专利名称：用于棉花中基因功能性分析的病毒诱导的基因沉默(vigs)的制作方法
用于棉花中基因功能性分析的病毒诱导的基因沉默
(VIGS)相关申请的交叉引用本申请要求2009年6月10日提交的美国临时专利申请61/185，631的权益，在此通过引用将其并入本申请。序列表提交本申请与电子形式的序列表一起提交。序列表名称为2577_195PCT_Sequence_ Listing, txt,于2010年6月3日创建。在此通过引用将电子形式序列表中的信息并入本申请。
背景技术：
本发明涉及在基因组规模上功能性分析棉花基因的领域。更具体地，本发明涉及使用病毒诱导的基因沉默(VIGS)在基因组规模上高通量功能性分析棉花基因的方法。本发明还涉及用于在棉花植物中瞬时表达基因的瞬时表达载体和用于在棉花植物中瞬时表达基因的方法。本文所用的出版物和其它材料是用于说明本发明的背景，或提供与实践有关的额外细节，它们在此援引加入且分别列在参考书目中供参考。棉花(棉属(Gossypium spp.))是世界上最重要的纤维植物和重要的油料作物，其生长在超过80个国家中，在2006/2007生长季节世界产量的记录是122，000, 000 (480磅/包)(美国农业部海外局)。消费量与产量之间的逆差发生在1994/1995年，预期在2009/2010 生长季节将持续增加至 2，500，000 (480 磅 / 包)(United States Departmentof Agriculture-Foreign Agricultural Service[USDA-FAS]2009)。棉花生产为约100,000,000名农民带来收入，且约150个国家参与到棉花进口和出口(Lee et al.，2007)。估计世界范围内其经济影响为约$5，000, 000, 000, 000/年。而且，改进食物和饲料用的棉花种子能够显著提高食物挑战型经济中数百万人的营养和生计。棉花也是可再生生物燃料的潜在候选植物。棉花纤维由近乎纯的纤维素组成。与木质素相比，纤维素易于转化为生物燃料。最佳的棉花纤维生产和加工将确保这种天然可再生的产品相比于源自石油的合成不可再生纤维更有竞争力，以确保更加可持续的发展。为了解决上述问题，棉花的许多农艺学性质，如纤维长度和强度、农业产率、耐旱性和抗害虫性需要通过可利用的遗传资源和鉴定基因功能的快速方法来增强(Udall etal.，2006)。棉花是广泛生长且用于生产天然织物纤维和棉花籽油的重要作物。棉花纤维是用于研究细胞伸长以及细胞壁和纤维素生物合成的模型系统。此外，棉花纤维是单细胞，因此细胞伸长可独立于细胞分裂来评价。将棉花纤维用作植物发育的模型系统的最显著优点之一是Beasley和Ting在1973年对棉花胚珠的培养方法进行了优化。棉花属包括约45个二倍体(2n = 2x = 26)和5个四倍体(2n = 4x = 52)的物种，它们全部显示出二体遗传模式。尽管也在一定程度上使用其它三种物种，海岛棉(Gossypium barbadense)(四倍体)、亚洲棉(Gossypium arboretum) ( 二倍体)和草棉(Gossypium herbaceum) (二倍体)，但最普遍的棉花变种是陆地棉(Gossypium hirsutum)(陆地棉，四倍体)的形式，其占世界范围内每年棉花作物的约95%。其它这三类物种也是重要的遗传资源，为专门育种目的提供了基因库。例如，对生物和非生物胁迫具有高抗性的草棉可被用作与陆地棉进行种间杂交以改善其对各种胁迫抗性的良好起始遗传材料。因此，也十分需要在棉属和亲缘植物中进行基因功能性分析的独立于物种的方法。目前，棉花全基因组测序刚刚开始。同时，不断增加的棉属EST序列(目前约400, 000个)组和源自在一系列生长条件下由各种组织和器官构建的不同文库的非冗余基因(unigene)组可在网络上以及通过基于这些序列的微阵列分析来获得(Udall et al.，
2006)。其它植物基因组序列的可用性起到在棉花EST数据库中鉴定和注解假定的直系同源物的有用平台的作用。虽然可从棉花纤维差异以及叶毛状体和次生木质部细胞形成之间说明相似性，但最终需要在棉花中直接检测假定的直系同源基因的功能。此外，已知棉花纤维表达在其它植物中尚无已知同源物的基因，这些基因赋予了一些独特的纤维性质。即使一些转录因子基因的功能已在拟南芥(Arabidopsis)中测试,但它们的确切功能仍需要在 同源棉花植物中进一步确认。鉴定棉属的农艺学和品质性状的重要方法是稳定转化入棉花。然而，稳定转化的棉花植物的低效生产限制了大规模基因鉴定。而且，此过程费力且耗时，不适用于基因组规模上的高通量分析。而且，仅有少量栽培品种可用作转化的宿主。通常，难以通过在棉花中的稳定转化来从良好的起始遗传材料中直接鉴定重要的遗传元件。因此，希望开发出在基因组规模上独立于物种的棉属基因高通量功能性分析的方法。
发明内容
在一个实施方式中，本发明涉及在棉花(棉属)植物中直接操作靶基因表达的方法。更具体地，本发明涉及在全部棉花物种和种质，特别是在四倍体棉花，如陆地棉(Gossypium hirsutum)和海岛棉(Gossypium barbadense), 二倍体棉花，如草棉(Gossypium herbaceum)和亚洲棉(Gossypium arboretum),以及源自种内和种间杂交的种质中调节或抑制一种或多种靶基因表达的方法。所述方法已对属于若干功能性种类的基因，包括参与发育、小RNA途径和次级代谢生物合成的转录因子等进行了测试。特别预期本发明的方法和组合物可用于棉花基因的功能性分析中。本发明涉及在基因组规模上功能性分析棉花基因的领域。更具体地，本发明涉及使用病毒诱导的基因沉默(VIGS)在基因组规模上高通量功能性分析棉花基因的方法。本发明还涉及用于在棉花植物和植物组织中瞬时表达基因的瞬时表达载体和用于在棉花植物和植物组织中瞬时表达基因的方法。本发明涉及VIGS在可靠且快速和以高通量方式评价棉花(棉属)植物和植物组织基因功能中的应用。一方面，本发明提供了用于在棉花(如陆地棉)中进行VIGS的高效和可再生的系统以及方法。在一个实施方式中，本发明提供了烟草脆裂病毒(TRV)全病毒基因组的进一步再合成。在另一实施方式中，本发明提供了用于全基因组功能性分析的快速沉默方法。在另一实施方式中，本发明提供了 TRV VIGS系统在克隆和功能性鉴定若干功能性种类基因中的应用。这些重要的基因可用于改进棉花农艺学性状，如抗害虫性。在一个实施方式中，包含TRV RNA2的载体和包含TRV RNAl的载体为合成的植物载体。在另一实施方式中，TRV RNA2包含能够沉默第一目标基因的第一沉默序列。在一个实施方式中，第一沉默序列为目标基因的有义链的序列。在另一实施方式中，第一沉默序列为目标基因的反义链的序列。在另一实施方式中，第一沉默序列为编码能够对第一目标基因进行RNA干扰(RNAi)的短发夹RNA(shRNA)。在另一实施方式中，第一沉默序列为编码能够对第一目标基因进行RNAi的前体微小RNA(miRNA)或miRNA的序列。在另一实施方式中，核酸进一步包含能够沉默第二目标基因的第二沉默序列。在另一实施方式中，核酸包含能够沉默大于两个目标基因的大于两种沉默序列。在一些实施方式中，目标基因为候选转录因子基因。在另一实施方式中，目标基因为叶绿素或类胡萝卜素生物合成中的候选基因。在另一实施方式中，目标基因为类黄酮生 物合成途径中的候选基因。在另一实施方式中，目标基因为原花色素和花色素生物合成途径中的候选基因。在另一实施方式中，目标基因为棉花纤维发育中的候选基因。在另一实施方式中，目标基因为棉花纤维起始、伸长、次生壁沉积、成熟或种子发育中的候选基因。在一个实施方式中，目标基因为小RNA(smRNA)生物合成中的候选基因。在另一实施方式中，目标基因为次级代谢毒剂生物合成中的候选基因，且对植物抗生物胁迫也很重要。在另一实施方式中，目标基因为与细胞伸长、细胞壁生物合成和纤维素生物合成相关的候选基因。因此，第一方面，本发明提供了在棉花中进行病毒诱导的基因沉默(VIGS)的方法。根据此方面，所述方法包括(a)将包含能够沉默第一目标基因的第一沉默序列的核酸插入包含烟草脆裂病毒(TRV) RNA2序列的载体中，以产生修饰型TRV RNA2载体；(b)制备农杆菌(Agrobacterium)的混合培养物,所述混合培养物包含含有包含TRV RNAl序列的载体的农杆菌和含有修饰型TRV RNA2载体的农杆菌；(c)将农杆菌的混合培养物引入棉花的植物组织以产生受感染的植物组织；和(d)使受感染的植物组织生长足够的时间，以诱导第一目标基因的基因沉默。在此第一方面的一个实施方式中，植物组织为棉花植物或棉花幼苗。在此实施方式中，受感染的植物在步骤(C)中产生，且受感染的植物在步骤(d)中生长。在此第一方面的一个实施方式中，植物组织为棉花胚珠。在此实施方式中，受感染的棉花胚珠在步骤(C)中产生，且受感染的棉花胚珠在步骤(d)的培养中生长。在另一实施方式中，植物组织为棉花纤维。在此实施方式中，受感染的棉花纤维在步骤(C)中产生，且受感染的棉花纤维在步骤(d)的培养中生长。在进一步的实施方式中，棉花植物或幼苗被感染，且病毒在棉花组织中传播，使得VIGS在受感染的棉花植物或幼苗的全部组织中发生。在另一方面，本发明提供了在棉花中分析基因功能的方法。根据此方面，所述方法包括(a)将包含能够沉默候选基因的沉默序列的核酸插入包含烟草脆裂病毒(TRV)RNA2序列的载体中，以产生修饰型TRV RNA2载体；(b)制备农杆菌(Agrobacterium)的混合培养物,所述混合培养物包含含有包含TRV RNAl序列的载体的农杆菌和含有修饰型TRV RNA2载体的农杆菌；(c)将农杆菌的混合培养物引入棉花的植物组织以产生受感染的植物组织；
