴趣蛋白质的方法，包含a.提供一种细胞，b.减少该细胞中之核糖体RNA基因(rDNA)沉默，c.藉由增加转录因子之表达来增加该细胞中之核糖体RNA转录，及d.该细胞于允许该感兴趣蛋白质表达之条件下培养。
14.如权利要求13之方法，其中该方法另外包含e.纯化该感兴趣蛋白质。
15.如权利要求13或14之方法，其中该细胞中之重组蛋白质表达比未减少rDNA沉默之细胞增加，该增加较佳为20%至100%，更佳为20%至300%，最佳大于20%。
16.如权利要求13至15之方法，其中步骤b)包含敲低或敲除核仁重建复合物(NoRC) 之一种组分且步骤c)包含过表达转录因子。
17.如权利要求13或16之方法，其中该转录因子为上游结合因子(UBF)。
18.如权利要求16之方法，其中该NoRC组分为TIP-5或SNF2H，以TIP-5较佳。
19.如权利要求13至16任一之方法，其中敲低TIP-5并过表达UBF。
20.一种产生用于生产重组蛋白质之宿主细胞的方法，包含a.提供一种细胞，b.减少该细胞中之核糖体RNA基因(rDNA)沉默，c.藉由增加转录因子之表达来增加该细胞中之核糖体RNA转录，d.视需要选择单一细胞克隆，及e.获得宿主细胞。
21.如权利要求20之方法，其中步骤b)包含敲低或敲除核仁重建复合物(NoRC)之一种组分且步骤c)包含过表达转录因子。
22.如权利要求21之方法，其中该NoRC组分为TIP-5或SNF2H，以TIP-5较佳，且其中该转录因子为上游结合因子(UBF)。
23.一种如权利要求20至22中任一项之方法产生之细胞。
24.如权利要求1至22中任一项之方法或如权利要求23之细胞，其中该细胞为真核细胞，较佳哺乳动物、啮齿动物或仓鼠细胞。
25.如权利要求24之方法，其中该仓鼠细胞为CHO细胞，诸如CHO-K1、CHO-S、CH0-DG44 或 CH0-DUKXB11，较佳为 CH0-DG44 细胞。
26.如权利要求1至22、24、或25任一之方法，其中步骤b)和c)之次序颠倒。
27.—种于细胞中增加重组蛋白质表达之方法，包含a.提供一种细胞，b.减少该细胞中之核糖体RNA基因(rDNA)沉默，较佳藉由敲低TIP-5或藉由阻止 TIP-5乙酰化来达成，c.增加该细胞中之神经酰胺转移蛋白(CERT)表达，d.视需要增加该细胞中之核糖体RNA转录，藉由增加转录因子，较佳UBF之表达来达成，及e.该细胞于允许蛋白质表达之条件下培养。
28.—种于细胞中增加重组蛋白质表达之方法，包含a.提供一种细胞，b.增加该细胞中之核糖体RNA转录，藉由增加转录因子，较佳UBF之表达来达成，c.增加该细胞中之神经酰胺转移蛋白(CERT)表达，d.视需要减少该细胞中之核糖体RNA基因(rDNA)沉默，较佳藉由敲低TIP-5或藉由阻止TIP-5乙酰化来达成，及e.该细胞于允许蛋白质表达之条件下培养。
全文摘要
本发明系关于细胞培养技术之领域。其系关于经由引入编码UBF之核酸或减少NoRC蛋白质(尤其TIP-5)表达而达成核糖体RNA(rRNA)表达增加之生产宿主细胞系。该等细胞系具有比对照细胞系改善之分泌及生长特性。本发明另外关于一种利用所述方法产生之细胞生产蛋白质之方法。
文档编号C12N15/67GK102459608SQ201080031561
公开日2012年5月16日 申请日期2010年5月12日 优先权日2009年5月15日
发明者B.埃南克尔, H.考夫曼, L.弗洛林, M.弗瑟尼格, R.桑托罗 申请人:贝林格尔.英格海姆国际有限公司