专利名称：经过修饰的启动子的制作方法
技术领域：
本发明涉及经过修饰的启动子、各自包含该启动子的表达载体和转化体、以及使用该转化体制备目标基因产物的方法。
背景技术：
通过微生物的使用，已经在以工业规模生产很多有用物质，包括食品，例如酒精饮料、味增、和酱油(大豆来源)；以及其他物质，例如氨基酸、有机酸、与核酸相关的物质、抗生素、糖、脂质、和蛋白质。这些物质可用于宽范围的领域，例如食品、医药、诸如洗涤剂和化妆品的日用品、以及化学品的原材料。在通过微生物的介导来工业生产有用物质时，产率的加强是一个重要议题。被用来加强产率的一个手段是通过例如突变的遗传技术来对产生目标物质的细菌进行育种。近年来，随着微生物遗传学和生物技术的发展，人们聚焦于更多基于重组技术等的有效方法， 以用来生产有用物质。已经对基因转录所需的启动子进行了大量研究。就枯草杆菌而言，来源于芽孢杆菌KSM-64菌株(FERM BP-2886)的碱性纤维素酶基因的启动子域(参见，例如非专利文献 1)、来源于芽孢杆菌KSM-S237菌株(FERM BP-7875)的碱性纤维素酶基因上游所存在的启动子域(参见，例如专利文献1和非专利文献幻、以及其他启动子域被用作使编码外源蛋白质或多肽的基因活跃转录的启动子域。然而，为在工业生产中减少生产成本，需要实现更高产率的启动子或微生物。通常来说，启动子域具有多个与转录调控相关的位点。通过外部信号的介导，这些位点在促进或抑制基因表达中发挥作用。例如，当微生物的培养基包含大量例如葡萄糖的降解物时，微生物主要将该降解物作为碳源进行利用，且用于降解高分子糖的酶的表达被抑制。这种现象被称为“降解物阻遏”，其曾在大肠杆菌、芽孢杆菌等中被观察到。已知枯草杆菌中的降解物阻遏发生在转录水平。芽孢杆菌中涉及降解物阻遏的区域被称为“降解物应答元件(ere) ”。非专利文献3已经公开，可以通过在来源于枯草杆菌的α -淀粉酶基因的降解物阻遏操纵基因域上进行点突变来增加或减少降解物阻遏。同时，在来源于枯草杆菌的内切葡聚糖酶的启动子中，有一段与α-淀粉酶的降解物阻遏域相似的核苷酸序列，其被称为 “降解物阻遏操纵基因类似序列”(非专利文献2)。然而，该序列的真正作用还没有被阐明。[专利文献 1] JP-A-2000-210081[非专利文献 1] Sumitomo et al. , Biosci. Biotech. Biochem. , 59 :2172-2175, 1995[非专利文献2]Hakamada et al. , Biosci. Biotech. Biochem. 64 :2281-2289, 2000[非专利文献 3]Weickert & Chambliss, Proc, Natl. Acad. Sci.USA,87 6238-6242，1990
发明内容
本发明涉及经过修饰的启动子，其包含来源于属于芽孢杆菌属细菌的启动子的核苷酸序列，其中至少一个选自如下的核苷酸序列被修饰SEQ ID NO :1所表示的核苷酸序列；与SEQ ID NO :1所表示的核苷酸序列相当的核苷酸序列，只是其中一个或多个碱基被取代、缺失、添加或插入；以及相对于SEQ ID NO :1所表示的核苷酸序列具有70%或更高的序列一致性的核苷酸序列。本发明也涉及用于制备经过修饰的启动子的方法，该方法包括在来源于属于芽孢杆菌属细菌的启动子中修饰至少一个选自如下的核苷酸序列SEQ ID NO :1所表示的核苷酸序列；与SEQ ID NO :1所表示的核苷酸序列相当的核苷酸序列，只是其中一个或多个碱基被取代、缺失、添加或插入；以及相对于SEQ ID NO :1所表示的核苷酸序列具有70%或更高的序列一致性的核苷酸序列。本发明也涉及上述经过修饰的启动子或通过上述方法制备的经过修饰的启动子， 其中一个或多个碱基被进一步取代、缺失、添加或插入。本发明也涉及表达载体，其包含上述经过修饰的启动子或通过上述方法制备的经过修饰的启动子。本发明也涉及转化体，其包含上述经过修饰的启动子或通过上述方法制备的经过修饰的启动子。