咸味调节物质的筛选方法

专利名称：：咸味调节物质的筛选方法
技术领域：
：本发明涉及筛选含有替代咸味或修饰咸味的物质的咸味调节物质的方法。咸味替代或咸味调节物质在食品领域等中是有用的。
背景技术：
：味觉对于检测食品中的营养成分或有害成分是重要的。哺乳动物的味觉感受经由存在于口腔内的味蕾中所含的味觉受体细胞来实现。所感受的信号从味觉受体细胞向进入味蕾中的味神经传递，再传递至中枢。通常，哺乳动物的味觉分为五种基本味质。即甜味、苦味、酸味、咸味和鲜味(umami)，将它们称作五种基本味道。近年来随着研究的进展，这五种基本味道所对应的受体日益清楚(非专利文献1、2)。新型味觉受体的鉴定和分离使味觉感受的新的调节方法成为可能。例如，通过使用味觉受体进行高亲和性激动剂或拮抗剂的探索，可以进行味觉调节物质的筛选。这种味觉调节物质能够带来各种消费品的味质的改善或改良。作为五种基本味道之一的咸味，其参与钠离子或其他无机阳离子的检测，对于保持体内的内环境稳定至关重要。在咸味的感受通路中，认为存在受利尿剂阿米洛利(amiloride)抑制的阿米洛利敏感性通路和不受阿米洛利影响的阿米洛利非敏感性通路(非专利文献幻。参与两种咸味感受通路的分子存在于味蕾内的味觉受体细胞中并发挥作用(非专利文献2)。认为阿米洛利敏感性通路是由上皮性钠通道(ENaC)介导的。ENaC由4种亚基α、β>Y>δ构成，以包含α、β和Υ、或δ、β和Υ的组合的异源多聚体(hetero-multimer)的形式发挥作用(非专利文献1。但是，虽然在啮齿类动物中观察到咸味感受明显被阿米洛利抑制，但是只在一部分人中观察到这种抑制，暗示在人咸味感受机制中存在不同的受体。如上所述，关于咸味感受机制包括受体在内尚未清楚的部分颇多。从食品中摄取过剩的盐分被认为是高血压或循环系统疾病的要因之一，包括日本在内，全世界都在开展限制盐分摄取量的行动(国际保健机构、非专利文献4)。—直都存在着减少盐分摄取量的传统技术，例如使用氯化钾作为氯化钠的替代品的低盐调味品和低盐食品，但氯化钾存在着具有苦味和刺激味的问题。因此，使用氯化钾的食物的味道明显差。为了改善这种缺陷，有人开发了一种调味品组合物，其中除氯化钾以外，还以特定比例混合氯化铵、乳酸钙、L-天冬氨酸钠、L-谷氨酸盐和/或核酸类呈味物质(专利文献1)；包含抗坏血酸的低钠咸味调味品(专利文献幻；以及使用卡拉胶的苦味抑制方法(专利文献幻等。但是，减盐技术尚未达到以下水平，即去除咸味以外的不愉快的味道、同时提供与氯化钠同等程度的咸味强度。并且，有使用即使减少氯化钠也不会损及咸味强度的咸味增强物质的减盐方法。例如已知碱性氨基酸、特别是L-精氨酸具有增强咸味的效果(非专利文献5、6)。作为应用该知识的技术，有人开发了L-精氨酸、L-天冬氨酸和氯化钠的组合(专利文献4)，使用碱性氨基酸和枸橼酸的中和盐的呈味改良剂(专利文献幻等。但从减盐效果、风味、咸味强度等角度考虑，尚未开发出任何的可以充分补偿氯化钠的不足的技术。另一方面，Kv3家族作为钾通道家族而已知，该钾通道家族原来被认为在进行高频率刺激的神经细胞中发挥作用，当细胞的膜电位去极化至_20mV以上时释放钾离子，显示出外向电流(非专利文献7)。但是，对于这些，只知道其作为电位依赖性钾通道的作用(非专利文献811)，关于其在静止膜电位(约_60mV-80mV)附近根据细胞外钠浓度作为阳离子通道的作用则完全不知。至于与味觉的关系，报道了在从大鼠菌状乳头分离的味觉细胞中，通过PCR法确认了Kv3.1和Kv3.2的基因表达(非专利文献12)。然而，关于在该味觉细胞中的作用则完全不知。现有技术文献专利文献专利文献1日本特开平11-187841号公报专利文献2日本特开平H810M号公报专利文献3日本特开平4462758号公报专利文献4美国专利第5145707号说明书专利文献5日本特开2003-0144088公报非专利文献非专利文献1Chandrashekar，J.等人，Nature，444:288^4^006)非专利文献2=Bachmanov,Α.A.等人，Ann.Rev.Nutr,27:387412(2007)##^lJiK3:DeSimone,J.A.^A,Am.J.Physiol.RegulatoryIntegrativeComp.Physiol.，249:5261(1985)非专禾丨J文献4Reducingsaltintakeinpopulations-ReportaWHOForumandTechnicalMeeting,[online],[2009年9月20日检索]，互联网URL:http://www.who.int/dietphysicalactivity/reducingsalt/en/非专利文献5:Riha,W.等人，Chem.Senses,22:778(1997)非专利文献6=Estrella,N.L.等人，Chem.Senses,34:A117-8(2009)非专利文献7:Rudy,B.等人，TrendsinNeuroscience,24:5175(2001)##^lJ；K8Gutman,G.Α.等人，PharmacologicalReviews57473508(2005)非专利文献9=McCormack,T.等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA.87:52275231(1990)非专利文献10HERNANDEZ-PINEDA,R.等人、J.Neurophysiol.82:15121528(1999)非专利文献11=Madeja,M.等人，Neuropharmacology39:202210(2000)非专利文献12:Liu，L.等人，Am.J.Physiol.CellPhysiol.289:868880(2005)非专利文献13=Stahler,F.等人，ChemosensoryPerception1:789(^2008)
