使用阵列比较基因组杂交技术分析核酸突变的方法

专利名称：使用阵列比较基因组杂交技术分析核酸突变的方法
技术领域：
本发明涉及使用阵列比较基因组杂交技术分析核酸突变的方法，所述方法降低来自分析结果的假阳性等的影响并且改善分析结果的可靠性。
背景技术：
阵列比较基因组杂交(CGH)技术已知为这样的方法，其用于在短时间内检测发生在数101Λ至数Mb水平上的基因组结构异常，诸如基因组拷贝数异常(见，例如，非专利文件1和2)。在使用阵列CGH的用于遗传性疾病等的诊断阵列的情况中，变得必要的是精确地诊断与病理状况直接相关的拷贝数异常。因此，作为标准的核酸必定不具有拷贝数变异 (CNV)并且因此应当进行小心的选择和确认包括稀有CNV的情况，以致总是存在麻烦的并且需要复查的情况。此外，在包括用于全基因组分析的阵列、检查出拷贝数异常的情况中，因为难以获得已被证明为对于目标基因组是正常的标准核酸，所以必需对双亲和同胞进行连续检查并且进行重复地复查以确认所述情况是否是假阳性或假阴性或新发生(de novo)拷贝数异常，并且用正常分析物的分析实例和公用数据库验证(见，例如，非专利文件1)。在判断出是假阳性或假阴性的情况中，复查变得必要并且产生这样的问题，即利用一次检查不能做出诊断。
背景技术：
文件非专利文件非专利文件1 :"Arei CGH Shindan Katsuyo Gaido Bukku Shitte Okitai Senshokutai Bisaikozo Ijosho(Arrey CGH Diagnosis Utilization Guidebook, Chromosome Fine Structure Disorder Which Is Need To Know)(阵列CGH诊断使用指南， 需要了解的染色体精细结构异常)”由Joji hazawa等编辑，Iyaku (Medicine and Drug (医学和药物))Journal Co.，Ltd.2 Jssei Imoto, Joji Inazawa “Maikuro Arei Gijusu wo Mochiita CGH Kaiseki :CGH Arei Hou(CGH Analysis Using Microarray Technology :CGH Array Method (使用微阵列技术的CGH分析CGH阵列方法))，，，Saibo Kogaku (细胞技术)，卷23， No.03,355-361(2004)。发明概述本发明要解决的问题鉴于背景技术的以上问题，本发明的一个目的是提供分析核酸突变的方法以及用于执行数据处理的程序，所述方法减小分析结果中假阳性和假阴性的影响，尤其是，减小由于标准核酸的CNV所导致的影响(其为常规阵列比较基因组杂交技术中的问题)，并且改善分析结果的可靠性而不需要复查。此外，本发明的另一个目的是提供使用分析核酸突变的方法来诊断源于基因突变的疾病的方法。解决所述问题的方式以上问题已经由以下方法解决。1. 一种使用阵列比较基因组杂交技术来分析核酸突变的方法，其包括步骤(a)使用η组相同的探针核酸组，其中多个样点存在于一个核酸微阵列上并且彼此不同的探针核酸已经被固定在多个所述样点上，使η种标记的样品核酸Sl至Sn逐个地与η组所述探针核酸组接触以实现杂交，步骤(b)选择已经固定有相同探针核酸的η个样点Xl至fti，所述样点Xl至& 选自η组所述探针核酸组，并且获得已经被杂交到η个相应的样点Xl至&中的样品核酸的标记强度Fl至而，步骤(c)将所述样点Xl的标记值Fl与所述标记值F2至1 中的每个比较，由此获得n-1个比较值C2至Cn，并且确定所述比较值中的每个是否落入指定的数值范围内，以及步骤(d):确定在n-1个所述比较值中在所述步骤(c)中已经确定为未落入所述指定的数值范围内的比较值的数目是否超过指定数目，并且在超过所述指定数目的情况下，判断所述样点Xl为阳性，η是3以上的整数，所述样品核酸是分析物核酸或标准核酸，至少Sl是分析物核酸，而Xl是已经与Sl接触的样点。2.根据以上1的分析核酸突变的方法，其中在η种所述样品核酸中至少两种是分析物核酸。3.根据以上1或2的分析核酸突变的方法，所述方法进一步包括步骤(c')确定从F2与Fl的比较值至F2与1 的比较值的n_l个比较值中的每个是否落入指定的数值范围，以及步骤(d')确定n-1个比较值中在所述步骤(c')中已经确定为未落入所述指定的数值范围内的比较值的数目是否超过所述指定数目，并且在超过所述指定数目的情况下，判断样点X2为阳性，样点X2是已经与不同于以上Sl的样品核酸S2接触的样点。4.根据以上1至3中任一项的分析核酸突变的方法，其中在η种所述样品核酸中至少一种是标准核酸。5.根据以上1至3中任一项的分析核酸突变的方法，其中η种所述样品核酸都是分析物核酸。6.根据以上1至5中任一项的分析核酸突变的方法，其中η种所述样品核酸是来源于属于分类学上相同物种的不同个体的核酸。7.根据以上1至6中任一项的分析核酸突变的方法，其中提供η个相同的探针核酸组NSl至NSn，各探针核酸组NSi被提供在具有ρ个样点tn至tip的核酸微阵列上，i是整数并且满足1 < i < η而ρ是整数并且满足2 ( ρ，将彼此不同的探针核酸固定在各探针核酸组NSi的ρ个所述样点tn至tip上，各探针核酸组NSi的ρ个所述样点中的一个是样点Xi，将相同的探针核酸固定到样点、至tnj上，j是整数并且满足1彡j彡P，
步骤(a)包括使所述标记的样品核酸Si与所述探针核酸组NSi接触，从而将所述样品核酸Si杂交到已经固定在所述探针核酸组NSi的ρ个所述样点上的核酸上，步骤(b)包括获得已经杂交到各探针核酸组NSi的所述样点tn至、中的样品核酸的标记值Fil至Fip，NSl和NSm选自所述探针核酸组NSl至NSn并且m是整数并且满足2彡m彡n，所述步骤(c)包括以下步骤(cl)比较所述标记值Flj和Riij以确定ρ个比较值Cl “至Cp"，(c2)计算所述比较值Cl"至Cp"的平均值或中央值，以及(c3)基于在所述步骤(c2)中获得的平均值或中央值，设定指定的数值范围，并且判断所述比较值Cl"至Cp"是否落入所述指定的数值范围内。8.根据以上1至7中任一项的分析核酸突变的方法，其中所述样品核酸都用相同的标记物标记。9.根据以上1至8中任一项的分析核酸突变的方法，其中步骤(b)中的所述标记强度？1至而是校正值。10.用于在根据以上1至9中任一项的分析核酸突变的方法中执行数据处理的程序，所述程序执行以下进程⑴和(II)[进程⑴比较从Fl与F2的比较值至Fl与1 的比较值的n_l个比较值是否落入指定的数值范围][进程(II)在以下情况下判断样点Xl为阳性在以上⑴中临时确定的所有n-1 个比较值中，存在的已经通过进程(I)确定为未落入所述指定的数值范围内的比较值的数目超过指定数目]。11.根据以上10的程序，其中所述进程⑴包括以下进程⑴至(ν)[进程(i)在存在于η组所述探针核酸组的每个中的ρ个样点中，从η组所述探针核酸组中选择一对两个探针核酸组，所述一对两个探针核酸组被这样选择以致包含样点XI，以及在所述两个探针核酸组之间，计算已经固定有所述相同的探针核酸的成对的样点的标记强度的比较值][进程(ii)对所述探针核酸组中的ρ个成对的样点中的每个进行在进程(i)中的比较值的计算]，[进程(iii)计算在进程(ii)中获得的ρ个比较值的平均值或中央值]，以及[进程(iv)从在进程(iii)中获得的平均值或中央值设定指定的数值范围，并且比较P个比较值中的每个是否超过所述指定的数值]。12. 一种诊断源于基因突变的疾病的方法，所述方法使用根据以上1至9中任一项的分析核酸突变的方法。本发明的优势根据本发明的分析核酸突变的方法可以降低假阳性和假阴性在分析结果中的影响，尤其是，降低由于标准核酸的CNV所导致的影响(其为常规阵列比较基因组杂交技术中的问题)，并且可以改善分析结果的可靠性。更具体地，即使对于在常规阵列比较基因组杂交技术中由于假阳性和假阴性的影响而需要复查的分析物，根据本发明的分析核酸突变的方法不需要复查。因为本发明的程序在以上分析核酸突变的方法中执行数据处理，所以可以降低在分析结果中假阳性和假阴性的影响，尤其是由于CNV所导致的影响，并且可以改善分析结果的可靠性。因为根据本发明的用于诊断来源于基团突变的疾病的方法包括使用以上分析核酸突变的方法，所以可以在降低假阳性和假阴性影响的情况下做出诊断。附图简述