本发明也涉及制备目标基因产物的方法，该方法包括采用转化体。在一个实施方式中，包含相对于SEQ ID NO 1所表示的核苷酸序列具有70%或更高的序列一致性的核苷酸序列是SEQ ID NO :2所表示的核苷酸序列。在另一个实施方式中，来源于属于芽孢杆菌属细菌的启动子是来自枯草杆菌或枯草杆菌突变菌株的启动子。在另一个实施方式中，来源于属于芽孢杆菌属细菌的启动子是来自芽孢杆菌 KSM-64菌株(FERM BP-2886)中碱性纤维素酶基因的启动子；来自芽孢杆菌KSM-S237菌株 (FERM BP-7875)中碱性纤维素酶基因的启动子；或含有相对于任意上述启动子的核苷酸序列具有70%或更高的序列一致性的核苷酸序列、并具有ere类似序列的启动子。在另一个实施方式中，核苷酸序列的修饰是核苷酸序列中碱基的缺失、取代或添加。在另一个实施方式中，经过修饰的启动子被可操作性地(operably)连接至编码目标基因产物的基因的上游。
[图1]通过SOE-PCR法制备具有缺失的突变启动子的流程。[图2]制备pDL2-S237质粒的流程。[图3]本发明中转化体以及野生型的β-半乳糖苷酶活性。A 在含有葡萄糖的培养基中的活性。B:在含有麦芽糖的培养基中的活性。C:在含有山梨醇的培养基中的活性。 D 在含有模型糖化液的培养基中的活性。
具体实施方式
本发明涉及提供加强基因转录的经过修饰的启动子、各自含有该启动子的表达载体和转化体、以及通过使用该转化体制备目标基因产物的方法。本发明者已经在属于芽孢杆菌属微生物中的纤维素酶基因的启动子域上发现了多个与降解物阻遏序列相似的序列。本发明者也已经发现，当这些发现的序列被突变时，由该启动子调控的基因表达显著增加，且由该基因编码的基因产物的产率增加。本发明的经过修饰的启动子显著增加了与启动子下游相连的基因的转录量。因此，根据本发明，可更加有效地获得目标基因产物。在本发明中，氨基酸序列之间的序列一致性以及核苷酸序列之间的序列一致性都是通过Lipman-Pearson法(Science，227，1435 (1985))确定的。具体而言，序列一致性是通过使用遗传信息处理软件Genetyx-Win(Software Development Co. , Ltd.)的同源性分析(同源性检索)程序来分析计算，其中参数ktup (Unit size to compare)设为2。除非另外指出，用在本说明书中的枯草杆菌DNA的核苷酸序列和碱基号都是基于枯草杆菌转录因子检索网站(http://dbtbs. hgc. jp)。本发明的经过修饰的启动子是通过修饰与降解物应答元件(下文中称为“ere类似序列”)相似的核苷酸序列而制备的，其中该降解物应答元件存在于编码启动子的多核苷酸上，该启动子来源于含有ere类似序列的属于芽孢杆菌属微生物的基因。ere类似序列的例子包括SEQ ID NO 1所表示的核苷酸序列；以及与SEQ ID NO :1所表示的核苷酸序列相当的核苷酸序列，只是其中一个或多个碱基被取代、缺失、添加或插入。ere类似序列的例子还包括相对于SEQ ID NO :1所表示的核苷酸序列具有70%或更高、优选80%或更高、更优选90%或更高的序列一致性的核苷酸序列。再次，“多个”是指1 6个，优选为1 3个。取代、缺失、添加或插入碱基的方法在例如Dieffenbach et al. (Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York，581-621，1995)中有过公开。通过采用该技术,一个或多个碱基可以被取代、缺失、添加、或插入。对于确认目标序列是否为ere类似序列，例如，可以通过以类似于下述实施例的方式，在将突变引入序列中时，观察目标基因在例如葡萄糖的降解物的存在下加强表达来进行。相对于SEQ ID NO :1所表示的核苷酸序列具有 70%或更高序列一致性的核苷酸序列的例子包括SEQID NO :2所表示的核苷酸序列。