专利名称：借助于基于血浆的参比物质测定因子xiii的方法
借助于基于血浆的参比物质测定因子Xl 11的方法本发明属于体外诊断领域，并涉及借助于基于血浆的参比物质测定血液凝固因子 XIII (因子XIII、F XIII)的方法和用于进行所述方法的检验试剂盒。因子XIII是血液凝固因子，其作用于血液凝固级联的末端，并对永久性伤口闭合起重要作用。在血液凝固的最后阶段中，即纤维蛋白形成，凝血酶切割纤维蛋白原。以此方式形成的纤维蛋白单体自发地聚集成长纤维，最终形成可溶性纤维蛋白聚合物的致密分支网络。因子XIII也被凝血酶活化，由此形成因子xilla。因子XIIIa会造成纤维蛋白聚合物的交联，由此纤维蛋白凝块变得在机械上更稳定，可变形性更低，且更耐受纤溶酶的溶解。先天性的或后天获得性的因子XIII缺乏可能导致出血倾向、伤口愈合紊乱以及导致流产。由于它的临床重要性，测定因子XIII用以排除或证实因子XIII缺乏，是凝固诊断的一个重要组成部分。因子XIIIa (无催化活性的酶原因子XIII的活化形式)是一种转谷氨酰胺酶，其通过纤维蛋白分子的赖氨酰基和谷氨酰基氨基酸侧链之间的分子间酰胺键的形成，催化纤维蛋白聚合物的三维交联。在该反应中生成的氨(NH3)或铵离子(NH4+)被释放出来。在下文中，为了简便起见，术语氨用于表示氨和铵离子。氨形成现象在不同的测试试验中被用于测定因子XIII
Muszbek, L.等人[Clin. Chem. (1985) 31(1)，35-40]描述了用于测定去纤维蛋白化的血浆样品中的因子XIII的方法，其中样品的因子XIII被凝血酶活化成因子Xllla。 此外，将样品与β-酪蛋白和乙胺混合，所述β-酪蛋白和乙胺用作通过因子XIIIa形成分子间酰胺键的底物。为了定量地检测在该反应中释放出的氨，另外将样品与NADPH (还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸)和与NADPH-依赖性的指示剂反应的组分(即谷氨酸脱氢酶 (GLDH)和α-酮戊二酸)混合。在氨存在下，GLDH将α -酮戊二酸转化成谷氨酸。该反应额外地消耗NADPH，并形成NADP+ (烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸)，即NADPH的氧化形式。 NADP+具有不同于NADPH的吸收光谱，所以实验批料的吸收(消光度或光密度)与NADPH的消耗成比例地变化，并因而与氨的量成比例地变化，并因而与因子XIII的量或活性成比例地变化。或者，在该实验批料中，可以使用NADH替代NADPH。与NADP+不同，NADPH除了具有在约沈0 nm的最大吸收以外，还具有在约340 nm的最大吸收。最大吸收的确切位置通常取决于多种参数，尤其是溶液的介电常数和PH。一般而言，NADPH的最大吸收位于335-345 nm的范围。因此，通常在约340士5 nm的波长处测量实验批料的吸收的变化，使得定量测定样品中的因子XIII成为可能。EP 336 353 A2 或 Fickenscher 等人(Thromb Haemost. 1991，65(5) 535—40) 描述了一种类似的方法，用这种方法通过释放的氨来定量因子XIII。EP 336 353 A2描述了一种测定没有预处理的含有纤维蛋白的血浆样品中的因子XIII的方法。为了阻止反应批料中干扰性纤维蛋白凝块的形成，另外将样品与纤维蛋白聚集抑制剂混合。在Ca2+离子存在下，样品的因子XIII被凝血酶活化成因子Xllla。此外，将样品与合成的含有谷氨酰胺的肽和甘氨酸乙基酯相混合，所述肽和甘氨酸乙基酯用作通过因子XIIIa形成分子间酰胺键的底物。为了定量地检测在该反应中释放出的氨，另外将样品与NADH (还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸)和与NADH-依赖性的指示剂反应的组分(即与谷氨酸脱氢酶(GLDH)和 α-酮戊二酸)混合。在氨存在下，GLDH将α-酮戊二酸转化成谷氨酸。