(d)使受感染的植物组织生长足够的时间，以诱导候选基因的基因沉默；和(e)分析所沉默的候选基因对受感染的植物组织的表型影响。在此第二方面的一个实施方式中，植物组织为棉花植物或棉花幼苗。在此实施方式中，受感染的植物在步骤(C)中产生，且受感染的植物在步骤(d)中生长。在此第一方面的一个实施方式中，植物组织为棉花胚珠。在此实施方式中，受感染的棉花胚珠在步骤(C)中产生，且受感染的棉花胚珠在步骤(d)的培养中生长。在另一实施方式中，植物组织为棉花纤维。在此实施方式中，受感染的棉花纤维在步骤(C)中产生，且受感染的棉花纤维在步骤(d)的培养中生长。在进一步的实施方式中，棉花植物或幼苗被感染，且病毒在棉花组织中传播，使得VIGS在受感染的棉花植物或幼苗的全部组织中发生。在另一方面，本发明提供了用于在棉花植物或棉花组织中瞬时表达基因的瞬时表 达载体和方法。根据此方面，瞬时表达载体包含TRV RNA2序列和至少一个拷贝的强亚基因组启动子，以及任选存在地包含第一感兴趣的序列的核酸。在一个实施方式中，亚基因组启动子能够被TRV复制酶识别。在另一实施方式中，亚基因组启动子为强衣壳蛋白亚基因组启动子。在进一步的实施方式中，亚基因组启动子源自烟草脆裂病毒组，而非TRV。在一个实施方式中，亚基因组启动子为合成的豌豆早枯病毒(PEBV)亚基因组启动子。在另一实施方式中，亚基因组启动子为辣椒环斑病毒(PepRSV)衣壳蛋白亚基因组启动子。用于在棉花中瞬时表达的感兴趣的核酸插入在亚基因组启动子的下游，且可操纵地连接于此启动子。根据此方面，用于在棉花组织中瞬时表达感兴趣的核酸的方法包括(a)将包含待在棉花植物中表达的第一感兴趣的序列的核酸插入瞬时表达载体中，以产生TRV RNA2表达载体，所述瞬时表达载体包含烟草脆裂病毒(TRV) RNA2序列和至少一个拷贝的强亚基因组启动子，其中所述核酸可操纵地连接于所述亚基因组启动子；(b)制备农杆菌的混合培养物，所述混合培养物包含含有包含TRVRNA1序列的载体的农杆菌和含有TRV RNA2表达载体的农杆菌；(C)将农杆菌的混合培养物引入棉花的植物组织；和(d)使受感染的植物生长足够的时间，以瞬时表达目标基因。在此另一方面的一个实施方式中，植物组织为棉花幼苗。在此另一方面的另一个实施方式中，植物组织为棉花胚珠。在此另一方面的另一个实施方式中，植物组织为棉花植物。在另一实施方式中，植物组织为棉花纤维。在更进一步的实施方式中，棉花植物或幼苗被感染，且病毒在棉花组织中传播，使得VIGS在受感染的棉花植物或幼苗的全部组织中发生。在另一方面，本发明提供了修饰型TRV RNAl载体。根据此方面，修饰型TRV RNAl载体包含已插入至少一个内含子的TRV RNAl序列。在另一方面，修饰TRV RNA基因组以去除假定的内含子样特征和潜在的问题区域，如长的富含胸腺嘧啶的序列。此修饰型TRVRNAl载体可用于在任何上述方法中替换含TRV RNAl的载体。
图I :根据本发明的用于棉花瞬时表达的方法。瞬时表达可用于病毒诱导的基因沉默(VIGS)或基因表达。图2 :用一个内含子插入进行TRV RNAl修饰的示意图。
图3A-3C :棉酚生物合成基因的沉默。图3A :用对照和psTRV2 CAD感染的棉花植物的表型。图3B :使用从处理植物的上部叶提取的总RNA进行实时定量PCR。实时PCR分析显示CAD转录物水平在系统叶中显著降低。图3C :来自cad沉默的棉花叶的棉酚和相关倍半萜化合物的HPLC色谱。CK :载体对照感染的；CAD，来自杜松烯合酶表达沉默的植物中的叶子。叔丁基蒽醌被用作内标。图4A-C =VIGS对一种叶绿素生物合成基因镁螯合酶CH42基因的影响和对胡萝卜素生物合成基因八氢番茄红素去饱和酶(ros)基因的影响。将携带psTRVl或psTRV2(载体对照 1+2 (图 4A)或核对物(check)(图 4B)、psTRV2 CH42 (图 2A 和 2B)、psTRV2 PDS (图2A))的根瘤农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)株的培养物以I : I的比例混合。使混合培养物真空进入2-3叶龄植物期的陆地棉植物。图4A :在接种后(DPI) 14天采集的棉花叶；图4B :棉花芽和45DPI采集的棉花叶。CH42酶负责在叶绿素生物合成期间将Mg加入卟啉环中。CH42基因的沉默阻碍了新生叶中叶绿素合成，这些新生叶丧失了它们的绿色，但因存在类胡萝卜素而显出黄色。图4C :定量RT-PCR分析，以确定在CH42处理的棉花新生叶中沉默的陆地棉CH42RNA水平，和在PDS处理的棉花新生叶中陆地棉H)S RNA水平。数值代表来自具有标准偏差的3个独立实验的平均值。实时PCR分析显示CH42和PDS转录物 水平在系统叶中显著降低。图5A-C =VIGS系统不但在四倍体棉花陆地棉中起作用，而且也在二倍体棉花亚洲棉(图A、图B)和草棉(图C)中起作用。图6 :预测的假定的棉花ASl (GhASl)蛋白(SEQ ID NO 18)与拟南芥ASl (AtASl (GenBank 登录号NM_129319 ;SEQ ID N0:19))、普通烟(Nicotiana tabacum)ASl (NtASI (GenBank 登录号AY559043 ;SEQ ID NO :20))和小翠云(Selaginellakraussiana)ARP(SkARP(GenBank 登录号AY667452 ;SEQ ID NO :21))的氨基酸序列比较。格式为CLUSTALW产生的比对图，共有序列(SEQ ID NO 22)列在下方。在保守的R2R3MYB结构域下方划线。图7A-7H :转录因子ASl的沉默。图7A-7D psTRV2 ASl感染的棉花植物的表型。图7F和7G :psTRV2 ASl感染的棉花植物的扫描电镜图。图9H :使用从处理植物的上部叶提取的总RNA进行实时定量PCR。实时PCR分析显示ASl转录物水平在系统叶中显著降低。PB :主要叶片；EB :异位叶片；ebad :近轴的异位叶片；ebab :远轴的异位叶片。CK :受感染的载体对照；AS1，来自ASl表达沉默的植物的叶。图8A-8C psTRV2 AGOl感染的棉花植物的表型。PB :主要叶片；EB :异位叶片。图9A和9B :棉花叶中花色素和原花色素生物合成基因ANS和ANR的沉默。图9A psTRV2 ANS或sTRV2 ANR感染的棉花植物的表型显示出对叶、叶柄和芽的影响。图9B :使用从处理植物的上部叶提取的总RNA进行实时定量PCR。实时PCR分析显示ANR和ANS转录物水平在系统叶中显著降低。CK :受感染的载体对照；ANR，来自ANR表达沉默的植物的叶；ANS，来自ANS表达沉默的植物的叶。图10 :棉花皮中花色素和原花色素生物合成基因ANS和ANR的沉默。图11 :不同棉花器官中花色素和原花色素生物合成基因ANS和ANR的沉默。图12 :棉花芽中花色素和原花色素生物合成基因ANS和ANR的沉默。图13A-13N :在psTRV2 AN处理的植物中，在棉花叶(图13A和13B)、花芽和花球(图13D、13F、13H、13J、13L和13N)中，以及在对照植物的棉花花芽和花球中(图13C、13E、13G、13I、13K和13M)，CtBP直系同源基因AN的沉默。图14 =CtBP直系同源基因AN在棉花胚珠和纤维中的沉默。CK :受感染的载体对照；ANR，来自AN表达沉默的植物的叶。图15 :棉花CtBP直系同源基因AN在棉花纤维起始中起重要作用。1+2 :受感染的载体对照；AN，来自AN表达沉默的植物的叶。图16A和16B =CtBP直系同源基因AN在棉花系统叶(图16A)和胚珠(图16B)中的沉默。实时PCR分析显示AN转录物水平在系统叶和胚珠中均显著降低。CK:受感染的载体对照；AN，来自AN表达沉默的植物的叶。图17A-J :细胞骨架基因Katanin(KTN)在棉花中的沉默。