SEQ ID NO :2所表示的核苷酸序列与SEQ ID NO :1所表示的核苷酸序列相当，只是其中三个碱基被取代。因此，SEQ ID NO :2所表示的核苷酸序列相对于SEQ ID NO :1所表示的核苷酸序列，具有76. 9%的同源性。对于来源于属于芽孢杆菌属细菌的启动子，而且本发明的经过修饰的启动子是由该启动子制备而得到的，即，该启动子是对应于本发明的经过修饰的启动子的亲本启动子， 则没有特别的限制，只要该亲本启动子来源于属于芽孢杆菌属细菌且含有ere类似序列。 优选该亲本启动子来源于枯草杆菌或枯草杆菌的突变菌株。优选的亲本启动子的例子包括来源于芽孢杆菌KSM-64菌株(FERM BP-2886)的碱性纤维素酶基因的启动子(SEQ ID N0: 3中的1 609号碱基)、和来源于芽孢杆菌KSM-S237菌株(FERM BP-7875)的碱性纤维素酶基因的启动子(SEQ ID NO 4中的1 572号碱基)。SEQ ID NO 1和2所表示的核苷酸序列，分别对应于来自SEQ ID NO :3中1 609号碱基所表示的KSM-64菌株的碱性纤维素酶基因的启动子中的399 412号以及沈4 276号碱基的核苷酸序列，并且分别对应于来自SEQ ID NO :4中1 572号碱基所表示的KSM-S237菌株的碱性纤维素酶基因的启动子中的359 372号以及223 235号碱基的核苷酸序列。本发明中亲本启动子的其他例子包括来源于属于芽孢杆菌属细菌且具有ere类似序列的启动子，其具有与SEQ ID NO :3或4表示的碱性纤维素酶基因的启动子的核苷酸序列相当的核苷酸序列，只是其中一个或多个碱基被取代、缺失、添加或插入；或相对于SEQ ID NO :3或4所表示的碱性纤维素酶基因的启动子的核苷酸序列，具有70%或更高、优选为 80%或更高、更优选为90%或更高、甚至更优选为95%或更高、更优选为98%或更高的序列一致性的核苷酸序列。对于启动子是否具有ere类似序列的证实，可以通过测序来确认 ere类似序列在启动子的核苷酸序列中的存在；或者通过比较启动子的序列与SEQ IDNO 3或4所表示的碱性纤维素酶基因的启动子的序列来识别与ere类似序列对应的区域来进行。取代、缺失、添加或插入碱基的方法在例如Dieffenbach et al. (Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York，581-621，1995)中公开。通过采用这个技术,一个或多个碱基可以被取代、缺失、添加或插入。对于鉴定启动子序列，例如通过以类似于下述实施例的方式，在引入LacZ基因时观察β -半乳糖苷酶的表达来进行。在亲本启动子包含两种或更多种ere类似序列的情况下，至少一种存在于亲本启动子中的ere类似序列的核苷酸序列可以被修饰。换言之，一种、两种或更多种、或全部存在于亲本启动子中的ere类似序列可以被修饰。例如，当亲本启动子具有两种由SEQ ID N0 1和2表示的ere类似序列时，仅有由SEQ ID NO 1表示的核苷酸序列或由SEQ ID NO 2 表示的核苷酸序列可以被修饰，或者由SEQ ID NO 1和SEQ ID NO 2表示的两种核苷酸序列可以被修饰。优选由SEQ IDNO :1和SEQ ID NO :2表示的两种核苷酸序列均被修饰。在一个实施方式中，本发明中经过修饰的启动子是通过修饰至少一种存在于来自枯草杆菌或枯草杆菌突变菌株的启动子中的ere类似序列而制备的。在另一个实施方式中，本发明中经过修饰的启动子是通过在来源于KSM-64菌株 (FERM BP-2886)的碱性纤维素酶基因的启动子(SEQID NO :3中1 609号碱基)中修饰由264 276号碱基表示的ere类似序列和由399 412号碱基表示的ere类似序列中的至少一种而制备的。优选地，由264 276号碱基表示的ere类似序列和由399 412号碱基表示的ere类似序列都被修饰。