用于急性肾损伤的诊断和/或预后的方法

专利名称：用于急性肾损伤的诊断和/或预后的方法
技术领域：
本发明一般意义上属于生物医学领域，且尤其涉及用于急性肾损伤 (dano renal aguda)的诊断和/或预后的方法。
背景技术：
在肾移植中，急性肾小管坏死(necrosis tubular aguda，TNA)是移植后移植物功能延迟的主要原因。此外，TNA导致急性排斥反应发病率的升高、慢性排斥反应的发生以及移植物存活的降低(Parmu et al.，2008)。近年来对器官需求的增加使得需要使用来自亚最佳供体(包括心搏停止的供体和老年的供体)的器官，这使得发生移植后TNA的百分率、移植物的发病率及其功能恢复的延迟显著升高。这推高了肾移植对于公共卫生的总经济成本。注意到国家移植中心(National Transplant Organization, ΝΤΟ)最近的统计数字表明，在西班牙每年实现约2，200例肾移植，而超过4，000位患者仍然在等候者名单中 (Dominguez-Gil y Pascual. 2008)。另一方面，TNA (包括源自缺血的TNA)是急性肾功能衰竭(Fracaso Renal Agudo, FRA)最常见的形态表现形式(Kellum et al.，2008)。因为约50%的高死亡率，FRA代表了发达国家中肾疾病中最严重问题之一。全部FRA事件的约 30%发生在因多器官功能衰竭而进入I⑶的患者中。在后一种情况下，死亡率升高至80% (Chertow et al.，2005)。FRA的发生还是心脏介入之后最常见的并发症，其中在西班牙每年进行的约30，000例心脏介入，而其中超过是在我们医院进行的。几乎全部手术过的患者均发生一定程度的FRA(Yates and StafforcHchmit，2006)。手术后FRA的严重程度取决于患者的长期进展，在心脏手术后需要透析的那些情况中，导致接近60%的死亡率 (Takar et al. ,2005 ；Candela-Toha et al. ,2008) 肾移植和心脏手术是人 TNA 的两种 “准”实验研究的情况，因为已知缺血刺激的时刻和持续时间，并且还可对它们进行监测。近几十年来，且迄今为止，所有发病率-死亡率的这些统计数据没有显著改变，在所有这些情况中不存在用于预防和/或降低TNA的有效治疗。这很大程度上归因于缺乏比使用至今的血清肌酸酐和尿素的测定更准确的肾损伤标志物。这些经典的标志物不直接反映细胞损伤或在肾组织(小管或内皮)的隔室中产生的细胞损伤；它们仅是损伤所引起的肾功能改变的指示参数(Vaidya et al.，2008)。事实上，这样可能无法鉴定出具有亚临床肾损伤的患者，因为尚未产生血清中肌酸酐和尿素水平的显著改变。因此，最近几年，正在进行很多试图鉴定和确证新的FRA标志物(例如，NGAL、IL18、KIM、抑半胱氨酸蛋白酶蛋白C(ciStatina C)、VEGF或CXCL10)的研究，所述标志物在没有显著附加病理状况的婴儿人群中(而非在成年人群中)似乎是良好标志物(Vaidya et al.，2008)。肾缺血、血容量减少和毒性物质是最常见的发生TNA的原因。血流减少和因此所造成的组织缺氧导致在近端小管上皮水平上的损伤，引起肾小球滤液的迅速减少，改变血管通透性，并且激起放大组织损伤的炎症反应(Thurman et al.，2007)。缺血损伤的程度和范围取决于缺血的严重程度和持续时间。在亚致死的缺血中，可见到近端上皮细胞脱离至小管腔，其中很多细胞是有活力的。在长时间的缺血中，持续的组织缺氧和炎症反应等增加上皮和血管的损失，伴有肾皮质-髓质区中细胞的死亡。另一方面，缺血之后，血管腔隙也被损伤。事实上，内皮损伤显著地促进并维持急性肾损伤。缺血期间，小管周流量(flujo peritubular)的早期改变和早期再灌注与内皮的形态和功能的丧失相关，导致屏障功能的丧失、炎症和促凝血剂活性。中长期，已将有利于慢性肾损伤之进展的微血管密度之丧失描述为初始缺血的直接结果(Basile 2007)。为了解决TNA，启动促进组织修复的机制从未损伤的上皮小管细胞启动细胞分裂和分化。