专利名称:单糖制造方法
技术领域:
本发明涉及单糖制造方法,尤其涉及从木素纤维素原料制造单糖的方法。
背景技术:
随着近年环境意识的提闻,关于有效利用生物质的研究盛行。对生物质资源中的多糖进行分解而得到的糖通过用作微生物的发酵底物,可用于生产乳酸、异丙醇、こ醇、氨基酸等多种有用物质。作为生物质原料,通常使用含有木素的木素纤维素、从木素纤维素除去木素而得到的纤维素等。作为木素纤维素原料,例如,可列举阔叶树或针叶树等 木材、麦杆或玉米残渣等农业残渣等,另ー方面,作为完全除去了木素的纤维素,可列举Avicel等试剂形式的纤维素。此外,作为一定程度地除去了木素的木素纤维素原料,可列举阔叶树牛皮纸浆(kraft pulp)、针叶树牛皮纸楽;、机械纸楽;、来自洋麻等草本的纸楽;;废纸、或从纸衆厂回收的含有纸浆纤维成分的造纸污泥等。由生物质资源中的多糖类制作作为发酵底物的单糖的方法大致分为两种方法。一种是使用无机酸进行水解的酸法糖化,另ー种是使用酶或生产该酶的微生物进行水解的酶法糖化。与酶法糖化相比,酸法糖化虽然在技术上可以完成,但是与以淀粉、废糖蜜等为原料的方法相比,成本还较高,而且因废弃所使用的酸引起的环境压力成为问题,妨碍实用化。另ー方面,在酶法糖化中,已知纤维素酶、半纤维素酶等酶的价格高,这成为实用化的障碍。作为降低用于糖化的酶成本的方法,进行了这样的尝试通过底物木素纤维素原料的化学、物理的前处理,提高之后的酶的糖化反应效率,降低使用的酶量。作为这样的尝试,例如,可以举出用酸对原料进行前处理的方法(日本特开2008-514207号)、用球磨机粉碎后用酸进行蒸煮的前处理方法(日本特开2008-271962号)、通过打浆处理来解开纤维素纤维的前处理方法(日本特开2009-171885号)等。通过上述各种底物前处理方法提高酶反应的效果有限,并不是降低成本的关键。例如,对高度除去了木素的纸浆进行打浆处理时的酶反应的提高效果仅为I. 3倍(日本特开2009-171885号)。其中,使用酸的前处理方法的应用报道最多,但以从木素纤维素原料除去木素成分为主要目的,有必要在处理后进行将酸和木素分离的エ序。木素的除去程度对糖化酶的酶反应性有影响,但是并未报道在处理后尤其是未分离前处理反应物时的酶反应性、以及该酶反应时的酶的行为。此外,为了进一歩降低成本,也尝试了糖化反应后回收酶进行再利用的方法,但是酶对未分解的底物固体残渣的粘附妨碍了回收,不能成功地进行稳定的酶回收。例如,已知利用酶吸附于糖化反应后的未分解的底物固体残渣,吸附回收酶并进行再利用的方法(日本特开昭59-213396号、日本特开昭62-208282号、日本专利第1299068号、日本特开昭63-007781号)。然而,日本特开昭59-213396号及日本特开昭62-208282号中记载了可直接利用吸附于底物固体残渣的酶,另一方面,日本专利第1299068号及日本特开昭63-007781号中记载了对于酶的回收再利用有必要进行从底物固体残渣的分离操作。如上所述,关于糖化反应后的底物固体残渣的可利用性,很难说见解统一。此外,当直接利用吸附于底物固体残渣的酶吋,可回收的活性量有67% 97%的波动,仅示出了 I次的回收结果(日本特开昭59-213396号)。此外,也进行了利用通电处理从残渣中分离酶并回收的尝试(日本特开2008-206484号)。但是,该方法操作复杂,即使成功地进行了酶回收,在成本方面依然存在问题。另外,也尝试了通过使用超滤膜处理糖化反应液来直接回收酶的方法。古市等提出了使用超滤膜处理糖化反应液回收酶,进一歩用反滲透膜对糖液一方进行浓缩的方法(日本特开昭58-198299号)。但是,对于酶的回收量并无记载,对于连续的操作成绩也无记载。