图1是流程图，其显示作为本发明的一个实施方案的分析核酸突变的方法。图2是部分示意图，其显示作为本发明的一个实施方案的分析核酸突变的方法的一个实施方案的部分。图3是这样的图，其显示分析物DNA No. 1与作为标准的男性基因组DNA的荧光强度比的对数坐标图的结果。图4是这样的图，其显示分析物DNA No. 1与分析物DNA No. 2的荧光强度比的对数坐标图的结果。图5是这样的图，其显示分析物DNA No. 1与分析物DNA No. 3的荧光强度比的对数坐标图的结果。图6是这样的图，其显示分析物DNA No. 1与分析物DNA No. 4的荧光强度比的对数坐标图的结果。实施本发明的方式在本说明书中，表示范围的“至”显示这样的范围，所述范围包含分别在词的前后作为最小值和最大值描述的数值。根据本实施方案的分析核酸突变的方法是使用阵列比较基因组杂交技术的分析方法，所述方法包括以下步骤(a)至(d)。图1和图2是示意图，其显示根据本发明的分析核酸突变的方法的一个优选实施方案。在这样点上，在图1中作为步骤(d)中判断标准的样点的数目是一半而在图2中例举了 η是4的情况，但是本实施方案不限于此。首先，在步骤(a)中，使用η组相同的探针核酸组，其中彼此不同的探针核酸已经被固定到核酸微阵列上的P个以上的样点，使Sl至Sn的η种样品核酸逐个与所述探针核酸组接触从而实现杂交。下文中，P是2以上的整数而η是3以上的整数。然后，选择已经固定有所述相同的探针核酸的η个样点Xl至fti，所述样点Xl至 ft!选自η组探针核酸组中的每个，并且获得已经杂交到相应的样点中的样品核酸的标记强度Fl至1 (样点Xl =Fl的标记强度，样点X2 :F2的标记强度...样点& =Fn的标记强度) (步骤(b))。接下来，确定从F2与Fl的比较值至Fl与而的比较值的n_l个比较值中的每个是否落入指定的数值范围(步骤(c))。在图2中，在步骤3中Fl与F2的比较值C2显示为 F1/F2而Fl与F3的比较值C3显示为F1/F3，但是如以下所述比较值的计算方法不限于此。然后，在n-1个比较值中，当在步骤(c)中已经确定为未落入指定的数值范围内的比较值的数目超过指定数目时，样点Xl被确定为阳性(步骤(d))。顺便提及，此处集中于任意的样点Xl以进行说明，但是也可以用其他样点代替所述样点来进行说明。优选的是用阵列中已经杂交有样品核酸Si的所有样点代替以上Xl来进行分析。此处，阵列比较基因组杂交技术(下文中有时也称为阵列CGH技术)是指其中比较基因组杂交技术在核酸微阵列上进行的技术。例如，该技术已经准确地描述于由Joji Inazawa等编辑的"Arei CGH Shindan Katsuyo Gaido Bukku Shitte Okitai Senshokutai Bisaikozo Ijosho" (Iyaku(Medicine and Drug(医学和药物))Journal Co. , Ltd)等中。在常规阵列CGH技术中，已知有使用两色法的技术，其中不同种类的标记化合物被用于标准核酸和分析物并且同时杂交到相同的样点中。在两色法中，在相同的阵列中同时评价标准物和分析物，但是，在标准核酸的CNV 未知的情况中，难以确定作为测量结果出现的增加或减小是否是标准物的增加或减小或分析物影响下的增大或减小(所谓假阳性/假阴性)。为避免这种问题，在两色法中，事先对标准物的CNV进行确认。然而，在标准物的CNV未知的情况中，需要很多样品和实验以评价标准物的CNV。另一方面，在本实施方案的方法中，作为分析物的核酸和作为对照的一个核酸各自杂交到已经固定有相同种类的核酸的不同的样点并且将测量值彼此比较。然而，甚至在此方法中，当分析物核酸添加到阵列1，作为对照的分析物核酸添加到阵列2，各自杂交时， 比较样点Xl和样点X2(它们是已经固定有相同的探针核酸的样点)的标记强度由此获得一个比较值，并且基于它判断阳性或阴性，尤其在对照包含CNV(拷贝数变异)的情况中，产生由于对照的影响所导致的增加或减小(所谓假阳性/假阴性)并且因此存在需要复查的情况或发生判断错误的情况。因此，在本实施方案中，使用η种标记的样品核酸。η是3以上的整数。具体地， 在η种样品核酸中集中于一种作为判断目标，使用剩下的η-1种作为对照获得关于该判断目标的η-1个比较值，并且进行对比较值阳性或阴性的临时判断。然后，在η-1个临时判断的结果中，指定数目以上的结果是临时阳性的情况被判断为真阳性，而判断为临时阳性的结果的数目小于指定数目的情况被判断为真阴性。至于指定数目，优选使用临时判断结果总数目的30 %至70 %范围内的数目，而 40 %至60 %的数目是更优选使用的。此处，阳性/阴性与在常规阵列CGH技术中是相同的，并且以下情况被称为阳性 与标准核酸相比在鉴定核酸中已经被固定到目标样点的核酸序列以更大的量存在，或者以更小的量存在或者不存在；而量相等的情况被称为阴性。 通常，在某个样点中，在分析物核酸与一种对照核酸的比较中，产生假阳性和假阴性(下文中简称为假阳性等)的可能性最多是大约1/10，通常是1/100以下。因此，使用 η-1种对照核酸，并且在所得的η-1个临时判断的结果中，指定数目以上的结果是临时阳性的情况被判断为真阳性，由此很大程度上减小了产生以上假阳性的可能性。如上，通过根据本实施方案的分析核酸突变的方法，假阳性等可以从测量结果中减少。此外，因为在本实施方案中以上产生比率变得很低，所以可能不使用标准核酸。用于本实施方案中的样品核酸的种类η是3以上并且优选地是4以上。如上所述，所述效果随η增加而变高并且η的上限不受限制，但是，为快速获得数据或从简化计算的观点来看，η优选100以下。最优选地η是4至100。下文中，标记的η种样品核酸也被显示为样品核酸Si、S2、. . . Sn-1, Sn(η是3以上的整数)。下文中，当确认样点(Xl)中的标记是否为阳性时，即当确认核酸突变(Si)在与样点(Xi)接触的标记的样品核酸中是否出现时，集中于样点(Xi)进行说明，而样点(Xi)是任意的样点。通常，集中于阵列上的P个以上的样点(P是2以上的整数)中的每个样点以进行实施方案的方法，并且优选地，集中于已经杂交有样品核酸的阵列上的所有样点以进行确认。此外，在所述样品核酸中，集中的核酸被用作待判断的核酸而待比较的相对的一个被用作对照核酸，但是可以集中于任何样品核酸并且将其用作待判断的核酸。优选的是至少两种所述样品核酸是分析物核酸。即，以上核酸如Sl可以任意选自η种所述核酸，并且通过施行本实施方案使用顺序地包含在η种核酸中的所有分析物核酸如Sl可以对核酸突变进行高度可靠的分析。通过比较关于样品核酸的对应样点的标记强度，可以判断多个分析物核酸的真阳性或阴性。此外，对于阵列上的所有样点中的每个，进行杂交的步骤和获得标记强度的步骤通常执行一次。在这样点上，也可能的是关于其中之前已经获得了杂交后的标记强度的数据，通过所述实施方案的方法进行确认。