发明内容发明所要解决的课题本发明的课题在于鉴定咸味受体蛋白和编码该蛋白的基因，提供用于探索增强或抑制咸味感受的化合物或咸味替代物质的筛选系统。解决课题的方法本发明的发明人设想若在使用咸味受体或调节该受体的分子时，可以有效率地探索、鉴定增强或抑制咸味感受的化合物或咸味替代物质，则进而可以开发不改变呈味的有效的减盐方法，其结果，可以制造维持呈味不变的含盐浓度低的食品。而且，进行了深入研究，结果成功地鉴定了参与咸味感受的分子，从而完成了本发明。本发明如下。(1)咸味调节物质的筛选方法，该方法包括下述步骤使受检物质与表达Kv3.2蛋白的细胞接触，并将所观察到的上述细胞内的阳离子流入量和未使上述受检物质与上述细胞接触时所观察到的上述细胞内的阳离子流入量进行比较。(2)(1)所述的方法，其中，通过在钠离子存在下测定上述细胞的细胞膜电流，来测定上述阳离子的流入量。(3)(1)所述的方法，其中，通过在钠离子非存在下测定上述细胞的细胞膜电流，来测定上述阳离子的流入量。(4)上述⑴或⑵所述的方法，其中，咸味调节物质为咸味增强物质或咸味抑制物质。(5)上述(1)或C3)所述的方法，其中，咸味调节物质为咸味替代物质。(6)上述方法，其中，Kv3.2蛋白具有SEQIDNO:2、SEQIDNO:4、SEQIDNO:6、SEQIDNO:8、SEQIDNO:10、SEQIDNO:12、SEQIDNO:14、SEQIDNO:16、SEQIDNO18、SEQIDNO40,SEQIDNO47,SEQIDNO:49、SEQIDNO:51或SEQIDNO53的氨基酸序列。(7)上述方法，其中，Kv3.2蛋白与SEQIDNO:2、SEQIDNO:4、SEQIDNO:6、SEQIDNO:8,SEQIDNO:10、SEQIDNO:12,SEQIDNO:14,SEQIDNO:16,SEQIDNO:18、SEQIDNO:40,SEQIDNO:47、SEQIDNO:49、SEQIDNO:51或SEQIDNO:53的序列显示至少78%以上的序列同一性，并且能够构成活性随着细胞外钠离子浓度变化而变化的阳离子通道。(8)上述方法，其中，Kv3.2蛋白具有包含1个或多个氨基酸残基的取代、缺失、插入和/或添加的SEQIDNO2,SEQIDN0:4、SEQIDN0:6、SEQIDN0:8、SEQIDNO:10,SEQIDNO:12、SEQIDNO:14、SEQIDNO:16、SEQIDNO:18、SEQIDNO:40,SEQIDNO:47,SEQIDNO:49,SEQIDNO:51或SEQIDNO:53的氨基酸序列，并且能够构成活性随着细胞外钠离子浓度变化而变化的阳离子通道。(9)上述方法，其中Kv3.2蛋白由下述(a)或(b)所示的DNA编码(a)DNA，其中具有SEQIDNO:1、SEQIDNO:3、SEQIDNO:5、SEQIDNO:7、SEQIDNO9,SEQIDNO=IUSEQIDNO13,SEQIDNO15,SEQIDNO17,SEQIDNO39、SEQIDNO:46、SEQIDNO:48、SEQIDNO50或SEQIDNO52的核苷酸序列；(b)DNA，其能够在严格的条件下和与SEQIDNO:1、SEQIDNO:3、SEQIDNO:5、SEQIDNO7,SEQIDNO:9、SEQIDNO=IUSEQIDNO13,SEQIDNO15,SEQIDNO:17、SEQIDNO39,SEQIDNO46、SEQIDNO48、SEQIDN0:50或SEQIDNO:52的核苷酸序列互补的核苷酸序列、或可由上述核苷酸序列制备的探针进行杂交，并且编码能够构成活性随着细胞外钠离子浓度变化而变化的阳离子通道的蛋白。(10)上述方法，其中，Kv3.2蛋白为选自来自人、小鼠、大鼠、爪蟾属的蛙、狗、马、黑猩猩、恒河猴、鸡、负鼠、猪或牛的Kv3.2蛋白同系物，以及它们的突变体、它们的片段和它们的嵌合蛋白。(11)上述方法，其中，上述细胞为以可表达的形态导入有编码Kv3.2蛋白的多核苷酸的卵母细胞。(12)上述方法，其中，上述细胞表达从选自味觉细胞、舌上皮、肾上腺、松果体、甲状腺、黑素细胞和肾脏的组织中分离的Kv3.2基因。(13)Kv3.2蛋白变体，该变体为下述(a)(c)中任一项所示的蛋白(a)蛋白，其中具有SEQIDNO:47、SEQIDNO:49、SEQIDNO51或SEQIDNO53的序列；(b)蛋白，该蛋白与SEQIDNO:47、SEQIDNO:49、SEQIDNO51或SEQIDNO53的序列显示至少78%以上的序列同一性，并且能够构成活性随着细胞外钠离子浓度变化而变化的阳离子通道；(c)蛋白，其具有包含1个或多个氨基酸残基的取代、缺失、插入和/或添加的SEQIDNO47,SEQIDNO49、SEQIDNO:51或SEQIDNO:53的氨基酸序列，并且能够构成活性随着细胞外钠离子浓度变化而变化的阳离子通道。