近年来，很多研究已证明，不仅表皮的去分化并增殖的本身未损伤的细胞，而且肾多能细胞以及甚至肾外的多能细胞(例如，来自骨髓的多能细胞)可贡献于修复缺血后的小管损伤(Lin 2008)。然而，干细胞对修复缺血损伤的贡献是受到质疑的，尽管公认其对未损伤的近端小管细胞和实质(padnquima)的再血管化有根本性贡献。在后一过程中，已提出缺血之后动员的内皮亲本也可参与(Becherucci et al. ，2009)。 miRNA是大小(22 25个核苷酸)很小的、内源性编码的RNA，能够在诱导的沉默复合物(RISK)内通过与其靶mRNA全部或部分互补来识别信使RNA，并因此负性调节蛋白质的表达(Chang and Mendel 1，2007)。在人中已经克隆了超过700种，并且生物信息学的预测表明它们总共可控制总蛋白质中超过30%的表达(Filipowicz et al.，2008)。 多数是通过RNA Pol II从单个基因转录的，或者它们中的多个来自同时转录的多顺反子 (policistr0nico)。他们作为较长的pre-miR而产生，在细胞核中被核酸酶III (Drosha)加工，通过核输出蛋白(Exportina) -5依赖性的机制和Ran-GTP依赖性的机制进入细胞质，并且它们在那里被另一种核酸酶III (Dicer)最终加工成为其成熟的形式(Rana 2007)。其功能在广泛多样的过程(包括胚胎发育、对于应激的应答或者生理过程的严格调节以及因此在生物中维持体内稳态)中是至关重要的。需要强调的是miRNA的表达谱是细胞类型特异性的并且可根据刺激而改变，因此，同一 miRNA的具体细胞环境将决定其在具体细胞类型中的功能(Bartel2009)。出于这个原因，已从导致了病理状况(例如，癌症(Bartels and jTsongalisJOOg)、自身免疫(Sonkoly and Pivarcsi 2008)、糖尿病(Zhou et al. ,2008) 或血管病理状况⑴rbich et al.，2008))之发生的多种机制中指出了某些miRNA的失调， 并且将它们作为很多所述病理状况之进展的精确生物标志物。最近已证明，miRNA还是任何类型的刺激(包括缺乏营养或缺氧)之前迅速和准确的细胞应答中的关键调节物(Ivan et al.，2008)。另一方面，已证明这些miRNA可与mRNA —起以微颗粒(血小板的微泡；肿瘤细胞中的外来体(exosoma)；中性粒细胞的核外粒体(ectosoma))的形式被细胞分泌或交换(Valadi et al.，2007)。因此，可在体液(例如，血液、尿或胸膜液)中检测它们。事实上，据估计健康个体的外周血液可含有浓度在5 50mg/ml之间的微颗粒，在患有多种病理状况之患者的情况中，所述浓度可升高(Hunter et al.，2008)。这可允许使用通过最小侵袭性的方法(抽血和收集尿)所获得的样品对这些病理状况的进展进行非常可靠的监测 (Gilad 2008)。在尿中，所检测的miRNA(其中包括miR-127)显示出了很高的稳定性，即便是在高度侵蚀性的条件下也是这样(Melkonyan et al.，2008)。鉴于miRNA的失调可导致多种病理状况，它们开始被认为是治疗作用的新靶点。事实上，已开发了用于调节其表达的工具pre-mir用于其过表达，而antagomir(anti-mir)用于其抑制，在多种体外和体内实验模型中具有非常有希望的结果(Krutzfeld et al.，2006 ；Care et al.，2007 ；Van Rooij et al.，2008)，尽管仍需确定其在人中作为治疗策略的有效性。
