专利名称：制备间充质干细胞、组合物和其试剂盒的方法
技术领域：
本发明涉及干细胞处理过程及在干细胞基础上得到组合物以用于临床应用的方法。特别地，涉及一种处理抽取的骨髓以分离间充质干细胞(MSC)及其大规模培养/扩增以进一步用于临床应用的方法。
背景技术：
在人骨髓中间充质干细胞(hMSC)数量极少，仅占有核细胞的0. 001至0. 01%，但是他们在培养基中能很快地生长和扩增，而不失去干细胞特性。hMSC由于具有以下特性而具有提高修复受损组织的潜能(I)易分离；(2)高扩增潜力；(3)遗传稳定性；(4)从分离到分离的可再生(可再现)属性；(5)可再生特性；(6)与组织工程方法的兼容性。目前MSC和类MSC细胞还能从除骨髓之外的多种其他组织中分离出来，这些组织包括脂肪组织、羊水、骨膜和胎儿组织，并表现出表型差异。表型上，MSC表达多个标志物，然而，不巧的是，没有一个是MSC特异的。从人骨髓获得的间充质干细胞(hBMSC)已被广泛研究，是由于其相对易获得且具有分化为骨原细胞、成脂细胞、软骨细胞和包括肝细胞、心肌细胞和神经元的其他种类组织或细胞的潜能。其多潜能性及自我更新性使其作为自我更新细胞来源及在可再生药物的应用方面得到了更多的关注。另外，其基于对培养物的粘附性的基础上的分离形成了去除非间充质系细胞系的简单方法、降低了对基于特征表面标记物表达的复杂细胞分离方法的依赖性。源于骨髓的MSC的局限性是其数量少，而临床应用需要应用大量的MSC。本发明提供了处理源于骨髓的MSC和为临床应用进一步大量扩增的方法。
发明内容
本发明公开了一种制备包含间充质干细胞、胎牛血清(FBS)和二甲基亚砜(DMSO)的主细胞库(原始细胞库，Master Cell Bank)组合物的方法,所述的方法包含以下步骤a)获得骨髓细胞并在培养基中将其稀释，离心经稀释的细胞以得到第一团块(the firstpellet)，并用培养基将第一团块重新稀释，b)向重新稀释后的团块中加入密度梯度溶液并离心以在界面处得到阻挡层(buffy layer), c)向阻挡层中加入等体积的培养基并离心以获得第二团块(a second pellet)，然后将第二团块悬浮于培养基中，并孵育以获得约80%至85%的汇合率(汇合度)，d)吸出培养基并用杜氏磷酸盐缓冲液(DPBS)清洗汇合细胞，然后用0. 25%的胰酶处理细胞并再次孵育经处理的细胞，e)用中和培养基将经再次孵育的细胞中和并再次将细胞离心以获得第三团块(a third pellet)，然后使第三团块悬浮在培养基中，并用包含约85%至95%的FBS和约5%至15%的DMSO的冷冻培养基将细胞冷冻，以及f)将冷冻的细胞用胰酶处理，并使经胰酶处理的细胞再次悬浮于冷冻培养基中以获得主细胞库组合物；一种制备包括间充质干细胞、胎牛血清(FBS)和二甲基亚砜(DMSO)的工作细胞库(Work Cell Bank)组合物的方法,所述方法包含以下步骤a)如上所述,用来自于不同捐献者的骨髓细胞制备主细胞库组合物，b)从组合物中获得细胞团块，然后使细胞团块悬浮于培养基并等比例汇合细胞以得到细胞集合(cell aggregate ), c )用培养基培养所述细胞集合，然后孵育已得到约80%至85%的汇合率并再次执行以上步骤(d)，d)用培养基中和再次孵育的细胞，然后将细胞离心以获得第二团块，并使第二团块悬浮在培养基中以获得培养细胞，e)再次将培养细胞离心并用包含约85%至95%的FBS和约5%至15%的DMSO的冷冻培养基将细胞冷冻，以获得工作细胞库组合物；一种制备包括间充质干细胞、勃脉力A液(plasmalyte A)、人血清白蛋白(HSA)、二甲基亚砜(DMSO)的组合物的方法,所述组合物选择性具有药用添加剂，所述方法包括以下步骤a)如上述制备工作细胞库组合物，b)从组合物中获得间充质干细胞，用培养基培养细胞并孵育以得到约80%至85%的汇合率，再次执行上述步骤(d)，c)用培养基中和经再次孵育的细胞，然后将细胞离心以获得细胞团块，在DPBS中清洗细胞团块，然后再次离心以获得第二细胞团块，d)使第二细胞团块悬浮于完全培养基中并培养细胞，然后将培养后的细胞孵育，并向经孵育的细胞中加入完全培养基以获得约80%至85%的汇合率，e)用胰酶消化汇合细胞并用DPBS再次清洗细胞，然后用0. 