此外,日本特开2006-87319号中指出即使在用超滤膜处理糖化反应液的情况下,酶对未分解残渣的粘附也会成为问题,并公开了ー种连续的糖化反应方法,在该方法中,在滞留时间内96质量%的总底物被糖化的条件下,通过膜处理过滤分离酶使其滞留于反应体系内。这种情况下,由于装置的结构、操作上、酶活性的降低等导致的残渣增大与反应的不稳定性直接相关,所以对于酶和底物的投入量有很大限制。上述利用膜过滤进行的酶回收的研究中,虽然将已经高程度地除去了木素的纸浆用作底物,但是酶对未分解残渣的吸附仍然是最大的问题,有必要将其降低。
发明内容
如上所述,虽然开发了多种利用纤维素酶或半纤维素酶高效率地水解纤维成分从木素纤维素原料制造糖类的技术,但是依然存在糖化所需要的酶的成本高、缺乏经济性的问题。为了解决上述问题,可尝试对底物进行前处理的方法、和对酶进行回收再利用的方法,但是前者效果有限,后者酶回收率低,依然未解決问题。关于酶回收率低的问题,原因被认为是酶对未分解的底物残渣的吸附,但是,从酶的性质上来说,难以防止其对底物吸附。因此,本发明的目的在于提供一种可削减酶的使用量,简便且低成本地从木素纤维素原料制造单糖的方法。本发明如下所述。[I] 一种由木素纤维素原料制造单糖的单糖制造方法,包括得到由木素纤维素原料及糖化酶得到的糖化液;使上述糖化液中的糖化酶吸附于木素纤维素原料将其回收;以及,使用回收的上述糖化酶将木素纤维素原料糖化。[2]如[I]所述的方法,其中,上述木素纤维素原料为阔叶树牛皮纸浆、针叶树牛皮纸浆、机械纸浆、来自草本的纸浆、废纸、或造纸污泥、或它们的混合物。[3]如[I]或[2]所述的制造方法,其中,上述木素纤维素原料为由前处理得到的前处理原料,所述前处理是在酸性条件下进行加热处理后进行中和。[4]如[3]所述的制造方法,其中,上述前处理原料中的半纤维素含量为前处理前的50质量%以下。 [5]如[3]或[4]所述的制造方法,其中,上述前处理原料中的糠醛为前处理原料的干燥质量的I质量%以下。
[6]如[I] [5]中任一项所述的制造方法,其中,上述木素纤维素原料为由前处理得到的前处理原料,所述前处理包括以下(a) (d)(a)得到木素纤维素原料的固态成分浓度为8质量% 30质量%的原料液;(b)用终浓度O. 2质量% 12质量%的无机酸对上述原料液进行酸化;(c)在80°C 150°C下对酸化过的原料液进行I小时 6小时保温(incubating);(d)在20°C 80°C下将上述保温后的原料液调节为pH3 8。[7]如[6]所述的制造方法,其中,上述无机酸为硫酸、盐酸、硝酸、磷酸或它们的组合。[8]如[I] [7]中任一项所述的制造方法,其中,上述回收包括以下(e) (h) (e)得到上述糖化液和木素纤维素原料的混合液,所述木素纤维素原料的固态成分质量为上述糖化酶的酶活性成分的总蛋白质质量的40倍以上;(f)在20°C 80V下进行I分钟 3小时的保温;(g)将上述保温后的混合液固-液分离为糖化液和作为固态成分的吸附有酶的木素纤维素原料;(h)将分离的上述木素纤维素原料作为酶-底物复合物回收。[9]如[I] [7]中任一项所述的制造方法,其中,上述回收包括以下⑴ (k)(i)在残存上述糖化酶的酶活性成分的总蛋白质质量的40倍以上的固态成分质量的木素纤维素原料的条件下,終止糖化反应;(j)将反应终止后的反应液固-液分离为糖化液和作为固态成分的未反应的木素纤维素原料;(k)将分离的上述木素纤维素原料作为酶-底物复合物回收。[10]如[8]或[9]所述的制造方法,其中,包括添加在上述固-液分离时被分离至液体中的酶活性成分的糖化酶进行上述再糖化。[11]如[10]所述的制造方法,其中,在上述固-液分离时被分离至液体中的酶活性成分的糖化酶含有葡萄糖苷酶。