对于miRNA在对缺血的应答中的作用，已测定了其在大鼠局灶性脑缺血中的表达，建立了 miR-145的表达与脑损伤之间的关联(Dharap et al.，2009)。在人的心脏缺血中，miR-100和miR-133似乎参与心脏损伤的机制(Sucharov C，et al. ,2008) 在亦为人的肝缺血中，miR-223已被确立为损伤的中介物(Yu et al.，2008)。相反，miR_U6和 miR-210已被描述为对多种刺激(包括缺氧)作出响应的血管发生、新血管形成和组织修复的关键发起物(Suarez and Sessa,2009 ；Fasanaro et al. , 2008 ；van Solingen et al.， 2008)。到目前为止，文献中尚未描述过肾的I/R中被调节的miRNA，但是当然已经开始推测其作为肾病理状况(包括与血压调节紊乱相关的那些病理状况)的生物标志物的潜力 (Liang M et al.，2009)。在另一种情况下，已经鉴定出一些与肾移植中的免疫排斥反应相关的 miRNA (Sui et al. ,2008) 所有上文所述内容均证明需要鉴定和确证新的肾损伤之发展的生物标志物，其更准确并且指示何种组织隔室以及以何种程度损伤和/或恢复，其检测更加迅速、简便并且不需要对患者进行活组织检查。

发明内容
因此，在第一方面中，本发明提供用于急性肾损伤的诊断和/或预后的方法，其包括分析患者的样品以测定选自miR-127、miR-126、miR-210和miR-101的至少一种微 RNA(micro-RNA)的表达水平，并且将所述表达水平与对照值比较，其中所述水平的改变指示肾损伤。在本发明的一个更具体的方面中，要分析的患者样品是血液。在本发明的另一个具体方面中，所述样品是血清。在本发明的另一个方面中，所述样品是尿。在一个更具体的方面中，通过测定miR-127的表达水平单独或与选自miR-126、 miR-210和miR-101的至少一种微RNA联合来进行急性肾损伤的诊断和/或预后。在一个更具体的方面中，血清miR-127表达水平相对于对照值的降低指示急性肾损伤。 在一个更具体的方面中，尿miR-127的表达水平相对于对照值的升高指示急性肾损伤。在一个更具体的方面中，通过测定miR-126的表达水平单独或与选自miR-127、 miR-210和miR-101的至少一种微RNA之联合来进行急性肾损伤的诊断和/或预后。在一个更具体的方面中，血清miR-126的表达水平相对于对照值的降低指示急性肾损伤。在一个更具体的方面中，通过测定miR-210的表达水平单独或与选自miR-127、 miR-126和miR-101的至少一种微RNA联合来进行急性肾损伤的诊断和/或预后。在一个更具体的方面中，血清miR-210的表达水平相对于对照值的升高指示急性肾损伤。在一个更具体的方面中，尿miR-210表达水平相对于对照值的降低指示急性肾损伤。在一个更具体的方面中，通过测定miR-101的表达水平单独或与选自miR-127、 miR-126和miR-210的至少一种微RNA联合来进行急性肾损伤的诊断和/或预后。
在一个更具体的方面中，血清miR-101的表达水平相对于对照值的升高指示急性肾损伤。在本发明中，急性肾损伤是指具有缺血病因的原发或继发(例如，毒性物质或通过造影(radiocontraste)所引起的肾损伤的情况)的肾损伤，，并且在任何情况下，不包括慢性肾损伤。在本发明的一个更具体的方面中，通过PCR测定微RNA的表达。在一个更具体的方面中，通过定量PCR测定微RNA的表达。在一个更具体的方面中，通过多重PCR测定微RNA 的表达。在本发明的另一个更具体的方面中，通过总RNA微阵列测定微RNA的表达。在第二个方面中，本发明涉及用于急性肾损伤的诊断和/或预后的试剂盒，其包含实施本发明的方法所需的探针和引物。在本发明的一个更具体的方面中，所述试剂盒包含用于测定选自miR-127、 miR-126、miR-210和miR-101的至少一种微RNA之表达水平所需的探针和引物。在本发明的另一个更具体的方面中，所述试剂盒包含RNA微阵列。


