专利名称：在单个反应管中进行多个反应的方法
技术领域：
本发明一般性地涉及在单个反应管中进行多于ー个反应的方法。
背景技术：
过去几十年中分子生物学家致力于表征、分离和操作細胞和有机体的分子组分。 这些组分包括脱氧核糖核酸(DNA)、遗传信息储存库、核糖核酸(RNA)。RNA与DNA的亲缘关系很近，其功能涉及从充当DNA的临时工作拷贝到实际的结构和酶促功能，以及作为翻译机器和蛋白质的功能性及结构性部分，其中蛋白质为細胞主要的结构及酶分子。分子生物学家进行的用来表征、分离和操作这些组分的大部分实验台上的实验在试管中进行，并且通常每个试管中仅仅进行单个反应。但是，由于实验误差，需要重复这些反应来确保实验结果的准确度和可靠性。重复次数越多，实验结果的准确度和可靠性越高。 但是，试管间结果的差异可以很显著。近些年，分子生物学家已经对在单个试管中进行多于ー个反应的可能性进行了探索。例如，在聚合酶链式反应(PCR)领域，已开发了使用分子信标或探针的多重反应，使得可在单个试管中同时进行多于ー个目标基因的扩增。但是，重复这些多重实验仍然是必须的。此外，常规PCR技术的ー个问题是它们通常在加热块上进行，加热块内可能没有均勻的温度控制。例如，加热块中心可能比加热块的边缘加热地更快并达到更高的温度。因此，放置在加热块中不同位置的不同试管暴露于不同的条件，从而导致从不同试管获得的结果的不期望的实验差异。这种差异也大大影响了阳性和阴性对照的准确度和可靠性。其他分子生物学实验，比如DNA提取和纯化技木，由很多步骤构成。例如，进行DNA 提取的最标准方案是进行至少以下步骤細胞裂解、清洗和在水中洗脱提取的DNA。通常， 細胞裂解反应在第一个试管中进行。之后，将细胞裂解液倾倒入另ー个试管中用于结合、清洗和/或洗脱。另外的纯化步骤可在又ー个试管中进行。由于DNA的一部分可能留在前一个试管中或者可能在转移过程中意外洒出，所以样品从ー个试管转移到另ー个试管可导致不期望的DNA损失。因此，需要提供ー种方法，该方法在单个集成的试管中进行多于ー个反应，比如 PCR反应的重复或者DNA提取和纯化的所有步骤或者其組合，该方法克服了或者至少改善了如上所述的ー个或多个缺陷。
发明内容
根据第一个方面，本发明提供在反应管中提供至少两个反应区域的方法，所述方法包括以下步骤在所述管中提供至少两个由各自反应相形成的反应区域；在所述管中提供与所述反应相不混溶并且布置在其之间从而分隔所述反应区域的分隔相；
在所述管中提供至少ー个能够与化学物质相连接的颗粒，其中所述颗粒可在所述反应区域间移动从而引入所述化学物质。有利地，根据本文公开的方法在单个反应管中进行多个反应减少了管间差异。其还减少或消除了对将样品从ー个管转移到另ー个管的需要。另外，其允许在单个集成的管中进行反应的所有步骤。有利地，所公开的方法可用于实施多种不同类型的分子生物学技木。有利地，反应相彼此之间被分隔相流体密封，颗粒的移动不造成对相分隔的任何干扰。有利地，分隔相是液体分隔相，同时允许反应相的隔离和所述颗粒在反应相之间的移动，而不需要相态的改变。更有利地，所述颗粒基本上仅与所述化学物质相连接，所述化合物质穿过反应相而其他溶液或物质却没有。也就是说，反应相之间基本没有交叉污染。在一个实施方案中，所述反应是聚合酶链式反应。在另ー个实施方案中，所述反应是进行DNA提取和/或纯化的步骤。在又一个实施方案中，所述反应是DNA提取和/或纯化步骤与聚合酶链式反应(PCR)的組合。有利地，可在同一反应管中进行阳性和/或阴性对照反应，以增强其中所发生反应的集成性。在一个实施方案，本发明提供了进行PCR的方法，所述方法包括以下步骤在管中提供由各自反应相形成的多个区域，每个所述反应区域包含至少ー种选择用于扩增目标核酸的溶液；在所述管中提供多个与所述反应相不混溶的分隔相，所述分隔相布置在成对反应区域之间；在所述管中提供至少ー个能够与用于PCR反应的化学物质相连接的颗粒，其中所述颗粒可在所述反应区域之间移动从而将所述化学物质引入其中。