步骤(a)在步骤(a)中，使Sl至Sn的η种标记的样品核酸逐个与已经固定有相同的探针核酸的η个样点Xl至&接触，由此将样品核酸杂交到以上被固定的核酸。核酸微阵列是指探针核酸高密度地结合到固体基底的阵列。用于以上固体基底的固体材料不受特殊限制，只要它是探针核酸可以结合的材料，例如，玻璃材料诸如通常使用的载玻片以及塑料材料。作为用于本实施方案的核酸微阵列，可以提及BAC-DNA阵列、寡核苷酸微阵列、 c-DNA微阵列等。在根据本实施方案的分析核酸突变的方法中，可以使用市售的核酸微阵列或者可以使用通过通常方法制备的核酸微阵列。所述样点是指已经大量地高密度地固定有探针核酸的区域并且多个样点存在于以上的核酸微阵列上。以上在核酸微阵列上的样点的数目不受特殊限制，只要该数目是ρ个以上，但是通常，5个至1，000, 000个的数目是优选的而300个至5，000个的数目是优选的。所述样点在以上核酸微阵列上的布置不受特殊的限制，并且可以提及在多个区域中具有阵列并且能够在一个基底上测量多个样品核酸的多分析物阵列，在一个基底上组合多个阵列并且复制大量样点的带环(tie ring)阵列等。探针核酸是指这样的核酸，所述核酸已经固定在核酸微阵列的基底上(优选地以多个样点的形式)并且优选地是包含已知序列的核酸。探针核酸的大小优选地是10个碱基(b)至101Λ，更优选50b至51Λ，并且进一步优选IOOb至2kb。“相同的探针核酸”也包括在严格条件下和与以上探针核酸互补的核酸杂交的核酸。在本实施方案中，分别用在已经固定有相同的探针核酸的η个样点中的不同样品核酸进行杂交。此处，已经固定有相同的探针核酸的样点被表示为样点XI、Χ2、... Xn-U fti (η是3以上的整数)。η个样点XI、Χ2、. . . Xn-UXn可以存在于相同的核酸微阵列上但是优选地存在于 η个不同的核酸微阵列上。例如，在η个样点分别存在于η个相同种类的核酸微阵列上的情况中，优选的是使用具有相同区编号(block number)、列编号或行编号的样点作为η个以上的样点。待固定的探针核酸的量优选为每样点0. 8至5 μ g，更优选为1. 0至2. 0 μ g。在步骤(a)中，“探针核酸组”是指一组编码特定转录产物的基因的探针核酸。在本实施方案中，探针核酸组的数目通常对应阵列上的样点的数目。对于一个探针核酸组，在每个样点上可以固定一种探针核酸或者可以固定多个探针核酸，只要在单独的样点之间固定的探针核酸的种类是不同的。通常，一个探针核酸组固定在一个阵列上。在步骤(a)中，η组探针核酸组是指η组相同的探针核酸组并且也可以包括在严格条件下和与特定探针核酸组互补的探针核酸组杂交的探针核酸组。以上相同的探针核酸组对应于样品核酸的种类并且是η组。至于以上的探针核酸，可以提及化学合成的核酸、cDNA、BAC(细菌人工染色体)、 YAC (酵母人工染色体)、PAC (来源于Pl的人工染色体)、通过使用基因工程技术扩增它们获得的那些。此外，通过化学修饰天然核酸诸如DNA和RNA获得的核酸可以用作探针核酸。可以使用例如，PNA (肽核酸),BNA (桥接核酸)、膦酸甲酯类DNA、硫代磷酸酯类DNA、氨基磷酸酯类DNA、硼烷磷酸酯(boranophosphate)类DNA等。此外，也可以采用嵌合体类核酸。至于将探针核酸结合到固体基底上的方法，可以提及使用已经结合有由基因芯片 (Gene Chip)代表的发光基团的亚酰胺(amidite)单体以及使用掩膜逐个化学合成核苷酸的方法，或者通过喷墨方法将亚酰胺单体点样于固体基底上从而化学合成所需的序列的方法，通过改变电极上溶液的PH并且利用pH改变除去保护基团而在基底上合成核酸的方法， 纯化之前化学合成的核酸并将其点样在基底上的方法，使用点样仪(spotter)点样cDNA的方法等。至于点样方法，可以提及喷墨法、插针(Pin)阵列法等。样品核酸是指用于根据本实施方案的分析核酸突变的方法的单链或双链核酸并且可以是DNA、RNA等中的任何一个。样品核酸的来源不受特殊限制并且，例如，可以提及分析目标诸如包含样品核酸的细胞，使用核酸微阵列对其核酸的表达量和现有量、基因组中的拷贝数等进行测量；或对其进行评价诸如诊断的细胞，并且也可以提及组织、器官、一个个体等，并且所述来源不限于细胞自身。尤其地，样品核酸的来源优选能够从被认为具有特定疾病的人类患者、动物等获得的细胞等。至于疾病，可以包括所有疾病，诸如癌症、遗传疾病和传染性疾病，核酸可以具有关于所述疾病的某些信息，并且所述疾病不受特殊的限制。本实施方案的方法适于检查突变数目相对小的先天遗传疾病。非入侵性位点诸如粘膜、毛发和指甲以及体液诸如血液、 淋巴、骨髓、精子和羊水优选地用作样品。η种样品核酸优选地是来源于分类上属于相同物种的不同个体的核酸或来源于相同个体的不同细胞的核酸，更优选来源于人类不同个体的核酸或来源于相同人类个体的不同细胞(例如，正常细胞和癌细胞)的核酸。来源于人类不同个体的核酸是最优选的。此外，本实施方案的方法优选地用于检查这样的个体，所述个体不是根据患有特定遗传疾病的可能性等选择的(对新生儿等的全数检查)。在样品核酸的制备(例如，纯化、断裂)方面，优选的是通过纯化处理除去溶于细胞的物质诸如蛋白质和脂质。这是因为在用荧光等标记时发生不同副反应并且当不进行纯化时溶于细胞的物质诸如蛋白质和脂质很大程度上也影响背景噪音，以致核酸微阵列的性能显著降低。至于用于纯化的方法，可以提及使用用二氧化硅、纤维素化合物等的核酸吸附膜支撑的柱体(cartridge)的方法，用乙醇沉淀或用异丙醇沉淀，用酚氯仿萃取等。此外，可以提及以下方法使用离子交换树脂的固相萃取柱、色谱等，与疏水取代基诸如十八烷基键合的二氧化硅支持物(support)，具有尺寸排阻作用的树脂。样品核酸的长度不受特殊限制并且，例如，可以是全基因组，但是可以在以下的断裂处理后进行以上的纯化处理。在这样点上，标记的样品核酸的长度不受特殊限制，但是通过标记/断裂处理，所述核酸通常被断裂为1，000个碱基(11Λ)或碱基对(bp)至5，OOOb或bp。至于断裂处理，可以提及酶处理、超声处理、机械破碎处理、化学处理等。至于用于酶处理的酶，优选使用限制酶或核酸酶。至于限制酶的种类，也可能使用多个酶。至于机械破碎处理，可以提及使用玻璃球、不锈钢球、氧化锆球等裂开核酸的方法。以上核酸可以经受扣除法(subtraction method)的处理。扣除法是指这样的方法在目标基因的拷贝数或表达存在差异的情况中，通过以扣除的方式扣除存在于基因中的差异来有效地分离基因。可以采用例如，PCR选择法、RDA(代表性差别分析)法、DsDD(双链特异性直接消化)法等。尤其，在本实施方案中，在使用来源于癌细胞的样品核酸的情况中，因为大量正常细胞与癌细胞一起包含在癌组织中，所以存在这样的情况，其中核酸微阵列的性能显著下降，但是可以通过所述扣除法在一定程度上防止所述性能下降。至于η种样品核酸，其优选包括至少多种分析物核酸和至少一种、优选两种以上的标准核酸。此外，作为本实施方案的另一个实施方案，可能不使用样品核酸，S卩，所有的η种样品核酸都可以是分析物核酸。分析物核酸是所谓获得自分析物的核酸，S卩，核酸突变未知并且所述核酸突变由本实施方案分析的目标核酸。例如，提取自正常细胞(非癌化细胞)的核酸或提取自异常细胞(例如，癌细胞)的核酸可以用作分析物核酸。标准核酸是在上面用于与分析物核酸比较的核酸，并且是使用者(分析核酸突变的方法的实施者)事先在某种程度上掌握其关于突变等的一些信息的核酸。具体地，关于拷贝数变异(CNV)等，优选拷贝数变异的位置和数目已知的核酸并且更优选碱基序列已知的核酸。