图 1 显示遭受缺氧/再充氧方案(protocol。de Hipoxia/Reoxigenaci0n)的HK-2 人近端小管细胞中miR-U6的表达。NX:在氧可获得性(含氧量正常，21%)和营养物可获得性(含有10% FBS的完全培养基)的正常条件下的细胞CC 遭受营养物限制的对照细胞 (其处于无营养物的培养基中)。Hyp 在他期间遭受营养物和氧限制的细胞(1%氧的无营养物的培养基)；R-3、R-6、R-24h :6h的缺氧之后的细胞再次处于正常的氧和营养物可获得性的条件下。图2显示经历了缺氧/再充氧方案的HK-2人近端小管细胞中miR-210的表达。 NX 在氧可获得性(含氧量正常，21% )和营养物可获得性(含有10% FBS的完全培养基) 的正常条件下的细胞CC 经历了营养物限制的对照细胞(其处于无营养物的培养基中)。 Hyp 经历了营养物和氧限制的细胞(1%氧的无营养物的培养基)；R-3、R-6、R-24h 再次处于正常的氧和营养物可获得性的条件下的细胞。图3显示经历了缺氧/再充氧方案的HK-2人近端小管细胞中miR-101的表达。 NX 在氧可获得性(含氧量正常，21% )和营养物可获得性(含有10% FBS的完全培养基) 的正常条件下的细胞CC 经历了营养物限制的对照细胞(其处于无营养物的培养基中)。 Hyp 经历了营养物和氧限制的细胞(1%氧的无营养物的培养基)；R-3、R-6、R-Mh 再次处于正常的氧和营养物可获得性的条件下的细胞。图4显示经历了缺氧/再充氧方案的HK-2人近端小管细胞中miR-127的表达。 NX 在氧可获得性(含氧量正常，21% )和营养物可获得性(含有10% FBS的完全培养基) 的正常条件下的细胞CC 经历了营养物限制的对照细胞(其处于无营养物的培养基中)。 Hyp 经历了营养物和氧限制的细胞(1%氧的无营养物的培养基)；R-3、R-6、R-24h 再次处于正常的氧和营养物可获得性的条件下的细胞。图5显示经历了缺氧/再充氧方案的NRK-52E大鼠近端小管细胞中miR-101的表达。NX:在氧可获得性(含氧量正常，21%)和营养物可获得性(含有10% FBS的完全培养基)的正常条件下的细胞CC:经历了营养物限制的对照细胞(其处于无营养物的培养基中)。Hyp 经历了营养物和氧限制的细胞(1%氧的无营养物的培养基)；R-15min、R-30min、 R-lh, R-3h, R-6h, R-24h :再次处于正常的氧和营养物可获得性的条件下的细胞。图6显示经历了缺氧/再充氧方案的NRK-52E大鼠近端小管细胞中miR-127的表达。NX:在氧可获得性(含氧量正常，21%)和营养物可获得性(含有10% FBS的完全培养基)的正常条件下的细胞CC:经历了营养物限制的对照细胞(其处于无营养物的培养基中)。Hyp 经历了营养物和氧限制的细胞(1%氧的无营养物的培养基)；R-15min、R-30min、 R-lh, R-3h, R-6h, R-24h :再次处于正常的氧和营养物可获得性的条件下的细胞。图7显示经历了缺氧/再充氧方案的HMEC人内皮细胞中miR-101的表达。NX 在氧可获得性(含氧量正常，21%)和营养物可获得性(含有10% FBS的完全培养基)的正常条件下的细胞CC 经历了营养物限制的对照细胞(其处于无营养物的培养基中)。Hyp 经历了营养物和氧限制的细胞(1%氧的无营养物的培养基)；R-15min、R-30min、R-lh、R-;3h、 R-Mh 再次处于正常的氧和营养物可获得性的条件下的细胞。图8显示经历了缺氧/再充氧方案的HMEC人内皮细胞中miR-127的表达。NX 在氧可获得性(含氧量正常，21%)和营养物可获得性(含有10% FBS的完全培养基)的正常条件下的细胞CC 经历了营养物限制的对照细胞(其处于无营养物的培养基中)。Hyp 经历了营养物和氧限制的细胞(1%氧的无营养物的培养基)；R-15min、R-30min、R-lh、R-;3h、 R-Mh 再次处于正常的氧和营养物可获得性的条件下的细胞。图9显示经历了缺氧/再充氧方案的HMEC人内皮细胞中miR-210的表达。NX 在氧可获得性(含氧量正常，21%)和营养物可获得性(含有10% FBS的完全培养基)的正常条件下的细胞CC 经历了营养物限制的对照细胞(其处于无营养物的培养基中)。Hyp 经历了营养物和氧限制的细胞(1%氧的无营养物的培养基)；R-15min、R-30min、R-lh、R-;3h、 R-Mh 再次处于正常的氧和营养物可获得性的条件下的细胞。图10显示经历了缺氧/再充氧方案的HMEC人内皮细胞中miR_U6的表达。