在另一个实施方式中，本发明中经过修饰的启动子是通过在来源于KSM-S237菌株(FERM BP-7875)的碱性纤维素酶基因的启动子(SEQ ID NO :4中1 572号碱基)中修饰由223 235号碱基表示的ere类似序列和由359 372号碱基表示的ere类似序列中的至少一种而制备的。优选地，由223 235号碱基表示的ere类似序列和由359 372 号碱基表示的ere类似序列都被修饰。ere类似序列的核苷酸序列的修饰的例子包括核苷酸序列中部分或全部碱基的缺失、核苷酸序列中部分或全部碱基的取代、以及在核苷酸序列中任意位点上碱基的添加。用于本文中的术语“部分碱基”是指1个或更多个碱基，优选为3个或更多个碱基，更优选为 6个或更多个碱基，甚至更优选为10个或更多个碱基。碱基的缺失、取代、或添加可以通过技术领域内常用的方法来进行，例如定点突变(site-directed mutagenesis)。定点突变可以通过 Kunkel 法(Proc. Natl. Acad. Sci. USA.，82，488，1985)、PCR 等来进行。或者，本发明中经过修饰的启动子可以通过SOE(重叠延伸剪切)-PCR法(Gene， 77，51，1989)来制备，其中在存在于启动子中的ere类似序列的核苷酸序列上，碱基被缺失、取代、或添加。根据SOE-PCR法，在下游端含有核苷酸序列修饰位点的上游DNA片段、以及在上游端具有核苷酸序列修饰位点的下游DNA片段都通过第一 PCR来制备。在制备出ere类似序列缺失的片段的情况下，设计引物，从而使得上游DNA片段的下游侧以及下游DNA片段的上游侧相互地退火，并得到ere类似序列缺失的核苷酸序列(图1)。接下来，通过使用由第一 PCR制备的两个DNA片段作为模板、上游DNA片段的上游引物、和DNA片段的下游引物来进行第二 PCR。结果，在上游DNA片段的下游端与下游DNA 片段的上游端之间发生退火，从而两个DNA片段互相连接。因此，制备出含有ere类似序列缺失的启动子序列的DNA片段(图1)。在这种情况下，当PCR中采用的引物被设计成具有限制性内切酶识别序列(restriction sequence)时，制备出在末端包含限制性内切酶识别序列的启动子DNA片段，并通过限制性内切酶法引入到载体中。相似地，当设计出引物从而使得上游DNA片段的下游侧和下游DNA片段的上游侧相互退火并制备出包含至少一个碱基被取代或添加的ere类似序列的核苷酸序列时，可以制备出包含至少一个ere类似序列的碱基已经被取代或添加的启动子序列的DNA片段。在本发明的经过修饰的启动子中，一个或多个碱基可以被进一步取代、缺失、添加或插入，只要能保持启动子的功能和增强目标基因表达的效果。取代、缺失、添加、或插入碱基的方法在例如Dieffenbach et al. (Cold Spring Harbor Laboratory Press,New York, 581-621,1995)中公开。通过采用这个技术，一个或多个碱基可以被取代、缺失、添加或插入。对于确认进一步被修饰的修饰启动子是否具有启动子功能且表现出加强目标基因表达的作用，例如，可以通过以类似于下述实施例的方式在例如葡萄糖的降解物的存在下观察加强目标基因表达的效果。通过将本发明的由此制备的经过修饰的启动子引入至合适的载体中，可以制备本发明的表达载体。对于引入经过修饰的启动子的载体没有具体的限制，且优选例如PDL2和 PMUTIN的载体。将经过修饰的启动子引入至载体中可以根据任何本领域常用的方法进行。 例如，通过限制性内切酶的方式切割载体，并结合在末端含有上述限制性内切酶识别序列的启动子，从而将启动子引入到载体中(限制性内切酶法)。在本发明的表达载体中，本发明中经过修饰的启动子被可操作性地连接至编码目标基因产物的基因的上游。目标基因产物的例子包括蛋白质、多肽和非编码RNA。对于蛋白质和多肽的种类没有具体限制，且蛋白质或多肽包括用于例如洗涤剂、食品、纤维、饲料、 化学品、医疗、和诊断的工业用酶；以及生理活性肽。