图17A :载体对照处理的植物中的表型影响；图17B psTRV2 KTN处理的植物中的表型影响；图17D、17F、17H和17J psTRV2 KTN处理的植物的花芽和花球中的表型影响;图17C、17D、17G和171 :对照 植物的花芽和花球中的表型影响。图18 =KTN是棉花纤维伸长的必需基因。图19 =KTN在叶毛状体长度和模式中起作用。图20A-20E :psTRV2 GFP感染的植物。图20A :空载体感染的植物的表型。图20B-20D psTRV2 GFP感染的植物的表型。图20E :psTRV2 GFP感染的植物的蛋白印迹。上栏用抗GFP抗体检测的GFP蛋白。下栏用作为上样对照的考马斯亮蓝染色的rbcL带。栏I :空载体；栏2-4 psTRV2 GFP进入的3种独立植物。图21A和21B :棉花胚珠培养物。图21A:BT培养基中的2周龄培养物。图21B :体外胚珠培养物上的纤维长度。图22A和22B :棉花中肌动蛋白基因表达。图22A psTRVl+psTRV2处理的胚珠。全部胚珠能够很好地生长为纤维。图22B :psTRVl+psTRV2 Actin I处理的胚珠。虽然胚珠能够生长为纤维，但此纤维比对照纤维短。图 23A-23L =VIGS-GhActinU VIGS-GhADF I 和 psTRVl+psTRV2 的胚珠表面的扫描电镜图。图 23A-23D :在 0(图 23A)、1(图 23B)和 2(图 23C、图 23D) DPA 时，psTRVl+psTRV2感染的胚珠，以及在感染后I (图23A、图23B、图23C)和2 (图23D)天扫描的胚珠。注意到，纤维长度随时间增加。图23E-23H:在0(图23E)、1(图23F)和2(图23G、图23H)DPA时，psTRVl+psTRV2 Actin I感染的胚珠，以及在感染后I (图23E、图23F、图23G)和2 (图23H)天扫描的胚珠。注意到纤维长度比在相同时期pSTRvl+pSTRV2中的纤维长度短，毛状体的表面粗糙且褶皱。图23I-23L :在0(图231)、1(图23J)和2(图23K、图23L)DPA时，psTRVl+psTRV2 GhADF I感染的胚珠，以及在感染后I (图231、图23J、图23K)和2 (图23L)天扫描的胚珠。注意到纤维长度与相同时期psTRVl+psTRV2的纤维长度相同。图 24A-24C :VIGS-GhCTR UVIGS-GhDELLA I 和 psTRVl+psTRV2 的胚珠表面的扫描电镜图。图24A :在IDPA时psTRVl+psTRV2感染的胚珠和在感染后I天扫描的胚珠。图24B 在IDPA时psTRVl+psTRV2 GhCTR I感染的胚珠和在感染后I天扫描的胚珠。注意到纤维长度比相同时期sTRVl+sTRV2的纤维长度短。图24C :在IDPA时psTRVl+psTRV2 GhDELLAI感染的胚珠和在感染后I天扫描的胚珠。注意到纤维长度与相同时期psTRVl+psTRV2的纤维长度相同。
图 25A-25C :VIGS-GhAlpha-tubulin I、VIGS-GhBeta-tubul in I 和psTRVl+psTRV2的胚珠表面的扫描电镜图。图25A :在IDPA时psTRVl+psTRV2感染的胚珠和在感染后 I 天扫描的胚珠。图 25B :在 IDPA 时 psTRVl+psTRV2 GhAlpha-tubulinl DPA感染的胚珠和在感染后I天扫描的胚珠。注意到毛状体的表面粗糙且褶皱。图25C :在IDPA时psTRVl+psTRV2 ADFGhBeta-tubulin I感染的胚珠和在感染后I天扫描的胚珠。注意到毛状体的表面粗糙且褶皱。图 26A-26D :VIGS-GhMADS 9、VIGS_GhMBY5、VIGS_GhMBY6 和 psTRVl+psTRV2 的胚珠表面的扫描电镜图。图26A :在IDPA时psTRVl+psTRV2感染的胚珠和在感染后3天扫描的胚珠。图26B :在IDPA时psTRVl+psTRV2 GhMADS 9感染的胚珠和在感染后3天扫描的胚珠。注意到纤维长度比相同时期sTRVl+sTRV2的纤维长度长。图26C :在IDPA时psTRVl+psTRV2 ADFGhMYB 5感染的胚珠和在感染后3天扫描的胚珠。注意到纤维长度与相同时期 psTRVl+psTRV2 的纤维长度相同。图 26D :在 I DPA 时psTRVl+psTRV2 ADFGhMYB6感染的胚珠和在感染后3天扫描的胚珠。注意到纤维长度与相同时期sTRVl+sTRV2的纤维长度相同。
图27A和27B :棉花纤维中GhActin I基因表达的RT-PCR分析。图27A :将作为RNA标准的微管蛋白基因用作对照。图27B :棉花纤维中GhActin I基因表达。RT-PCR结果显示Actin I的VIGS导致其mRNA表达显著降低。图28 :棉花纤维中VIGS-Actin I的实时RT-PCR分析。感染后14天纤维中GhActinI基因表达的相对值以GhTubulin表达活性的百分数显示(参见材料和方法实施例12)。实时PCR结果显示Actin I的VIGS导致其mRNA显著降低。图29 :棉花纤维中VIGS-ADF I的实时RT-PCR分析。感染后14天纤维中GhADF I基因表达的相对值以GhTubulin表达活性的百分数显示(参见材料和方法实施例12)。实时PCR结果显示ADF I的VIGS导致其mRNA显著降低。图30 :棉花纤维中VIGS-CTR I的实时RT-PCR分析。感染后14天纤维中GhCTR I基因表达的相对值以GhTubulin表达活性的百分数显示(参见材料和方法实施例12)。实时PCR结果显示CTR I的VIGS导致其mRNA显著降低。图31 :棉花纤维中VIGS-DELLA I的实时RT-PCR分析。感染后14天纤维中GhDELLAI基因表达的相对值以GhTubulin表达活性的百分数显示(参见材料和方法实施例12)。实时PCR结果显示DELLA I的VIGS导致其mRNA显著降低。图32 :棉花纤维中VIGS-GhAlpha-tubulin I的实时RT-PCR分析。感染后14天纤维中GhAlpha-tubulin I基因表达的相对值以GhUbiquitin表达活性的百分数显示(参见材料和方法实施例12)。实时PCR结果显示GhAlphy-tubulin I的VIGS导致其mRNA显著降低。图33 :棉花纤维中VIGS-GhBeta-tubul in I的实时RT-PCR分析。感染后14天纤维中GhBeta-tubulin I基因表达的相对值以GhUbiquitin表达活性的百分数显示(参见材料和方法实施例12)。实时PCR结果显示GhBeta-tubulin I的VIGS导致其mRNA显著降低。图34 :棉花纤维中VIGS-GhMADS 9的实时RT-PCR分析。感染后14天纤维中GhMADS9基因表达的相对值以GhUbiquitin表达活性的百分数显示(参见材料和方法实施例12)。实时PCR结果显示GhMADS 9的VIGS导致其mRNA显著降低。图35 :棉花纤维中VIGS-GhMYB 5的实时RT-PCR分析。感染后14天纤维中GhMYB5基因表达的相对值以GhUbiquitin表达活性的百分数显示(参见材料和方法实施例12)。实时PCR结果显示GhMYB 5的VIGS导致其mRNA显著降低。图36 :棉花纤维中VIGS-GhMYB 6的实时RT-PCR分析。感染后14天纤维中GhMYB6基因表达的相对值以GhUbiquitin表达活性的百分数显示(参见材料和方法实施例12)。实时PCR结果显示GhMYB 6的VIGS导致其mRNA显著降低。图37显示psTRV2001的图谱。sTRV2的序列从6785位核苷酸延伸至9696位核苷酸，如SEQ ID NO :82所示。