25%的胰酶处理经再次清洗的细胞，并孵育经处理的细胞，接着用完全培养基中和孵育后的细胞，f)离心经中和的细胞并用DPBS清洗经离心的细胞，再次离心以获得第三团块，g)用勃脉力A液、DMSO和人血清白蛋白冷冻第三团块并选择性地包含药用添加剂以获得组合物；包括间充质干细胞、人血清白蛋白(HSA)、勃脉力A液和二甲基亚砜(DMS0)，并可选性地具有任意药用添加剂的组合物；一种包括间充质干细胞、胎牛血清(FBS)和二甲基亚砜(DMSO)的主细胞库或工作细胞库组合物；包含上述组合物和说明书的试剂盒。
为使本发明易于理解和实施，现将参考示例性实施方式和附图进行解释，附图和其下的详细注释并入并成为说明书的一部分，用于进一步说明实施方式和解释许多原理及优点，依照本发明，其中图I是描述涉及获得主细胞库(MCB)步骤的流程图。图2是描述涉及获得工作细胞库(WCB)步骤的流程图。图3是描述涉及获得最终组合物/研究产品(IP)/研究医疗产品(MP)步骤的流程图。图4是第5代的研究产品(IP)的照片(放大100X)，显示了形态特征，为纺锤体状且成纤维细胞样。
具体实施例方式本发明涉及一种制备包含间充质干细胞、胎牛血清(FBS)和二甲基亚砜(DMSO)的主细胞库组合物的方法，所述的方法包含以下步骤(a)获得骨髓细胞并在培养基中将其稀释，将稀释后的细胞离心以得到第一团块，并用培养基将第一团块重新稀释；(b)向重新稀释后的团块加入密度梯度溶液以在界面处得到阻挡层；(c)向阻挡层重新加入等体积的培养基并离心以获得第二团块，然后使第二团块悬浮于培养基中，并孵育以达到约80%至约85%的汇合率；
(d)吸出培养基并用杜氏磷酸盐缓冲液(DPBS)清洗汇合细胞，然后用0. 25%的胰酶处理细胞并再次孵育经处理的细胞；(e)用中和培养基中和经再次孵育的细胞并再次将细胞离心以获得第三团块，然后在培养基中悬浮第三团块，并用包含约85%至95%的FBS和约5%至15%的DMSO的冷冻培养基将细胞冷冻；以及(f)将冷冻的细胞用胰酶消化并将经胰酶处理过的细胞再次悬浮于冷冻培养基中以获得主细胞库组合物。
在本发明的一个实施方式中，所述孵育过程在温度约为37° C的5%C02孵育箱中实施的；在约7天至8天后补充培养基获得汇合率；中和培养基包括达尔伯克氏改良伊格尔培养基-KNOCKOUT[DMEM-K0]、约10%的胎牛血清(FBS)和约0. 5%的青霉素-链霉素；再次孵育是在37 ° C的孵育箱中完成的，孵育时间为2分钟至3分钟。本发明涉及一种制备包括间充质干细胞、胎牛血清(FBS)和二甲基亚砜(DMSO)的工作细胞库组合物的方法，所述方法包含以下步骤(a)如上所述，用来自不同捐献者的骨髓细胞制备主细胞库组合物；(b)从组合物中获得细胞团块，然后使细胞团块悬浮于培养基并等比例汇集细胞以得到细胞集合；(C)用培养基培养该细胞集合，然后孵育以得到约80%至85%的汇合率并再次执行以上步骤(d)；(d)用培养基将再次孵育后的细胞中和，然后将细胞离心以获得第二团块，并使第二团块悬浮于培养基以获得培养细胞；以及Ce)将培养细胞再次离心并用包含约85%至95%的FBS和约5%至15%的DMSO的冷冻培养基冷冻细胞，以获得工作细胞库组合物。在本发明的一个实施方式中，主细胞库组合物包括约含I百万至3百万个细胞的间充质干细胞、约85%至95%的胎牛血清(FBS)和约5%至15%的DMS0。在本发明的另一个实施方式中，所述细胞团块的获得是通过解冻干细胞、用完全培养基中和冷冻培养基并在约IOOOrpm至1500rpm下离心约10至20分钟得到的。