(14)DNA，其编码Kv3.2蛋白变体，该DNA是下述(a)或(b)所示的DNA(a)DNA，其具有SEQIDNO46、SEQIDNO48、SEQIDN0:50或SEQIDNO:52的核苷酸序列；(b)DNA，其能够在严格的条件下和与SEQIDNO:46、SEQIDNO:48、SEQIDNO50或SEQIDNO:52的核苷酸序列互补的核苷酸序列、或可上述核苷酸序列制备的探针进行杂交，并且编码能够构成活性随着细胞外钠离子浓度变化而变化的阳离子通道的蛋白。(15)探索具有正向或负向调节Kv3.2活性的功能的蛋白或构成咸味受体的蛋白的方法，该方法包括鉴定在Kv3.2基因表达细胞中表达的基因中的显示表达概况与Kv3.2基因类似的基因、或在Kv3.2基因表达细胞中表达被抑制的基因。(16)通过鉴定与Kv3.2蛋白或表达该蛋白的细胞作用的化合物来探索咸味调节物质的方法。(17)探索呈味物质或风味物质的方法，该方法包括鉴定与由Kv3.2蛋白和在味觉细胞中特异性表达的蛋白构成的通道或复合体作用的化合物。(18)分离的卵母细胞或味觉细胞，其中以可表达的形态导入有编码Kv3.2蛋白的多核苷酸。发明效果根据本发明鉴定的咸味受体蛋白构成在味觉细胞中表达的咸味受体离子通道。激活该受体的物质作为咸味调节物质、即咸味替代物、咸味增强剂或咸味抑制剂的候选物质是有效的。另外，若使用在细胞表面表达上述受体的细胞，则可以提供咸味替代物、咸味增强剂或咸味抑制剂的简便的筛选系统。另外，包含咸味替代物质或咸味增强物质的食品对抑制过剩的盐分摄取有效，从而对高血压或循环系统疾病的预防有效。图1显示表明小鼠的各种组织中的Kv3.1、Kv3.2、Kv3.3和Kv3.4基因表达的RT-PCR结果(电泳照片)。泳道1舌尖部分(包括菌状乳头)、泳道2轮廓乳头区、泳道3舌两侧部分(包括叶状乳头)、泳道4不含味蕾的舌上皮、泳道5无逆转录酶、泳道6肾脏。图2显示当细胞外钠离子浓度发生变化时所观察到的表达Kv3.2蛋白(人)的非洲爪蟾卵母细胞的细胞膜电流的变化。KCNC2显示Kv3.2cRNA的注入。图3显示当细胞外钠离子浓度由OmM变为96mM时所观察到的表达Kv3蛋白(人)的非洲爪蟾卵母细胞的细胞膜电流之差。图4显示表明小鼠舌上皮中的Kv3.2基因的表达位点的原位杂交结果(显微镜照片)。图5显示所观察到的表达与低分子有机化合物A接触的Kv3.2蛋白(人)的卵母细胞的细胞膜电流。KCNC2显示Kv3.2cRNA的注入。图6显示当细胞外钠离子浓度发生变化时所观察到的表达Kv3.2蛋白(非洲爪蟾)的非洲爪蟾卵母细胞的细胞膜电流。Χ1Κν3.2显示非洲爪蟾的Kv3.2cRNA的注入。具体实施例方式以下，详细说明本发明。本发明的发明人在含有味蕾的小鼠舌上皮组织中确认到编码属于Kv3家族的离子通道Κν3·1、Κν3.2、Kv3.3和Κν3·4(Rudy等人，TrendsinNeuroscience,24:517526(2001))的基因的表达，所述离子通道是原来被认为在进行高频率刺激的神经细胞中发挥作用，当细胞的膜电位去极化至_20mV以上时显示出电流的钾通道；还发现人Kv3.2基因在非洲爪蟾卵母细胞中的表达能够以细胞膜电流随着细胞外钠离子浓度变化而变化的形式参与咸味感受。基于该发现，发现Kv3.2发挥咸味受体离子通道的作用，可用于筛选新的咸味调节物质。另外，他们确认Kv3.2基因在味蕾中表达，在咸味响应灵敏度不同的两种小鼠中发现了Kv3.2基因存在着相应于灵敏度的表达量之差，进一步确认Kv3.2为咸味受体。另外，本发明的发明人新发现了味蕾中的Kv3.2蛋白的剪接变体。本发明的方法包括下述步骤使受检物质与表达Kv3.2蛋白的细胞接触，并将所观察到的上述细胞内的阳离子流入量和未使上述受检物质与上述细胞接触时所观察到的上述细胞内的阳离子流入量进行比较。Kv3.2蛋白是构成作为Kv3家族的一员的钾通道的蛋白，由本发明的发明人首次发现了Kv3.2蛋白具有随着细胞外钠离子浓度变化而变化的阳离子通道活性。Kv3.2蛋白是由Kcnc2基因(也记作KCNC2)编码的多肽。在本发明中，Kv3.2蛋白的例子包括具有SEQIDNO:2、SEQIDNO:4、SEQIDNO6,SEQIDNO:8,SEQIDNO:10、SEQIDNO:12、SEQIDNO:14,SEQIDNO:16,SEQIDNO:18、SEQIDNO:40,SEQIDNO:47,SEQIDNO:49,SEQIDNO:51或SEQIDNO:53的氨基酸序列的蛋白。作为编码人Kv3.2蛋白的多核苷酸，有4种核苷酸序列注册在基因数据库(NationalCenterforBiotechnologyInformation,http://www.ncbi.nlm.nih.gov/或Ensemblproject,http://www.ensembl.org/index.html,NM_139136,NM_139137,NM_153748,AY243473)中。SEQIDNO=USEQIDNO:3、SEQIDNO:5禾口SEQIDNO:7的核苷酸序列相当于上述各核苷酸序列。由各核苷酸序列编码的氨基酸序列见SEQIDNO2,SEQIDNO4,SEQIDNO:6和SEQIDNO:8。这些各氨基酸序列除C末端区外具有共通的序列(相当于SEQIDNO:2的1538位的部分)，认为它们是剪接变体。