具体实施例方式本发明涉及在基因组规模上功能性分析棉花基因的领域。更具体地，本发明涉及 使用病毒诱导的基因沉默(VIGS)在基因组规模上高通量功能性分析棉花基因的方法。本发明还涉及用于在棉花植物中瞬时表达基因的瞬时表达载体和用于在棉花植物中瞬时表达基因的方法。病毒诱导的基因沉默(VIGS)(Ruiz et al.，1998 ；Burch-Smith et al.，2004)系统为在无需对植物进行遗传转化下确定基因产物的生物学功能提供了可能性。RNA和DNA病毒均诱导导致病毒相关siRNA产生的RNA沉默(Baulcombe，2004)。可构建携带插入的候选植物基因部分序列的重组病毒。此重组病毒可在整个植物中系统地移动,产生可介导内源候选基因转录物降解的 siRNA (Brigneti et al. ,2004 ；Burch-Smith et al.,2004),导致接种植物中候选基因表达的沉默。VIGS方法提供了若干机会(I)基因/基因家族敲减的有效反向遗传学工具；(2)快速且高通量(Nasir et al. ,2005) —全基因组ORF敲除少于I个月；(3)瞬时、可逆的和所谓“可诱导的”敲除表型(Burch-Smith et al.，2004);和(4)适用于沉默的不同器官为通过不同感染方法在根(Valentine et al.,2004)、花(Liu et al.，2004)、叶(Liu et al.，2002)或果实(Fu et al.，2005)中敲除基因提供了机会。烟草脆裂病毒(TRV)为双向的正链有义RNA病毒。TRV RNAl编码来自基因组RNA的134kDa和194kDa复制酶蛋白，来自亚基因组RNA的29_kDa移动蛋白和16_kDa富含半胱氨酸的蛋白。TRV RNA2编码来自基因组RNA的衣壳蛋白和来自亚基因组RNA的两种非结构蛋白。TRV RNAl可在没有RNA2下复制并系统地移动。在TRV RNA2cDNA构建体中，将非结构基因用多克隆位点(MCS)替换，此多克隆位点用于克隆VIGS中靶基因序列(MacFarlaneand Popovich,2000)。TRV VIGS系统已成功地用在一些植物中，如拟南芥(Burch-Smith et al.,2006)、辣椒(Capsicum annuum) (Chung et al.,2004)、番爺(Lycopersicon esculentum)(Liu et al. ,2002)、矮牵牛(Petunia hybrida) (Chen et al. , 2005)和马铃薯(Solanumtuberosum) (Brigneti et al.,2004)。这些植物中大多数已经实验证明是对一些TRV株敏感的宿主(Plant Virus Online,http colon backslash backslash image dot fs dotuidaho dot edu backslash vide backslash descr808 dot htm)。更重要地是，无法合理地预期此TRV VIGS系统在全部植物中必然起作用。例如，Dinesh Kumar et al. (2007)中说明了 TRV VIGS系统可能起作用的植物列表。然而，此TRV VIGS系统无法在花生(Arachis hypogaea)和大豆(Glycine max)中起作用，因为尽管它们包含在Dinesh Kumaret al. (2007)的列表中，但仍不是TRV的宿主。事实上，如本文所述，TRV VIGS系统不在Dinesh Kumar et al. (2007)或在线病毒数据库中所列对烟草脆裂病毒(TRV)敏感的全部植物中起作用。而且，系统感染是待用于功能性基因分析的TRV VIGS系统所需的。一些植物局部地而非系统地对TRV敏感，因此TRV VIGS系统可在这些植物中起作用。在本发明前，尚不知道在包括棉花植物(棉属)的锦葵目中的植物是TRV的宿主或在一定程度上对TRV局部或系统地敏感。在筛选许多病毒载体后，发现棉花对TRV敏感且TRVVIGS系统可用在棉花中，因此，此发现是无法预期的。本发明的不可预期性进一步通过以下证实，即TRV VIGS系统无法在对TRV敏感或作为TRV宿主植物列出的全部植物中起作用。一方面，本发明提供了用于在棉花中进行VIGS的高效和可再生的系统以及方法。在一个实施方式中，本发明提供了 TRV全病毒基因组的进一步再合成。在另一实施方式中， 本发明表明这些载体具有与原始载体类似的效率。在另一实施方式中，本发明提供了 TRVVIGS系统在克隆和功能性鉴定棉花基因中的应用。根据此方面，瞬时表达载体包含TRVRNA2序列和至少一个拷贝的强亚基因组启动子，以及任选存在地包含第一感兴趣的序列的核酸。在一个实施方式中，亚基因组启动子能够被TRV复制酶识别。在另一实施方式中，亚基因组启动子为强衣壳蛋白亚基因组启动子。在进一步的实施方式中，亚基因组启动子源自烟草脆裂病毒组，而非TRV。在一个实施方式中，亚基因组启动子为合成的豌豆早枯病毒(PEBV)亚基因组启动子。在另一实施方式中，亚基因组启动子为辣椒环斑病毒(PepRSV)衣壳蛋白亚基因组启动子。用于在棉花中瞬时表达的感兴趣的核酸插入在亚基因组启动子的下游，且可操纵地连接于此启动子。此载体可用于在棉花植物中瞬时表达感兴趣的核酸。在另一实施方式中，本发明提供了其中内含子已插入TRV RNAl序列的修饰型TRV RNAl载体。因此，一方面，本发明提供了在棉花中进行病毒诱导的基因沉默(VIGS)的方法。根据本发明，所述方法包括(a)将包含能够沉默第一目标基因的第一沉默序列的核酸插入包含烟草脆裂病毒(TRV) RNA2序列的载体中，以产生修饰型TRV RNA2载体；(b)制备农杆菌(Agrobacterium)的混合培养物,所述混合培养物包含含有包含TRV RNAl序列的载体的农杆菌和含有修饰型TRV RNA2载体的农杆菌；(c)将农杆菌的混合培养物引入棉花的植物组织以产生受感染的植物组织；和(d)使受感染的植物组织生长足够的时间，以诱导第一目标基因的基因沉默。在此第一方面的一个实施方式中，植物组织为棉花植物或棉花幼苗。在此实施方式中，受感染的植物在步骤(C)中产生，且受感染的植物在步骤(d)中生长。在此第一方面的一个实施方式中，植物组织为棉花胚珠。在此实施方式中，受感染的棉花胚珠在步骤(C)中产生，且受感染的棉花胚珠在步骤(d)的培养中生长。在另一实施方式中，植物组织为棉花纤维。在此实施方式中，受感染的棉花纤维在步骤(C)中产生，且受感染的棉花纤维在步骤(d)的培养中生长。在进一步的实施方式中，棉花植物或幼苗被感染，且病毒在棉花组织中传播，使得VIGS在受感染的棉花植物或幼苗的全部组织中发生。
在一个实施方式中，包含TRV RNA2的载体和包含TRV RNAl的载体为合成的植物载体。本文所示的结果和表型数据表明合成的TRV-VIGS系统可有效地用作TRV-VIGS系统，以诱导所需内源棉花基因的沉默。在另一实施方式中，TRV RNA2包含能够沉默第一目标基因的第一沉默序列。在一个实施方式中，第一沉默序列为目标基因的有义链的序列。在另一实施方式中，第一沉默序列为目标基因的反义链的序列。在另一实施方式中，第一沉默序列为编码能够对第一目标基因进行RNA干扰(RNAi)的短发夹RNA(shRNA)。在另一实施方式中，第一沉默序列为编码能够对第一目标基因进行RNAi的前体微小RNA (miRNA)或miRNA的序列。在另一实施方式中，核酸进一步包含能够沉默第二目标基因的第二沉默序列。在另一实施方式中，核酸包含能够沉默大于两个目标基因的大于两种沉默序列。在一个实施方式中，目标基因为候选转录因子基因。在另一实施方式中，目标基因为叶绿素或类胡萝卜素生物合成中的候选基因。在另一实施方式中，目标基因为类黄酮生物合成途径中的候选基因。在另一实施方式中，目标基因为原花色素或花色素生物合成途径中的候选基因。在另一实施方式中，目标基因为棉花纤维发育中的候选基因。在另一实施方式中，目标基因为棉花纤维起始、伸长、次生壁沉积、成熟或种子发育中的候选基因。在另 一实施方式中，目标基因为smRNA生物合成中的候选基因。在另一实施方式中，目标基因为植物激素信号途径中的候选基因。在另一实施方式中，目标基因为与非生物和生物胁迫抗性有关的候选基因。在另一实施方式中，目标基因为脂肪酸生物合成中的候选基因，如硬脂酰-酰基载体蛋白去饱和酶(SAD)基因。在另一实施方式中，目标基因为棉花纤维发育中的候选基因，如与细胞伸长、细胞壁生物合成和纤维素生物合成相关的候选基因。在另一实施方式中，目标基因为相关棉花毛状体中的候选基因。在另一实施方式中，目标基因为次级代谢生物合成中的候选基因。本文所示的结果表明本发明的VIGS系统可有效地抑制靶宿主基因，且可作为快速的手段来测定候选基因的功能，以及研究诸如转录因子基因等调节基因的功能，或参与小RNA生物合成途径的基因的功能。本文所述的VIGS测定提供了在同源系统中检测棉花基因序列功能的手段。使用标准化的cDNA文库，可以通过本发明的VIGS系统进行基因功能的大规模筛选。宿主植物可为陆地棉(四倍体)，但如本文所述，本发明不限于此物种。因此，宿主植物也可为海岛棉(四倍体)、亚洲棉(二倍体)和草棉(二倍体)，以及其它天然棉属物种,和全部商购棉花变种和种质,包括源自种内和种间杂交的种质。第二方面，本发明提供了在棉花中分析基因功能的方法。根据本发明，所述方法包括(a)将包含待沉默候选基因的沉默序列的核酸插入包含烟草脆裂病毒(TRV)RNA2序列的载体中，以产生修饰型TRV RNA2载体；(b)制备农杆菌(Agrobacterium)的混合培养物,所述混合培养物包含含有包含TRV RNAl序列的载体的农杆菌和含有修饰型TRV RNA2载体的农杆菌；(c)将农杆菌的混合培养物引入棉花的植物组织以产生受感染的植物组织；(d)使受感染的植物组织生长足够的时间，以诱导候选基因的基因沉默；和分析所沉默的候选基因对受感染的植物组织的表型影响。