该反应额外地消耗 NADH,并形成NAD+，即NADH的氧化形式。NAD+具有不同于NADH的吸收光谱，所以实验批料的吸收与NADH的消耗成比例地变化，并因而与氨的量成比例地变化，并因而与因子XIII的酶活性成比例地变化，并因而与因子XIII的量成比例地变化。或者，在该实验批料中可以使用NADPH替代NADH。通过测量实验批料在340 nm波长处的吸收的变化使得定量测定样品中的因子XIII成为可能。一种基于在EP 336 353 A2中所述的实验原理的商业实验是 Siemens Healthcare Diagnostics 的 Berichrom F XIII 实验。为了简便，当表述涉及NADH的磷酸化和未磷酸化形式时，即当同样提到NADH和 NADPH时，使用术语NAD (P) H。当表述涉及处于氧化状态的NADH的磷酸化和未磷酸化形式时，即当同样提到NAD+和NADP+时，使用术语NAD⑵+。在所述的实验方法中，也能使用NADH或NADPH的类似物(所谓的NAD (P) H类似物) 替代NADH或NADPH。这样的类似物优选是位于350 nm之上具有最大吸收的类似物。一种类似物是模仿生理物质的生物作用的物质，即在该情况下，例如，与NAD (P) +或NAD (P) H类似能起协同底物的作用的物质。这必须是这样的类似物，在这种物质中氧化形式和还原形式具有不同的最大吸收，其中NAD(P)H类似物的最大吸收位于超过350 nm。优选使用其中烟酰胺基团被替代成其它基团的结构类似物。在这里，优选环状化合物，尤其是杂环化合物，以非常特别的方式优选吡啶类似物，即，例如，3-乙酰基吡啶、3-(甲)醛吡啶、硫代烟酰胺、硒代烟酰胺等。现有技术的上述方法和基于检测实验批料中的氨形成的测定因子XIII活性的其它方法具有下述缺点，即在具有低因子XIII浓度的样品中，测量的因子XIII活性经常过高。甚至已经发现，在具有严重的获得性(erworbene)因子XIII缺乏的患者的血浆样品(在此样品中不能通过免疫学方法和其它方法检测到因子XIII)中，BeriChrom F XIII实验检测出 8-14% 的因子 XIII 活性(Lim, W.等人，J Thromb Haemost 2004; 2: 1017-1019)。 但是恰恰在具有低因子XIII浓度的样品中，因子XIII活性的正确测定是用因子XIII浓缩物最好可能地治疗患者的基本前提条件。错误地过高测定因子XIII活性的原因不明。作为可能的原因，讨论了独立于因子XIIIa的NADH或NADPH消耗，其可能由酶(其存在于来自患者的样品中，并利用NADH或 NADPH作为辅因子)引起，或由来自患者的样品中氨的非特异性形成引起，这也会导致独立于因子XIIIa 的 NADH或NADPH消耗(Ajzner, E和Muszbek, L. ； J Thromb Haemost 2004; 2: 2075-2077)。为了解决错误地过高测定因子XIII活性的问题，Ajzner & Muszbek提议，在一个平行批料中，将来自患者的样品的第二等分试样与碘乙酰胺相混合，并测定因子 XIII活性。碘乙酰胺抑制活化的因子XIII的转谷氨酰胺酶活性。在该平行批料中测量的吸光度的变化与独立于因子XIIIa的NADH或NADPH消耗相对应，然后可以从未用碘乙酰胺处理的常规实验批料中测得的活性减去该值。以此方式，可校正在常规实验批料中测量的因子XIII活性。但是，这种校正因子XIII活性的方法具有下述缺点，即来自患者的每个样品必须测量2次，一次不使用碘乙酰胺，一次使用碘乙酰胺。这样的方案不仅使测试总量 (Testaufkommen)倍增，而且使因子XIII测定的成本倍增。此外，尚不清楚碘乙酰胺的使用是否适合在凝固分析仪中的常规使用。因此，本发明的目的是，提供用于测定因子XIII的装置和方法，它们可以正确测定因子XIII，特别是在具有低因子XIII浓度或活性的血浆样品中正确测定因子XIII，不需要测量平行批料。该目的通过仅使用血浆作为对于小于基准的100%的因子XIII活性的参比物质得以实现。