[12]如[8]或[9]所述的制造方法,其中,上述被分离至液体中的酶活性成分的糖化酶是通过过滤分离或树脂精制回收在上述固-液分离エ序中被分离至糖化液中的酶活性成分而得到的物质。[13]如[I] [12]中任一项所述的制造方法,其中,上述糖化酶是选自纤维素酶及半纤维素酶中的至少ー种。[14]如[13]所述的制造方法,其中,上述纤维素酶是具有内切葡聚糖酶、纤维ニ糖水解酶及葡萄糖苷酶的各活性的酶混合物。[15]如[13]或[14]所述的制造方法,其中,半纤维素酶是具有木聚糖酶、木糖苷酶、甘露聚糖酶、果胶酶、半乳糖苷酶、葡糖苷酸酶及阿拉伯呋喃糖苷酶的各活性的酶混合物。
[图I]为表示本发明的实施例涉及的木素纤维素原料的前处理品与未进行前处理的未处理品的酶糖化反应结果的图。
[图2]为表示本发明的实施例涉及的反复糖化反应的结果的图,其中,使用了通过对木素纤维素原料的前处理品的吸附而回收的酶。[图3]为表示本发明的实施例涉及的使用了吸附回收酶的反复糖化反应中的催化剂基本単元減少的结果的图。[图4]为表示本发明的实施例涉及的在补充了未吸附酶活性成分的情况下和未补充未吸附酶活性成分的情况下,分别进行的反复糖化的结果的图。[图5]为表示本发明的实施例涉及的使用了吸附及膜回收的酶的反复糖化反应中的催化剂基本単元減少的结果的图。
具体实施例方式本发明的单糖制造方法是从木素纤维素原料制造单糖的单糖制造方法,包括如下、步骤得到由木素纤维素原料及糖化酶得到的糖化液;使上述糖化液中的糖化酶吸附于木素纤维素原料将其回收(以下,有时称为“回收エ序”);以及,使用回收的上述糖化酶将木素纤维素原料糖化(以下,有时称为“再糖化工序”)。本发明人等对通过提高糖化酶的回收率进行重复使用来降低成本的方法进行了研究,发现对于吸附至底物或未分解底物残渣的酶成分,可不施加特别的剥离处理而直接进行再使用。根据本发明,使糖化液中的糖化酶吸附于木素纤维素原料将其回收,使用回收的糖化酶将木素纤维素原料糖化得到单糖,因此,可简便地回收糖化酶,同时可进行糖化酶的重复使用。结果可大幅減少制造糖类时的酶的使用量,可简便且低成本地由木素纤维素原料制造单糖。本发明中,“单糖”主要是指由I个糖单元构成的单糖类。需要说明的是,作为单糖,只要是葡萄糖或使用糖化酶由木素纤维素原料得到的其他单糖,就可以没有特别限制地包含于本发明的单糖中。但是,本发明中,含有生成的单糖的糖化液中,也可存在由2个 100个左右的多个糖单元构成的寡糖。本说明书中,术语“エ序”不仅仅是独立的エ序,即使在不能与其他エ序明确区别的情况下,只要能够实现本エ序所期待的作用,即可使用本术语。此外,本说明书中,使用“ ”表示的数值范围表示包括“ ”前后所记载的数值分别作为最小值及最大值的范围。本发明中,在提到可构成组合物的各成分的量的情况下,在存在多种属于组合物中各成分的物质的情况下,除非另有说明,是指组合物中存在的所述多种物质的总量。下面说明本发明。本发明涉及的单糖制造方法中,使用由木素纤维素原料及糖化酶得到的糖化液。该糖化液只要是由木素纤维素原料及糖化酶得到的糖化液就没有特别限制,优选为通过使用糖化酶由木素纤维素原料生成单糖(糖化工序)而得到的糖化液。本发明中,可以将获得的糖化液用于本制造方法中,也可以引入用于得到糖化液的糖化工序作为本制造方法的