根据第二个方面，本发明提供了包含下列的反应管至少两个允许反应在其中发生的反应相；与所述至少两个反应相不混溶并且布置在其之间的分隔相；能够与化学物质相连接的颗粒，其中所述颗粒可在所述反应相之间移动从而将所述化学物质引入其中。根据第三方面，本发明提供了用于在反应管中进行至少两个反应的系统，所述系统包含至少ー个所述反应管，其具有至少两个允许反应在其中发生的反应相、与所述两个反应相不混溶并布置在其之间的分隔相、和至少ー个能够与化学物质相连接的颗粒，其中所述颗粒可在所述反应相之间移动从而将所述化学物质引入其中；和至少ー个离心装置，其用于使得所述颗粒能够在离心力的作用下在所述反应相之间移动。根据第四个方面，本发明提供了用于在反应管中进行至少两个反应的系统，所述系统包含至少ー个所述反应管，其具有至少两个允许反应在其中发生的反应相、与所述两个反应相不混溶并布置在其之间的分隔相、和至少ー个能够与化学物质相连接的磁性颗粒，其中所述磁性颗粒可在所述反应相之间移动从而将所述化学物质引入其中；和至少ー个在所述反应管外部的磁性装置，其中所述磁性装置可沿与所述反应管的纵轴基本平行的纵轴移动。定义在本文中使用的以下文字和术语应当具有所标明的含义术语“连接(coupled) ”，在表示颗粒与化学物质“连接”吋，包括颗粒与化学物质之间直接和间接的物理和化学結合(bonding)。化学結合涵盖化学物质分子的共价和非共价结合，其具体包括但不限于共价结合、静电结合、氢键结合和范德华カ结合。化学結合可涵盖直接化学結合，其中化学物质分子与颗粒结合，和间接化学結合，即化学物质分子和另 ー种化学物质相结合，所述另ー种化学物质继而与所述颗粒相结合。物理结合表示任何吸引性的非化学相互作用，其能够将化学物质保持在所述颗粒表面。物理结合也可以是直接和间接的，在直接物理结合中化学物质与所述颗粒物理性地直接相连，而在间接物理结合中化学物质与另ー种化学物质直接相连，所述另ー种化学物质与所述颗粒物理性结合。术语“化学物质”广义地解释为包括任何实体，例如原子、分子、分子碎片和离子。 该实体可以是生物样品、非生物样品或者核酸。“生物样品”可以选自皮肤拭子(dermal swab)、脑脊液、血液、痰液、支气管肺泡灌洗液、支气管吸出物、肺组织和尿液。“非生物样品”可以是包含下列的液体悬浮物粉末、 来自空气样本的颗粒和来自土壤样品的颗粒以及表面拭子(surface swipe)。可以培养生物和非生物样品以利于对微生物状况(如炭疽杆菌(B. anthracis))进行评价。术语“核酸”可包括，例如，但不限于脱氧核糖核酸(DNA)、核糖核酸(RNA)和人工核酸比如肽核酸(PNA)、吗啉基(morpholino)和锁核酸(LNA)、甘油核酸(glycol nucleic acid, GNA)和苏糖核酸(TNA)。在本文中，术语“核酸”、“核酸序列”或者“核酸分子”应该从广义解释，举例来说，可以是核糖核酸(RNA)或脱氧核糖核酸(DNA)或者其模拟物的寡聚物或者聚合物。该术语包括由天然核碱基、糖类和共价核苷间(骨架)连接构成的分子以及具有非天然核碱基、糖类和共价核苷间(骨架)连接构成的具有类似功能的分子或者其組合。因为所需的性质，比如对核酸靶分子亲和カ增强以及在核酸酶和其他酶存在时稳定性増加，这样的经修饰或者取代的核酸可能比天然形式更优选，并且在本文中用术语“核酸类似物”或者“核酸模拟物”来描述。核酸模拟物的优选实例是包含肽核酸(PNA)、锁核酸 (LNA)、木-锁核酸Uylo-LNA)、硫代磷酸酷、2’-甲氧基、2’-甲氧基乙氧基、吗啉基和氨基磷酸酯的分子或者功能上类似的核酸衍生物。术语“颗粒”广义地解释为包括任何磁性或者非磁性的任何形状的颗粒，该颗粒能够和化学物质相连接。所述颗粒可以是基本上为球形的磁性颗粒。术语“磁性装置”广义地解释为包括任何能够通过在物体上施加磁场从而在所述物体上施加吸引力或者排斥力的材料。适合用作磁性装置之材料的典型例子是镍、铁、钴、 钆及其合金。文字“基本上”不排除“完全地”，例如，“基本上不含” Y的組合物可以完全不含Y。 在必要吋，文字“基本上”可在本发明的定义中省去。除非另外特別指出，术语“包括”和“包含”及其语法上的变化形式，旨在表示“开放性”或“包含性”的表示，使得它们包含所记载的要素，而且还允许包含其他未记载的要素。