另夕卜，在同样的数据库中，有1种编码小鼠Kv3.2蛋白的多核苷酸被注册(ΝΜ_001025581，SEQIDNO:9)。由SEQIDNO:9的核苷酸序列编码的氨基酸序列见SEQIDN0:10。另外，作为编码大鼠Kv3.2蛋白的多核苷酸，有4种核苷酸序列注册(NM_139216，NM_139217，ENSRN0T00000049943，X62839)。这些核苷酸序列见SEQIDNO=IUSEQIDN0:13、SEQIDNO:15和SEQIDNO:17。由这些核苷酸序列编码的氨基酸序列见SEQIDNO12,SEQIDNO14,SEQIDN0:16和SEQIDNO:18。这些氨基酸序列除C末端区外也具有共通的序列(相当于SEQIDN0:12的1593位的部分)，认为它们是剪接变体。另外，如后述实施例所示，非洲爪蟾的Kv3.2蛋白基因被分离出来，显示该蛋白具有随着细胞外钠离子浓度变化而变化的阳离子通道活性。该基因的核苷酸序列见SEQIDNO39,由该基因编码的Kv3.2蛋白的氨基酸序列见SEQIDNO:40。并且，如后述实施例所示，从包含味蕾的小鼠舌上皮组织中分离出4种小鼠Kv3.2基因的剪接变体。这些剪接变体的核苷酸序列见SEQIDNO46,SEQIDNO48、SEQIDN0:50和SEQIDN0:52。由这些核苷酸序列编码的氨基酸序列分别见SEQIDNO47、SEQIDNO:49、SEQIDNO51和SEQIDNO:53。SEQIDNO:10、SEQIDNO:47、SEQIDNO:49、SEQIDNO51和SEQIDNO53的氨基酸序列除C末端区外具有共通的序列(相当于SEQIDNO10的1597位的部分)。本发明的方法中使用的Kv3.2蛋白还包含种间同系物，例如除了上述的具有来自人、小鼠、大鼠和非洲爪蟾的序列的蛋白外，还可以是来自狗、马、黑猩猩、鸡、负鼠、猪或牛的Kv3.2蛋白。编码这些蛋白的基因的序列信息分别以下述编号注册，即，狗XM_538289、马ΧΜ_001488185、黑猩猩XR_020952、鸡XM_0012352M、负鼠ΧΜ_001363374,ΧΜ_001363455、猪ΧΜ_001926426、ΧΜ_001924780,以及牛XM_590276。另外，关于恒河猴、变色龙蜥蜴、绒猴、豚鼠、懒猴、犰狳、长鼻袋鼠、小马岛猬、刺猬、三刺鱼、大猩猩、大象、沙袋鼠、狐猴、小蝙蝠、鼠兔、兔、婴猴、红毛猩猩、蹄兔、果蝠、駒鼯、松鼠、斑马雀、横纹东方飩、眼镜猴、树駒、以及海豚，编码它们的Kv3.2蛋白的基因的序列信息分别以下述编号注册，即，恒河猴ENSMMUG00000012362、变色龙蜥蜴ENSACAG00000007691、绒猴ENSCJAG00000001261、豚鼠ENSCP0G00000003474、懒猴ENSCH0G00000007167、犰狳ENSDN0G00000013383、长鼻袋鼠ENSD0RG00000000056、小马岛猬ENSETEG00000010484、刺猬ENSEEUG00000002220、三刺鱼ENSGACG00000019441、大猩猩ENSGG0G00000003896、大象ENSLAFG00000031982、沙袋鼠ENSMEUG00000007789、狐猴ENSMICG00000017734、小蝙蝠ENSMLUG00000010813、鼠兔ENS0PRG00000017272、兔ENS0CUG00000004467、婴猴ENS0GAG00000000768、红毛猩猩ENSPPYG00000004780、蹄兔ENSPCAG00000015808、果蝠ENSPVAG00000010964、駒鼯ENSSARG00000006415、松鼠ENSST0G00000004842、斑马雀ENSTGUG00000007;354、横纹东方飩ENSTRUG00000003532、眼镜猴ENSTSYG00000010689、树鼠句ENSTBEG00000001105、以及海豚ENSTTRG00000013226。编码Kv3.2的基因并不限于具有上述基因信息的基因或具有公知序列的基因，只要由所选择的基因编码的Kv3.2蛋白能够构成活性随着细胞外钠离子浓度变化而变化的阳离子通道，这些基因的同系物或人工修饰体等具有保守突变的基因也可使用。即，可以是编码下述蛋白的基因具有在1个或多个位置包含1个或多个氨基酸残基的取代、缺失、插入和/或添加的公知蛋白的氨基酸序列的蛋白等。所述Kv3.2蛋白“能够构成活性随着细胞外钠离子浓度变化而变化的阳离子通道”是指，当表达该蛋白的细胞与钠离子接触时，具有增加由于阳离子向细胞内流入所产生的细胞膜电位的活性。阳离子的例子包括钠离子、钙离子、镁离子、锂离子、铵离子等，优选为钠离子。这里，尽管“1个或多个”氨基酸残基的数目是指根据氨基酸残基在蛋白的立体结构中的位置或氨基酸残基的种类而不同，但具体可以优选120个、更优选110个、进一步优选15个、特别优选13个。保守突变的代表性突变为保守取代。作为保守取代，当取代位点为芳族氨基酸时，是指Wie、Trp和Tyr间互相取代的突变；当取代位点为疏水性氨基酸时，是指Leu、Ile和Val间互相取代的突变；当为极性氨基酸时，是指Gln和Asn间互相取代的突变；当为碱性氨基酸时，是指Lys、Arg和His间互相取代的突变；当为酸性氨基酸时，是指Asp和Glu间互相取代的突变；当为具有羟基的氨基酸时，是指Ser和Thr间互相取代的突变。