专利名称：用于改进重组蛋白表达的方法
技术领域：
本发明借助于增加载体上的选择压力，从而增加载体相关的异源蛋白表达，在真核细胞中的重组蛋白表达领域中具有实际应用。
背景技术：
在重组蛋白产生领域中，增加转染基因的表达是细胞系发育期间的基本首要工作。改进转录、翻译、蛋白质折叠和分泌是增加异源蛋白效价的密集研究的所有目标。无论过去所用方法如何，本领域中需要提供增加所需蛋白的产率的较好的用于重组蛋白产生的方法。
发明内容
一方面，本发明提供一种用于增加宿主细胞中的异源蛋白表达的方法，所述方法包括以下步骤在允许蛋白表达的条件下培养包含编码所述异源蛋白的第一异源多核苷酸序列的宿主细胞，所述第一多核苷酸在载体上编码，所述宿主细胞进一步包含具有针对选择标记蛋白的蛋白编码序列的第二多核苷酸序列，所述第二多核苷酸与编码所述选择标记蛋白的野生型多核苷酸相比具有序列修饰，所述序列修饰降低由所述第二多核苷酸编码的mRNA的翻译效率，具有所述序列修饰的所述第二多核苷酸和所述野生型多核苷酸编码针对所述选择标记蛋白的相同氨基酸序列。一方面，所述第一多核苷酸和所述第二多核苷酸在单个载体中，且在这方面的一个实施方案中，所述第一多核苷酸和第二多核苷酸各自受不同启动子的转录控制。在其它方面，所述第一多核苷酸和所述第二多核苷酸在独立载体中。另一方面，所述第一多核苷酸和第二多核苷酸受相同启动子的转录控制。在所述方法的一个实施方案中，所述修饰在编码所述选择标记蛋白的第二多核苷酸的非翻译区中，且在某些方面，所述修饰在5'非翻译区中和/或所述修饰在3'非翻译区中。在所述方法的另一实施方案中，所述修饰在编码所述选择标记蛋白的基因的蛋白编码区中。一方面，所述修饰在针对选择标记基因编码序列的蛋白编码区的起始密码子的25、20、15、10或5个密码子中。在所述方法的另一方面，第二多核苷酸序列中的蛋白编码序列包含至少一个被修饰的密码子，所述密码子并非编码所述选择标记蛋白的野生型多核苷酸中的野生型密码子，所述被修饰的密码子作为密码子，并非是针对所述宿主细胞编码的所述氨基酸的偏好密码子。一方面，第二多核苷酸序列中的蛋白编码序列包含至少一个被修饰的密码子，所述密码子并非编码所述选择标记蛋白的野生型多核苷酸中的野生型密码子，所述被修饰的密码子作为密码子，是针对所述宿主细胞编码的所述氨基酸的最不偏好密码子。
在所述方法的另一方面，第二多核苷酸序列中的蛋白编码序列包含至少一个被修饰的密码子，所述密码子并非编码所述选择标记蛋白的野生型多核苷酸中的野生型密码子，且所述修饰在所述mRNA的二级结构中引入了降低所述mRNA的翻译效率的变化。在所述方法的一个实施方案中，第二多核苷酸序列中的蛋白编码序列包含至少一个被修饰的密码子，所述密码子并非编码所述选择标记蛋白的野生型多核苷酸中的野生型密码子，且所述修饰增加mRNA中的密码子配对。在所述方法的另一实施方案中，第二多核苷酸序列中的蛋白编码序列包含至少一个被修饰的密码子，所述密码子并非编码所述选择标记蛋白的野生型多核苷酸中的野生型密码子，且所述修饰改变mRNA的G+C含量。在多个方面，所述修饰增加mRNA的G+C含量，且在多个方面，G+C含量增加1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、
14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、
39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、 71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99 或 100%。在其它方面，G+C 含量增加超过 100%。在所述方法的另一方面，第二多核苷酸序列中的蛋白编码序列包含至少一个被修饰的密码子，所述密码子并非编码所述选择标记蛋白的野生型多核苷酸中的野生型密码子，且所述修饰可改变mRNA的A+T含量。在一个实施方案中，所述修饰降低mRNA的A+T含量，且在某些方面，A+T 含量降低 1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、