此外，例如，当癌症在具有CNV或某些嵌合体的患者体内产生时，在获得自癌细胞的核酸和获得自相同患者的不同于所述癌细胞的正常细胞的核酸的情况中，所述CNV或某些嵌合体被抵消，以致在获得自正常细胞的核酸作为标准核酸的使用中不出现问题。因此， 即使当基因组中的拷贝数不同于它在该生物物种中通常存在的量时，所述核酸可以用作标准核酸，只要可以从与分析物核酸的比较中获得信息，例如，在相同固体的情况中。各以上样品核酸优选地标记以相同的标记。 标记是指结合到核酸的可检测物质。所述可检测物质不受特殊限制并且可以提及荧光物质、酶、放射性同位素、诱发FRET (荧光共振能量转移)的化合物等。优选的是具有荧光物质的荧光标记物。所述荧光物质不受特殊限制并且可以使用异硫氰酸荧光素(FITC)、Cy染料、 Alexa、绿色荧光蛋白(GFP)、蓝色荧光蛋白(BFP)、黄色荧光蛋白(YFP)、红色荧光蛋白 (RFP)、吖啶、DAPI、溴化乙锭、SYBR绿、德克萨斯红、稀土荧光标记试剂、TAMRA, ROX等。优选用Cy染料诸如Cy-3或Cy_5进行荧光标记。此外，关于标记，可以使用地高辛(Digoxigein) (DIG)、生物素等。作为使用生物素的实例，当抗生物素蛋白与已经结合到探针的生物素结合时，已经结合有生物素的碱性磷酸酶结合于其上，并且添加碱性磷酸酶的底物氮蓝四唑和5-溴-4-氯-3-吲哚磷酸酯，观察到紫色显色并且因此可以用于检测。此外，可以以非酶的方式进行标记。也可以使用例如，ULS阵列CGH标记试剂盒 (由 Kreatech Biotechnology BV 公司生产)等。至于用于荧光标记的方法，可以使用直接标记法和间接标记法中的任一标记方法。直接标记方法是指这样的方法，其中将核酸转变为单链核酸，将短链核酸杂交于其上， 并且将已经结合有荧光物质(例如，Cy染料)的核苷酸化合物与核苷酸混合，由此在一步中标记核酸。间接标记法是指这样的方法，其中将核酸转变为单链核酸，将短链核酸杂交于其上，将具有能够结合荧光物质(例如，Cy染料)的取代基的核苷酸化合物(例如，具有氨基烯丙基的核苷酸化合物)与天然核苷酸混合在一起，首先合成具有取代基的核酸，然后经由氨基烯丙基结合荧光物质(例如，Cy染料)，由此核酸得到标记。至于用于将标记化合物诸如荧光物质引入到核酸中的方法，可以使用随机引物法 (引物延伸法)、切口平移法、PCR(聚合酶链反应)法、末端标记法等。尤其，在本实施方案中，可以合适地使用随机弓I物法。随机引物法是这样的方法，其中杂交几bp (碱基对)至超过IObp的随机引物核酸并且使用聚合酶同时进行扩增和标记，由此合成标记的核酸。切口平移法是这样的方法，其中，例如，使已经用DnaseI引入切口的双链核酸经受DNA聚合酶的作用以分解DNA并且通过聚合酶的活性同时合成标记的核酸。PCR法是这样的方法，其中制备两种引物并且使用所述引物进行PCR反应，由此同时进行扩增和标记从而获得标记的核酸。末端标记法是这样的方法，其中，在标记5'端的方法中，通过与T4多核苷酸激酶的磷酸化反应将标记化合物诸如荧光物质结合到用碱性磷酸酶去磷酸化的核酸的5'端。标记3'端的方法是这样的方法，其中用末端转移酶将标记化合物诸如荧光物质加到核酸的3'端。
至于标记的样品核酸等，也可能使用含有标记的样品核酸等的未纯化溶液。在使用这种未纯化溶液的情况中，酶等仍然保留在所述溶液中并且因此，在制备后，优选使留在所述溶液中的酶活性失活。这是基于避免影响数据再现性的观点。至于使酶失活的方法，任何方法都是可能的，只要它们能够使酶失活，但是优选进行添加螯合剂或60°C以上热处理的方法中的任一种或两种。加热温度优选60°C以上，更优选63°C以上。充分的加热时间是1分钟以上并且更优选地，优选在65°C以上进行5分钟以上的热处理。此外，在使用克列诺片段(klenow fragment)的标记方法的情况中，也可能使用涡旋混合器等使酶的活性丧失。杂交在步骤(a)中，为了将η种标记的样品核酸Sl至Sn逐个地提供给以上η组探针核酸组中的每个，作为用于使样品核酸逐个结合到以上各样点中的方法，可以使用任何方法诸如吸管吸移。在步骤(a)中，探针核酸和样品核酸可以通过将它们在杂交溶液中孵育来杂交。孵育条件不受特殊限制但是孵育优选在25至50°C进行，更优选在30至45°C进行，并且进一步优选在37至42°C进行。此外，用于杂交的时间优选8至96小时，更优选12 至72小时，并且进一步优选16至48小时。对于用于步骤(a)中的杂交的杂交溶液，没有特殊的限制，只要探针核酸和样品核酸在所述溶液中杂交。优选具有这样性质的溶液探针核酸和样品核酸合适地杂交，并且更优选具有这样作用的溶液加速探针核酸和样品核酸的序列之间高符合度的杂交，并且另一方面抑制所述序列之间低符合度的杂交。杂交溶液优选包含具有排除体积效应(extruded volume effect)的物质，用于降低样品核酸熔点的物质和用于调节离子强度的溶液。作为具有排除体积效应的物质，可以提及聚乙二醇(PEG，见，例如， JP-A-2000-325099)、葡聚糖硫酸酯等。作为用于降低样品核酸熔点的物质，可以提及甲酰胺、甘油、甲醛、二甲亚砜 (DMSO)、N, N- 二甲基甲酰胺(DMF)、硫氰酸胍(GuSCN)、碘等。作为用于调节离子强度的溶液，可以提及SSC(150mM NaCl、15mM柠檬酸钠)、 SSPE(150mM NaClUOmM NaH2PO4. H2O、ImM EDTA pH7. 4)、MES 杂交缓冲液等。在所述杂交溶液中，可以加入封闭剂(blocking agent)、表面活性剂等。作为表面活性剂，可以提及阳离子表面活性剂、阴离子表面活性剂、非离子表面活性剂等。作为阴离子表面活性剂，可以提及十二烷基硫酸钠(SDS)等。作为非离子表面活性剂，可以提及Tween(注册商标)、Trit0n X(注册商标)等。以上封闭剂用于在杂交时减少对非特异性杂交的检测。例如，可以提及tRNA(转移RNA)、经修饰的鲑鱼精子DNA、聚A(聚腺苷酸)、聚dA(聚脱氧腺苷酸)、脱脂乳等，其主要具有减少核酸微阵列的背景噪音的作用。同样，可以使用通常市售的封闭剂。此外，在本实施方案中，如在JP-A-2005-087109中描述的，作为杂交溶液的一种组成，也可以使用磷脂、Denhardt溶液(包含聚蔗糖(ficoll)、聚乙烯吡咯烷酮和牛血清清蛋白作为主要组分的溶液)、季铵盐甜菜碱(Biochemistry (生物化学)32，137-144 (1993))、TMAC (氯化四甲铵)(Proc. Natl. Acad. Sci. USA (美国科学院院刊),82,1585-1588 (1985))、 市售杂交溶液，例如 ExpressHyb (由 Clontech 公司制造)、PerfectHyb (由 TOYOBO Co.， Ltd.制造)、ULTRAhyb (由Ambion公司制造)等。对于杂交，优选在严格条件下使得目标核酸和探针核酸杂交。作为具体的杂交条件，例如，在37°C进行16小时的杂交反应后，作为洗涤条件，可以提及⑴用5mL 2XSSC溶液在室温洗涤30秒，(2)用5mL 50%甲醛/2XSSC(pH7. 0)溶液在50°C洗涤15分钟，(3) 用 5mL 2XSSC/0. 1% SDS (pH7. 0)溶液在 50°C洗涤 30 分钟，(4)用 5mL 2 X SSC 溶液在室温洗涤5分钟。步骤(b)在步骤(b)中，获得在η个样点Xl至&中杂交的样品核酸的标记值Fl至而。在步骤(b)中，用于在杂交后在核酸微阵列上获得标记强度的方法不受特殊限制，只要标记强度可以得到测量。在步骤(b)中，样点Xl的标记强度显示为F1，样点X2的标记强度显示为F2，...样点紐-1的标记强度显示为而-1，而样点)(n的标记强度显示为而。