在此第二方面的一个实施方式中，植物组织为棉花植物或棉花幼苗。在此实施方式中，受感染的植物在步骤(C)中产生，且受感染的植物在步骤(d)中生长。在此第一方面的一个实施方式中，植物组织为棉花胚珠。在此实施方式中，受感染的棉花胚珠在步骤(C)中产生，且受感染的棉花胚珠在步骤(d)的培养中生长。在另一实施方式中，植物组织为棉花纤维。在此实施方式中，受感染的棉花纤维在步骤(C)中产生，且受感染的棉花纤维在步骤(d)的培养中生长。在进一步的实施方式中，棉花植物或幼苗被感染，且病毒在棉花组织中传播，使得VIGS在受感染的棉花植物或幼苗的全部组织中发生。在一个实施方式中，包含TRV RNA2的载体和包含TRV RNAl的载体为合成的植物载体。本文所示的结果和表型数据表明合成的TRV-VIGS系统可有效地用作TRV-VIGS系统，以诱导所需内源棉花基因的沉默。在另一实施方式中，TRV RNA2包含能够沉默第一目标基因的第一沉默序列。在一个实施方式中，第一沉默序列为目标基因的有义链的序列。在另一实施方式中，第一沉默序列为目标基因的反义链的序列。在另一实施方式中，第一沉默序列为编码能够对第一目标基因进行RNA干扰(RNAi)的短发夹RNA(shRNA)。在另一实施方式中，第一沉默序列为编码能够对第一目标基因进行RNAi的前体微小RNA (miRNA)或miRNA的序列。在另一实施方式中，核酸进一步包含能够沉默第二目标基因的第二沉默序列。在另一实施方式中，核酸包含能够沉默大于两个目标基因的大于两种沉默序列。
在一个实施方式中，目标基因为候选转录因子基因。在另一实施方式中，目标基因为smRNA生物合成中的候选基因。在另一实施方式中，目标基因为原花色素和花色素生物合成途径中的候选基因。在另一实施方式中，目标基因为棉花纤维发育中的候选基因。在另一实施方式中，目标基因为棉花纤维起始、伸长、次生壁沉积、成熟或种子发育中的候选基因。在另一实施方式中，目标基因如上所述。本文所示的结果表明本发明的VIGS系统可有效地抑制靶宿主基因，且可作为快速的手段来测定候选基因的功能，以及研究诸如转录因子基因等调节基因的功能，或参与小RNA生物合成途径的基因的功能。本文所述的VIGS测定提供了在同源系统中检测棉花基因序列功能的手段。使用标准化的cDNA文库，可以通过本发明的VIGS系统进行基因功能的大规模筛选。宿主植物可为陆地棉(四倍体)，但如本文所述，本发明不限于此物种。因此，宿主植物也可为海岛棉(四倍体)、亚洲棉(二倍体)和草棉(二倍体)，以及其它天然棉属物种,和全部商购棉花变种和种质,包括源自种内和种间杂交的种质。—旦一种或多种棉花基因的功能被表征，可使用常规技术制备转基因植物以改变一种或多种基因的表达模式。或者，如本文所述可制备瞬时表达一种或多种基因的植物。插入棉属植物的DNA(感兴趣的DNA)对转化过程不是至关重要的。通常，被引入植物的DNA是构建体的一部分。DNA可为感兴趣的基因，如蛋白的编码序列，或其可为能够调节基因表达的序列，如反义序列、有义抑制序列、shRNA、前体miRNA或miRNA序列。构建体通常包括与感兴趣DNA的5’端和/或感兴趣DNA的3’端可操纵连接的调节区域。本文中也将包含全部这些元件的盒称为表达盒。在表达盒构建体中，表达盒可额外地包含5’引导序列。调节区域(即启动子、转录调节区域和翻译终止区域)和/或编码信号锚的多核苷酸与宿主细胞之间或彼此之间是天然/同源的。或者，调节区域和/或编码信号锚的多核苷酸与宿主细胞之间或彼此之间是异源的。参见美国专利7，205，453以及美国专利申请公开文本2006/0218670和2006/0248616。表达盒可额外地包含可选择的标记基因。参见美国专利7，205, 453以及美国专利申请公开文本2006/0218670和2006/0248616。通常，表达盒将包括用于选择转化细胞的可选择的标记基因。使用可选择的标记基因来选择转化的细胞或组织。通常，植物可选择的标记基因将编码抗生素抗性，适合的基因包括以下至少一组编码抗生素大观霉素的基因、编码链霉素抗性的链霉素磷酸转移酶(SPt)基因、编码卡那霉素或遗传霉素抗性的新霉素磷酸转移酶(nptll)基因、编码潮霉素抗性的潮霉素磷酸转移酶(hpt或aphiv)基因、乙酰乳酸合酶(als)基因。或者，植物可选择的标记基因将编码除草剂抗性，如对磺酰脲类除草剂、草铵膦、草甘膦、铵、溴苯腈、咪唑啉酮和2，4_ 二氯苯氧乙酸盐(2，4-D)的抗性，包括编码有此除草剂抗性的基因，所述除草剂对谷氨酰胺合酶起抑制作用，如草胺膦或basta (如bar基因)。参见WO 02/36782、美国专利7，205, 453以及美国专利申请公开文本2006/0218670和2006/0248616，和本文援引加入的那些文献。可选择的标记基因的此列表不意在限制。可使用任何可选择的标记基因。大量启动子可用在本发明的实施中。可基于所需结果选择启动子。也就是说，核酸可与组成型的启动子、组织优选的启动子或用于在感兴趣的宿主细胞中表达的其它启动子组合。此类组成型的启动子包括，例如Rsyn7的核启动子(W0 99/48338和美国专利
6,072, 050) JSCaMV35S 启动子(Odell et al. , 1985);大米肌动蛋白(McElroy et al.，1990);泛素(Christensen and Quail, 1989,和Christensen et al. , 1992) ；pEMU(Last etal. , 1991) ；MAS(Velten et al. , 1984) ;ALS 启动子(美国专利 5，659，026)等。其它组成 型的启动子包括例如美国专利 5，608，149 ;5，608，144 ;5，604，121 ;5，569，597 ;5，466，785 ；5，399，680 ;5，268，463 和 5，608，142 中描述的那些。其它启动子包括诱导型启动子，特别是病原体诱导型启动子。此类启动子包括来自通过病原体感染诱导的病理相关蛋白(PR蛋白)，如PR蛋白、SAR蛋白、￠-1, 3-葡聚糖酶、几丁质酶等。其它启动子包括在病原体感染位点处或附近表达的那些。在另一实施方式中，启动子可为损伤诱导型启动子。在其它实施方式中，通过应用外源性化学调节剂，可用化学调节的启动子来调控植物中的基因表达。启动子可为应用化学品诱导基因表达的化学诱导型启动子，或应用化学品抑制基因表达的化学抑制型启动子。此外，可使用组织优选的启动子来靶向提高特定植物组织内部感兴趣的多核苷酸的表达。这些启动子分别描述于美国专利6，506，962,6, 575，814,6, 972，349和7，301，069以及美国专利申请公开文本2007/0061917 和 2007/0143880。适合时，可最佳化感兴趣的DNA以提高在转化植物中的表达。也就是说，可使用植物优选的密码子来合成编码序列以改进表达。本领域中可获得合成植物优选的基因的方法。参见如美国专利5, 380,831,5,436, 391和7，205，453，以及美国专利申请公开文本2006/0218670 和 2006/0248616。在植物中使用dsRNA进行基因沉默以及设计用于基因沉默的siRNA或shRNA分子是本领域熟知的。参见例如美国专利申请公开文本2004/0192626、2004/0203145、2005/0026278、2005/0 186586、2005/0244858、2006/02 12950、2007/0259827、2007/0265220、2007/0269815、20080269474 和 2008/0318896。在植物中使用 miRNA 进行基因沉默以及设计用于基因沉默的前体miRNA或miRNA分子是本领域熟知的。参见例如美国专利申请公开文本 2006/0130176、2006/0218673、2007/0083947、2007/0130653、2007/0154896 和 2008/0313773。在某些实施方式中，本发明还提供了从本发明的转基因植物获得的植物产物。术语“植物产物”意在包括可从特定植物获得的任何物，例如，果实、种子、花粉、胚珠、植物胚、油、果汁、蜡、蛋白、脂类、脂肪酸、维生素、全部或部分的植物组织(例如，根、叶、茎、花、棉桃、果实、皮)、细胞、细胞悬液、块茎和匍匐茎。在另一方面,本发明提供了用于在棉花植物中瞬时表达基因的瞬时表达载体和方法。根据此方面，瞬时表达载体包含TRV RNA2序列和至少一个拷贝的强亚基因组启动子，以及任选存在地包含第一感兴趣的序列的核酸。在一个实施方式中，亚基因组启动子能够被TRV复制酶识别。在另一实施方式中，亚基因组启动子为强衣壳蛋白亚基因组启动子。在进一步的实施方式中，亚基因组启动子源自烟草脆裂病毒组，而非TRV。在一个实施方式中，亚基因组启动子为合成的豌豆早枯病毒(PEBV)亚基因组启动子。在另一实施方式中，亚基因组启动子为辣椒环斑病毒(PepRSV)衣壳蛋白亚基因组启动子。