20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99 或 100%。在所述方法的其它方面，在编码所述选择标记蛋白的第二多核苷酸蛋白编码序列中至少1%、至少2%、至少3%、至少4%、至少5%、至少6%、至少7%、至少8%、至少9%、至少10%、至少11%、至少12%、至少13%、至少14%、至少15%、至少16%、至少17%、至少18%、至少19%、至少20%、至少21%、至少22%、至少23%、至少24%、至少25%、至少26%、至少27%、至少28%、至少29%、至少30%、至少31%、至少32%、至少33%、至少34%、至少35%、至少36%、至少37%、至少38%、至少39%、至少40%、至少41%、至少42%、至少43%、至少44%、至少45%、至少46%、至少47%、至少48%、至少49%、至少50%、至少51%、至少52%、至少53%、至少54%、至少55%、至少56%、至少57%、至少58%、至少59%、至少60%、至少61%、至少62%、至少63%、至少64%、至少65%、至少66%、至少67%、至少68%、至少69%、至少70%、至少71%、至少72%、至少73%、至少74%、至少75%、至少76%、至少77%、至少78%、至少79%、至少80%、至少81%、至少82%、至少83%、至少84%、至少85%、至少86%、至少87%、至少88%、至少89%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%的密码子为被修饰的密码子。在所述方法的其它方面，选择标记蛋白是选自由以下组成的组新霉素磷酸转移酶(npt II)、潮霉素磷酸转移酶(hpt)、二氢叶酸还原酶(dhfr)、硫酸博来霉素(zeocin)、腐草霉素(phleomycin)、博来霉素抗性基因ble、庆大霉素乙酰基转移酶、链霉素磷酸转移酶、乙酰乳酸合酶突变形式(als)、溴苯腈水解酶、草胺膦乙酰基转移酶(bar)、烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸(EPSP)合酶(aro A)、肌肉特异性酪氨酸激酶受体分子(MuSK-R)、铜锌超氧化物岐化酶(sodl)、金属硫蛋白(cupl，MTl)、^ -内酰胺酶(BLA)、嘌呤霉素N-乙酰基-转移酶(pac)、杀稻瘟菌素乙酰基转移酶(bis)、杀稻瘟菌素脱氨酶(bsr)、组氨醇脱氢酶(HDH)、N-琥珀酰-5-氨基咪唑-4-甲酰胺核苷酸(SAICAR)合成酶(adel)、精氨基琥珀酸裂解酶(arg4)、￠-异丙基苹果酸脱氢酶(leu2)、转化酶(suc2)、乳清酸核苷-5’ -磷酸(OMP)脱羧酶(ura3)和这些标记蛋白中任一者的直系同源物。在所述方法的多个实施方案中，宿主细胞是真核细胞，宿主细胞是哺乳动物细胞，宿主细胞是人细胞，宿主细胞是中国仓鼠细胞，宿主细胞是中国仓鼠卵巢细胞，宿主细胞是酵母细胞，宿主细胞是酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)细胞,宿主细胞是毕赤酵母(Pichia pastoris)细胞,宿主细胞是原核细胞,宿主细胞是大肠杆菌(Escherichia coli)细胞，宿主细胞是昆虫细胞，宿主细胞是草地贪夜蛾(Spodoptera frugiperda)细胞,宿主细胞是植物细胞，或宿主细胞是真菌细胞。 在所述方法的一方面，表达载体是(中国仓鼠延伸因子I(CHEFl)表达载体。另一方面，所述方法利用包含图2中展不的多核苷酸的第二多核苷酸,且在一个实施方案中,所述第二多核苷酸在(中国仓鼠延伸因子I (CHEFl)表达载体中包含图2中展示的多核苷酸。