ー个エ序。本发明中使用的木素纤维素原料只要是木素含量低的生物质原料即可。低木素含量是指低于生物质原料的平均木素含量即30质量%的值,优选为20质量%以下,更优选为10质量%以下。作为木素含量低的原料,优选以纤维素、半纤维素为主要成分的纤维,所述纤维如下得到利用碱提取或碱性消化(alkali digestion)等化学纸浆制造法、或有机溶解等方法,从针叶树、阔叶树、伐木残料、建筑废材、剪枝废弃物、锯屑、洋麻、及稻草、麦杆等农业废弃物等木素纤维素材料中高度除去木素而得到。较优选例如阔叶树牛皮纸浆、针叶树牛皮纸浆、机械纸浆、来自洋麻等草本的纸浆、废纸、或造纸污泥(含有从纸浆厂回收的纸浆纤维成分)、或它们的混合物。如果是这些原料,例如可进行使用糖化酶的可靠的糖化处理。特别优选使用_叶树牛皮纸浆、针叶树牛皮纸浆,均可以从一般的纸浆制造企业获得。本发明的酶糖化方法中,作为底物的木素纤维素原料优选为由前处理得到的前处理原料,所述前处理是在酸性条件下进行加热处理之后进行中和;更优选木素含量低的木素纤维素原料的前处理原料。通过对木素纤维素原料进行前处理,可加快酶对木素纤维素原料的吸附速度。通过在酸性条件下进行加热然后进行中和的前处理,可部分分解生物质原料中的半纤维素,转换为木糖等单糖。上述来自木素纤维素原料的半纤维素成分的減少可提高使用酶的原料糖化的效率,同时也有助于提高之后的酶的吸附回收率。作为前处理原料,优选半纤维素含量为前处理前的半纤维素含量的50质量%以下,即,前处理的程度优选半纤维素成分的50质量%以上分解为可溶性的单糖或寡糖,更期待作为副产物的糠醛仅为木素纤维素原料的干燥质量的I质量1^以下。通过使半纤维素含量为前处理前的半纤维素含量的50质量%以下,可进ー步提高糖化酶处理效率。通过使作为副产物的糠醛为I质量以下,可以不给糖化反应液中的收率带来很大影响,井能够抑制之后的酶反应エ序和酶的吸附回收エ序中的微生物的污染。需要说明的是,由于糠醛具有较低的沸点,所以可通过对生成单糖液进行减压浓缩处理而容易地除去。半纤维素含量只要为前处理前的半纤维素含量的50质量%以下,就没有必要完 全除去半纤维素,可以残留30质量%以上,也可以残留40质量%以上。该前处理中,首先,用水稀释木素纤维素原料使得固态成分浓度为8质量% 30质量%,得到原料液。木素纤维素原料由于溶解度极低,所以制备成固态成分悬浊液。作为前处理中使用的无机酸,可以从硫酸、盐酸、硝酸、磷酸等中选择,它们可以单独使用也可以组合使用。如果为上述无机酸,例如可以使前处理效率良好。其中,在エ业应用中,优选廉价的硫酸。该前处理包括将无机酸添加至原料液中使其终浓度为O. 2质量% 12质量%来进行酸化;以及在80°C 150°C下对酸化过的原料液进行I小时 6小时保温。进ー步优选使木素纤维素原料的固态成分浓度为8质量% 20质量%,添加无机酸使其终浓度为O. 2质量% 5质量%,在90°C 150°C下进行I小时 4小时保温。对于前处理反应中使用的反应容器没有特别限定,可以考虑具有耐酸性的加热压カ容器、或将具有耐酸性的容器置于反应釜之类的加热压カ装置中进行处理的方案。将保温后的原料液在20°C 80°C下调节为pH3 8、优选为pH4 7,制成木素纤维素原料前处理品(前处理原料)。对于PH调节用的碱试剂没有特别限定,可使用NaOH或Κ0Η、氨等。前处理后的木素纤维素原料的溶解度依旧低,作为固态成分悬浊液回收。本发明中的糖化酶是指将木素纤维素原料分解为单糖单元的酶,只要是将木素纤维素原料分解为单糖的酶即可,只要是具有纤维素酶及半纤维素酶各活性的酶即可。纤维素酶只要是将纤维素分解为葡萄糖的酶即可,可列举具有内切葡聚糖酶、纤维ニ糖水解酶及β -葡萄糖苷酶各活性中的至少ー种活性的酶,从酶活性的观点考虑,优选为具有上述各活性的酶混合物。同样地,半纤维素酶只要是可将半纤维素分解为木糖等单糖的酶即可,可列举具有木聚糖酶、木糖苷酶、甘露聚糖酶、果胶酶、半乳糖苷酶、葡糖苷酸酶及阿拉伯呋喃糖苷酶各活性中的至少ー种活性的酶,从酶活性的观点考虑,优选为具有上述各活性的酶混合物。