用于在棉花中瞬时表达的感兴趣的核酸插入在亚基因组启动子的下游，且可操纵地连接于此启动子。在另一实施方式中，核酸包含在棉花植物中分别待表达的两种或更多种感兴趣的序列。在另一实施方式中，载体包含两种或更多种核酸，每一核酸包含待在棉花植物中表达的感兴趣的序列，且每一核酸可操纵地连接于亚基因组启动子的单独拷贝。在棉属植物中待瞬时表达的感兴趣的序列对本发明的瞬时表达方法不是至关重 要的。感兴趣的序列可为感兴趣的基因，例如蛋白的编码序列，或其可为能够调节基因表达的序列，如反义序列、有义抑制序列或微小RNA(miRNA)序列。感兴趣的序列除了包括亚基因组启动子外，还通常包括调节区域，所述调节区域可操纵地连接于感兴趣序列的5’端和/或感兴趣序列的3’端。在瞬时表达盒中，感兴趣的序列可额外地包含5’引导序列。调节区域(即转录调节区域和翻译终止区域)和/或编码信号锚的多核苷酸与宿主细胞之间或彼此之间是天然/同源的。或者，调节区域和/或编码信号锚的多核苷酸与宿主细胞之间或彼此之间是异源的。参见美国专利7，205, 453以及美国专利申请公开文本2006/0218670和 2006/0248616。适合时，可最佳化感兴趣的序列以提高在植物中的瞬时表达。也就是说，可使用植物优选的密码子来合成编码序列以改进表达。本领域中可获得合成植物优选的基因的方法。参见如美国专利5，380，831,5, 436，391和7，205，453，以及美国专利申请公开文本2006/0218670 和 2006/0248616。在一个实施方式中，感兴趣的序列为(a)在棉花中待表达的基因的编码序列，如苏云金杆菌(Bacillus thuringiensis)杀虫毒素蛋白(BT)和 Flower locus T(FT)基因，以缩短开花时间；或(b)待下调的基因的序列，如候选转录因子基因、smRNA生物合成中的候选基因、植物激素信号途径中的候选基因、与非生物和生物胁迫抗性有关的候选基因、月旨肪酸生物合成中的候选基因、棉花纤维发育中的候选基因、相关棉花毛状体中的候选基因和次级代谢生物合成中的候选基因。根据此方面，用于在棉花组织中瞬时表达感兴趣的核酸的方法包括(a)将包含待在棉花植物中表达的第一感兴趣的序列的核酸插入瞬时表达载体中，以产生TRV RNA2表达载体，所述瞬时表达载体包含烟草脆裂病毒(TRV) RNA2序列和至少一个拷贝的亚基因组启动子，其中所述核酸可操纵地连接于所述亚基因组启动子；(b)制备农杆菌的混合培养物，所述混合培养物包含含有包含TRVRNA1序列的载体的农杆菌和含有TRV RNA2表达载体的农杆菌；(c)将农杆菌的混合培养物引入棉花的植物组织；和
(d)使受感染的植物组织生长足够的时间，以瞬时表达目标基因。在此方面的一个实施方式中，植物组织为棉花幼苗。在此方面的另一个实施方式中，植物组织为棉花胚珠。在此方面的另一个实施方式中，植物组织为棉花植物。在此方面的另一个实施方式中，植物组织为棉花纤维。在更进一步的实施方式中，棉花植物或幼苗被感染，且病毒在棉花组织中传播，使得VIGS在受感染的棉花植物或幼苗的全部组织中发生。在一个实施方式中，包含TRV RNA2的载体和包含TRV RNAl的载体为合成的植物载体。在另一个实施方式中，第一感兴趣的序列为基因的有义链的序列。在另一实施方式中，第一感兴趣的序列为基因的反义链的序列。在另一实施方式中，第一序列编码前体miRNA或miRNA。如本文所示,本发明的瞬时表达载体可用于在棉花植物中快速地瞬时表达感兴趣的核酸。在另一实施方式中，核酸进一步包含待在棉花植物中表达的感兴趣的第二序列。在另一实施方式中，核Ife包含待在棉花植物中表达的多于两种的感兴趣的序列。在另一实施方式中，两种或更多种核酸被插入瞬时表达载体中。在此实施方式中，每一核酸包 含感兴趣的序列，且每一核酸可操纵地连接于亚基因组启动子的单独拷贝。两种或更多种核酸中的感兴趣的序列可以相同或不同。感兴趣的序列包括上述那些。宿主植物可为陆地棉(四倍体)，但如本文所述，本发明不限于此物种。因此，宿主植物也可为海岛棉(四倍体)、亚洲棉(二倍体)和草棉(二倍体)，以及其它天然棉属物种,和全部商购棉花变种和种质,包括源自种内和种间杂交的种质。在某些实施方式中，本发明还提供了从本发明的瞬时表达植物获得的植物产物。术语植物产物摂意在包括可从特定植物获得的任何物，例如，果实、种子、花粉、胚珠、植物胚、油、果汁、蜡、蛋白、脂类、脂肪酸、维生素、全部或部分的植物组织(例如，根、叶、茎、花、棉桃、果实、皮)、细胞、细胞悬液、块茎和匍匐茎。在另一方面，本发明提供了修饰型TRV RNAl载体，其具有改进的转录起始。有很多原因会引起RNA病毒载体的转录起始困难。首先是可能被RNA加工工具错误识别的非最佳化的基因组序列，如嵌在RNA基因组中的隐蔽剪接位点和富含胸腺嘧啶的假定的内含子序列。其次，TRV RNAl病毒载体编码约7. OKb核苷酸的极大的转录物，其大小是平均植物基因大小(l_2Kb)的约3-4倍。实际上，植物基因通常包含促进来自细胞核的前mRNA加工和输出的大量内含子。在基于农杆菌渗入法(agroinfiltration)的VIGS和瞬时表达系统中，没有内含子序列，在来自病毒构建体的植物细胞核中产生的前mRNA转录物无法被有效地识别或适当地加工。根据此方面，修饰型TRV RNAl载体包含已插入至少一个内含子的TRV RNAl序列。可插入另外的内含子以使病毒转录物更容易地被宿主细胞核前mRNA加工和输出工具识另IJ，以此增加能发生病毒复制的植物细胞的百分数，以及增加能起始感染的效率。理论上，可使用任何植物内含子。在一个实施方式中，内含子的大小为约100核苷酸至约400核苷酸。在另一个实施方式中，内含子源自拟南芥。内含子插入位点可为TRVl基因组的共有AG/GT序列，或为匹配此共有序列而已通过沉默核苷酸取代来突变的序列。此修饰型TRV RNAl载体可用于在任何上述方法中替换含TRVRNA1的载体。宿主植物可为陆地棉(四倍体)，但如本文所述，本发明不限于此物种。因此，宿主植物也可为海岛棉(四倍体)、亚洲棉(二倍体)和草棉(二倍体)，以及其它天然棉属物种，和全部商购棉花变种和种质，包括源自种内和种间杂交的种质。除非另有说明，本发明的实施应用本领域技术人员知晓的化学、分子生物学、微生物学、重组DNA、遗传学、免疫学、细胞生物学、细胞培养和转基因生物学的常规技术。参见，例如Maniatis et al.，1982，Molecular Cloning(Cold Spring HarborLaboratory Press，Cold Spring Harbor，New York) ；Sambrook et al. , 1989, MolecularCloning，2nd Ed. (Cold Spring Harbor Laboratory Press， Cold Spring Harbor， NewYork) ；Sambrook and Russell，2001，Molecular Cloning,3rd Ed. (Cold Spring HarborLaboratory Press，Cold Spring Harbor，New York) ；Ausubel et al. ,1992), CurrentProtocols in Molecular Biology (John Wiley & Sons，including periodic updates)；Glover，1985， DNA Cloning(IRL Press, Oxford) ;Russell，1984， Molecular biology ofplants a laboratory course manual(Cold Spring Harbor Laboratory Press， ColdSpring Harbor，N. Y.) ;Anand，Techniques for the Analysis of Complex Genomes，(Academic Press, New York，1992) ；Guthrie and Fink， Guide to Yeast Geneticsand Molecular Biology(Academic Press, New York，1991) ；Harlow and Lane，1988， Antibodies， (Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor,New York)；Nucleic Acid Hybridization(B. D. Hames & S. J. Higgins eds. 1984) ；TranscriptionAnd Translation (B. D. Hames & S. J. Higgins eds. 1984) ；Culture Of Animal Cells (R.