被看作保守取代的取代具体包括由Ala取代成Ser或Thr；由Arg取代成GlruHis或Lys；由Asn取代成Glu、Gln、Lys、His或Asp；由Asp取代成AsruGlu或Gln；由Cys取代成Ser或Ala；由Gln取代成Asn、Glu、Lys、His、Asp或Arg；由Glu取代成Gly、Asn、Gin、Lys或Asp；由Gly取代成Pro；由His取代成Asn、Lys,Gin、Arg或Tyr；由Ile取代成Leu、Met、Val或Phe；由Leu取代成lie、Met、Val或Phe；由Lys取代成Asn,Glu,Gin、His或Arg；由Met取代成lie、Leu、Val或Phe；由Phe取代成Trp,Tyr、Met、Ile或Leu；由Ser取代成Thr或Ala；由Thr取代成Ser或Ala；由Trp取代成Phe或Tyr；由Tyr取代成His、Phe或Trp；以及由Val取代成Met、Ile或Leu。上述的氨基酸的取代、缺失、插入、添加或倒位等还可以是由于基因所来源的微生物的个体差异或种的不同等天然发生的突变或变异的结果(突变体或变体)。这样的基因例如可以通过位点特异性诱变法修饰公知的基因的核苷酸序列使所编码的蛋白的特定位点的氨基酸残基包括氨基酸残基的取代、缺失、插入或添加而获得。并且，上述的具有保守突变的基因可以是编码下述蛋白的基因相对于所编码的氨基酸序列整体具有78%以上、优选80%以上、进一步优选90%以上、更优选95%以上、进一步优选97%以上、特别优选99%以上的同源性，并且与野生型Kv3.2蛋白具有同等功能的蛋白。在本说明书中，“同源性”(homology)有时是指“同一性”(identity)。另外，基因序列中的各密码子可被取代成在导入有基因的宿主中容易使用的其它密码子。具有保守突变的基因可以是通过诱变剂处理等通常用于突变处理的方法获得的基因。并且，Kv3.2基因只要可以在基因导入到宿主细胞中时表达Kv3.2蛋白，可以包含1个或多个内含子。编码Kv3.2的DNA(以下有时记作“Kv3.2基因”。)的例子包括在严格的条件下可以和与公知的基因序列互补的核苷酸序列或可由该互补序列制备的探针进行杂交，并且编码与公知的Kv3.2蛋白具有同等功能的蛋白的多核苷酸。“严格的条件”是指，形成所谓的特异性杂化物、而不形成非特异性杂化物的条件。虽然难以将该条件明确地数值化，但严格条件的例子包括同源性高的多核苷酸彼此之间、例如具有78%以上同源性、优选80%以上同源性、进一步优选90%以上同源性、更优选95%以上同源性、特别优选97%以上同源性的多核苷酸彼此之间杂交、而同源性较其低的多核苷酸彼此之间不杂交的条件；或普通DNA杂交的清洗条件、即在相当于在60°C下、1XSSC、0.1%SDS，优选在60°C下、0.1XSSC、0.1%SDS，进一步优选在68°C下、0.IXSSC,0.1%SDS的盐浓度和温度下清洗1次、更优选2或3次的条件。作为探针，还可以使用与该基因互补的部分序列。这样的探针可以以根据公知的基因序列制作的寡核苷酸为引物、以包含这些核苷酸序列的DNA片段为模板，通过PCR来制作。例如，当使用具有约300bp长度的DNA片段作为探针时，杂交的清洗条件可以是50°C、2XSSC、0.1%SDS。比较各种Kv3家族蛋白的同源性时，虽然在上述各种动物的Kv3.2蛋白同系物间显示出78%以上的同源性(同一性)，但在比较Kv3.2蛋白与其他Kv3家族蛋白时最高的同源性为74%。Kv3.2基因可如下获得根据公知的Kv3.2基因或本说明书中公开的新的Kv3.2基因、例如编码具有SEQIDNO:2、SEQIDNO:4、SEQIDNO:6、SEQIDNO:8、SEQIDNO10、SEQIDNO:12、SEQIDNO:14、SEQIDNO:16、SEQIDNO:18、SEQIDNO:40、SEQIDNO47,SEQIDNO49、SEQIDNO:51或SEQIDNO:53所示的氨基酸序列的多肽的多核苷酸的核苷酸序列的信息设计适当的引物或探针，使用上述引物或探针和来自目标生物[例如哺乳动物(例如人、小鼠、大鼠、狗、马、黑猩猩、恒河猴、鸡、负鼠、猪或牛等)]的试样(例如总RNA、mRNA组分、cDNA文库)，通过实施聚合酶链反应(PCR)法、DNA杂交或RNA杂交等而获得。Kv3.2基因只要编码能够构成活性随着细胞外钠离子浓度变化而变化的阳离子通道的蛋白即可，可以是片段，也可以是编码Kv3.2蛋白或其片段与其他蛋白的嵌合蛋白的基因。例如，如上所述，存在Kv3.2蛋白的剪接变体，该共通部分(例如SEQIDNO2的1538位)的C末端侧区域可被缺失或取代成其他序列的可能性高。将编码Kv3.2蛋白的多核苷酸以可表达的形态导入适当的宿主细胞中，使Kv3.2蛋白表达，从而可以获得具有咸味受体离子通道的细胞。例如，通过将编码Kv3.2蛋白的直链状DNA或包含编码Kv3.2蛋白的序列的载体导入宿主细胞中，可以使Kv3.2蛋白表达。可表达的形态的序列的例子包括根据DNA信息制备的、并且在编码Kv3.2蛋白的序列的上游包含编码Kv3.2蛋白的序列和转录和翻译所必需的序列的序列，使能够生成Kv3.2蛋白。另外，通过向宿主细胞中注入编码Kv3.2蛋白的cRNA，也可以获得具有咸味受体离子通道的细胞。此时，在cRNA的5’末端侧包含翻译所必需的序列。转录所必需的序列的例子包括启动子和增强子等表达调节序列。