η是3以上的整数。例如，在放射性同位素的情况中，可以使用X射线胶片、BASS(由FUJIFILM公司生产)等。在荧光物质用作标记物质的情况中，优选使用荧光扫描仪。作为荧光扫描仪，例如，可以提及FLA系列(由FUJIFILM公司生产)、GenePix系列(由Axon Instruments Inc. 生产)、LS Reloaded (由TECAN公司生产)等。步骤(c)在步骤(c)中，将样点Xl的标记值Fl与标记值F2至而中的每个相比，由此获得 n-1个比较值C2至Cn，并且进行确定各比较值是否落入指定的数值范围。换言之，进行临时确定各比较值的大小是否对应阳性。不包括步骤(d)的常规方法中的阳性/阴性(尤其是与S2至Sn中的标准核酸的比较值的确定结果)对应于本文中的临时确定的阳性/阴性。比较值是通过彼此比较相同种类的两个样点的标记强度获得的数值，并且可以提及标记强度比、标记强度之间的差等。比较值优选标记强度比，更优选标记强度比的对数值 (Log值)，并且进一步优选以2为底的标记强度比的对数值(LO&值)。用于临时判断各比较值阳性或阴性的标准，S卩，指定的数值范围可以与常规阵列比较基因组杂交技术的标准相等并且，例如，准备已知为阳性的样品核酸(阳性对照)和已知为阴性的样品核酸(阴性对照)并且可以使用它们的中间值作为阈值进行判断。此外，因为可能用于杂交的η种样品核酸的量彼此不同，所以优选包括用于校正样品核酸的量的步骤。这种步骤不受特殊限制，并且可以应用在比较不同探针核酸组中获得的标记强度的单色法杂交中通常使用的归一化。例如，可以使用整体归一化等。例如，可以提及这样的方法使每个阵列中的P个样点的标记强度的平均值，或如之后在步骤(^)中描述的，中央值在待比较的阵列中相等，以及这样的方法在获得一对阵列间的每个样点的每个比较值后，使所述一对阵列间的P个比较值的平均值或中央值等于另一对阵列间的P个比较值的平均值或中央值。具体地，可以提及这样的方法用通过用单个标记强度或比较值除以各阵列内的P个样点的标记强度的平均值或中央值获得的比率，通过减去标记强度的平均值或中央值获得的值，或偏差值表示。通过包括这种步骤，可以校正如上所述的由样品核酸的量引起的差异。此处，用于校正的方法不受特殊限制并且，例如，可以提及这样的方法使标记强度乘以和除以平均值或中央值，排除与平均值或中央值偏离一定值以上的值。此外，在以上的校正步骤中，在通过除以平均值或中央值获得的比率的情况中，所得的值是对应于拷贝数的值。至于前述步骤(C)中的指定的数值范围，可以根据各测量值 (尤其是获得自对已知突变测量的值)设定这样的值，所述值能够排除突变明显发生的区域，或者可能基于可能作为理论拷贝数的数值设定值。对于后者，具体地，在存在于不含异常的常染色体上的特定核酸区域的数目是1个拷贝而一对的以上染色体对的拷贝数是1的情况中，理论上可能的拷贝数是间隔0.5的值，诸如0、0.5、1、1.5、2..。因此，对于用于在以上步骤(c)中进行确定的标准，可能使用以上间隔的一半(即0.25)作为阈值来判断临时阳性或阴性，或者排除中间值(例如，0.2至0. 3)而不像以前那样作为假阳性进行判断。可以与在常规阵列比较基因组杂交中阳性判断标准相似地设定比较值的指定的数值范围。例如，在使用荧光强度比的情况中，理论上，可以提及诸如0.8至1.2的值，但是考虑到序列的鉴定等，所述值可以任意设定。例如，在进行之后要提及的修正的情况中，可以在这种程度上进行乘或除。S卩，在本实施方案中，以上步骤(C)优选对存在于η组探针核酸组中的每个中的P 个样点进行以下步骤(cl)至(c3)的步骤。S卩，总共计算(n-l)Xp个比较值。[步骤(cl)从以上η组探针核酸组中选择一对两个探针核酸组，这样选择以致其包括样点XI，以及在所述两个探针核酸组之间比较ρ对固定有相同的探针核酸的样点的每对的标记强度，以计算P个比较值][步骤(c2)计算步骤(Cl)中获得的ρ个比较值的平均值或中央值][步骤(c3)基于步骤(c2)中获得的平均值或中央值设定指定的数值范围并且确定P个比较值中的每个是否超过指定的数值范围]更具体地，本实施方案包括以下步骤提供η个相同的探针核酸组NSl至NSn，各探针核酸组NSi提供具有ρ个样点tn至tip的核酸微阵列，i是整数并且满足 l^i^nMp是整数并且满足2彡p，将彼此不同的探针核酸固定在各探针核酸组NSi的ρ个样点tn至、上。各探针核酸组NSi的ρ个样点中的一个是样点Xi，将相同的探针核酸固定到所述样点、至tnj上，j是整数并且满足1彡j彡P，步骤(a)包括使标记的样品核酸Si与探针核酸组NSi接触从而将样品核酸Si杂交到已经固定在探针核酸组NSi的ρ个样点上的核酸，步骤(b)包括获得已经杂交到各探针核酸组NSi的样点tn至、中的样品核酸的标记值Fil至Fip，NSl和NSm选自探针核酸组NSl至NSn并且m是整数并且满足2彡m彡n，步骤(c)包括以下步骤(cl)比较标记值Flj与Fmj以确定ρ个比较值Cl"至Cp"，(c2)计算比较值Cl"至Cp"的平均值或中央值，以及(c3)基于在步骤(c2)中获得的平均值或中央值设定指定的数值范围并且判断比较值Cl"至Cp"是否落入指定的数值范围。在步骤(c!3)中，优选的是比较值是标记强度比并且根据标记强度比的平均值或中央值的偏差进行对阳性或阴性的临时判断。例如，基于平均值或中央值的偏差设定阈值 (指定的数值范围)，并且与平均值或中央值的偏差超过以上阈值的情况可以临时地被判断为阳性(或阴性)。在获得如上所述的比较值前，也可以通过计算各探针核酸组中的ρ个样点的单个标记强度的平均值或中央值并且将它与单个的标记强度相比来实施计算比较值的平均值或中央值的步骤以及将它与步骤(c2)和(c3)中的单个的比较值比较的步骤。即，在本实施方案中，以上步骤(c)可以是以下步骤[步骤(CC)计算η组探针核酸组中的单个样点的标记强度的平均值或中央值，在η组探针核酸组的每个中，基于所述平均值或中央值计算单个样点的偏差值 (F' UF' 2. . . F' η),计算在η组探针核酸组中的一对两个组之间相同种类的成对的样点的标记强度的比较值，并且根据η组的平均值或中央值，确定从成对的F' 1和F' 2的比较值至成对的F' 1和F' η的比较值的η-1个比较值中的每个是否落入指定的数值范围]。顺便提及，在本实施方案中，为了说明的缘故，将单个的步骤编号成不同的数以进行说明，但是所述编号不限制其次序并且也不排除同时处理。步骤(d)在步骤(d)中，在已经确定为未落在指定的数值范围的数目超过η-1中的指定数目的情况中，样点Xl被确定成阳性。指定数目优选地是η-1的一半并且η是4以上和指定数目是η-1的70%的情况是更优选的。此外，确定的数目是某个数目以下的情况优选地被确定为阴性，但是同样优选的是限定特定的范围而落入限定范围内的情况被判断为假阳性并且进行复查。甚至在进行复查的情况中，与常规方法相比，预期在很大程度上减小需要复查的可能性。此外，在进行复查的情况中，优选改变比较主体来进行复查。在这样点上，在步骤(d)中，在比较值已经被确定为未落入指定的数值范围的情况的数目没有超过η-1中的指定数目的情况中，可以判断样点Xl中的数据缺少可靠性并且可以进行处理诸如复查。此外，样点(Xl)是任意样点并且通常，在包含样点Xl的相同的阵列中的多个样点 (优选地所有样点)中，在替换以上(Xl)的情况下进行与本实施方案的步骤(a)至(d)相同的步骤或处理(i)至(iii)。标记强度校正以上在步骤(b)中获得的标记强度优选为经校正的值。具体地，在步骤(b)中获得的标记强度优选获得自以下步骤的值。优选的是包括这样的步骤使标记的样品核酸与某个样点上的固定的探针核酸杂 、-