在已知的测定血浆样品中的因子XIII的方法中，使用的参比物质通常是正常血浆库，例如来自通常至少20个明显健康的供体的血浆。该正常血浆的因子XIII活性被定义为100%或基准(Norm)，或将它与国际参照血浆的因子XIII活性相对比，由此可以赋予正常血浆因子XIII活性值。为了提供具有更低因子XIII活性(< 100%)的参比，制备该正常血浆的稀释液。作为稀释剂通常使用水溶液，例如，0.9%的NaCl溶液。例如，将一份正常血浆与2份合适的缓冲液相混合(1:2稀释)，并定义为具有基准的33. 33%的因子XIII活性的参比。通过借助于待标准化的因子XIII实验测量正常血浆和一系列正常血浆的稀释液，通过将界定的因子XIII活性(例如以基准的％为单位)分配给测量的原始值的方法， 作出参照曲线(校正曲线)。然后可以在标准化的实验系统中测量患者样品的原始值，并最后借助于参照曲线，换算成例如以基准的％为单位的校准值或标准化的实验结果。已经发现，通过使用仅由血浆组成的用于因子XIII活性的基准值(100%)和用于低于基准值(< 100%)的因子XIII活性的参比，得到参照曲线，借助于这样的方法在所述方法中，根据实验批料中NAD(P)H的消耗，测量活化的因子XIIIa的转谷氨酰胺酶活性，其可以正确测定因子XIII，特别是在具有低因子XIII浓度或活性的血浆样品中的因子XIII。本发明提供定量测定血浆样品中的因子XIII的方法，其中借助于实验批料中 NAD(P)H的氧化性消耗，测量活化的因子XIIIa的转谷氨酰胺酶活性，且其中将得到的测量值与借助于参比物质测定的参照值相对比，其中至少与基准相比具有降低的因子XIII活性的参比物质由血浆组成。定量测定血浆样品中的因子XIII的方法，在此方法中借助于实验批料中NAD(P) H的氧化性消耗测量活化的因子XIIIa的转谷氨酰胺酶活性，所述方法应当理解为是指，例如，这样的方法，其中将血浆样品与下述物质混合
I.用于将因子XIII活化成因子XIIIa的物质或物质混合物，
II.具有至少一个谷氨酰基的因子XIIIa的受体底物，
III.因子XIIIa的氨基供体底物，
IV.NAD (P) H 或 NAD (P) H 类似物，
V.在氨存在下能够将NAD (P) H氧化成NADP+的试剂， 并测量实验批料的吸收的变化。尤其适合将因子XIII活化成因子XIIIa的物质是凝血酶，例如人或牛来源的凝血酶，或重组制得的凝血酶，优选地在钙离子存在下。同样合适的是物质或物质混合物，例如， 因子Xa，蛇毒液蛇静脉酶(Ecarin)，或组织因子、磷脂和Ca2+离子的混合物，它们如下实现因子XIII的间接活化通过将样品中存在的凝血酶原直接地或间接地活化成凝血酶，所述凝血酶然后又活化因子XIII。术语“具有至少一个谷氨酰基的因子XIIIa的受体底物”应当理解为是指，具有至少一个谷氨酰基(例如来自氨基酸谷氨酰胺)的多肽或肽模仿物。已知的因子XIIIa的受体底物是，例如，β-酪蛋白和大量合成肽。合适的合成肽描述在例如EP 314 023 Α2中。术语“因子XIIIa的氨基供体底物”应当特别理解为是指伯胺。优选的伯胺是乙醇胺、腐胺、尸胺、二氨基乙烷、氨基乙烷。特别优选的伯胺是甘氨酸乙基酯或甘氨酸甲基酯。术语“NADH”是化合物还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸的缩写。在本发明范围内 NADH消耗应当理解为是指，NADH氧化成NAD+ (烟酰胺腺嘌呤二核苷酸)。术语“NADH”应当被广义地理解，且也包括下述NADH类似物，它们可以以与NADH类似的方式氧化，且它们当处于氧化形式时，同样具有与它们的还原形式不同的光学性质，所以它们的消耗可以通过光度测定法来测出=NADPH (还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸，可氧化成NADP+)、硫代-NADH (还原型硫代烟酰胺腺嘌呤二核苷酸，可氧化成硫代-NAD+)、硫代-NADPH (还原型硫代烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸，可氧化成硫代-NADP+)、硒代-NADH (还原型硒代烟酰胺腺嘌呤二核苷酸，可氧化成硒代-NAD+)和硒代-NADPH (还原型硒代烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸，可氧化成硒代-NADP+)。