工业用酶的例子包括氧化还原酶、转移酶、水解酶、裂解酶、异构酶、和连接酶/合成酶。优选例如纤维素酶、α-淀粉酶和蛋白酶的水解酶基因。水解酶的具体例子包括由多糖水解酶分类所定义的属于第5族的纤维素酶(Biochem. J.，280，309，1991)。其中，优选来源于微生物，例如属于芽孢杆菌属的微生物的纤维素酶。更具体的例子包括来源于芽孢杆菌KSM-64菌株(FERM BP-2886)的由SEQ ID NO 3表示的氨基酸序列构成的碱性纤维素酶；来源于芽孢杆菌KSM-S237菌株(FERM BP-7875)的由SEQ ID NO :4表示的氨基酸序列构成的碱性纤维素酶；和相对于由SEQ ID NO :3或4表示的氨基酸序列，具有70%或更高、优选80%或更高、更优选90%或更高、甚至更优选95%或更高、更优选98%或更高的序列一致性的氨基酸序列构成的纤维素酶。α -淀粉酶的具体例子包括来源于微生物的α -淀粉酶。优选来源于属于芽孢杆菌属微生物的液化α-淀粉酶。更具体的例子包括来源于芽孢杆菌KSM-K38菌株(FERM ΒΡ-6946)的由SEQ ID NO :5表示的氨基酸序列构成的碱性淀粉酶；和相对于由SEQ ID NO: 5表示的氨基酸序列，具有70%或更高、优选80%或更高、更优选90%或更高、甚至更优选 95%或更高、更优选98%或更高的序列一致性的氨基酸序列构成的淀粉酶。蛋白酶的具体例子包括来源于属于例如芽孢杆菌属微生物等微生物的丝氨酸蛋白酶和金属蛋白酶。优选地，上述蛋白质基因或多肽基因被可操作性地连接到本发明经过修饰的启动子区域以及分泌信号肽区域。例如，目标蛋白质或多肽的结构基因可以被可操作性地连接到来源于KSM-64菌株(FERMBP-2886)或KSM-S237菌株(FERM BP-7875)的纤维素酶基因中的分泌信号肽区域。更加具体地，目标蛋白质或多肽的结构基因可以可操作性地连接至由SEQ ID NO 3的610 696号碱基表示的核苷酸序列；由SEQ ID NO 4的573 659号碱基表示的核苷酸序列；相对于任意上述核苷酸序列，具有70%或更高、优选80%或更高、 更优选90%或更高、甚至更优选95%或更高、更优选98%或更高的序列一致性的核苷酸序列构成的DNA片段；或与任意核苷酸序列相当的DNA片段，只是部分碱基缺失。非编码RNA是指在相应DNA的转录之后不翻译为蛋白质的RNA。非编码RNA的例子包括含有调控序列的非翻译区域、tRNA、rRNA、mRNA型ncRNA(mRNA类似非编码RNA)、 snRNA (核内小 RNA)、snoRNA (核内小 RNA)、miRNA (微小 RNA)、stRNA (时序小 RNA)、禾口 siRNA (短干扰RNA)。这些非编码RNA涉及多个生物活性的机制，例如细胞表达、发育、分化和其他的调控，且可以在研究、医疗护理、诊断、药物开发、农业(例如饲养或杀虫剂生产)、 渔业、畜牧业、和化学制备中加以利用。本发明中经过修饰的启动子和编码目标基因产物或分泌信号肽区域的基因可以在将其引入载体前进行连接。或者，可以将本发明中经过修饰的启动子引入至已经含有编码目标基因产物的基因的载体或者还另外含有分泌信号肽区域的载体中。本文中使用的在启动子和基因之间；或启动子、基因和分泌信号之间的术语“可操作性地连接”，是指启动子可以诱发基因的转录的连接、或者是通过分泌信号来分泌基因所编码的蛋白质的连接。启动子和基因之间；或启动子、基因和分泌信号之间的“可操作性地连接”的过程是本领域技术人员所知的。通过将本发明所制备的表达载体通过普通转化方法引入至宿主微生物中，得到本发明的转化体。或者，本发明的转化体也可以制备如下构建DNA片段，其中，与宿主微生物的基因组同源的合适区域、与以下片段相结合，该片段是通过使本发明中经过修饰的启动子与编码目标基因产物的基因、以及任选地分泌信号肽区域连接而制备的；并通过同源重组，直接将该DNA片段引入至宿主微生物的基因组。也可以使用普通重组技术，通过将本发明的表达载体引入至宿主微生物中来提供本发明的转化体。目标基因产物可以使用本发明的转化体并通过以下过程而制备将转化菌株接种到含有可同化碳源、氮源、和其他必要成分的培养基中；通过普通培养方法培养转化体；以及接下来收集或纯化目标基因产物。如下文中实施例所述，与ere类似序列未被修饰的微生物相比，本发明的转化体表现出更高的目标基因产物的产率。实施例本发明将通过实施例的方式做更加具体的描述。