还可以包含转录终止序列。翻译所必需的序列的例子包括核糖体结合位点。并且，根据需要可以包含加工信息位点、例如RNA剪接位点、聚腺苷酸化位点等。启动子的例子包括来自免疫球蛋白基因、SV40、腺病毒、牛乳头状瘤病毒、巨细胞病毒等的启动子。作为导入有编码Kv3.2蛋白的多核苷酸的细胞，优选动物细胞、昆虫细胞或酵母，特别优选动物细胞。例如，可以使用味觉细胞被浓缩的组分、分离的味觉细胞、或从选自舌上皮、肾上腺、松果体、甲状腺、黑素细胞和肾脏的组织中分离的组织等。认为在导入表达编码Kv3.2蛋白的多核苷酸的重组载体时可以进行暂时的功能表达的细胞的具体例子包括非洲爪蟾卵母细胞、中国仓鼠卵巢细胞(CHO)、人胚肾(HEK)细胞、Sf-9昆虫细胞等。本发明提供以能够表达的形态导入有这样的编码Kv3.2蛋白的多核苷酸的细胞。作为细胞，优选卵母细胞或味觉细胞，特别优选味觉细胞，其适用于咸味调节物质的筛选。作为向这些细胞中导入编码Kv3.2蛋白的多核苷酸的方法，可以采用公知的方法。向细胞中导入多核苷酸等的操作所必需的技术记载在Sambrook，J.，Fritsch，E.F.和Maniatis,Τ.,"MolecularCloningALaboratoryManual,第二版，，，ColdSpringHarborLaboratoryPress,(1989)等中。如实施例所示，表达Kv3.2蛋白的细胞具有随着细胞外钠离子浓度变化而变化的阳离子通道活性。因此，在细胞中表达的Kv3.2蛋白能够构成活性随着细胞外钠离子浓度变化而变化的阳离子通道。推测Kv3.2蛋白以多聚体的形式构成活性随着细胞外钠离子浓度变化而变化的阳离子通道，但只要表达Kv3.2蛋白的细胞具有随着细胞外钠离子浓度变化而变化的阳离子通道活性，Kv3.2蛋白可以是单体或多聚体。“阳离子通道”是指，允许钠离子、钙离子和钾离子等阳离子流入或流出细胞内的通道。并且，如实施例所示，编码Kv3.2蛋白的基因在味觉感受器即舌的味蕾中表达，由于其表达量在咸味感受灵敏度高的小鼠种系中较在咸味感受灵敏度低的小鼠种系中高，由此支持了Kv3.2蛋白是调节咸味感受灵敏度的咸味受体蛋白。因此，通过鉴定与Kv3.2蛋白或表达该蛋白的细胞作用的化合物，可以探索咸味调节物质。作为这样的化合物的鉴定方法，除上述方法外，例如还可以通过测定纯化的Kv3.2蛋白与受检物质的结合来进行。此外，通过以相关蛋白(例如Kv1.2、Chen等人、Proc.Nat1.Acad.Sci.USA,107:1135211357(2010))的立体结构信息为参考使用计算机推测其立体结构，再使用计算机选择与能够影响离子通道活性的位点具有亲和性的化合物，可以有效率地探索与Kv3.2蛋白作用的化合物。使受检物质与如上操作得到的表达Kv3.2蛋白的细胞接触，再将所观察到的上述细胞内的阳离子流入量和未使上述受检物质与上述细胞接触时所观察到的上述细胞内的阳离子流入量进行比较，从而可以筛选咸味调节物质。若在受检物质与表达Kv3.2蛋白的细胞接触时所观察到的上述细胞内的阳离子流入量较未使上述受检物质与上述细胞接触时所观察到的上述细胞内的阳离子流入量多，则判断为受检物质激活咸味受体通道；若在受检物质与表达Kv3.2蛋白的细胞接触时所观察到的上述细胞内的阳离子流入量较未使上述受检物质与上述细胞接触时所观察到的上述细胞内的阳离子流入量少，则判断为受检物质使咸味受体通道失活。另外，在Kv3.2基因表达细胞中表达的基因中，通过鉴定显示表达概况与Kv3.2基因类似的基因或在Kv3.2基因表达细胞中表达被抑制的基因，还可以探索具有正向或负向调节Kv3.2活性的功能的蛋白或构成咸味受体的蛋白。Kv3.2活性是指，Kv3.2蛋白构成在表达其的细胞中随着细胞外钠离子浓度变化而变化的阳离子通道的功能。另外，Kv3.2活性还是指Kv3.2蛋白作为咸味受体蛋白的活性。显示表达概况与Kv3.2基因类似的基因是指，基因表达的组织特异性与Kv3.2基因表达的组织特异性类似的基因。作为鉴定显示表达概况类似的基因的方法之一，可以列举DNA微阵列法等综合性基因表达分析方法。具体而言，从各种组织中提取RNA，利用DNA微阵列法等综合性基因表达分析方法探索与Kv3.2基因显示基因表达的组织特异性类似的基因，从而可以鉴定这样的基因。在Kv3.2基因表达细胞中表达被抑制的基因是指，在Kv3.2基因表达的细胞中表达被抑制、在Kv3.2基因未表达的细胞中可以确认到表达的基因。作为鉴定表达被抑制的基因的方法之一，可以列举DNA微阵列法等综合性基因表达分析方法。具体而言，从各种组织中提取RNA，利用DNA微阵列法等综合性基因表达分析方法在Kv3.2基因表达组织中探索未观察到表达的基因，从而可以鉴定这样的基因。如上所述鉴定的基因，是编码具有调节Kv3.2活性的功能的蛋白或构成咸味受体的蛋白的基因，推测这样的蛋白与Kv3.2蛋白一同构成通道或复合体，参与味觉感受。并且，通过鉴定与由作为味觉受体的Kv3.2蛋白和在味觉细胞中特异性表达的蛋白构成的通道或复合体作用的化合物，还可以探索呈味物质或风味物质。风味物质是指修饰呈味的物质，其可以作为风味添加剂在食品中使用。作为呈味物质或风味物质，更具体而言，可以列举咸味调节物质。已知激活味觉受体的物质通过促进味觉受体细胞的兴奋而显示出呈味或增强呈味。因此，使用在细胞膜上表达咸味受体通道的细胞，可以筛选激活咸味受体通道或使其失活的物质、即咸味调节物质。