NX 在氧可获得性(含氧量正常，21% )和营养物可获得性(含有10% FBS的完全培养基)的正常条件下的细胞CC 经历了营养物限制的对照细胞(其处于无营养物的培养基中)。Hyp 经历了营养物和氧限制的细胞(1%氧的无营养物的培养基)；R-15min、R-30min、R-lh、R-;3h、 R-Mh 再次处于正常的氧和营养物可获得性的条件下的细胞。图11显示诊断为缺血病因的急性肾功能衰竭(FRA)患者的血清miR-127的表达。 对照健康对照中miRNA的表达等于1。将患者中的表达数据以该数据归一化。Oh和3天 取患者样品的时间，因FRA进入时(Oh)和随后在其进展中(3天)。图12显示诊断为缺血病因的急性肾功能衰竭(FRA)患者的尿miR-127的表达。对照健康对照中miRNA的表达等于1。将患者中的表达数据以该数据归一化。Oh和3天取患者样品的时间，因FRA进入时(Oh)和随后在其进展中(3天)。图13显示诊断为缺血病因的急性肾功能衰竭(FRA)患者的血清miR_U6的表达。 对照健康对照中miRNA的表达等于1。将患者中的表达数据以该数据归一化。Oh和3天 取患者样品的时间，因FRA进入时(Oh)和随后在其进展中(3天)。图14显示诊断为缺血病因的急性肾功能衰竭(FRA)患者的血清miR-210的表达。 对照健康对照中miRNA的表达等于1。将患者中的表达数据以该数据归一化。第0天、第1天、第2天、第3天、第7天取患者样品的时间，因FRA进入时(第0天)和随后在其进展中。图15显示诊断为缺血病因的急性肾功能衰竭(FRA)患者的尿miR-210的表达。对照健康对照中miRNA的表达等于1。将患者中的表达数据以该数据归一化。第0天、第1 天、第2天、第3天、第7天取患者样品的时间，因FRA进入时(第0天)和随后在其进展中。图16显示诊断为缺血病因的急性肾功能衰竭(FRA)患者的血清miR-101的表达。 对照健康对照中miRNA的表达等于1。将患者中的表达数据以该数据归一化。第0天、第 1天、第2天、第3天、第7天取患者样品的时间，因FRA进入时(Od)和随后在其进展中。图17显示血清样品中miR-101的表达a 在属于组IA的患者中，b 在属于组IB 的患者中，以及c 在属于组II的患者中。图18显示血清样品中miR-127的表达a 在属于组IA的患者中，b 在属于组IB 的患者中，以及c 在属于组II的患者中。图19显示血清样品中miR-126的表达a 在属于组IA的患者中，b 在属于组IB 的患者中，以及c 在属于组II的患者中。图20显示血清样品中miR-210的表达a 在属于组IA的患者中，b 在属于组IB 的患者中，以及c 在属于组II的患者中。
具体实施例方式通过使用阵列，在模拟I/R的H/R模型中鉴定出以差别方式表达的微RNA: miR-127、miR-126、miR-210和miR-101，因此，这些微RNA的每一种单独或组合充当肾损伤的生物标志物。实施例1 经历了缺氧/再充氧的细胞系中miRNA的表达在含有特定的血清、抗生素和生长因子的合适培养基中进行以下细胞的培养 (HK2 人近端小管细胞，NRK-52E 大鼠近端小管细胞，以及HMEC 人微血管内皮细胞)。在 37°C下，将所述细胞保持在具有5% C02的潮湿气氛中。使上文中描述的细胞系经历低氧/再充氧方案。即，使细胞系经历氧张力和营养物可获得性的改变。为了该目的，使用了两种不同的培养箱37 °C下在灌注了 5 % CO2、1 % 02>94% N2之混合物的封闭培养箱中缺氧；37°C下在含有5% CO2的标准培养箱中再充氧。 细胞生长至汇合，在缺氧之前M小时剥夺血清。在缺氧的过程中，将细胞保持在具有低浓度葡萄糖或衍生物的无血清的基本培养基(HBSQ中。在再充氧的过程中，使用完全培养基 (Saenz-Morales et al.，2006)。所有样品的缺氧时间为6h，而再充氧的时间可变(15min 72h)。所有体外实验均重复至少3次。随后，通过PCR测定细胞系中不同微RNA的表达，为了该目的，从流体样品(血清或尿)中提取总RNA并对其进行定量，将它们每一种50纳克用于15微升中的逆转录 (retrotranscripcion, RT)反应。