当使用NADH或NADPH时，在约340 nm的波长处， 测量由于氧化成NAD+或NADP+引起的吸光度的变化。当使用硫代-NADH、硫代-NADPHJB 代-NADH或硒代-NADPH时，在约340 nm至约430 nm的波长处，测量由于氧化成硫代-NAD+、 硫代-NADP+、硒代-NAD+或硒代-NADP+引起的吸光度的变化。“在氨存在下能够将NADH氧化成NAD+的试剂”优选地是酶/底物系统，其包括酶和所述酶的底物，其中所述酶催化影响底物，并从而在氨存在下将NADH氧化成NAD+或上面提及的NADH类似物。合适的酶/底物系统是，例如，谷氨酸脱氢酶/酮戊二酸系统或丙氨酸脱氢酶/丙酮酸系统或丝氨酸-2-脱氢酶/3-羟基丙酮酸系统或缬氨酸脱氢酶/3-甲基-2-氧代丁酸系统或亮氨酸脱氢酶/4-甲基-2-氧代戊酸系统或甘氨酸脱氢酶/乙醛酸系统或赖氨酸脱氢酶/1，2- 二脱氢哌啶-2-羧酸系统或苯丙氨酸/苯基丙酮酸系统或天冬氨酸脱氢酶/草酰乙酸系统或葡萄糖-6-磷酸脱氢酶/D-葡糖酸-1，5-内酯-6-磷酸系统。在根据本发明的方法的一个优选的实施方案中，另外将血浆样品与纤维蛋白聚集抑制剂相混合。纤维蛋白聚集抑制剂是阻止凝血酶诱导的纤维蛋白单体的聚集的物质。以此方式，阻止含有纤维蛋白原的样品中的纤维蛋白凝块形成，否则所述纤维蛋白凝块会不利地影响实验批料的吸收测量。优选的纤维蛋白聚集抑制剂是合成的肽，例如，序列 Gly-Pro-Arg-Pro的肽(可作为Pefabloc FG商购可得，Pentapharm,瑞士)。可以用作纤维蛋白聚集抑制剂的其它优选肽，尤其是序列Gly-Pro-Arg-Pro-Ala的优选的肽，描述在 EP 456 152 A2 中。在另一个实施方案中，另外将样品与肝素中和物质(例如海美溴铵(也称作聚凝胺 ))相混合，以消除肝素的凝血酶抑制作用，所述肝素可能存在于例如接受肝素治疗的患者的样品中。与样品混合以得到实验批料的组分I-V，可以各自单独地，即以单一试剂的形式， 且依次地与样品混合；但是，它们也可以合并在单一试剂中，所述试剂在一个单个的移液步骤中与样品相混合。所述一种或多种试剂优选地包括缓冲液基质，在所述缓冲液基质中溶解了所述物质。合适的缓冲液基质含有例如HEPES、N，N-二(2-羟乙基)甘氨酸、NaCl、白蛋白和/或防腐剂例如叠氮化钠，和它优选地具有6. 0-9. 0的pH值，特别优选6. 5-8. 5的 PH值。因为F XIII的活化需要钙离子，缓冲液基质另外包含钙盐，优选氯化钙。所述一种或多种试剂与样品的混合，可以手工地进行，或使用自动凝固测量仪进行。如果在根据本发明的方法中使用谷氨酸脱氢酶/酮戊二酸系统作为在氨存在下能够将NADH氧化成NAD的试剂，则如此选择加入实验批料的谷氨酸脱氢酶的量，使得在实验批料中的终浓度是10 - 500 IU/ml，优选40 - 240 IU/ml。含有纤维蛋白原的血浆特别适合作为样品材料。但是，根据根据本发明的方法也可以测定去纤维蛋白化的血浆中的因子XIII。在光度计辅助下，测量实验批料的吸收的变化(ΔΑ)，所述光度计包括光源(其发射光束穿过要测量的实验批料)和检测器(其测量穿过的光的强度，并将它转化成电信号)。分别根据是否使用NADH或NADPH或硫代-NADH、硫代-NADPH、硒代-NADH或硒代-NADPH，使用约340 nm至约430 nm的波长的光，测量吸收的变化。单位时间改变的吸收与因子XIII活性相关联。由于NADH或NADH类似物的消耗，实验批料的吸收(A)的降低特别在反应动力学的线性范围内与因子XIII活性成正比。