本文所使用的术语“约”，在制剂成分浓度的背景中，通常表示所记载值的+/-5 %，更通常表示所记载值的+/-4%，更通常表示所记载值的+/-3%，更通常表示所记载值的+/-2 %，甚至更通常表示所记载值的+/_1%，甚至更通常表示所记载值的+/-0. 5%。在整个本申请公开内容中，某些实施方案可能以范围的形式公开。应理解为，范围形式的描述只是为了方便和简洁，而不应当被视为对所公开范围的硬性限制。因此，对范围的描述应当被认为已经具体公开了所有可能的子范围以及该范围内的各个数值。例如，对范围的描述如1至6应当被认为已经具体公开了子范围例如1至3、1至4、1至5、2至4、2至6、3至6等，以及这个范围内的各个数值，例如1、2、3、4、5和6。无论范围有多宽，该原则均适用。任选实施方案的公开下面公开用于在反应管中进行多于一个反应之方法的示例性非限制性实施方案。所述反应管可含有多个颗粒。所述颗粒可在离心力或者重力作用下移动穿过反应相。在一个实施方案中，所述颗粒是磁性颗粒，其可在磁力作用下移动穿过反应相。本公开方法可另外包括以下步骤提供至少一个在反应管外部的磁性装置，其中该磁性装置可沿与所述反应管纵轴基本平行的纵轴移动。在一个实施方案中，所述反应相是水相(aqueous phase)。在一个实施方案中，所述不混溶的相是油相。该油相可包含矿物油。在一个实施方案中，所述反应包括核酸提取反应。在一个实施方案中，所述反应包括聚合酶链式反应。所述水相可包含细胞裂解溶液、清洗缓冲液、洗脱缓冲液或者聚合酶链式反应溶液。在一个实施方案中，所述磁性颗粒为球形，并具有约0. 5微米至约300微米、或者约0. 5微米至约100微米、或者约0. 5微米至约50微米、或者约0. 5微米至约25微米、或者约0. 5微米至约10微米、或者约0. 5微米至约5微米、或者约1微米范围内的直径。所使用的磁珠可以是Magpr印 二氧化硅珠子(Merck，法国)。在一个实施方案中，Magprep⑧二氧化硅珠的用量为约10微克至约200微克、约20微克至约175微克、约30微克至约150微克、约40微克至约125微克、约50微克至约100微克的范围。在一个实施方案中，反应管是毛细管。该毛细管可以是约35毫米长，内径约0. 75毫米，外径约1毫米。在一个实施方案中，所述毛细管是玻璃毛细管。该玻璃毛细管可以由硼硅酸盐玻璃或者任何其他具有优良热性能的材料制成并可承受温度快速变化而不破裂。所述磁性装置可以以变化的或恒定的或者二者组合的速度移动。在决定磁性装置移动速度时考虑磁珠的用量，从而控制磁珠在反应管中的移动。所述磁性装置的移动速度越低，约束磁珠彼此接近并形成簇的磁力就越大。这提供足够的动量使得磁珠移动穿过水油界面，即从水相穿至油相，反之亦然。磁珠的用量越大，使得所述磁珠形成具有足够动量移动穿过油-水界面的簇所需的磁性装置移动速度就越小。所述磁性装置可以以约0. 1毫米/秒至约10毫米/秒、约1毫米/秒至约9毫米/秒、约2毫米/秒至约8毫米/秒、约3毫米/秒至约7毫米/秒、约4毫米/秒至约6毫米/秒范围内的速度移动。聚合酶链式反应可包含荧光染料，该染料可协助检测反应完成之前，之中和/或之后核酸的存在状况和/或所存在的量。聚合酶链式反应也可以是多重反应。所用的荧光染料可以是STOR Green，或者分子探针或信标。在一个实施方案中，所公开的系统还包含光学检测装置，其用来检测在每个所述不混溶相中核酸的存在状况和/或量。
附图举例说明了所公开的实施方案，并用于解释所公开实施方案的原理。但是，应理解附图仅为举例说明的目的而设计，而不作为对本发明的限定。图1是包含多于一个不混溶相的玻璃毛细管的示意图。图2是反应系统的示意图，其包含图1所示的包含多于一个不混溶相的玻璃毛细管。图3a和北是图1所示的包含多于一个不混溶相的玻璃毛细管的截面示意图，以说明其中所含磁珠的移动。