图IA为编码DHFR的多核苷酸且图IB为与小家鼠(Mus musculus) cDNABC005796相同的用于密码子去优化的DHFR多肽序列。图2显示密码子去优化的DHFR序列(称为弱化(cr)和最差(wst))的DNA序列。图3显示与野生型(wt)序列对准的去优化的DHFR(最差的，wst和弱化的，cr)。指示了核苷酸变化(*)，包括仓鼠最不偏好密码子(参见表4)和新的串联密码子对(以粗体表示；参见表5)。简并符号为B(C或G或T)、D(A或G或T)、H(A或C或T)、V(A或C或G)。图4显示具有野生型(WT)DHFR的CHEFl表达载体pDEF38。密码子去优化的DHFR置换WT DHFR来制备pDEF81 (弱化DHFR)和pDEF82 (最差DHFR)。报告基因FIGI克隆至IjXhoI-XbaI 克隆位点中以制备 pDEF38: FIGI、pDEF81: FIGI 和 pDEF82: FIGI0图5显示使用密码子去优化的DHFR使得蛋白表达增加。CHO细胞用共表达目标蛋白(FIGI)的野生型(wt)和密码子去优化的(弱化，pDEF81:FIGI和最差，pDEF82:FIGI)DHFR来转染。由蛋白A HPLC测定并以U g/ml报告的效价值是两次独立转染的平均值，每次转染重复测量三次(总共6次产生测定)。结果指示密码子去优化的DHFR的所选转染池的表达效价相对于野生型DHFR池具有明显改进。图6展示转染池分批补料产生模型在密码子去优化的细胞系中提供改进的产生率。这一实验是在50ml离心管中用汇集的转染子进行12天；野生型(pDEF38:FIGI，蓝色)和密码子去优化的(pDEF81:FIGI，紫色和pDEF82:FIGI，粉红色)DHFR共表达目标蛋白FIGI。两个转染池(A和B)重复进行两次。密码子去优化的池显示比野生型样品大的产生率。图7显示密码子去优化的DHFR的所选细胞的DHFR降低和目标蛋白表达增加。CHO细胞用共表达目标蛋白FIGI的野生型(T462)和密码子去优化的(pDEF81:FIGI，T463和pDEF82:FIGI，T464)DHFR来转染。转染池用荧光甲氨蝶呤(F-MTX)染色以检测DHFR，并用荧光标记的抗体染色以识别FIGI (RPE)。染色的细胞通过在FACSCalibur上进行的流式细胞术来分析。图7A显示来自每次转染的10，OOO个个别细胞的双重染色FACS概况，对合并的DHFR (F-MTX)和FIGI (RPE = FIGI)表达绘图。图7B显示来自两个10，000个细胞的群体的对每次转染取平均值所得到的平均F-MTX(DHFR)和RPE荧光强度。这些结果指示，与野生型细胞相比时，两个密码子去优化的DHFR池的DHFR都降低并且FIGI产生都增加。图8展示密码子去优化 的DHFR克隆的DHFR降低并且目标蛋白表达增加。CHO细胞转染池(野生型T462、弱化T463和最差T464)通过限制性稀释来克隆，并且每次转染扩增23个确认的单克隆细胞系。克隆细胞用荧光甲氨蝶呤(DHFR RFU)染色以检测DHFR，并用RPE标记的抗FIGI荧光抗体(FIGI RFU)染色。来自每个克隆群体的总共10，000个染色的细胞通过在FACSCalibur上进行的流式细胞术来分析。图8A显示F-MTX染色的细胞的平均荧光。每个数据点是个别克隆。克隆按从低到高的平均荧光排序。图SB显示RPE染色的细胞的平均荧光。每个数据点是个别克隆。克隆按从低到高的平均荧光排序。图9显示与野生型克隆相比，密码子去优化的克隆具有改进的产生率。克隆效价通过对在第8天从6孔产生模型采集的上清液进行蛋白A HPLC来测定。克隆按从高到低的效价排序。与野生型DHFR克隆(pDEF38:FIGI)相比，密码子去优化的克隆pDEF81 :FIGI和pDEF82:FIGI显示较大的FIGI产生率。