I.Freshney, Alan R.Liss，Inc.，1987) immobilized Cells And Enzymes (IRL Press，1986) ；B.Perbal, A Practical Guide To Molecular Cloning(1984) ；the treatise，Methods In Enzymology(Academic Press，Inc. , N. Y. ) ；Methods In Enzymology,Vols.154 and 155 (Wu et al. eds.), Immunochemical Methods In Cell And MolecularBiology (Mayer and Walker, eds.，Academic Press，London，1987) ；Handbook OfExperimental Immunology, Volumes I-IV(D. M. Weir and C. C. Blackwell, eds.，1986)；Riott， Essential Immunology,6th Edition， Blackwell Scientific Publications，Oxford,1988 ；Fire et al.，RNA Interference Technology From Basic Science toDrug Development, Cambridge University Press， Cambridge，2005 ;Schepers， RNAInterference in Practice，Wiley-VCH，2005 ;Engelke，RNA Interference (RNAi) TheNuts & Bolts of siRNA Technology,DNA Press,2003 ;Gott，RNA Interference,Editing,and Modification !Methods and Protocols (Methods in Molecular Biology)，HumanPress,Totowa,NJ, 2004 ；SohaiI,Gene Silencing by RNA Interference-Technology andApplication，CRC，2004。实施例本发明通过参考以下实施例来描述，这些实施例以说明的方式提供且不意在以任何方式限制本发明。使用本领域熟知的标准技术或以下具体描述的技术。实施例I :实施例2-6的实验方法棉花幼苗棉花种子在温室中繁殖并发芽。将带有2-3片真正叶子的4至14日龄幼苗用于VIGS测定。仅具有子叶的更年幼幼苗也可用于VIGS测定。合成的TRV RNAl表达载体合成的TRVl载体全长(7756bp)序列包括=SphI位点、T-DNA右边界序列(152bp)、复制的花椰菜花叶病毒(CaMV) 35S增强子区域(752bp)(Shi et al.，1997)、TRV Ppk20株RNAl (6791bp)、地下三叶草斑驳病毒卫星RNA核酶序列(46bp)和SmaI位点序列。此全长序列被内源性SalI位点分为两部分。这两部分单独合成，并被克隆入PGH载体以得到两个载体pGH-YeJ-Vl-I和pGH-YeJ-Vl_2。合成的TRV RNAl片段Vl-I (通过SphI和SalI酶处理从pGH-YeJ-Vl-I释放)和V1-2 (通过SalI和SmaI酶处理从pGH-YeJ-V1-2释放)与用SphI和EcoICRI酶处理的pBI121 (GenBank登录号AF485783)载体连接。新合成的TRV RNAl载体被称为psTRVlOOl (本文也称作psTRVl)。合成的psTRVlOOl的序列在SEQ ID NO 1中示出。合成的TRV RNAl序列与公开的TRV RNAl序列相同。合成的TRV RNA2表达载体合成的TRV2载体全长(2915bp)序列包括=HindIII位点、复制的花椰菜花叶病毒(CaMV) 35S增强子区域(752bp) (Shi et al.，1997)、TRV株ppk20RNA25'-序列(1639bp)、多克隆位点(61bp)、TRV株ppk20 RNA2 3'-序列(396bp)和HpaI位点。合成此全长序列，并克隆入pGH载体以得到pGH-YeJ-V2。将合成的TRV RNA2片段V2通过HindIII和HpaI位点连接入pCAMBIA0390 (GenBank登录号AF234291)。新合成的TRV RNA2载体被称为psTRV2001 (本文也称作psTRV2)。合成的sTRV2的序列在SEQID NO :2中示出。合成的TRV RNA2序列与公开的TRV RNA2序列相同。合成的psTRV2001 的序列在SEQ ID NO 82中示出。合成的TRV瞬时表达载体为了构建瞬时表达载体psTRV2100，将合成的豌豆早枯病毒(PEBV)亚基因组启动子(237bp，SEQ ID NO 3)多核苷酸插入psTRV2001载体的多克隆位点中，此多核苷酸包括在其5'末端的EcoRI位点和其3'末端的NcoI位点。将绿色荧光蛋白(GFP)表达载体 pK20GFPc 用引物 GFP-F(5’ -TTATAGGTACCATGGCTAGCAAAGGAGAAGAAC-3’ (SEQ ID NO :25))和 GFP-R (5 ’-CCTAAGAGCTCTTAATCCATGCCATGTGTAATC CC-3’ (SEQID NO 26)进行PCR扩增，并将GFP基因插入psTRV2100的NcoI和BamHI位点中。此载体称为 psTRV2 GFP。修饰型sTRVl载体使用基于PCR的策略将来自拟南芥actinl(内含子2，GenBank登录号U27981，位置1957-211Ibp)的植物内含子引入TRVRNA1基因组中。三个片段基于三对引物来扩增用于Fl的F1P5和F1P3、用于F2的F2P5和F2P3、和用于F3的F3P5和F3P3。这些引物对的序列在表I中示出。引物相对于此内含子的位置显示在图2中。在第二轮PCR扩增中，通过使用F1P5和F3P3的重叠PCR得到更长的DNA片段。将PCR产物进一步用EcoRI和XbaI消化，并插入psTRVlOOl载体中。含内含子的psTRVl被称为psTRVlOOl-内含子(本文也称作psTRVl-内含子)。插入的内含子的序列为gtaagtacatttccataacgttccatcgtcattgattcttcattagtatgcgtttatgaagctttttcaatttaattctctttggtagatcttaagattcctctgtttcttgcaaaataaagggttcaattatgctaatattttttatatcaattttgacag(SEQ ID NO :27)。表I :用于内含子合成的基因引物
引物序列(5，-* 3’ )SEQ ID NO psTRVlOOl 中的位置
F1P5cctgaattcaatatcgtgtttaaagacg410764-10791
F1P3ataattctagagggggactgtttctggtggcatg5F2P5cgttttgggtaactagaggtaagtacatttccataacgttcc6
F2P3aatgaatccttttctcacctgtcaaaattgatataaaaaata7
F3P5ttatatcaattttgacaggtgagaaaaggattcattcctgttg8
F3P3cctacatgtacaaccctgatatgtatt911115-11141基因克隆和VIGS载体克隆对来自陆地棉叶样品的cDNA产物进行PCR以扩增候选基因，并将其克隆到合成载体PSTRV2001的XbaI和BamHI位点中。基因克隆中所用的引物在表2中示出，表2中也包括所克隆基因序列的参照。表2 :基因引物和基因序列
基因 j弓丨物序列(5’ —3Q——— j SEQ ID NO: j克隆的基因
CAD F: ATTATCTAGAAATTGAAAGAAGAAGTGAGG10604 bp,
R: TATTGGATCCCAGGAAGTTCATCTATGCAT11GenBank;
___AY8001Q6
ASl F: ATAATTCTAGAGGGGGACTGTTTCTGGTGGCATG12418 bp
__R: CCGTAAGGGATCCCTTCTTGATACC__13__ _
AGOl FrATAATTCTAGAGGGGGACTGTTTCTGGTGGCATG14583 bp
__R: TACCTGGATCCCCACTTATCATTGATCCACTGTCTG 15___
CH42 F: AAATATCTAGAGGTGCTACTGAAGATAGGGTCTGTGG 54653 bp
__R: GACTCCAAAGGATCCTTGCGAAGACG__55___
PDS F: TTATTTCTAGAGCACGAGCTTCCTTTGTATCTGCC56479 bp
__R: TCCTAGGATCCAATATTGGTGTATGACCTGCATCCGC 57__
ANS F: AATAATCTAGAAGAGAAGTATGCCAACGACCA58663
__R: GCTATGGATCCGGAGGGAACAGTGGAGGTTCGG 59__
ANR FrAATAATCTAGACTTGTAACACTACAAGAGTTGGG60595
R: GAGCTGGATCCGGGCTCGGCATACGTCTTCCAC__61____
AN F: AATAATCTAGACACTCATCAACCATATCCAGTACC 62621 bp