具体实施例方式图1显示玻璃毛细管10，其具有矿物油层形式的四个分隔相(11A、11B、11C、11D)和由其中所含对照溶液13、第一测试溶液14、第二测试溶液15和清洗溶液16组成的水层所形成的四个反应区域。对照溶液13、第一测试溶液14和第二测试溶液15是含有进行聚合酶链式反应(PCR)所需试剂的溶液。在使用时，第一测试溶液14和第二测试溶液15提供了进行独立的一式两份的相同反应。玻璃毛细管10在其底部还含有一个环氧树脂封口12，以密封玻璃毛细管10的底部，从而防止其中所含溶液和矿物油的泄露。玻璃毛细管10的功能将在下文参照图2、3A和;3B进一步描述。图2显示具有图1所示玻璃毛细管10以及如上所述内容物的反应系统20。反应系统20还包含样品保持器21、毛细管保持器22和磁体30。DNA所编码的磁珠40首先容纳在样品保持器21中。磁体30提供磁力使磁珠40沿玻璃毛细管10移动。当操作时，随着磁体30沿箭头35所示方向向下移动，磁珠40沿箭头45所示方向向下移动。这使得编码在磁珠40上的DNA根据实验的要求移动穿过矿物油层(11A、11B、11C、11D)并混合在多个水层中(13、14、15、16)，其中对照溶液13是阳性对照，其可用于检查其中所含PCR溶液的完整性。在一个实施方案中，对照溶液13用作阴性对照。因此，磁珠40不需要穿过矿物油层IlD移动到对照溶液13。图3A和;3B显示玻璃毛细管10的截面，以便于显示磁珠40沿玻璃毛细管10的移动。相比而言，图3A所示磁体30 (如箭头32所示向下移动)相比图;3B所示(如箭头34所示向下移动)以更快的速度移动。参看图3A，磁体30以5毫米/秒的速度移动。因为磁体30较快的移动速度，第二测试溶液14中的磁珠40散开，因此没有足够动量来穿过矿物油层11D。例如，当对照溶液13用作阴性对照时，此操作是期望的。另一方面，参看图:3B，磁体以3毫米/秒的速度移动。因为磁体30较慢的移动速度，第二测试溶液14中的磁珠40紧密地簇集在一起，从而为磁珠40穿过矿物油层IlD提供了足够的动量。例如，当对照溶液13用作阳性对照时，此操作是期望的。应用应了解所公开的方法允许在单个反应管中进行多于一个物理或化学反应。所公开的方法允许一式多份地进行相同的实验，由此避免可能显著影响实验结果准确度和可靠性的试管间差异。有利地，还可在同一反应管中包含阳性和/或阴性对照实验，以进一步增强其中所进行实验的集成性。应了解所公开方法可用于进行许多不同类型的分子生物学实验，例如聚合酶链式反应、DNA提取和/或DNA纯化。有利地，所公开方法还消除了将实验样品或反应从一个试管转移到另一个试管的需要。有利地，为了进行反应，磁珠与目的化学物质相连接。磁珠的移动也帮助化学物质混合在反应相中。更有利地，应了解磁珠移动穿过反应相和分隔相不造成对相分隔的任何干扰。应明确在阅读了前述公开内容后在不脱离本发明精神和范围的情况下对本发明的多种其他修改和改动是对本领域技术人员来说显而易见的，并且所有这些修改和改动应涵盖在所附权利要求的范围内。
权利要求
1.用于在反应管中提供至少两个反应区域的方法，所述方法包括以下步骤 在所述管中提供至少两个由各自反应相形成的区域；在所述管中提供分隔相，所述分隔相与所述反应相不混溶并布置在其之间，从而分隔所述反应区域；以及在所述管中提供至少一个颗粒，该颗粒能够与化学物质相连接，其中所述颗粒可在所述反应区域之间移动从而引入所述化学物质。
2.根据权利要求1的方法，其中所述颗粒可在离心力或重力作用下移动。
3.根据权利要求1的方法，其中所述颗粒是磁性颗粒。
4.根据权利要求3的方法，其还包括以下步骤在所述反应管的外部提供至少一个磁性装置，其中所述磁性装置可沿基本与所述反应管纵轴平行的纵轴移动。
5.根据前述任一权利要求的方法，其中所述反应相是水相。