测定的血浆样品的测量值最初是原始值，然后将该值与借助于参比物质测定的参照值相对比。在本发明范围内，参比物质应当理解为已知其因子XIII浓度或活性的材料。根据本发明，至少与基准相比具有降低的因子XIII活性(< 基准的100%)的参比物质由血浆组成。术语“血浆”应当理解为是指，一个或多个供体(优选人供体)的血液的液体无细胞部分，其如通常在凝固分析中一样，通过从抗凝血的全血去除细胞性的血液组分获得。为了阻止全血样品中的血液凝固，将每个血液样品(经常在抽血过程中已经)与抗凝血剂相混合，优选与柠檬酸钠溶液相混合。其它常用的抗凝血剂是肝素钠、肝素锂、EDTA或柠檬酸盐磷酸盐葡萄糖(CPD)。因而，每份血浆必然包含一定体积份额的抗凝血剂。多个明显健康的供体的血浆的混合物(血浆库)被称作正常血浆。通过定义，正常血浆具有因子XIII浓度，并因而具有100%的因子XIII活性。因子XIII-缺乏型血浆是这样的血浆其不具有正常因子XIII活性，或至少不超过正常因子XIII活性的1%。因子 XIII-缺乏型血浆可以例如从具有相应表型的患者得到，或借助于特异性抗体通过从正常血浆选择性地免疫吸附因子XIII得到。为了完整起见，应当指出，不同的正常血浆的实际因子XIII活性随生产商、批次、填装等而变化。通过与F XIII的国际标准血浆进行对比来测定正常血浆的实际因子XIII活性。正常血浆的实际因子XIII活性通常在国际标准血浆的80%至120%之间。与基准相比因子XIII活性降低的根据本发明的参比物质，可以由正常血浆和因子XIII-缺乏型血浆的混合物组成。为此，以使得到的混合物具有希望的因子XIII活性的份数，将正常血浆与因子XIII-缺乏型血浆相混合。例如，如果将1份正常血浆与2份因子XIII-缺乏型血浆相混合(1:2稀释)，得到具有基准的33. 33%的因子XIII活性的参比物质。与基准相比具有降低的因子XIII活性的根据本发明的参比物质，可以另外由因子XIII-缺乏型血浆组成，所述血浆中已经以获得希望的因子XIII活性的量加入了纯化的 (即分离的)因子XIII。人、动物或重组制备的因子XIII是合适的。不具有因子XIII活性 (^ 1%)的根据本发明的参比物质优选地由因子XIII-缺乏型血浆组成。根据本发明，仅由血浆组成的参比物质被用于测定参照值，或用于作出低于基准值(< 100%)的因子XIII活性的参照曲线。在一个优选的实施方案中，由正常血浆组成的参比物质被用于测定与基准值(100%)相对应的因子XIII活性的参照值。在一个同样优选的实施方案中，使用由正常血浆组成的参比物质(其中已经以获得希望的高于基准值的因子XIII活性的量加入了分离的因子XIII)来测定参照值或作出高于基准值(> 100%)的因子XIII活性的参照曲线。本发明另外提供了因子XIII-缺乏型血浆用于制备参比物质的用途，所述参比物质适用于执行定量测定因子XIII的方法。如已经描述的，因子XIII-缺乏型血浆可以用作正常血浆的稀释介质，从而这样制备参比物质，所述参比物质由血浆组成，且具有低于基准值(< 100%)的因子XIII活性。但是，因子XIII-缺乏型血浆也可以用作基质，所述基质中以如此的的量加入纯化的(即分离的)因子XIII，以形成具有低于或高于基准值的希望的因子XIII活性的参比物质。本发明另外提供了一种参比物质，其具有与基准相比减小(< 100%)的因子XIII 活性，且由正常血浆和因子XIII-缺乏型血浆的混合物组成，或由以如此的量加入纯化的 (即分离的)因子XIII的因子XIII-缺乏型血浆组成，使得它具有低于基准值的因子XIII 活性。根据本发明的参比物质可以以液体或以冻干形式提供。本发明另外提供了一种试剂盒，其包含正常血浆(作为单独的单元)和因子 XIII-缺乏型血浆(作为单独的单元)，所述血浆分别以液体或以冻干形式存在。借助于正常血浆，可测定因子XIII活性的基准值的参照值(100%)。借助于因子XIII-缺乏型血浆，可测定缺少因子XIII活性的参照值(0%)。借助于2种血浆的混合物(其可以由用户根据需要制备)，可测定低于基准(< 100%)的任意因子XIII活性的参照值。本发明另外提供了一种试剂盒，其包含以液体或冻干形式的至少一种参比物质作为单独的单元，所述参比物质具有低于基准(< 100%)的因子XIII活性，且由血浆组成，优选地由正常血浆和因子XIII-缺乏型血浆的混合物组成。优选地，根据本发明的检验试剂盒另外包含正常血浆(作为单独的单元)和/或因子XIII-缺乏型血浆(作为单独的单元)。