本发明涉及一种制备包括间充质干细胞、勃脉力A液、人血清白蛋白(HSA)、二甲基亚砜(DMSO)的组合物的方法，所述组合物可选地加入药用添加剂，所述方法包括以下步骤(a)根据上述内容制备工作细胞库组合物；(b)从组合物中获得间充质干细胞，用培养基培养细胞并孵育以得到约80%至85%的汇合率，再次执行上述步骤(d)；(c)用培养基中和经再次孵育的细胞然后将细胞离心以获得细胞团块，在DPBS中清洗细胞团块，然后再次离心以获得第二细胞团块；(d)使第二细胞团块悬浮于完全培养基中并培养细胞，然后将培养后的细胞孵育，并向孵育后的细胞中加入完全培养基以获得约80%至85%的汇合率；Ce)用胰酶处理汇合细胞并用DPBS再次清洗细胞，然后用0. 25%的胰酶处理经再次清洗的细胞，并孵育经处理的细胞，然后用完全培养基将孵育后的细胞中和；(f)离心处理中和后的细胞并用DPBS清洗离心后的细胞，再次离心以获得第三团块；以及(g)用勃脉力A液、DMSO和人血清白蛋白冷冻第三团块并选择性地加入药用添加剂以获得组合物。在本发明的一个实施方式中，所述工作细胞库包括含约I百万至3百万个细胞的间充质干细胞、约85%至95%的胎牛血清(FBS)和约5%至15%的二甲基亚砜(DMS0)。在本发明的另一个实施方式中， 离心过程是在约20° C至25° C的温度范围内、约1200rpm至1500rpm的速度下离心约10至20分钟的持续时间进行的。在本发明的另一个实施方式中，孵育是在约37° C下5%的CO2孵育箱中完成的；其中，所述汇合率是在约7天至8天后补充培养基获得的；且其中所述再次孵育是在37° C的孵育箱中孵育约2至3分钟完成的。在本发明的另一个实施方式中，所述培养基包括浓度范围为约85%至95%的达尔伯克氏改良伊格尔培养基-KNOCKOUT[DMEM-K0]、浓度范围为约5%至15%的胎牛血清[FBS]、浓度范围为约0. 5%至2%的谷氨酰胺、浓度范围为约0. 1%至1%的青霉素-链霉素和浓度范围约0. 5ng/mL至5ng/mL的碱性成纤维细胞增长因子(bFGF)。本发明涉及一种包括间充质干细胞、人血清白蛋白(HSA)、勃脉力A液和二甲基亚砜(DMSO)的可选地包含药用添加剂的组合物。本发明涉及包括间充质干细胞、人血清白蛋白(HSA)、勃脉力A液和二甲基亚砜(DMSO)的主细胞库或工作细胞库组合物。本发明的一个实施方式中，在每个冻存管中，间充质干细胞浓度范围为约25百万至200百万个细胞、人血清白蛋白的浓度范围为约1%至6%、勃脉力液的浓度范围为约80%至90% ;且二甲基亚砜的浓度为约5%至10%。在本发明的另一个实施方式中，在每个冻存管中，间充质干细胞的浓度范围约为I百万至3百万个细胞；胎牛血清的浓度范围为约85%至95% ;二甲基亚砜的浓度范围为约5%至约15%。在本发明的另一个实施方式中，药用添加剂为勃脉力A液。本发明涉及包含上述组合物和说明书的试剂盒。本发明提出了一种治疗应用的源于骨髓的MSC的分离、汇集和大规模扩增的方法。本发明还公开了保存/储存新鲜富集的间充质干细胞(MSC)、最优条件下在移植前将冷冻-解冻的MSC以维持其特定期限内活性及全能性的基本方法。另外，本发明还涉及一种包含间充质干细胞、人血清白蛋白、勃脉力A液和二甲基亚砜(DMSO)及药用赋形剂的用于临床的组合物。本发明还涉及一种获得所述组合物的方法。所述方法进一步包括从抽出的骨髓中建立主细胞库，然后制备工作细胞库并最终得到研究医疗产品的组合物。在本发明的另一个实施方式中，这里所用的术语“研究医疗产品(IMP)或研究产品(IP)或治疗用组合物或组合物”全部表示主要组成为源于骨髓的异源间充质干细胞，并包括人血清白蛋白、勃脉力A液和二甲基亚砜(DMSO)的组合物。在该说明书的下文中将用IMP表示所涉及的组合物。在一个实施方式中，本发明提供了一种组合物和一种获得其的方法，所述组合物主要包含作为活性成分的间充质干细胞，人血清白蛋白、勃脉力A液和二甲基亚砜(DMS0)。所述间充质干细胞来自多位健康捐献者抽出的骨髓，优选为I至5位捐献者，更优选为I至3位捐献者；并在制备主细胞库时进行多重处理。