__R: GTCCTGGATCCACAATTCCCAACACTAGTCCTCGG 63_______
KTN F: ATGGCGGATCCTGTTGGAAATTCGCTAGCTGG 64 675 bp__R: GTCCTGGATCCATACTCAGGCATCCATAGAGGAAG 65__农杆菌渗入法将合成的psTRV载体和它们的衍生物通过电穿孔引入农杆菌株AGL1。3ml培养物在50mg/L卡那霉素和25mg/L利福平以及28°C下生长24小时。I天后，将培养物接种入含50mg/L卡那霉素、IOmM 2_(N_吗啉代)乙烷磺酸(MES)和20 u M乙酰丁香酮(acetosyringone)的LB培养基中，并在281^摇床中过夜生长。农杆菌细胞通过离心收集，并重悬浮于MMA溶液(IOmM MESUOmM MgCl2、200 u M乙酰丁香酮)至最终OD6。。为1.5。将农杆菌悬液在室温下静置3-4小时。在渗入前，将包含pTRVl/psTRVl或pTRV2/psTRV2载体的农杆菌培养物以I : I的比例混合。通过注射器渗入或真空渗入将培养物渗入棉花植物中。对于注射器渗入，使用Iml无针头注射器将农杆菌接种物送入2或3片最新展开叶的下侧。对于真空渗入，将全部植物浸入农杆菌接种物并持续经历80-90kPa真空5分钟，随后快速解除真空，以使接种物迅速进入植物组织。下述全部数据通过真空渗入获得。然而，也可使用注射器渗入，但注射器渗入比真空渗入更耗时。通过真空渗入获得的沉默效果优于通过注射器渗入获得的沉默效果。在渗入后，多余的农杆菌细胞悬液被用于浸润所渗入植物的根系统。所渗入植物在16小时光照/8小时黑暗的光周期循环下，在25°C生长室中生长。相同方法也用于测试在假定宿主植物中进行VIGS的实验。棉酚和相关萜类化合物的高效液相色谱测定棉籽和其它组织中的棉酚和相关萜类化合物的水平通过使用下述基于HPLC的方法测定。将IOOmg新鲜棉花叶样品用研钵和杵在液氮中匀浆，并将Iml溶剂I (乙腈水磷酸乙酸=80 20 0.1 (V/V/V)，pH =
2.8-2. 9)加入样品中。将植物组织进一步通过MIXER MILL MM300 (Qiagen,Germany)破碎。将悬液以3000g离心10分钟。将50 ill提取物部分在安装有微注射器的Agilent 1200HPLC系统上进行分析。将样品以恒溶剂强度由保持在40°C的Synergi 4 u m Fusion-RPSOA(Phenomenx)柱洗脱。流动相为乙醇甲醇异丙醇乙腈水乙酸乙酯二甲基甲酰胺磷酸=16. 7 4. 6 12. I 20. 2 37. 4 3. 8 5. I 0. I (Stipanovic etal.，1988)。溶剂流速为I. OmL mirT1，总运行时间为45分钟。信号在272nm下监测。数据收集和分析在Agilent Chemstation软件上进行。使用叔丁基蒽醌作为内标。 GFP显像和荧光定量分析。为了在叶片和整株植物上可视地监测GFP荧光，使用手持式IOOW长波UV灯(UV Products, Upland, CA)，且使用安装有UV和Kenko黄色透镜(Tokyo, Japan)的 Nikon Coolpix 995 数码相机(Tokyo, Japan)拍摄突光图像。抗体和蛋白质凝胶印迹分析总植物蛋白通过12%十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离。将抗GFP蛋白的鼠单克隆IgG用作一抗。将ECL过氧化物酶缀合的驴抗兔IgG用作二抗。使用ECL蛋白印迹检测试剂(GE healthcare)来观察免疫反应性条带。将考马斯亮蓝染色的rbcL条带用作上样对照。扫描电镜(SEM)。将新鲜叶用带子固定在样品室的内侧，随后用液氮冷冻。使用SEM(JSM-6360LV, JEOL, USA)收集图像。RNA提取和分析。将IOOmg叶组织在液氮中研磨，并用植物RNA纯化试剂(Invitrogen)提取。RNA 浓度使用 Nanodrop (Thermo, USA)测定。将 M-MLV 逆转录酶(Pr omega, USA)用于逆转录反应。实时PCR 使用 Power SYBR Green PCR Master (AppliedBiosystems, USA)，并使用表3所示的基因特异性引物在ABI7900HT中进行。全部样品一式三份进行，且数据在预设的Ct值(Applied Biosystems, USA)下用RQ管理工具分析。Jatropha rbcL mRNA用作内标。分析中包括的Ct值是基于3个生物平行测定,对每个生物样品进行三个技术平行测定。标准偏差基于3个生物平行测定来计算。表3 :基因特异性实时PCR分析中所用的引物。
权利要求
1.在棉花中进行病毒诱导的基因沉默(VIGS)的方法，包括 (a)将包含能够沉默第一目标基因的第一沉默序列的核酸插入包含烟草脆裂病毒(TRV)RNA2序列的载体中，以产生修饰型TRV RNA2载体； (b)制备农杆菌的混合培养物，所述混合培养物包含含有包含TRVRNA1序列的载体的农杆菌和含有修饰型TRV RNA2载体的农杆菌； (c)将农杆菌的混合培养物引入棉花的植物组织以产生受感染的植物组织；和 (d)使所述受感染的植物组织生长足够的时间，以诱导所述第一目标基因的基因沉默。
2.权利要求I的方法，其中包含TRVRNA2的载体和包含TRV RNAl的载体为合成的植物载体。
3.权利要求I的方法，其中所述第一沉默序列为所述第一目标基因的有义链的序列。
4.权利要求I的方法，其中所述第一沉默序列为所述第一目标基因的反义链的序列。
5.权利要求I的方法，其中所述第一沉默序列编码短发夹RNA(shRNA)或前体微小RNA(miRNA)。
6.权利要求I的方法，其中所述核酸进ー步包含能够沉默第二目标基因的第二沉默序列。
7.权利要求I的方法，其中所述核酸包含能够沉默多个目标基因的多个沉默序列。
8.权利要求I的方法，其中所述目标基因为候选转录因子基因。
9.权利要求I的方法，其中所述目标基因为smRNA生物合成中的候选基因。
10.权利要求I的方法，其中所述目标基因选自以下一組(a)原花色素或花色素生物合成途径中的候选基因、(b)棉花纤维发育中的候选基因、(C)叶绿素或类胡萝卜素生物合成途径中的候选基因、和(d)类黄酮生物合成途径中的候选基因。
11.权利要求10的方法，其中所述棉花纤维发育中的候选基因为棉花纤维起始、伸长、次生壁沉积、成熟或种子发育中的候选基因。
12.权利要求I的方法，其中所述棉花组织为棉花植物、棉花幼苗、棉花胚珠或棉花纤维。
13.权利要求I的方法，其中所述棉花为二倍体变种、四倍体变种、种间杂交的变种或种间杂交的变种。
14.在棉花中分析基因功能的方法，包括 (a)将包含能够沉默功能待分析的第一候选基因的第一沉默序列的核酸插入包含烟草脆裂病毒(TRV)RNA2序列的载体中，以产生修饰型TRVRNA2载体； (b)制备农杆菌的混合培养物，所述混合培养物包含含有包含TRVRNA1序列的载体的农杆菌和含有修饰型TRV RNA2载体的农杆菌； (c)将农杆菌的混合培养物引入棉花的植物组织以产生受感染的植物组织； (d)使受感染的植物组织生长足够的时间，以诱导所述第一候选基因的基因沉默；和 (e)分析所述第一沉默的候选基因对所述受感染的植物组织的表型影响。
15.权利要求14的方法，其中包含TRVRNA2的载体和包含TRVRNA1的载体为合成的植物载体。
16.权利要求14的方法，其中所述第一沉默序列为所述第一候选基因的有义链的序列。
17.权利要求14的方法，其中所述第一沉默序列为所述第一候选基因的反义链的序列。
18.权利要求14的方法，其中所述第一沉默序列编码短发夹RNA(shRNA)或前体微小RNA(miRNA)。
19.权利要求14的方法，其中所述核酸进ー步包含能够沉默第二候选基因的第二沉默序列。
20.权利要求14的方法，其中所述核酸包含能够沉默多个候选基因的多个沉默序列。
21.权利要求14的方法，其中所述候选基因为候选转录因子基因。
22.权利要求14的方法，其中所述候选基因为smRNA生物合成中的候选基因。
23.权利要求14的方法，其中所述目标基因选自以下一組(a)原花色素或花色素生物合成途径中的候选基因、(b)棉花纤维发育中的候选基因、(C)叶绿素或类胡萝卜素生物合成途径中的候选基因、和(d)类黄酮生物合成途径中的候选基因。
24.权利要求23的方法，其中所述棉花纤维发育中的候选基因为棉花纤维起始、伸长、次生壁沉积、成熟或种子发育中的候选基因。
25.权利要求14的方法，其中所述棉花组织为棉花植物、棉花幼苗、棉花胚珠或棉花纤维。
26.权利要求14的方法，其中所述棉花为二倍体变种、四倍体变种、种间杂交的变种或种间杂交的变种。
27.用于在棉花植物中瞬时表达感兴趣的序列的载体，所述载体包含TRVRNA2序列、至少ー个拷贝的强亚基因组启动子、和至少ー种包含感兴趣的序列的核酸，所述至少ー种核酸可操纵地连接于至少一个拷贝的所述亚基因组启动子。
28.权利要求27的载体，其中所述载体包含两种或更多种核酸，每一所述核酸包含感兴趣的序列，且每一所述核酸可操纵地连接于所述亚基因组启动子的拷贝。
29.用于在棉花植物组织中瞬时表达包含感兴趣的序列的核酸的方法，包括 (a)将包含待在棉花植物中表达的第一感兴趣的序列的核酸插入瞬时表达载体中，以产生TRV RNA2表达载体，所述瞬时表达载体包含烟草脆裂病毒(TRV) RNA2序列和至少ー个拷贝的强亚基因组启动子，其中所述核酸可操纵地连接于所述亚基因组启动子； (b)制备农杆菌的混合培养物，所述混合培养物包含含有包含TRVRNA1序列的载体的农杆菌和含有TRV RNA2表达载体的农杆菌； (c)将农杆菌的混合培养物引入棉花的植物组织；和 (d)使受感染的植物组织生长足够的时间，以瞬时表达目标基因。
30.权利要求29的方法，其中所述核酸包含待在棉花植物中表达的两种或更多种感兴趣的序列。
31.权利要求29的方法，其中两种或更多种核酸被插入所述瞬时表达载体中，其中每一所述核酸包含待在棉花植物中表达的感兴趣的序列，且每ー感兴趣的核酸可操纵地连接于所述亚基因组启动子的単独拷贝。
32.权利要求29的方法，其中所述棉花组织为棉花植物、棉花幼苗、棉花胚珠或棉花纤维。
33.修饰型TRVRNAl载体，其包含其中已插入内含子的TRV RNAl序列。
全文摘要
本发明涉及采用病毒诱导的基因沉默(VIGS)方法对棉花基因进行功能性分析。更具体地，本发明借助于烟草脆裂病毒(TRV)载体RNA1和RNA2在棉花中诱导基因沉默，并可分析对棉花植物表型的影响。此外，本发明还提供瞬时表达载体TRV RNA2，以便在强亚基因组启动子的影响下在棉花植物和植物组织中瞬时表达基因。
文档编号C12N15/82GK102803496SQ201080035446
公开日2012年11月28日 申请日期2010年6月10日 优先权日2009年6月10日
发明者叶健, 蔡南海, 曲景, Y·F·耿, Y·P·步 申请人:淡马锡生命科学研究院有限公司