本发明中,对于“酶活性成分”来说,在形成酶混合物的情况下,是指上述糖化酶中的每ー种;在使用単独的糖化酶的情况下,是指使用的糖化酶本身。对于上述纤维素酶及半纤维素酶的来源没有限制,可使用丝状菌、担子菌、细菌类等的半纤维素酶。例如,可以单独使用或混合两种以上来使用Trichoderma属、Acremonium ノ禹、Aspergillus ノ禹、Irpex ノ禹、Aeromonas 属、しIostridium 属、Bacillus ノ禹、Pseudomonas属、Penicillium属、Humicola属等各种来源的酶和/或利用基因重组制造出的酶。此外,作为酶源,也可直接使用通常市售的纤维素酶制剂或上述菌的培养物或其滤液。需要说明的是,其中,优选来自Trichoderma属、Acremonium属的纤维素酶等纤维素分解カ强的纤维素酶。作为市售的纤维素酶及半纤维素酶,可使用AccelleraselOOO (Genencor公司制)、Accellerasel500(Genencor 公司制)、AccelleraseXC(Genencor 公司制)> AccelleraseXY (Genencor 公司制)、Celluclast (Novozymes 公司制)、CellicCTec (Novozymes 公司制)、Cellic HTec (Novozymes 公司制)、Acremonium Cellulase (明治制果(株)制)、meicelase (明治制果(株)制)、Cellulase Amano A (天野酶(株)制)、Cellulase Amano T(天野酶(株)制)、Cellulase Daiwa(大和化成(株)制)、Cellulizer (Nagase 生化学エ业(株)制)、Driselase (协和发酵(株)制)、CellulaseOnozuka (Yakult 药品エ业(株)制)、Cellulosin (Hankyu Bioindustry Co.,Ltd 制)等。此外,作为市售的β -葡萄糖苷酶,可使用Novozyme 188 (Novozymes公司制)、AccelleraseBG(Genencor 公司制)等。本发明的糖化反应这样进行向木素纤维素原料中加入酶,一边搅拌ー边使反应进行。对于糖化反应中使用的反应容器没有特别限定,优选可搅拌以使得装入的木素纤维素原料、酶类充分混合,而且具有温度调节功能以使得能够保持在使用的酶的最适温度。对于反应温度来说,例如,为以Trichoderma属为代表的霉菌来源的市售酶时,优选为40°C 55°C。糖化反应槽中的液体pH优选保持在所使用的酶的最适pH,例如,为Trichoderma属来源的市售的酶时,优选pH4至7之间。对于反应中装入的、作为底物的木素纤维素原料和酶的浓度没有特别限定。对于木素纤维素原料前处理品的移液、装入等操作来说,优选为8质量% 30质量%的固态成分浓度。此外,对于使用的酶来说,可以根据其活性投入足以高效地分解底物的量。酶的量可根据酶的种类等适当调整。本发明的回收ェ序优选如下进行。即,优选包括如下步骤得到上述糖化液和木素纤维素原料的混合液;进行规定时间的保温;将上述保温后的混合液固-液分离为糖化液和作为固态成分的吸附有酶的木素纤维素原料;将分离的上述木素纤维素原料作为酶-底物复合物回收。通过上述回收,可将酶活性成分的总蛋白质质量的70质量%以上吸附在固态成分上来回收。上述エ序中的木素纤维素原料与其说是作为酶底物发挥作用不如说是作为酶的吸附剂发挥作用。为了充分地确保酶的吸附量,并且不減少固-液分离中的糖液部分的比例(=容积效率的維持),优选使用固态成分质量为糖化酶的酶活性成分的总蛋白质质量的40倍以上、优选200倍以上的木素纤维素原料,此外,在能够保持糖化酶的稳定性的温度、例如20°C 80°C的温度下进行I分钟 3小时保温。