图 1
根据现有技术，使用NaCl溶液作为标准血浆的稀释介质，基于NADH的Berichrom 因子XIII实验或基于硫代-NADH的因子XIII实验的校正曲线。图 2
根据本发明，使用因子XIII-缺乏型血浆作为标准血浆的稀释介质，基于NADH的 Berichrom 因子XIII实验或基于硫代-NADH的因子XIII实验的校正曲线。图 3
借助于使用NaCl或因子XIII-缺乏型血浆作为标准血浆的稀释介质进行的基于NADH 的Berichrom 因子XIII实验，不同因子XIII活性的样品的回收率的对比。图 4
借助于使用NaCl或因子XIII-缺乏型血浆作为标准血浆的稀释介质进行的基于硫代-NADH的因子XIII实验，不同因子XIII活性的样品的回收率的对比。
实施例实施例1 CN 102549164 A
因子XIII的测定
在下面的实施例中，使用包含NADH或硫代-NADH作为活性组分的试剂，测定血浆样品的因子XIII含量。基于NADH的试剂的组成描述在EP 336 353 A2或Fickenscher等人(Thromb Haemost. 1991, 65(5): 535-40)中，且由 Siemens Healthcare Diagnostics (德国)作为Berichrom 因子XIII试剂销售。基于硫代-NADH的试剂具有下述组成 活化剂试剂M 8. 3)
292μΜ 硫代-NADH (Oriental Yeast Company, Rotterdam,荷兰) 牛凝血酶(10 IU/ml)
Gly-Pro-Arg-Pro-Ala-酰胺，作为纤维蛋白聚集抑制剂O g/1) 氯化钙(1. 2 g/1)
海美溴铵(10 mg/1) 牛白蛋白
N, N-二 O-羟乙基)甘氨酸缓冲液(100 mmol/1) 检测试剂M 6. 5)
谷氨酸脱氢酶(160 U/ml)
Leu-Gly-Pro-Gly-Gln-kr-Lys-Val-Ile-Gly-酰胺，作为 F XIII 受体底物 O. 4 g/
1)
ADP
甘氨酸乙基酯(1.4 g/1)
α-酮戊二酸 g/1) 牛白蛋白
HEPES 缓冲液(10 mmol/1)。^7 ^ BCS XP II ^vIZfft (Siemens Healthcare Diagnostics Products GmbH, Marburg,德国)上的比色皿中，合并各种试剂，即75μ1活化剂试剂、75μ1检测试剂和15μ1血浆样品，并在37 °C温育。5分钟以后，开始测量吸光度。用340 nm波长的光测量具有Berichrom 因子XIII实验的NADH试剂的实验批料。用405 nm波长的光测量具有硫代-NADH试剂的实验批料。为了评价，计算开始测量以后60秒-350秒的时间窗内每分钟的吸光度变化。为了校正(即测定参照值)，使用正常血浆(标准人血浆，Siemens Healthcare Diagnostics Products GmbH, Marburg,德国)作为具有基准的100% (基准的百分比)因子F XIII-浓度的标准物(与F XIII的国际标准品相对比，该正常血浆含有95% F XIII)。 如下得到具有更低因子XIII浓度的校准点(即代表低于基准的因子XIII活性的参照值) 根据本发明，通过用因子XIII-缺乏型血浆稀释标准品，或者根据现有技术，通过用0. 9% NaCl溶液稀释标准品。因子XIII-缺乏型血浆从hnovative Research (美国)得到，或以类似于在EP 0 826 965 Al中描述的方法，用针对因子XIII的α -链或β-链的单克隆抗体来制备。通过在实验批料中增加标准血浆的体积，得到具有比标准物更高的因子XIII 浓度的校准点(即代表高于基准的因子XIII活性的参照值)。在图1中显示了用NaCl溶液作为稀释介质用2种试剂进行的实验的典型校正曲线。在图2中显示了用因子XIII-缺乏型血浆作为稀释介质用2种试剂根据本发明进行的实验的典型校正曲线。