父，加入标记的鉴定核酸并且将加入的核酸杂交到探针核酸的步骤，所述标记的鉴定核酸具有可以杂交到以上探针核酸的至少一部分的序列并且标记以不同于标记的样品核酸的标记物的标记物，获得以上样点中杂交的经标记的样品核酸的标记强度的步骤，
测量所述样点中杂交的经标记的样品核酸的标记强度的步骤，以及基于鉴定核酸的标记强度检测所述样点中固定的探针核酸的量并且通过检测的量校正样品核酸的标记强度的步骤。校正方法可以使用描述于例如JP-A-2010-004873中的方法。此处，优选的是使得标记的样品核酸杂交的步骤和使得标记的鉴定核酸(B)杂交的步骤同时进行，并且测量经杂交的标记的样品核酸的量的步骤和测量经杂交的鉴定核酸的量的步骤同时进行。此处，鉴定核酸是指具有可以杂交到探针核酸的至少一部分的序列的核酸，并且可以用于检测由多个样点杂交能力(具体地固定在每个样点的探针核酸的量)的不均导致的变化，并且可以进一步用于校正样点之间的探针核酸的量的变化。因此，充分地，鉴定核酸是可以杂交到固定在核酸微阵列上的所有样点中的探针核酸的核酸并且可以具有任何序列和链长度。此处，所有的样点表示可能使相同溶液中的分析物或标准物起反应的所有样点，并且通常是单一核酸微阵列上的所有样点但是不限于此。此外，鉴定核酸可以是任何核酸，只要它可杂交并且可以是天然核酸诸如DNA和 RNA以及同样地通过对天然核酸诸如DNA和RNA进行化学修饰获得的核酸。例如，可以使用PNA、甲基磷酸酯类DNA、硫代磷酸酯类DNA、嵌合体类核酸等。至于优选作为鉴定核酸的序列，可以提及重复性序列。重复性序列也被称为重复序列，并且是每隔某一数目的碱基就重复出现的序列，诸如限制酶识别位点。可以提及其中短的碱基序列的模式重复多次的序列，例如，聚d(AT)和聚d(GC)，以及其中长序列(一个单元可以达到数千个碱基对)重复多次的序列，并且已知在高等动物诸如人中这种序列以高频率出现在基因组中。在本实施方案中，例如，可以合适地使用从^witrogen公司商业获取的 Cot-IDNA。已知Cot-IDNA是这样的核酸，其在核酸微阵列测量中用于封闭获得自哺乳动物的分析物的重复序列。通过标记至少一部分的Cot-IDNA并且将标记的Cot-IDNA与未标记的Cot-IDNA 一起使用，也可能加强对特异性杂交的检测灵敏度并且减小样点间的差异。作为鉴定核酸，与分析物核酸不同，同样优选使用不同于分析物核酸并且具有所有探针核酸组通常具有的序列的核酸。例如，也可能使用这样的合成寡核苷酸作为鉴定核酸，所述合成寡核苷酸具有与通常存在于探针核酸中的核酸序列部分基本互补的核酸序列。此外，也可能使用具有被认为在阵列的制备中存在于所有样点中的序列的核酸作为鉴定核酸，诸如在阵列的制备中使用的载体(质粒、BAC、YAC、PAC、粘粒、病毒等)的核酸， 大肠杆菌的基因组等。在本实施方案中，优选地以与样品核酸的摩尔比为1以上的量使用鉴定核酸。通过以1以上的摩尔比使用它，核酸微阵列的性能得到改善。鉴定核酸的大小优选20bp以上，更优选20bp至IMbp，并且进一步优选IOObp至 500kb。使用的鉴定核酸的量与分析物或标准核酸的摩尔比优选地在0. 5至2的范围内。
自动化根据本实施方案的分析核酸突变的方法的所有步骤可以手工进行或者所述步骤可以借助部分自动的机器进行或者所有步骤可以借助全自动机器进行。通过自动化，工人免于繁重的工作，人员经费可以得到减小，由熟练程度的差异导致的结果的差异可以降低，并且可以避免人为失误。程序以下将说明本实施方案的程序。实施方案的程序是在以上说明的分析核酸突变的方法中用于执行数据处理的程序，其执行以下进程⑴和(II)[进程(I)比较从Fl与F2至Fl与1 的n_l个比较值是否落入指定的数值范围][进程(II)在以下情况中判断样点Xl为阳性在以上⑴中临时确定的所有n-1
个比较值中，已经由进程(I)确定为未落入指定的数值范围内的比较值的数目超过指定数目]。进程⑴优选地包括以下进程⑴至(V)[进程(i)在存在于η组探针核酸组的每个中的ρ个样点中，从η组探针核酸组中选择一对两个探针核酸组，所述一对两个探针核酸组被这样选择以致包含样点XI，以及在所述两个探针核酸组之间，计算已经固定有相同的探针核酸的成对的样点的标记强度的比较值][进程(ii)对探针核酸组中ρ个成对的样点中的每个进行进程(i)中的比较值计算]，[进程(iii)计算在进程(ii)中获得的ρ个比较值的平均值或中央值]，以及[进程(iv)从在进程(iii)中获得的平均值或中央值设定指定的数值范围并且比较P个比较值中的每个是否超过指定的数值]。通过使用本实施方案的程序，在对通过测量上述标记强度获得的数据的处理中可以有效地进行数据处理。所述程序通常以这样的方式提供它被记录在可在计算机上读取的记录介质上。 记录介质不受特殊限制，只要它在计算机上可读。本实施方案的记录介质包括便携的记录介质和固定类型的记录介质两者，并且可以提及高密度磁盘(CD)、软盘(FD)、硬盘、半导体存储器等。可以通过将本实施方案的程序记录在以上的记录介质上来传送它，或者可以以下述形式传送它它被记录在计算机的存储设备上并且经由网络传递到另一个计算机。以下将说明用于根据本实施方案诊断来源于基因突变的疾病的方法。用于根据本实施方案诊断来源于基因突变的疾病的方法使用以上说明的分析核酸突变的方法。作为以上的诊断目标疾病，可以包括所有疾病诸如癌症、遗传疾病和传染性疾病，对于所述疾病核酸可以具有某些信息，并且所述疾病不受特殊的限制。在根据实施方案的诊断方法中，通过将提取自正常细胞(非癌化细胞)的核酸作为标准核酸而提取自异常细胞(例如来源于癌症患者、遗传性疾病患者或传染性疾病患者的细胞)的核酸作为分析物核酸应用于以上说明的分析核酸突变的方法，可以诊断提供分析物的患者或者被用作分析物的细胞的病变，而不受由CNV等所导致的假阳性和假阴性的影响。
实施例以下将根据实施例说明本发明。显示于以下实施例中的材料、试剂、物质的量和比率、操作等可以适当地改变，只要它们不偏离本发明的本质。因此，本发明的范围不限于以下具体的实施例。在以下实施例中，Cy3男性表示通过用Cy3标记男性DNA获得的样品。相似地，Cy5 男性表示通过用Cy5标记男性DNA获得的样品。此外，Cy5-Cot_lDNA等相似地表示标记有相应标记化合物的核酸。[实施例1]1.制备标记的样品核酸向微管中放入 3 μ L(0. 75 μ g)Human Genomic DNA male (人男性基因组 DNA)(由 Promega公司生产，货号G152 ；下文中称为男性基因组DNA)，8 μ L水(不含DNAsejnase的蒸馏水，GIBC0)，20 μ L 用于阵列 CGH(BioI^rime (注册商标)Array CGH Genomic Labeling System(阵列CGH基因组标记系统)(invitrogen))的标记系统的2. 5XRandom Primers Solution (随机引物溶液)anvitrogen公司)，接着使用块型孵育器(block incubator) 在95°C热处理5分钟并且在37°C静置15分钟。向其中加入5 μ L的以上标记系统的IOXdCTP Nucleotide Mix (核苷酸混合物) (Invitrogen 公司)，3 μ L Cy3_dCTP Bulk Pack 250nmol (由 GEHealthcare Bioscience 公司生产)，lyL BioI^rime (注册商标)Array CGH Genomic Labeling System(阵列 CGH 基因组标记系统)的Exo-Klenow Fragment Qnvitrogen公司)，接着使用块型孵育器在37°C 与标记反应同时地进行2小时扩增反应。