6.根据前述任一权利要求的方法，其中所述不混溶的相为与所述反应相不混溶的油相。
7.根据前述任一权利要求的方法，其中所述反应是独立的化学或物理反应。
8.根据权利要求7的方法，其中所述反应包括核酸提取反应。
9.根据权利要求7的方法，其中所述反应包括聚合酶链式反应。
10.根据权利要求5的方法，其中所述水相包含下列至少之一(i)细胞裂解溶液; ( )清洗缓冲液；(iii)洗脱缓冲液和(iv)聚合酶链式反应溶液。
11.根据权利要求6的方法，其中所述油相包含矿物油。
12.根据权利要求3的方法，其中所述磁性颗粒基本为球形。
13.根据权利要求12的方法，其中所述球形磁性颗粒具有微米范围的直径。
14.根据权利要求3至13中任一项的方法，其中在所述管中提供多个磁性颗粒。
15.根据引用权利要求4的权利要求14的方法，其中所述磁性装置设置成使所述多个磁性颗粒以一定速度在所述两个反应区域之间移动，使得所述多个磁性颗粒以基本上单一簇的形式从一个反应相到达另一个反应相。
16.根据权利要求4的方法，其中所述磁性装置包含由选自下列的金属制成的磁体 镍、铁、钴、钆及其合金。
17.反应管，其包含至少两个反应相，以允许反应在其中发生；与所述至少两个反应相不混溶并布置在其之间的分隔相；和能够与化学物质相连接的颗粒，其中所述颗粒可在所述反应相之间移动从而将所述化学物质引入其中。
18.根据权利要求17的管，其中所述颗粒是磁性颗粒。
19.根据权利要求17的管，其中所述反应管是玻璃毛细管。
20.根据权利要求19的管，其中所述玻璃毛细管长约20毫米至约50毫米。
21.根据权利要求19的管，其中所述玻璃毛细管具有大约0.5毫米的内径。
22.用于在反应管内进行至少两个反应的系统，所述系统包含至少一个所述反应管，其具有至少两个允许反应在其中发生的反应相、与所述两个反应相不混溶并布置在其之间的分隔相、和至少一个能够与化学物质相连接的颗粒，其中所述颗粒可在所述反应相之间移动从而将所述化学物质引入其中；和至少ー个离心装置，其用于使得所述颗粒能够在离心力的作用下在所述反应相之间移动。
23.用于在反应管内进行至少两个反应的系统，所述系统包含至少ー个所述反应管，其具有至少两个允许反应在其中发生的反应相、与所述两个反应相不混溶并布置在其之间的分隔相、和至少ー个能够与化学物质相连接的磁性颗粒，其中所述磁性颗粒可在所述反应相之间移动从而将所述化学物质引入其中；和至少ー个在所述反应管外部的磁性装置，其中所述磁性装置可沿与所述反应管的纵轴基本平行的纵轴移动。
24.根据权利要求23或M中任ー项的系统，其还包含光学检测装置，用于检测所述反应相中所述化学物质的存在和/或量。
25.用于进行聚合酶链式反应(PCR)的方法，所述方法包含以下步骤在管中提供由各自反应相所形成的多个区域，每个所述反应区域包含至少ー种选择用于扩增目标核酸的溶液；在所述管中提供多个与所述反应相不混溶的分隔相，所述分隔相布置在成对反应区域之间；和在所述管中提供至少ー个颗粒，其能够与用于PCR反应的化学物质相连接，其中所述颗粒可在所述反应区域之间移动从而将化学物质引入其中。
26.根据权利要求25的方法，其中所述多个反应区域的所述溶液选择成扩增不同的目标核酸。
27.根据权利要求25的方法，其中所述颗粒可在离心カ或重力作用下移动。
28.根据权利要求25的方法，其中所述颗粒为磁性颗粒，并且可在磁力作用下移动。
全文摘要
本发明公开了用于在反应管中进行至少两个反应的方法，所述方法包括以下步骤在所述反应管中提供至少两个反应相使所述反应在其中发生，提供与所述两个反应相不混溶并布置在其之间的分隔相，提供至少一个能够与化学物质相连接的颗粒，其中所述颗粒可在所述反应相之间移动从而将所述化学物质引入其中。
文档编号C12Q1/68GK102574090SQ201080031874
公开日2012年7月11日 申请日期2010年6月16日 优先权日2009年6月16日
发明者基昂科克·约翰逊·吴, 拉尔斯·汤姆森 申请人:生物芯片创新有限公司