具体实施例方式本发明提供一种新的产生表达载体的方法和其用途，它们改进重组蛋白产率。本发明的载体允许增加宿主细胞中目标基因(GOI)的表达和降低共转化的选择标记的翻译效率，从而增加选择严格度。选择标记用于转染实验中以补足宿主细胞蛋白缺陷或对另外的毒性剂赋予抗性，从而选择目标共转化基因的存在(表达)。设计提供选择标记蛋白的降低的翻译效率的载体，使得编码所述选择标记蛋白的多核苷酸关于一个或多个参数“去优化”。所提供载体在实践用于增强重组蛋白表达的材料和方法中的使用是违反直觉的。实际上，改进的蛋白表达通常受“优化”编码目标蛋白的多核苷酸的作用，从而增加翻译效率和蛋白表达。通过延伸，将以相同方式优化针对选择标记基因的蛋白编码区。然而，本文中意外地显示修饰编码选择标记基因序列的多核苷酸使其不优选用于翻译(与在目标基因中进行类似变化无关)，允许分离用编码GOI的多核苷酸和编码选择标记的多核苷酸转化或转染的宿主细胞，其中由GOI编码的蛋白以意外的较高水平表达。因此，本文关于多核苷酸所用的术语“去优化”意指多核苷酸已以某一方式被修饰，使得由所述多核苷酸编码的蛋白的翻译不优选用于已经引入所述多核苷酸的宿主细胞。多核苷酸以多种方式去优化，且本发明不受本文所示例的方法限制。用于密码子优化的方法已经由他人描述(Itakura 1987, Kotula 1991, Holler1993, Seed 1998)。然而，关于密码子去优化效用的实例很有限。一个这种实例是将病毒基因去优化以通过并入最不偏好密码子或非随机化密码子对来降低复制适应性(Burns2006, Mueller 2006, Coleman2008, Kew 2008)。本文描述了通过并入物种特异性最不偏好密码子和串联密码子对来降低用于宿主细胞的dhfr基因的翻译效率的方法考虑。所提供的方法通常可适用于针对物种特异性宿主来去优化编码任何选择标记的多核苷酸中的密码子。不受任何特定作用机制的限制，减少选择标记的翻译可导致经由除翻译外的替代路径的同种蛋白质产生的补偿性增加，例如但不限于增加的转录或分泌，以使得具有无效基因的细胞能够存活。因此，能够克服标记基因的无活力并因此存活的宿主细胞也可以增加的速率表达G0I。不考虑精确的机制，本文意外地显示与传统认知相反，以降低翻译效率的方式修饰选择标记基因的多核苷酸序列由于某种原因增加共转化的编码GOI的基因的表达。本发明的载体和方法可与提供阳性选择的任何选择标记基因一起使用。示例性选择标记包括但不限于抗生素抗性基因编码的新霉素磷酸转移酶(npt II)、潮霉素磷酸转移酶(hpt)、二氢叶酸还原酶(dhfr)、硫酸博来霉素、腐草霉素、博来霉素抗性基因ble (未知 酶)、庆大霉素乙酰基转移酶、链霉素磷酸转移酶、乙酰乳酸合酶突变形式(als)、溴苯腈水解酶、草胺膦乙酰基转移酶(bar)、烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸(EPSP)酶(aro A)、肌肉特异性酪氨酸激酶受体分子(MuSK-R)、铜锌超氧化物岐化酶(sodl)、金属硫蛋白(cupl, MTl)、
内酰胺酶(BLA)、嘌呤霉素N-乙酰基-转移酶(pac)、杀稻瘟菌素乙酰基转移酶(bis)、杀稻瘟菌素脱氨酶(bsr)、组氨醇脱氢酶(HDH)、N_琥珀酰-5-氨基咪唑-4-甲酰胺核苷酸(SAICAR)合成酶(adel)、精氨基琥拍酸裂解酶(arg4)、P _异丙基苹果酸脱氢酶(leu2)、转化酶(suc2)和乳清酸核苷_5’ -磷酸(OMP)脱羧酶(ura3)。本领域中众所周知的是，遗传密码陈述的密码子指导在所翻译的多肽中添加特定氨基酸。本领域中也众所周知的是，20种天然存在的氨基酸是由不同数目的密码子编码，这些数目对于每种氨基酸来说在I到6个不同密码子的范围变动。如本文所用，编码相同氨基酸的不同密码子被称为“同义密码子”。这些同义密码子陈述于下表I中。表I-遗传密码
权利要求