实施例1制备来源于碱性纤维素酶基因的经过修饰的启动子通过PCR制备来源于KSM-S237纤维素酶的启动子DNA片段(Hakamada et al.， Biosci. Biotechnol. Biochem. 64，2281-2289, 2000)。将已经被引入至大肠杆菌-枯草杆菌用的穿梭载体PHY300PLK中且为来源于芽孢杆菌KSM-S237碱性纤维素酶基因DNA(SEQ ID N0:4的1 572号碱基)中的启动子区域的片段用作模板。将表1所示的EcoRI_ PS237Fff(SEQ ID NO :6)和 BamHI_PS237RV(SEQ ID NO :7)用作引物。使用上述模板和引物，通过PCR来制备上游侧具有EcoRI识别位点且下游侧具有BamHI识别位点的启动子DNA 片段。之后，为制备启动子DNA片段中目标序列被缺失的突变启动子DNA片段，使用通过上述PCR制备的片段作为模板、以及各自在表1所示的AcrelFW(SEQ ID NO 8)和BamHI_ PS237RV的引物组或者EcoRI_PS237FW和AcrelRV(SEQ ID NO 9)的引物组来进行PCR，从而制备出分别在上游侧和下游侧含有目标序列缺失的区域的片段。将这样得到的两个片段相结合来用作混合模板。使用混合模板和EcoRI_PS237FW引物以及BamHI_PS237RV引物来进行PCR，以制备在SEQ ID NO :4表示的核苷酸序列中223 235碱基残基被缺失的启动子序列DNA片段(Acrel)(图1)。以相似的方式，通过使用Acre2Fff(SEQ ID NO :10)来替代 AcrelFW，并用 Acre2RV(SEQ ID NO :11)来替代 Δ crelRV 以制备在 SEQ ID N0:4 表示的核苷酸序列中359 372碱基残基被缺失的启动子域序列DNA片段(Δ cre2)。进而，使用 Δ crel 作为模板、以及 Δ cre2FW和 BamHI_PS237RV 引物组或EcoRI_PS237FW和 Δ cre2RV 引物组来进行PCR。使用由此得到的这两个片段作为混合模板，使用EcoRI_PS237FW和BamHI_ PS237RV引物来进行PCR，从而制备出在SEQ ID NO :4表示的核苷酸序列中223 235以及 359 372碱基残基被缺失的启动子序列DNA片段(Δ crel. 2)。为扩增DNA片段，通过GeneAmp PCR系统(Applied Biosystems的产品)的方式以及Pyrobest DNA聚合酶(Takara Bio的产品)和其附带试剂的使用来进行PCR。制备 PCR液(50 μ L)，以便将适当稀释模板DNA片段(1 μ L)、正义链引物和反义链引物中的每一个(每个IOpmol)、和Pyrobest DNA聚合酶(2. 5U)进行组合。PCR包括30个循环的3步热处理(98°C, IOsec ；55°C，30sec ；和 72°C，1 5min(约 lmin/kb，根据目标产物调节))， 并在72°C反应5min。[表 1]
权利要求
1.一种经过修饰的启动子，其包含来源于属于芽孢杆菌属细菌的启动子的核苷酸序列，其中至少一个选自如下的核苷酸序列被修饰SEQ ID NO 1所表示的核苷酸序列；与SEQ ID NO 1所表示的核苷酸序列相当的核苷酸序列，只是其中一个或多个碱基被取代、缺失、添加或插入；以及相对于SEQ ID N0:1所表示的核苷酸序列具有70%或更高的序列一致性的核苷酸序列。