即，激活咸味受体通道的物质被期待着通过促进原来咸味受体离子通道被表达的咸味受体细胞的兴奋来增强咸味感受。因此，在钠离子非存在下激活咸味受体通道的物质作为咸味替代物质的候选是有效的，而在钠离子存在下激活咸味受体通道的物质作为咸味增强物质的候选物质是有效的。因此，可以将表达Kv3.2蛋白的细胞本身用于筛选咸味替代或咸味增强物质。另外，使咸味受体通道失活的物质作为咸味抑制物质的候选是有效的。表达Kv3.2蛋白的细胞内的阳离子流入量，可以通过将细胞悬浮于包含阳离子的溶液中，之后直接或间接地测定流入细胞内的阳离子的量来测定。细胞内的阳离子流入量，例如可以通过测定在细胞外阳离子存在下的上述细胞的电生理学性质、例如细胞电流来测定。例如，在钠离子的存在下使表达Kv3.2蛋白的细胞与受检物质接触，检测细胞膜电位或膜电流的变化、或细胞内阳离子浓度，从而可以筛选咸味增强物质或咸味抑制物质等咸味调节物质。另外，通过在钠离子非存在下使表达Kv3.2蛋白的细胞与受检物质接触，之后检测细胞膜电位或膜电流的变化、或细胞内阳离子浓度，可以筛选咸味替代物质。以下例示使用表达Kv3.2蛋白的细胞筛选咸味调节物质的具体方法。(1)使编码Kv3.2蛋白的cRNA在非洲爪蟾卵母细胞中表达，按照双极电压钳法，以咸味受体离子通道电流的增强或减弱为指标，检索与咸味受体离子通道发生作用的配体。例如，若向膜电位夹钳在保持电位-60SOmV的细胞的细胞外液中添加试验化合物时与未添加试验化合物时相比内向电流增加，则可以判定上述试验化合物是激活本发明的多肽的物质。另外，使细胞外钠离子浓度阶段性或连续地发生变化，可以测定内向电流。(2)对于使咸味受体离子通道在细胞表面表达的细胞，在按照电压钳法、特别是全细胞膜电压钳法进行了膜电位夹钳的状态下，以咸味受体离子通道电流的增强或减弱为指标，检索与咸味受体离子通道发生作用的配体。例如，若在钠离子存在下向膜电位夹钳在保持电位-SOmV的细胞的细胞外液中添加试验化合物时与未添加试验化合物时相比内向电流增加，则可以判定上述试验化合物为激活本发明的多肽的物质、即咸味增强物质。(3)对于使咸味受体离子通道在细胞表面表达的细胞，预先使其摄取膜电位敏感性色素，之后在钠离子存在下添加试验化合物，通过分析(即测定或检测)此时细胞内的上述色素的荧光强度的变化，来分析Kv3.2蛋白是否被活化。本方法利用了膜电位敏感性色素可以光学检测离子通道的开放所伴随的膜电位的变化的性质。更具体而言，作为上述膜电位敏感性色素，可以使用DiBAC[双(1，3_二丁基巴比妥酸)三次甲基氧杂菁，MolecularProbes]或其衍生物、或膜电位测定试剂盒(MolecularDevices)等。(4)对于使咸味受体离子通道在细胞表面表达的细胞，预先导入阳离子敏感性色素(例如，SBFI，CoroNaGreen,SodiumGreen(MolecularProbes等)，之后在钠离子存在下使配体候选化合物与咸味受体离子通道表达细胞接触一定时间，以此时的荧光强度比(细胞内阳离子浓度)的变化为指标，检索咸味增强或抑制的物质。(5)通过在钠离子非存在下实施上述(2)⑷所述的方法，可以探索咸味替代物质。实施例以下，参照实施例来具体说明本发明，但这些实施例并不限定本发明的范围。只要没有特别说明，则按照公知的方法(Maniatis，T.等人，“MolecularCloning-ALaboratoryManual，，,ColdSpringHarborLaboratory,NY,1982；禾口Hille,B.,IonicChannelsofExcitableMembranes，第二版，SinauerAssociatesInc.,MA,1992)实施这些实施例的程序。〔实施例1〕小鼠Kv3家族通道基因的表达分析使用小鼠舌上皮组织，通过RT-PCR法，按照以下程序分析编码具有SEQIDNO=IO所示的氨基酸序列的蛋白的Kv3家族通道基因在舌上皮中的表达分布。从小鼠的舌上分离上皮，再分别切除包含菌状乳头的舌尖部分、包含轮廓乳头的区域(舌中央后部)、包含叶状乳头的舌两侧部分、以及不含味蕾的上皮。另外切除肾脏，并粉碎。使用RNA提取试剂盒(AbsolutelyRNAMicroprep试剂盒，Stratagene)，从各组织中提取RNA。使用RT-PCR用SuperScriptIII第一链合成系统(Invitrogen)使提取的RNA逆转录，合成第一链cDNA。以得到的第一链cDNA为模板，组合表1所示的引物进行PCR，扩增Κν3.1、Κν3.2、Kv3.3和Kv3.4各蛋白的基因的cDNA。表权利要求1.咸味调节物质的筛选方法，该方法包括下述步骤使受检物质与表达Kv3.2蛋白的细胞接触，并将所观察到的上述细胞内的阳离子流入量和未使上述受检物质与上述细胞接触时所观察到的上述细胞内的阳离子流入量进行比较。2.权利要求1所述的方法，其中，通过在钠离子存在下测定上述细胞的细胞膜电流，来测定上述阳离子的流入量。3.权利要求1所述的方法，其中，通过在钠离子非存在下测定上述细胞的细胞膜电流，来测定上述阳离子的流入量。4.权利要求1或2所述的方法，其中，咸味调节物质为咸味增强物质或咸味抑制物质。5.权利要求1或3所述的方法，其中，咸味调节物质为咸味替代物质。6.