由此,可有效地将可溶化形态的糖化酶吸附在作为固态成分的木素纤维素原料上。此外,除了将用于吸附的木素纤维素原料重新放入糖化反应完成后的溶液中的方法之外,也可以在糖化反应中途使其終止,使糖化酶吸附在未分解的底物残渣上。即,也可以是包括如下步骤的回收エ序在规定量的木素纤维素原料残存的条件下使糖化反应终止;将反应终止后的反应液固-液分离为糖化液和作为固态成分的未反应的木素纤维素原料;将分离的上述木素纤维素原料作为酶-底物复合物回收。由此,可以紧接着糖化エ序进行吸附,可以在更短时间内进行酶的回收。需要说明的是,对于回收エ序来说,使用前处理原料来吸附糖化酶的情况可以在更短时间内有效地回收。当使用未进行前处理的未处理的木素纤维素原料吋,优选进行60分钟 120分钟,另一方面,当使用前处理原料吋,优选进行I分钟 120分钟。对于反应的终止来说,优选在从可溶性的分解生成单糖及寡糖类的蓄积量逆推算出的反应容器内的底物残渣的量为反应容器内的糖化酶的酶活性成分的总蛋白质质量的200倍以下的固态成分质量时終止反应,进ー步优选在40倍以上的固态成分质量时終止反应。通过在底物残渣的量为反应容器内的糖化酶的酶活性成分的总蛋白质质量的200倍以下的固态成分质量时終止反应,作为糖化工序,可充分地产生单糖,通过为40倍以上的固态成分质量,可确保作为吸附用的充分量的底物量。由此,底物残渣与酶蛋白质的质量比充分,可吸附70质量%以上的酶蛋白质。需要说明的是,反应容器内的底物残渣量可通过用高效液相色谱等公知的分析器測定混合液中的单糖或寡糖各自的量或它们的总量等来确认。吸附于木素纤维素原料的酶的回收如下进行对上述处理后的液体进行离心、或粗过滤等操作,从而分离成糖化液和作为固态成分的木素纤维素原料,分离取得固态成分一方。可以将上述吸附有酶的木素纤维素原料作为酶-底物复合物供给至下ー批的糖化反应中。应用于糖化液与底物固态物的分离的离心或粗过滤的条件可直接应用本领域内通常使用的方法,例如,在离心的情况下,可设置为500 X g 10000 X g,在粗过滤的情况,可使用不锈钢、陶瓷、树脂制的过滤器,使用网眼尺寸为O. I μ m 2_的过滤器进行过滤。另ー方面,对于固-液分离エ序的分离至上清糖化液中的酶活性成分,优选将其回收并用于再糖化。通过上述的回收方法追加回收未吸附的酶成分,可以使本发明中再次的酶糖化反应更稳定地进行。对于被分离至液体中的酶成分,使用膜从上清糖化液过滤分离回收或使用蛋白质 精制用树脂柱进行精制并回收,可以与吸附于上述的固态成分而被回收的酶成分合并,供给至下ー批的糖化反应エ序。或者,不从上述糖化液回收酶,而另行添加相当活性量的新的酶成分。从而可以以与前ー批的糖化反应エ序相同的活性量继续进行糖化反应。发现上述固-液分离エ序中被分离至上清糖化液中的酶成分主要含有β -葡萄糖苷酶、一部分内切葡聚糖酶。因此,从糖化效率的观点考虑,优选将葡萄糖苷酶、内切葡聚糖酶或它们的组合用作追加的糖化酶。回收后的糖化工序中,使用通过上述回收エ序回收的糖化酶,将木素纤维素原料糖化(本说明书中,有时称为“再糖化”)。优选追加上述固-液分离エ序中回收的被分离至液体中的酶。由此,即使进行重复再糖化,也可维持单糖蓄积率。使用吸附于木素纤维素原料而被回收的糖化酶、和被分离至液体中的酶(将它们合并,称为回收酶混合物)进行再糖化时,作为通过吸附于底物固态物来 回收的酶成分,优选使用追加了与被分离至糖化液中的活性量相当的新的酶活性成分的酶混合物。从而可更精密地控制、规定用于再糖化的酶活性量。