然后用2种试剂测量具有不同的因子XIII含量的样品，并借助于各自的校正曲线，评价实验结果。通过以不同的比例混合具有已知的高因子XIII活性的血浆库和因子 XIII-缺乏型血浆来制备样品。从起始血浆的因子XIII活性值和混合比，计算每种样品的理论因子XIII活性值。在测量样品以后，通过对比实际得到的测量值和预先理论计算的因子XIII活性值，计算每个样品的回收率百分比。超过100%的回收率等同于错误的过高的实验结果。如图3中所示，对于基于NADH的Berichrom 因子XIII实验，当根据本发明使用因子XIII-缺乏型血浆作为标准品的稀释介质(替代实验规定的NaCl)时，在具有小于20% 的因子XIII活性的样品的情况下，回收率更接近100%。如图4中所示，对于基于硫代-NADH 的实验，具有低因子XIII含量的样品的回收率的改善甚至还更显著。
权利要求
1.用于定量测定血浆样品中的因子XIII的方法，其中借助于实验批料中NAD(P)H或 NAD(P)H类似物的氧化性消耗测量活化的因子XIIIa的转谷氨酰胺酶活性，且将测得的测量值与借助于参比物质测定的参照值相对比，其特征在于，至少与基准相比具有降低的因子XIII活性的参比物质由血浆组成。
2.权利要求1的方法，其中至少一种与基准相比具有降低的因子XIII活性的参比物质由正常血浆和因子XIII-缺乏型血浆的混合物组成。
3.前述权利要求中任一项的方法，其中至少一种与基准相比具有降低的因子XIII活性的参比物质由加入了分离的因子XIII的因子XIII-缺乏型血浆组成。
4.前述权利要求中任一项的方法，其中不具有因子XIII活性的参比物质由因子 XIII-缺乏型血浆组成。
5.前述权利要求中任一项的方法，其中具有100%的因子XIII活性的参比物质由正常血浆组成。
6.前述权利要求中任一项的方法，其中至少一种与基准相比具有提高的因子XIII活性的参比物质由添加了分离的因子XIII的正常血浆组成。
7.前述权利要求中任一项的方法，其中借助于实验批料中NAD(P)H类似物的氧化性消耗，测量活化的因子XIIIa的转谷氨酰胺酶活性，且其中所述NAD(P)H类似物是硫代-NAD (P) H 或硒代-NAD (P) H。
8.因子XIII-缺乏型血浆用于制备参比物质的应用，所述参比物质用于定量测定因子XIII的方法中。
9.与基准相比具有降低的因子XIII活性的参比物质，其特征在于，所述参比物质由正常血浆和因子XIII-缺乏型血浆的混合物组成。
10.权利要求9的参比物质，其特征在于，其是冻干的。
11.试剂盒，其包含至少一种根据权利要求9或10之一的与基准相比具有降低的因子 XIII活性的参比物质。
12.权利要求11的试剂盒，其另外包含因子XIII-缺乏型血浆。
13.权利要求11或12之一的试剂盒，其另外包含正常血浆。
14.试剂盒，其包含至少一种正常血浆和一种因子XIII-缺乏型血浆，作为单独的单元。
15.权利要求11-14中任一项的试剂盒，其另外包含至少一种用于进行定量测定因子 XIII的方法的试剂，优选包含NAD (P)H或NAD (P)H类似物的试剂。
全文摘要
本发明属于体外诊断领域，涉及在借助于基于血浆的参比物质测定血液凝固因子XIII(因子XIII、FXIII)的方法和用于进行所述方法的检验试剂盒。
文档编号C12Q1/56GK102549164SQ201080044799
公开日2012年7月4日 申请日期2010年6月17日 优先权日2009年10月5日
发明者A.卡佩尔, F.维茨图姆, G.克罗斯特, L.佩希曼, N.灿德 申请人:西门子医疗诊断产品有限责任公司