在该步骤中使用特定的商业化的引物(茎环引物)。这些引物对每种miRNA是特异性的。RT之后，以定量的方式(qPCR)进行扩增反应。在10微升总体积中进行的该反应中，使用了 1微升RT总反应物和对每种miRNA特异性的引物，以及具有荧光捕捉剂(atrapador de fluorescencia) Wl^qman探针。所有试剂，引物以及含有用于RT和PCR之酶和核苷酸的反应混合物均来自Applied Biosystems0结果如下如图1所示，miR-126的表达水平严重依赖于营养物和氧的可获得性，因为相对于正常条件，对这二者的限制非常显著地降低miR-U6的表达。再充氧时，miRNA的表达恢复， 这时细胞恢复对氧和营养物的处置。因此，miR-U6表达的降低表明近端小管细胞中缺乏营养物和氧，这指示肾缺血。另一方面，鉴于再充氧池时记录到对体外上皮的重大损伤，该 miRNA的低表达表明缺血之后近端小管上皮的损伤。如图2所示，就像miR-U6那样，miR-210的表达水平严重依赖营养物和氧的可获得性，因为相对于正常条件，对这二者的限制非常显著地降低miR-210的表达。再充氧时， miRNA的表达恢复，这时细胞恢复对氧和营养物的处置。因此，miR-126的降低表明近端小管细胞中缺乏营养物和氧，就像miR-126的情况中那样，这指示肾缺血。另一方面，鉴于再充氧池时记录到对体外上皮的损伤，miR-210的低表达表明缺血之后近端小管上皮的损伤。如图3所示，与含氧量正常的条件相比，在缺氧条件下，miR-101的表达升高。在氧和营养物的可获得性再次正常化的再充氧中，该miRNA的表达再次正常化。缺氧条件的过程中，近端细胞中该miRNA之表达的升高指示肾缺血。如图4所述，与含氧量正常的条件相比，在缺氧条件下，miR-127的表达升高。在再充氧下，该miRNA的表达显著降低，再充氧Mh，当表皮单层恢复时，表达再次升高。因此， 缺氧条件的过程中，近端细胞中miR-127表达的升高指示肾缺血。在再充氧下，其早期表达的降低表明缺血损伤，而其随后的升高表明内皮的恢复。如图5所示，在该大鼠细胞中，在氧和营养物的可获得性再次正常化的再充氧下， miR-101的表达迅速正常化，尽管与在含氧量正常的条件下相比，其仍保持更高的表达水平。在缺氧条件的过程中，近端细胞中该miRNA表达的升高指示肾缺血。再充氧24h时，其新的升高表明表皮单层的恢复。如图6所示，就像在Hk_2(人小管)细胞中那样，与含氧量正常的条件相比，在营养物和氧的可获得性受限的低氧条件下，miR-127的表达升高。在再次可获得氧和营养物的再充氧条件下，该miRNA的表达迅速正常化。缺氧条件的过程中，近端细胞中该miRNA表达的升高指示肾缺血。如图7所示，就像近端小管细胞中那样，与含氧量正常的条件相比，在缺氧条件下，miR-101的表达升高。在氧和营养物的可获得性再次恢复正常化的再充氧的条件下，该 miRNA的表达维持在高水平，并在再充氧24h时开始正常化。在缺氧条件的过程中，内皮细胞中该miRNA表达的升高指示肾缺血。在再充氧下，其高表达与内皮的激活(促炎的)状态相关，在24h时开始正常化。如图8所示，就像近端小管细胞中那样，与含氧量正常的条件相比，在营养物和氧的可获得性受限的缺氧条件下，miR-127的表达升高。在可获得氧和营养物的再充氧下，该 miRNA的表达维持在高水平，并在再充氧24h时开始正常化。在缺氧条件的过程中，内皮细胞中该miRNA表达的升高指示肾缺血。在再充氧下，其高表达与内皮的激活(促炎的)状态相关，在24h时会开始正常化。如图9所示，不像近端小管细胞中的miRNA那样，与含氧量正常的条件相比，在缺氧条件下，miR-210的表达不显著地升高。在再充氧的条件下，该miRNA的表达维持在高水平，并且在再充氧24h时，其表达迅速降低。在低氧条件的过程中，内皮细胞中该miRNA表达的升高指示肾缺血。就像miR-127和miR-101那样，在再充氧下，miR-210的表达与内皮激活(促炎的)状态相关，在24h时开始正常化。