此外,也优选向通过吸附至底物固态物来回收的酶成分中追加通过过滤分离或树脂精制回收在固-液分离エ序中被分离至糖化液中的酶活性成分而得到酶活性成分,从而得到酶混合物。由此,没有必要追加酶,可大幅降低酶的使用量。需要说明的是,作为对分离的酶活性成分进行过滤分离或树脂精制的方法,可使用可回收酶活性成分的膜装置或树脂柱,可举出例如旭化成公司制“MICROZA pencil-scale型module ACP-0013D”等。各酶的活性回收值可直接使用通常使用的方法得到。例如,β_葡萄糖苷酶活性值可设定为通过用HPLC对底物纤维素ニ糖的分解速度进行定量而确定的值。此外,内切葡聚糖酶活性值可设定为測定590nm的吸光度变化来确定底物Azo-CM-Cellulose的分解活性而得到的值。对上述活性值与相当于最初投入的酶浓度的酶标准液进行比较,可计算出酶活性回收率。进ー步向上述回收酶混合物中追加作为底物的木素纤维素原料或其前处理品,用水调节浓度使得与最初的糖化反应条件一致,然后,控制pH、温度进行搅拌同时进行再糖化反应。以上的一系列的酶糖化、酶回收、再糖化可以重复实施,在维持酶的活性的期间内,可持续降低催化剂成本。实施例通过以下的实施例进ー步具体地说明本发明,但是本发明并不受以下实施例的任何限制,另外,除非另有说明”是指质量%。[实施例I]木素纤维素原料的前处理准备阔叶树牛皮纸浆(LBKP)作为木素纤维素含有物(以下“木素纤维素原料”、“纸浆”、和“LBKP”各术语表示相同含义,可相互交換使用)。取LBKP放入玻璃烧杯中并用水稀释使得固态成分浓度为10% [w/V],接着,以终质量浓度O. 5%添加硫酸。对于装入有LBKP-硫酸溶液的烧杯,在反应釜中于130°C下加热4小时。冷却后,用NaOH、和柠檬酸缓冲液(终浓度20mM)调节至pH5.0,形成木素纤维素原料前处理品。用高效液相色谱(HPLC)分析上述木素纤维素原料前处理品,半纤维素成分的88%被分解为可溶性的木糖,确认到糠醛的生成量仅为原料的干燥质量的O. 5%。<分析条件>
分析仪器日本分光HPLC柱ULTR0NPS-80H(300 X 8mm ;信和化工株式会社制)分析温度50°C流动相高氯酸水溶液pH2. I[实施例2]酶对木素纤维素原料的吸附试验
分别研究酶对木素纤维素原料、和木素纤维素原料前处理品的吸附性。使用含有内切葡聚糖酶、纤维二糖水解酶、β -葡萄糖苷酶、和半纤维素酶的市售的纤维素酶水溶液(商品名Accellerasel000, Genencor公司制)作为酶。用Bradford法测定使用的纤维素酶水溶液的蛋白质浓度,结果为2. 5质量%。使用烧瓶,向20mM的柠檬酸缓冲液中加入纤维素酶水溶液和木素纤维素原料前处理品,使得蛋白质质量木素纤维素原料前处理品固态成分质量比为I : 13、1 40、I 67、1 120,1 200。在45°C缓慢搅拌烧瓶,I分钟后回收吸附试验液,以7000X g离心,得到上清液。用Bradford法测定离心上清液中的蛋白质浓度,与未进行吸附处理的纤维素酶水溶液的蛋白质浓度进行比较。同样地,向20mM的柠檬酸缓冲液中加入纤维素酶水溶液和LBKP (未处理品),使得蛋白质质量LBKP固态成分质量比为I : 13、1 40,1 67、1 120,1 200。在45°C下缓慢搅拌烧瓶,I分钟后回收吸附试验液,以7000Xg离心,得到上清液。用Bradford法测定离心上清液中的蛋白质浓度,与未进行吸附处理的纤维素酶水溶液的蛋白质浓度进行比较。以上的研究中的酶活性成分总蛋白质量的、使用木素纤维素原料、及木素纤维素原料前处理品的吸附回收率示于表I。[表 I]
权利要求
1.一种由木素纤维素原料制造单糖的单糖制造方法,包括 得到由木素纤维素原料及糖化酶得到的糖化液; 使所述糖化液中的糖化酶吸附于木素纤维素原料将其回收;以及, 使用回收的所述糖化酶将木素纤维素原料糖化。