权利要求15中任一项所述的方法，其中，Kv3.2蛋白具有SEQIDNO:2、SEQIDNO:4、SEQIDNO:6、SEQIDNO:8、SEQIDNO:10、SEQIDNO:12、SEQIDNO:14、SEQIDNO16,SEQIDNO18、SEQIDNO40、SEQIDNO47、SEQIDNO49、SEQIDNO:51或SEQIDNO53的氨基酸序列。7.权利要求15中任一项所述的方法，其中，Kv3.2蛋白与SEQIDNO:2、SEQIDNO:4、SEQIDNO:6,SEQIDN0:8、SEQIDNO:10、SEQIDNO:12、SEQIDNO:14、SEQIDNO:16,SEQIDNO:18,SEQIDNO:40、SEQIDNO:47、SEQIDNO:49、SEQIDNO:51或SEQIDNO53的序列显示至少78%以上的序列同一性，并且能够构成活性随着细胞外钠离子浓度变化而变化的阳离子通道。8.权利要求15中任一项所述的方法，其中，Kv3.2蛋白具有包含1个或多个氨基酸残基的取代、缺失、插入和/或添加的SEQIDNO2,SEQIDN0:4、SEQIDNO:6、SEQIDNO:8、SEQIDNO:10、SEQIDNO:12、SEQIDNO:14、SEQIDNO:16、SEQIDNO:18、SEQIDNO:40,SEQIDNO:47、SEQIDNO:49、SEQIDNO:51或SEQIDNO:53的氨基酸序列，并且能够构成活性随着细胞外钠离子浓度变化而变化的阳离子通道。9.权利要求15中任一项所述的方法，其中Kv3.2蛋白由下述(a)或(b)所示的DNA编码(a)DNA，其具有SEQIDNO=USEQIDN0:3、SEQIDN0:5、SEQIDN0:7、SEQIDNO:9、SEQIDNO:11,SEQIDNO:13、SEQIDNO:15、SEQIDNO:17、SEQIDNO:39、SEQIDNO:46,SEQIDNO:48、SEQIDNO:50或SEQIDNO:52的核苷酸序列；(b)DNA，其能够在严格的条件下和与SEQIDNO=USEQIDNO:3、SEQIDNO:5、SEQIDNO:7,SEQIDN0:9、SEQIDNO:11、SEQIDNO:13、SEQIDNO:15、SEQIDNO:17、SEQIDNO:39,SEQIDNO:46、SEQIDNO:48、SEQIDNO:50或SEQIDNO:52的核苷酸序列互补的核苷酸序列、或可由上述核苷酸序列制备的探针进行杂交，并且编码能够构成活性随着细胞外钠离子浓度变化而变化的阳离子通道的蛋白。10.权利要求15中任一项所述的方法，其中，Kv3.2蛋白为选自来自人、小鼠、大鼠、爪蟾属的蛙、狗、马、黑猩猩、恒河猴、鸡、负鼠、猪或牛的Kv3.2蛋白同系物，以及它们的突变体、它们的片段和它们的嵌合蛋白。11.权利要求110中任一项所述的方法，其中，上述细胞为以可表达的形态导入有编码Kv3.2蛋白的多核苷酸的卵母细胞。12.权利要求110中任一项所述的方法，其中，上述细胞表达从选自味觉细胞、舌上皮、肾上腺、松果体、甲状腺、黑素细胞和肾脏的组织中分离的Kv3.2基因。13.Kv3.2蛋白变体，该变体为下述(a)(c)中任一项所示的蛋白(a)蛋白，其具有SEQIDNO47,SEQIDNO49、SEQIDNO:51或SEQIDNO:53的序列；(b)蛋白，该蛋白与SEQIDNO47,SEQIDNO:49、SEQIDNO:51或SEQIDNO53的序列显示至少78%以上的序列同一性，并且能够构成活性随着细胞外钠离子浓度变化而变化的阳离子通道；(c)蛋白，其具有包含1个或多个氨基酸残基的取代、缺失、插入和/或添加的SEQIDNO:47、SEQIDNO:49、SEQIDNO51或SEQIDNO53的氨基酸序列，并且能够构成活性随着细胞外钠离子浓度变化而变化的阳离子通道。14.DNA,其编码Kv3.2蛋白变体，该DNA是下述(a)或(b)所示的DNA(a)DNA，其具有SEQIDNO46、SEQIDNO48、SEQIDN0:50或SEQIDNO:52的核苷酸序列；(b)DNA，其能够在严格的条件下和与SEQIDNO46、SEQIDNO48、SEQIDNO:50或SEQIDNO:52的核苷酸序列互补的核苷酸序列、或可由上述核苷酸序列制备的探针进行杂交，并且编码能够构成活性随着细胞外钠离子浓度变化而变化的阳离子通道的蛋白。15.探索具有正向或负向调节Kv3.2活性的功能的蛋白或构成咸味受体的蛋白的方法，该方法包括鉴定在Kv3.2基因表达细胞中表达的基因中的显示表达概况与Kv3.2基因类似的基因、或在Kv3.2基因表达细胞中表达被抑制的基因。16.探索咸味调节物质的方法，该方法包括鉴定与Kv3.2蛋白或表达该蛋白的细胞发生作用的化合物。17.探索呈味物质或风味物质的方法，该方法包括鉴定与由Kv3.2蛋白和在味觉细胞中特异性表达的蛋白构成的通道或复合体发生作用的化合物。18.分离的味觉细胞，其中以可表达的形态导入有编码Kv3.2蛋白的多核苷酸。全文摘要通过使受检物质与表达Kv3.2蛋白的细胞接触，并将所观察到的上述细胞内的阳离子流入量和未使上述受检物质与上述细胞接触时所观察到的上述细胞内的阳离子流入量进行比较，来筛选咸味替代化合物、或者增强或抑制咸味感受的化合物等咸味调节物质。文档编号C12N15/09GK102575279SQ20108004501公开日2012年7月11日申请日期2010年9月29日优先权日2009年9月29日发明者前川誉实,开裕子,江藤让,石渡裕申请人:味之素株式会社