然后，使用块型孵育器整体加热到65°C以使包含在反应溶液中的Exo-Klenow Fragment失活。以上操作，遵从puregene OjIAgen公司)的实验方法从Coriell医学研究所的细胞株GM07189(下文中称为分析物核酸No. 1)、细胞株GM07189 (下文中称作分析物核酸 No. 2)、细胞株GM13451(下文中称作分析物核酸No. 3)和细胞株GM13451 (下文中称作分析物核酸No. 4)实施基因组提取。对于提取的DNA，使用NanoDrop (Scrum Inc.)测量0D。在因此获得的基因组上，进行与在以上人男性基因组DNA的情况中相同的操作，以获得未纯化的标记的样品核酸。同样，对于这些，使用Cy3_dCTP(由GE Healthcare Bioscience公司生产)作为标记化合物。2. 1.制备标记的鉴定核酸除了将3μ g(13y L)Cot_lDNA(由 hvitrogen 公司生产，货号 15279-011)用于微管中和使用 3μ L Cy5-dCTP Bulk Pack 250nmol (由 GE Healthcare Bioscience 公司生产)作为标记化合物外，以相同的方式获得标记的鉴定核酸(未纯化的)。2. 2制备包含标记的鉴定核酸的杂交溶液向微管加入21 μ L标记的核酸Cy5-Cot-lDNA，62 μ L未标记的Cot_lDNA(62 μ g, 由Invitrogen公司生产)，0. 3yg酵母tRNA，以及9yL 3M醋酸钠(pH 5. 2)，并且向其中加入-20°C 360 μ L 99. 5% (ν/ν)乙醇，以实现乙醇沉淀。干燥后，添加8. 7 μ L水、6. 5 μ L 甲醛以及16.8yL 20% SDS0向其中加入32 μ L葡聚糖-甲酰胺溶液，所述葡聚糖-甲酰胺溶液通过将水加入Ig葡聚糖、5mL甲酰胺和ImL 20 X SSC至7mL的体积而获得，接着将全部完全溶解。之后，收集到一个管中，并且将各30 μ L分散在多个管中。向其加入IOyL的以上标记的样品核酸的基因组中的每个，并且将整体充分搅拌。然后，在75°C孵育15分钟后，使产物在42°C保持30分钟以上。3.制备BAC阵列载玻片从已经插入人基因组的BAC文库，每个染色体随机选择包含被认为是含有先天性异常的基因区域的BAC，并且在50mL LB培养基(+氯霉素)中培养过夜。选择每个染色体具有特定长度的以上BAC，并且最终制成340个样点。遵从所附实验方法使用QIAGEN公司的质粒中提试剂盒(plasmid midi kit)提取它。在调节到Uyg/ieyL TE后，分别使用限制酶Rsal、DpnI和HaeIII进行2小时的消化，然后在80°C持续20分钟使所述酶失活，并且将这三种消化物混合。此外，力口入序列为 SEQ No. 1 5 ‘ -aattccggcggccgcccgatg-3 ‘的衔接子和序列为 SEQ No. 2 5 ‘ -P-catcgggcggccgcgg-3 ‘ (5 ‘端磷酸化)的它的互补链，在 95 °C、5 分钟，70°C、 15 分钟，65 °C、15 分钟，60°C、15 分钟，55 °C、15 分钟，50°C、15 分钟，45 °C、15 分钟，40°C、 15分钟，35°C、15分钟，30°C、15分钟，25°C、15分钟的限制酶消化后，所述衔接子连接到DNA片段上，并且加入5 μ L10XT4连接酶缓冲液和2. 5 μ L Τ4连接酶，以使限制酶处理后的DNA片段与衔接子结合。然后，使用Nucleospin试剂盒(由MACHEREY-NAGEL公司生产)纯化DNA片段。使用EX-Taq (由Takara Bio Inc.生产)和序列为SEQ No. 3 5' -NH2-ggaattccgcggccgcccgatg-3‘的 5'端胺化引物进行 PCR。PCR进行 15 个循环作为第一次PCR并且10个循环作为第二次PCR。通过在MICR0C0N柱上进行超滤来纯化产物到Iyg/μ L的终浓度，其被用作探针核酸。将它送至NGK Insulators Ltd.并且通过压电法在Matsunami Glass Ind.的载玻片上进行点样，以形成BAC阵列。此外，根据JP-A-2002-176977中描述的方法使BAC阵列经历封闭和热变性。4，杂交使用ALOKA Co.，Ltd 的 HYBRIMASTER HS300 进行杂交。放置BAC阵列载玻片，将温度设定为37°C并且，在加入杂交溶液后，在搅拌下进行 16小时的杂交。在此情况下，使用50%甲酰胺ΛX SSC作为湿润液体。之后，在25°C用5mL 2 X SSC进行漂洗5分钟并且用1011^2\33(漂洗5分钟，在501用51^ 50%甲酰胺/2 X SSC 漂洗14分钟并且用5mL 0. 1% SDS/2 X SSC漂洗30分钟，并且在25°C用2 X SSC漂洗5分钟。5.荧光图像的加载和数据处理使用gen印ix 4000B(由axon Inc.生产)加载荧光图像。基于其中图像被数字化的gpr文件进行计算。关于计算方法，使用cy5即Cot-IDNA的荧光值作为校正的指标， 对用cy3标记的标记的基因组的荧光强度进行校正，然后完成比较。使用减去背景荧光值后的值作为荧光值。计算方法log2(基因组分析物核酸的荧光强度/标记的cot-1 (分析物)/基因组标准核酸的荧光强度χ标记的cot-1 (标准))
对由此与分析物核酸No. 1杂交的所有成对的所有样点以及与标准人男性基因组 DNA杂交的所有样点中相同类型的样点进行此计算。对于通过以上计算获得的所有样品对的值，通过除以所有样点对的中央值进行整体归一化。因此，进行分析物核酸No. 1与标准人男性基因组DNA的比较。然而，因为标准核酸的CNV是未知的，有可能比较结果可以包含假阳性和假阴性。因此，分别使用分析物核酸No. 2,No. 3和No. 4代替标准人男性基因组DNA进行与分析物核酸No. 1的比较。6.结果图3至图6显示以上计算的结果。纵坐标轴表示荧光强度比而横坐标轴表示样点编号(探针核酸编号)。在图3至图6中， 表示落入阈值内的数据，□表示落在阈值外的数据(在正向上偏离的数据)，而Δ表示落在阈值外的数据(在负向上偏离的数据)。阈值设为0. 8和1. 2。图3是这样的图，其显示分析物DNANo. 1与作为标准核酸的男性基因组DNA的荧光强度比的对数坐标图的结果。图4是这样的图，其显示分析物DNANo. 1与分析物DNANo. 2的荧光强度比的对数坐标图的结果。图5是这样的图，其显示分析物DNANo. 1与分析物DNANo. 3的荧光强度比的对数坐标图的结果。图6是这样的图，其显示分析物DNANo. 1与分析物DNANo. 4的荧光强度比的对数坐标图的结果。在各个图中，对应于常染色体并且落在阈值外的样点是以下样点。图 3 :4、17、81、111、127、135、145、146、147、163、197、202、221、225、226、227、228、 229、230、231、232、244、245、264、310、328图 4 :31、181、197、219、225、226、227、228、229、230、231、232、281、291、314、318、 319、320、321、322图 5 :1、6、10、13、15、19、20、21、27、29、30、35、36、44、47、51、52、55、57、59、64、66、 72、80、86、94、96、113、137、141、157、167、174、178、181、185、204、215、216、217、225、226、 227、228、229、230、231、232、236、256、267、269、278、279、287、290、291、299、305、307、334图 6 :1、2、3、4、5、6、7、8、10、17、29、31、52、86、111、113、163、174、197、216、217、 226、227、228、230、231、232、236、245、273、287、290、306、342结果，在197以及225至232的每个样点中，所述比率超出了图3至图6中的多数结果中的阈值，所以所述样点可以判断为是阳性。