2.如权利要求I所述的制造方法,其中,所述木素纤维素原料为阔叶树牛皮纸浆、针叶树牛皮纸浆、机械纸浆、来自草本的纸浆、废纸、或造纸污泥、或它们的混合物。
3.如权利要求I或2所述的制造方法,其中,所述木素纤维素原料为由前处理得到的前处理原料,所述前处理是在酸性条件下进行加热处理后进行中和。
4.如权利要求3所述的制造方法,其中,所述前处理原料中的半纤维素含量为前处理前的50质量%以下。
5.如权利要求3或4所述的制造方法,其中,所述前处理原料中的糠醛为前处理原料的干燥质量的I质量%以下。
6.如权利要求I 5中任一项所述的制造方法,其中,所述木素纤维素原料为由前处理得到的前处理原料,所述前处理包括以下(a) (d) (a)得到木素纤维素原料的固态成分浓度为8质量% 30质量%的原料液; (b)用终浓度为0.2质量% 12质量%的无机酸对所述原料液进行酸化; (c)在80°C 150°C下对酸化过的原料液进行I小时 6小时保温; (d)在20°C 80°C下将所述保温后的原料液调节为pH3 8。
7.如权利要求6所述的制造方法,其中,所述无机酸为硫酸、盐酸、硝酸、磷酸或它们的组合。
8.如权利要求I 7中任一项所述的制造方法,其中,所述回收包括以下(e) (h) (e)得到所述糖化液和木素纤维素原料的混合液,所述木素纤维素原料的固态成分质量为所述糖化酶的酶活性成分的总蛋白质质量的40倍以上; (f)在20°C 80°C下进行I分钟 3小时的保温; (g)将所述保温后的混合液固-液分离为糖化液和作为固态成分的吸附有酶的木素纤维素原料; (h)将分离的所述木素纤维素原料作为酶-底物复合物回收。
9.如权利要求I 7中任一项所述的制造方法,其中,所述回收包括以下(i) (k) (i)在残存所述糖化酶的酶活性成分的总蛋白质质量的40倍以上的固态成分质量的木素纤维素原料的条件下,终止糖化反应; (j)将反应终止后的反应液固-液分离为糖化液和作为固态成分的未反应的木素纤维素原料; (k)将分离的所述木素纤维素原料作为酶-底物复合物回收。
10.如权利要求8或9所述的制造方法,其中包括 添加在所述固-液分离时被分离至液体中的酶活性成分的糖化酶,进行所述糖化。
11.如权利要求10所述的制造方法,其中,在所述固-液分离时被分离至液体中的酶活性成分的糖化酶含有3-葡萄糖苷酶。
12.如权利要求8或9所述的制造方法,其中,所述被分离至液体中的酶活性成分的糖化酶是通过过滤分离或树脂精制来回收在所述固-液分离中被分离至糖化液中的酶活性成分而得到的物质。
13.如权利要求I 12中任一项所述的制造方法,其中,所述糖化酶是选自纤维素酶及半纤维素酶中的至少一种。
14.如权利要求13所述的制造方法,其中,所述纤维素酶是具有内切葡聚糖酶、纤维二糖水解酶及3-葡萄糖苷酶的各活性的酶混合物。
15.如权利要求13或14所述的制造方法,其中,所述半纤维素酶是具有木聚糖酶、木糖苷酶、甘露聚糖酶、果胶酶、半乳糖苷酶、葡糖苷酸酶及阿拉伯呋喃糖苷酶的各活性的酶混合物。
全文摘要
本发明提供一种由木素纤维素原料制造单糖的单糖制造方法,包括得到由木素纤维素原料及糖化酶得到的糖化液;使上述糖化液中的糖化酶吸附于木素纤维素原料将其回收;以及使用回收的上述糖化酶将木素纤维素原料糖化。
文档编号C12P19/14GK102666871SQ201080051800
公开日2012年9月12日 申请日期2010年11月25日 优先权日2009年11月27日
发明者中山章, 安乐城正, 木村樱子, 松本和也, 渡边清一, 藤井亮太, 远藤绚子, 长部雅巳 申请人:三井化学株式会社