如图10所示，与含氧量正常的条件相比，在营养物和氧的可获得性受限的缺氧条件下，miR-126的表达不显著地升高。并且，在可获得氧和营养物的再充氧Ih时，其非常显著地升高。随后，该miRNA的表达正常化。在缺氧条件的过程中，内皮细胞中该miRNA表达的升高指示肾缺血。再充氧Ih时如此显著的升高清楚明确地与最大内皮激活(促炎的) 状态相关。^MM 2 :i金断为急t牛肾功能衰竭的患、者中miRNA的表汰以前瞻性的方式对患者的样品进行研究。患者或其法定代表人通过相关的知情同意而授权之后并且事先被我们医院的临床研究伦理委员会(Comit6 EtiCO de Investigacion Clinica)批准之后，在下文中描述的患者组中的移植病例中抽血和尿和肾活组织检查的样品。肾移植患者的样品分析了来自50位移植者(从头肾移植(transplante renal de novo)的并且有不同免疫抑制方案的患者)的样品，分成两组I. 25位即时移植物功能的患者II. 25位延迟移植物功能的患者在肾移植后第1、7、15、30天，取血液和尿样品，并在这些天中通过qRT-PCR测定要研究的miRNA的表达。在移植物无功能的情况下，在第7天时进行活组织检查，每7 10天重复进行，直至TNA期消退。假如怀疑排斥反应，通过活组织检查证实之后，将这些患者排除。在移植患者的情况下，收集和确定以下信息-受体特征年龄、性别和透析的时间。-供体特征供体的类型(脑死亡、心搏停止)、年龄、性别、对血管活性药物的需要和最后肌酸酐。-移植物特征热、冷缺血的时间和吻合的时间。HLA相容性和免疫抑制。-第2、4和12周时移植物的功能。在 8ml 的 VACUETTE 管(z serum sep clot activator)中收集血液样品，2500rpm 离心10分钟。通过离心收集所分离的血清，并根据Ramon and Cajal Hospital的BioBank的标准(在匿名的管中，具有唯一的代码，并置于-80°C)分装和存储。尿样品收集在标准尿瓶中，或从探针的沉积中提取，以2500rpm离心所述尿样品 10分钟以除去沉淀和其他残余物，并根据Ramon and Cajal Hospital的BioBank的标准 (在匿名的管中，具有唯一的代码，并置于_80°C )分装和存储。通过特许权协议，由BioBank要求它们全部的特许权。最大要求500微升，因为我们优化了用于在100 200微升的两种流体样品中通过定量PCR扩增miRNA的技术，为了该目的，从流体样品(血清或尿)中提取总RNA，然后对其进行定量，其中它们每一种50纳克用于15微升中的逆转录(RT)反应。该步骤中使用特定的商业化引物(茎环引物)。这些引物对每种miRNA是特异性的。RT之后，以定量的方式(qPCR)进行扩增反应。在10微升总体积中进行的该反应中，使用了 1微升的RT总反应物和对每种miRNA特异性的引物， 以及具有荧光捕捉剂的Taqman探针。所有试剂，引物以及含有用于RT和PCR之酶和核苷酸的反应混合物均来自Applied Biosystems0在提取总RNA之前对患者的血清和尿样品进行以下加工在56°C下，用蛋白酶 K(0. 65毫克/毫升)孵育lh，以消化100 200微升的血清或尿等分试样。随后，用酚/ 氯仿(5 1)进行第一次提取，并按照制造商的用法说明使用High Pure miRNA isolation Kit(Roche)处理水相。心脏手术之后患者的样品分析来自50位患者的样品，分成以下组-IA 以预定的方式使用体外循环(circulaci0n extracorporea, CEC)进行手术， 并且具有低FRA发生风险的10位成年人患者，即患者以Thakar 5系统的评分为0至2，或者以简化的SRI 6的评分为0至1。-IB 使用CEC进行第一次手术的患有先天性心脏病的10位儿科患者。-II 以预定的方式使用CEC进行手术，具有改变的基础肾功能，且以Thakar 5系统的评分> 5，或者以SRI 6的评分彡3的15位成年人患者。-III 以预定的方式使用CEC进行手术，具有正常的基础肾功能，并且与上一节具有相同评分的15位成年人患者。