超过以上阈值的其他样点可以被判断为是假阳性或假阴性。以上可见，发现No. 1样品具有异常拷贝数在对应于固定在样点197以及225至 232中的核酸的基因中增加。此外，对于No. 2至No. 4样品以及作为标准的男性，通过用其代替以上的No. 1样品进行类似测量，可以测量它们的拷贝数变异。顺便提及，尽管在本实施例中没有相关的实例，但是在阵列之间的某个样点的比较结果中出现值在正向上落在阈值外和值在负向上落在阈值外的两种结果的情况(例如， No. η样点在图3和图4中是□并且No. η样点在图5和图6中是Δ的情况)中，优选不判断所述样点为阳性。从以上结果可见，应当理解可以通过本发明的方法确定阳性或阴性而不受假阳性
等的影响。工业实用性根据本发明的分析核酸突变的方法、程序以及诊断方法可以降低分析结果中假阳性和假阴性的影响，尤其是，降低由于标准核酸的CNV所导致的影响(其为常规阵列比较基因组杂交技术中的问题)，并且能够改善分析结果的可靠性。虽然已经详细地并且根据其具体实施方案描述了本发明，但是对于本领域技术人员明显的是可以在其中进行各种改变和改良而不背离它的精神和范围。本申请基于在2009年9月10提交的日本专利申请号2009-209578，并且其内容通过引用结合于此。
权利要求
1.一种使用阵列比较基因组杂交技术来分析核酸突变的方法，其包括步骤(a)使用η组相同的探针核酸组，其中多个样点存在于一个核酸微阵列上并且彼此不同的探针核酸已经被固定在多个所述样点上，使η种标记的样品核酸Sl至Sn逐个地与η组所述探针核酸组接触以实现杂交，步骤(b)选择已经固定有相同探针核酸的η个样点乂1至&1，所述样点乂1至&!选自 η组所述探针核酸组，并且获得已经被杂交到η个相应的样点Xl至)(r!中的样品核酸的标记强度Fl至而，步骤(c)将所述样点Xl的标记值Fl与所述标记值F2至而中的每个比较，由此获得 n-1个比较值C2至Cn，并且确定所述比较值中的每个是否落入指定的数值范围内，以及步骤(d):确定在n-1个所述比较值中在所述步骤(c)中已经确定为未落入所述指定的数值范围内的比较值的数目是否超过指定数目，并且在超过所述指定数目的情况下，判断所述样点Xl为阳性，η是3以上的整数，所述样品核酸是分析物核酸或标准核酸，至少Sl是分析物核酸，而 Xl是已经与Sl接触的样点。
2.根据权利要求1的分析核酸突变的方法，其中在η种所述样品核酸中至少两种是分析物核酸。
3.根据权利要求1或2的分析核酸突变的方法，所述方法进一步包括步骤(c')确定从F2与Fl的比较值至F2与1 的比较值的n-1个比较值中的每个是否落入指定的数值范围，以及步骤(d')确定n-1个比较值中在所述步骤(c')中已经确定为未落入所述指定的数值范围内的比较值的数目是否超过所述指定数目，并且在超过所述指定数目的情况下， 判断样点X2为阳性，样点X2是已经与不同于以上Sl的样品核酸S2接触的样点。
4.根据权利要求1至3中任一项的分析核酸突变的方法，其中在η种所述样品核酸中至少一种是标准核酸。
5.根据权利要求1至3中任一项的分析核酸突变的方法，其中η种所述样品核酸都是分析物核酸。
6.根据权利要求1至5中任一项的分析核酸突变的方法，其中η种所述样品核酸是来源于属于分类学上相同物种的不同个体的核酸。
7.根据权利要求1至6中任一项的分析核酸突变的方法，其中提供η个相同的探针核酸组NSl至NSn，各探针核酸组NSi被提供在具有ρ个样点tn至tip的核酸微阵列上，i是整数并且满足1彡i彡η而P是整数并且满足2 ( ρ，将彼此不同的探针核酸固定在各探针核酸组NSi的ρ个所述样点tn至、p上， 各探针核酸组NSi的ρ个所述样点中的一个是样点Xi， 将相同的探针核酸固定到样点、至tnj上，j是整数并且满足1彡j彡P， 步骤(a)包括使所述标记的样品核酸Si与所述探针核酸组NSi接触，从而将所述样品核酸Si杂交到已经固定在所述探针核酸组NSi的ρ个所述样点上的核酸，步骤(b)包括获得已经杂交到各探针核酸组NSi的所述样点tn至、p中的样品核酸的标记值Fil至Fip，NSl和NSm选自所述探针核酸组NSl至NSn并且m是整数并且满足2彡m彡n， 所述步骤(c)包括以下步骤(cl)比较所述标记值Flj和Fmj以确定ρ个比较值Cl"至Cp"， (c2)计算所述比较值Cl"至Cp"的平均值或中央值，以及(c3)基于在所述步骤(c2)中获得的平均值或中央值，设定指定的数值范围并且判断所述比较值Cl"至Cp"是否落入所述指定的数值范围内。
8.根据权利要求1至7中任一项的分析核酸突变的方法，其中所述样品核酸都用相同的标记物标记。
9.根据权利要求1至8中任一项的分析核酸突变的方法，其中步骤(b)中的所述标记强度？1至而是校正值。
10.用于在根据权利要求1至9中任一项的分析核酸突变的方法中执行数据处理的程序，所述程序执行以下进程⑴和(II)[进程⑴比较从Fl与F2至Fl与而的n-1个比较值是否落入指定的数值范围] [进程(II)在以下情况下判断样点Xl为阳性在以上⑴中临时确定的所有n-1个比较值中，存在的已经通过进程(I)确定为未落入所述指定的数值范围内的比较值的数目超过指定数目]。
11.根据权利要求10的程序，其中所述进程⑴包括以下进程⑴至(V) [进程(i)在存在于η组所述探针核酸组的每个中的ρ个样点中，从η组所述探针核酸组中选择一对两个探针核酸组，所述一对两个探针核酸组被这样选择以致包含样点XI，以及在所述两个探针核酸组之间，计算已经固定有所述相同的探针核酸的成对的样点的标记强度的比较值][进程(ii)对所述探针核酸组中的P个成对的样点中的每个进行在进程(i)中的比较值计算]，[进程(iii)计算在进程(ii)中获得的P个比较值的平均值或中央值]，以及 [进程(iv)从在进程(iii)中获得的平均值或中央值设定指定的数值范围，并且比较 P个比较值中的每个是否超过所述指定的数值]。
12.—种诊断源于基因突变的疾病的方法，所述方法使用根据权利要求1至9中任一项的分析核酸突变的方法。
全文摘要
本发明提供了使用阵列比较基因组杂交技术分析核酸突变的方法，所述方法减少了假阳性和假阴性并且改善了分析结果的可靠性。使用阵列比较基因组杂交技术分析核酸突变的方法包括[步骤(a)使多个标记的样品核酸逐个与多个相同的探针核酸组接触以实现杂交]，[步骤(b)获得已经杂交到样点X1至Xn的每个样点中的样品核酸的标记强度F1至Fn，所述样点已经杂交有相同的探针核酸]，[步骤(c)确定从F1与F2的比较值至F1与Fn的比较值的n-1个比较值中的每个是否落入指定的数值范围]，以及[步骤(d)比较已经确定为未落入指定的数值范围内的比较值的数目是否超过指定数目并且，在超过指定数目的情况中，判断样点X1为阳性]。n是3以上的整数。
文档编号C12N15/09GK102482719SQ20108004021
公开日2012年5月30日 申请日期2010年9月9日 优先权日2009年9月10日
发明者仓光昌之, 岩木义英, 氏原大 申请人:富士胶片株式会社