2.根据权利要求1所述的经过修饰的启动子，其中，所述相对于SEQ ID NO :1所表示的核苷酸序列具有70%或更高的序列一致性的核苷酸序列是SEQ ID NO :2所表示的核苷酸序列。
3.根据权利要求1或2所述的经过修饰的启动子，其中，所述来源于属于芽孢杆菌属细菌的启动子是来自枯草杆菌或枯草杆菌的突变菌株的启动子。
4.根据权利要求3所述的经过修饰的启动子，其中，所述来源于属于芽孢杆菌属细菌的启动子是来自芽孢杆菌KSM-64菌株(FERM BP-2886)中碱性纤维素酶基因的启动子；来自芽孢杆菌KSM-S237菌株(FERM BP-7875)中碱性纤维素酶基因的启动子；或含有相对于任意所述启动子的核苷酸序列具有70%或更高序列一致性的核苷酸序列、并具有ere类似序列的启动子。
5.根据权利要求1 4中任一项所述的经过修饰的启动子，其中，所述核苷酸序列的修饰是在所述核苷酸序列中碱基的缺失、取代、或添加。
6.一种用于制备经过修饰的启动子的方法，其包括在来源于属于芽孢杆菌属细菌的启动子中修饰至少一个选自如下的核苷酸序列SEQ ID NO 1所表示的核苷酸序列；与SEQ ID NO 1所表示的核苷酸序列相当的核苷酸序列，只是其中一个或多个碱基被取代、缺失、添加或插入；以及相对于SEQ ID N0:1所表示的第一核苷酸序列具有70%或更高的序列一致性的核苷酸序列。
7.根据权利要求6所述的方法，其中，所述相对于SEQ ID NO :1所表示的核苷酸序列具有70%或更高的序列一致性的核苷酸序列是SEQ ID NO :2所表示的核苷酸序列。
8.根据权利要求6或7所述的方法，其中，所述来源于属于芽孢杆菌属细菌的启动子是来自枯草杆菌或枯草杆菌突变菌株的启动子。
9.根据权利要求8所述的方法，其中，所述来源于属于芽孢杆菌属细菌的启动子是来自芽孢杆菌KSM-64菌株(FERM BP-2886)中碱性纤维素酶基因的启动子；来自芽孢杆菌KSM-S237菌株(FERM BP-7875)中碱性纤维素酶基因的启动子；或含有相对于任意所述启动子的核苷酸序列具有70%或更高序列一致性的核苷酸序列、并具有ere类似序列的启动子。
10.根据权利要求6 9中任一项所述的方法，其中，所述核苷酸序列的修饰是所述核苷酸序列中碱基的缺失、取代或添加。
11.根据权利要求1 5中任一项所述的经过修饰的启动子、或通过权利要求6 10 中任一项所述的方法而制备的经过修饰的启动子，其中，所述经过修饰的启动子中的一个或多个碱基被进一步取代、缺失、添加或插入。
12.—种表达载体，其包含权利要求1 5和11中任一项所述的经过修饰的启动子、或通过权利要求6 10中任一项所述的方法而制备的经过修饰的启动子。
13.根据权利要求12所述的表达载体，其中，所述经过修饰的启动子被可操作性地连接到编码目标基因产物的基因的上游。
14.一种转化体，其包含权利要求1 5和11中任一项所述的经过修饰的启动子或通过权利要求6 10中任一项所述的方法而制备的经过修饰的启动子，其中，所述经过修饰的启动子被可操作性地连接到编码目标基因产物的基因的上游。
15.一种用于制备目标基因产物的方法，所述方法包括采用权利要求14所述的转化体。
全文摘要
本发明提供经过修饰的启动子、各自含有该启动子的表达载体和转化体、以及使用该转化体制备目标基因产物的方法。本发明提供一种经过修饰的启动子，其包含来源于属于芽孢杆菌属细菌的启动子的核苷酸序列，其中至少一个选自如下的核苷酸序列被修饰SEQ IDNO1所表示的核苷酸序列；与SEQ ID NO1所表示的核苷酸序列相当的核苷酸序列，只是其中一个或多个碱基被取代、缺失、添加或插入；以及相对于SEQ ID NO1所表示的核苷酸序列具有70％或更高的序列一致性的核苷酸序列。
文档编号C12N15/113GK102575253SQ20108004656
公开日2012年7月11日 申请日期2010年10月18日 优先权日2009年10月21日
发明者儿玉裕司, 川原彰人, 荒胜俊 申请人:花王株式会社