1.一种用于增加宿主细胞中异源蛋白表达的方法，所述方法包括以下步骤在允许蛋白表达的条件下培养包含编码所述异源蛋白的第一异源多核苷酸序列的所述宿主细胞，所述第一多核苷酸在载体上编码，所述宿主细胞进一步包含具有针对选择标记蛋白的蛋白编码序列的第二多核苷酸序列，所述第二多核苷酸与编码所述选择标记蛋白的野生型多核苷酸相比具有序列修饰，所述序列修饰降低由所述第二多核苷酸编码的mRNA的翻译效率，所述序列修饰、具有所述序列修饰的所述第二多核苷酸和所述野生型多核苷酸编码针对所述选择标记蛋白的相同氨基酸序列。
2.根据权利要求I所述的方法，其中所述第一多核苷酸和所述第二多核苷酸在单个载体中。
3.根据权利要求2所述的方法，其中所述第一多核苷酸和第二多核苷酸各自受不同启动子的转录控制。
4.根据权利要求2所述的方法,其中所述第一多核苷酸和第二多核苷酸各自受单个启动子的转录控制。
5.根据权利要求I所述的方法，其中所述第一多核苷酸和所述第二多核苷酸在独立载体中。
6.根据权利要求I所述的方法，其中所述修饰在编码所述选择标记蛋白的所述第二多核苷酸的非翻译区中。
7.根据权利要求6所述的方法，其中所述修饰在5'非翻译区中。
8.根据权利要求6所述的方法，其中所述修饰在3'非翻译区中。
9.根据权利要求I所述的方法，其中所述修饰在编码所述选择标记蛋白的所述基因的蛋白编码区中。
10.根据权利要求9所述的方法，其中所述修饰具有针对所述选择标记基因的所述蛋白编码区的起始密码子的25、20、15、10或5个密码子。
11.根据权利要求I所述的方法，其中所述第二多核苷酸序列中的所述蛋白编码序列包含至少一个被修饰的密码子，所述密码子并非编码所述选择标记蛋白的野生型多核苷酸中的野生型密码子，所述被修饰的密码子作为密码子，并非是针对所述宿主细胞编码的所述氨基酸的偏好密码子。
12.根据权利要求11所述的方法，其中所述第二多核苷酸序列中的所述蛋白编码序列 含至少一个被修饰的密码子，所述密码子并非编码所述选择标记蛋白的野生型多核苷酸中的野生型密码子，所述被修饰的密码子作为密码子，是针对所述宿主细胞编码的所述氨基酸的最不偏好密码子。
13.根据权利要求I所述的方法，其中所述第二多核苷酸序列中的所述蛋白编码序列包含至少一个被修饰的密码子，所述密码子并非编码所述选择标记蛋白的野生型多核苷酸中的野生型密码子，且所述修饰在所述mRNA的二级结构中引入了降低所述mRNA的翻译效率的变化。
14.根据权利要求I所述的方法，其中所述第二多核苷酸序列中的所述蛋白编码序列包含至少一个被修饰的密码子，所述密码子并非编码所述选择标记蛋白的野生型多核苷酸中的野生型密码子，且所述修饰增加所述mRNA中的密码子配对。
15.根据权利要求I所述的方法，其中所述第二多核苷酸序列中的所述蛋白编码序列包含至少一个被修饰的密码子，所述密码子并非编码所述选择标记蛋白的野生型多核苷酸中的野生型密码子，且所述修饰改变所述mRNA的G+C含量。
16.根据权利要求15所述的方法，其中所述修饰增加所述mRNA的G+C含量。
17.根据权利要求16所述的方法，其中所述G+C含量被改变1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99 或 100%。
18.根据权利要求I所述的方法，其中所述第二多核苷酸序列中的所述蛋白编码序列包含至少一个被修饰的密码子，所述密码子并非编码所述选择标记蛋白的野生型多核苷酸中的野生型密码子，且所述修饰改变所述mRNA的A+T含量。
19.根据权利要求18所述的方法，其中所述修饰降低所述mRNA的A+T含量。
20.根据权利要求19所述的方法，其中所述A+T含量被改变1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99 或 100%。