对于每位患者，在以下时刻对所列举的miRNA进行测定-基础手术前-进入ICU 2h 时-手术之后24h、48h 和 72h-第7天时(对于组IA和IB而言是任选的)如图11所示，与健康对照相比，miR-127的表达极大地降低。患者血清中该miRNA 表达的降低是肾缺血损伤或FRA的指示物。这些数据与图18中所示的数据相关联。如图12所示，与血清降低相关联，与健康对照相比，miR-127的表达显著升高。患者血清中该miRNA表达的降低以及其在尿中相应的升高是肾缺血损伤或FRA之早期诊断的指示物。如图13所示，血清miR-126的表达水平在缺血性肾损伤开始时显著降低，并且其表达在24h时大幅升高，随后正常化。这表明患者血清中该miRNA表达的降低是肾缺血损伤或FRA之早期诊断的指示物。如体外模型中讨论的那样，其在24h时的升高表明缺血之后与随后的炎症反应相关的内皮激活。这些数据与图19中所示的数据相关联。如图14所示，血清miR-210的表达在缺血肾损伤开始时显著升高；其在前Mh中维持，随后正常化。这些数据表明患者血清中该miRNA表达的升高是肾缺血损伤或FRA的早期诊断标志物。如图15所示，尿miR-210的表达在48h时显著升高，随后正常化。鉴于HK_2细胞中该miRNA的表达在开始观察到实验模型中上皮恢复的时间时升高，这表明患者尿中该 miRNA在4 时表达的升高指示肾缺血损伤之后恢复的开始。这些数据与图20中所示的数据相关联。如图16所示，在进入的早期，相对于健康对照，miR-101的表达显著升高，而在进展期间，相对于健康对象，不再检测到显著的表达。这表明，患者血清中该miRNA表达的升高是肾缺血损伤的早期诊断标志物。这些数据与图17中所示的数据相关联。
权利要求
1.用于对急性肾损伤进行诊断和/或预后的方法，其包括分析患者的样品以测定选自 miR-127、miR-126、miR-210和miR-101中至少一种微RNA的表达水平，并且将所述表达水平与对照值相比较，其中所述水平的改变指示急性肾损伤。
2.权利要求1的用于对急性肾损伤进行诊断和/或预后的方法，其中要分析的所述样品选自血液、血清或尿。
3.权利要求1 2中任一项的用于对急性肾损伤进行诊断和/或预后的方法，其中与对照值相比血清miR-127表达水平的降低指示急性肾损伤。
4.权利要求1 2中任一项的用于对急性肾损伤进行诊断和/或预后的方法，其中与对照值相比尿miR-127表达水平的升高指示急性肾损伤。
5.权利要求1 2中任一项的用于对急性肾损伤进行诊断和/或预后的方法，其中与对照值相比血清miR-U6表达水平的降低指示急性肾损伤。
6.权利要求1 2中任一项的用于对急性肾损伤进行诊断和/或预后的方法，其中与对照值相比血清miR-210表达水平的升高指示急性肾损伤。
7.权利要求1 2中任一项的用于对急性肾损伤进行诊断和/或预后的方法，其中与对照值相比尿miR-210表达水平的降低指示急性肾损伤。
8.权利要求1 2中任一项的用于对急性肾损伤进行诊断和/或预后的方法，其中与对照值相比血清miR-101表达水平的升高指示急性肾损伤。
9.前述权利要求中任一项的用于对急性肾损伤进行诊断和/或预后的方法，其中通过 PCR测定微RNA的表达。
10.前述权利要求中任一项的用于对急性肾损伤进行诊断和/或预后的方法，其中通过定量PCR测定微RNA的表达。
11.权利要求1 8中任一项的方法，其中通过RNA微阵列测定微RNA的表达水平。
12.用于对急性肾损伤进行诊断和/或预后的试剂盒，其包含实施权利要求1 11中任一项的方法所需的探针和引物。
全文摘要
本发明涉及通过分析选自miR-127、miR-126、miR-210和miR-101中至少一种微RNA的表达水平来进行急性肾损伤的诊断和/或预后的方法。
文档编号C12Q1/68GK102575294SQ201080044847
公开日2012年7月11日 申请日期2010年9月3日 优先权日2009年9月4日
发明者伊莱亚·阿瓜多弗赖莱, 大卫·萨恩斯莫拉莱斯, 费尔南多·利亚诺加西亚, 马里亚·劳拉·加西亚贝尔梅霍 申请人:拉蒙和卡哈尔大学医院生物医学研究基金会