21.根据权利要求11所述的方法，其中所述第二多核苷酸蛋白编码序列中的至少1%、至少2%、至少3%、至少4%、至少5%、至少6%、至少7%、至少8%、至少9%、至少10%、至少11%、至少12%、至少13%、至少14%、至少15%、至少16%、至少17%、至少18%、至少19%、至少20%、至少21%、至少22%、至少23%、至少24%、至少25%、至少26%、至少27%、至少28%、至少29%、至少30%、至少31%、至少32%、至少33%、至少34%、至少35%、至少36%、至少37%、至少38%、至少39%、至少40%、至少41%、至少42%、至少43%、至少44%、至少45%、至少46%、至少47%、至少48%、至少49%、至少50%、至少51%、至少52%、至少53%、至少54%、至少55%、至少56%、至少57%、至少58%、至少59%、至少60%、至少61%、至少62%、至少63%、至少64%、至少65%、至少66%、至少67%、至少68%、至少69%、至少70%、至少71%、至少72%、至少73%、至少74%、至少75%、至少76%、至少77%、至少78%、至少79%、至少80%、至少81%、至少82%、至少83%、至少84%、至少85%、至少86%、至少87%、至少88%、至少89%、至少90%、至少91 %、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%的密码子是被修饰的密码子。
22.根据权利要求I所述的方法，其中所述选择标记蛋白是选自由以下组成的组新霉素磷酸转移酶(npt II)、潮霉素磷酸转移酶(hpt)、二氢叶酸还原酶(dhfr)、硫酸博来霉素、腐草霉素、博来霉素抗性基因ble (未知酶)、庆大霉素乙酰基转移酶、链霉素磷酸转移酶、乙酰乳酸合酶突变形式(als)、溴苯腈水解酶、草胺膦乙酰基转移酶(bar)、烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸(EPSP)合酶(aro A)、肌肉特异性酪氨酸激酶受体分子(MuSK-R)、铜锌超氧化物岐化酶(sodl)、金属硫蛋白(cupl,MTl)、^ -内酰胺酶(BLA)、嘌呤霉素N-乙酰基-转移酶(pac)、杀稻瘟菌素乙酰基转移酶(bis)、杀稻瘟菌素脱氨酶(bsr)、组氨醇脱氢酶(HDH)、N-琥珀酰-5-氨基咪唑-4-甲酰胺核苷酸(SAICAR)合成酶(adel)、精氨基琥珀酸裂解酶(arg4)、0 -异丙基苹果酸脱氢酶(leu2)、转化酶(suc2)和乳清酸核苷_5’_磷酸(OMP)脱羧酶(ura3)。
23.根据权利要求I所述的方法，其中所述宿主细胞是真核细胞。
24.根据权利要求I所述的方法，其中所述宿主细胞是原核细胞。
25.根据权利要求25所述的方法，其中所述宿主细胞是大肠杆菌。
26.根据权利要求I所述的方法，其中所述宿主细胞是酵母细胞。
27.根据权利要求26所述的方法，其中所述宿主细胞是酿酒酵母。
28.根据权利要求26所述的方法，其中所述宿主细胞是毕赤酵母。
29.根据权利要求I所述的方法，其中所述宿主细胞是昆虫细胞。
30.根据权利要求29所述的方法，其中所述宿主细胞是草地贪夜蛾。
31.根据权利要求I所述的方法，其中所述宿主细胞是植物细胞。
32.根据权利要求I所述的方法，其中所述宿主细胞是原生动物细胞。
33.根据权利要求23所述的方法，其中所述宿主细胞是哺乳动物细胞。
34.根据权利要求23所述的方法，其中所述宿主细胞是人细胞。
35.根据权利要求23所述的方法，其中所述宿主细胞是中国仓鼠细胞。
36.根据权利要求35所述的方法，其中所述宿主细胞是中国仓鼠卵巢细胞。
37.根据权利要求I所述的方法，其中所述表达载体是中国仓鼠延伸因子I(CHEFl)表达载体。
38.根据权利要求I所述的方法，其中所述第二多核苷酸包含图2中展示的多核苷酸。
39.根据权利要求38所述的方法，其中所述表达载体是中国仓鼠延伸因子I(CHEFl)表达载体。
全文摘要
本发明提供允许增加重组宿主细胞中目标转染基因的表达的材料和方法。
文档编号C12P21/06GK102648285SQ201080044475
公开日2012年8月22日 申请日期2010年8月6日 优先权日2009年8月6日
发明者豪尔·罗伯特·葛莱罕·克拉克 申请人:Cmc依科斯生技制品公司