进一步，工作细胞库是从所述主细胞库中获得的，然后将其配制成方便组合物/用于治疗的(IMP) /临床应用。MSC的分离，主细胞库、工作细胞库和研究产品的制备MCB 制各在本发明的一个实施方式中，在无菌条件下从每位健康捐献者髂嵴中抽取60-70mL骨髓，分别收集至各自的血袋中。用20mL的注射器将样品转移使其通过细胞筛(100 y L)以除去骨针、血凝块和细胞聚集块，并收集至离心管中。用完全培养基将收集的骨髓稀释并以约1200rpm至1500rpm的速度离心约10至20分钟。完全培养基包括达尔伯克氏改良伊格尔培养基-KNOCKOUT [DMEM-K0]、胎牛血清(10%)、谷氨酰胺(1%)和青霉素-链霉素[Pen-Strep] (0.5%)。去除上清液并用完全培养基稀释细胞团块。在另一个离心管中放置淋巴细胞分离液(浓度梯度溶液)，然后向其中加入双倍体积的稀释后骨髓，并在室温及1200rpm至1500rpm速度下离心约10至20分钟，其中室温为20° C至25° C。收集界面处的阻挡层并对细胞计数。在本发明的另一个实施方式中，阻挡层由单核细胞(MNC)组成。用完全培养基清洗阻挡层的MNC、从每位捐献者得来的MNC的数量均不同，取决于捐献者的年龄和生物学特性。MNC的平均数量约为400百万-1000百万。将剩余的MNC置入一个小瓶中冷冻并在该小瓶中计数。向剩余的阻挡层中加入等体积的完全培养基并以约1200rpm至1500rpm的速度离心约10至20分钟。向细胞团块中加入培养基并使之逐渐悬浮。用血球计对细胞计数并向每个T-75烧瓶中接种约40百万-50百万个MNC细胞；并在37° C下将其转移至5%的CO2孵育箱中。在约72小时后第一次更换培养基，然后每48小时更换一次直至烧瓶中达到80%_85%的汇合率。由于MSC独特的塑料粘附性(plastic adherence)其将粘附于表面，因此能够保证培养基的置换。经过约48至约72小时后，通过显微镜观察到细胞，并拍摄下两张典型显微照片。在一个具体实施方式
中，在烧瓶中培养细胞直至达到约80%至85%汇合率。当汇合率达到约80%-85%时，将完全培养基吸出并用DPBS清洗细胞两次。向每个T-75烧瓶中加入约l-2mL的胰酶并在37。C下培养约2至3分钟。用包含DMEM-KO、10%FBS和0. 5%青霉素-链霉素[Pen-Strep]的中和培养基中和，并将中和后的样品收集后在室温及约1200rpm至1500rpm速度下离心约10至20分钟。向细胞团块中加入完全培养基，然后对细胞计数。然后用由约85%至95%的FBS和约5%至15%的DMSO组成的冷冻培养基加入每毫升含有约为I百万MSC细胞的小瓶中进行冷冻，被称为OR(PO)(如1-2管)，将细胞培养室(cellstacks)中剩余的细胞以每平方厘米接种约6，666个细胞的密度来培养/扩增，第7天或第8天(培养期)更换完全培养基并在第14至第18天用0. 25%的胰酶收获细胞培养室，用包含DMEM-K0、10%FBS、0. 5%青霉素-链霉素[Pen-Str印]的中和培养基中和胰酶处理过的细胞，收集至离心管中并以约1200rpm至1500rpm的速度离心约10分钟至20分钟。使细胞团块悬浮于完全培养基中以估计细胞数量。将浓度约为每毫升I百万至3百万细胞的小瓶中的细胞用包括约85%至95%的FBS和约5%至15%的DMSO的冷冻培养基冷冻，被称为第I代(Pl)细胞或主细胞库。WCB 制备:在本发明的另一个实施方式中，从每个主细胞库中取一个小瓶(I)，然后计数细胞、并将每位捐献者的细胞等比例汇集。这称为汇集(Pooling)。汇集根据需要可以是2，3，4，5或更多捐献者。在对所有捐献者的细胞进行计数，汇集后检测细胞活性；并将活性细胞按照每次获得的细胞数量平铺于2-10个室中。然后在约37° C下将培养室转移至5%C02孵育箱中，48-72小时后在显微镜下观察细胞集合并拍摄下两张典型显微照片。在第7天至第8天补充新鲜制备的包含有DMEM-KO、FBS、谷氨酰胺、青霉素-链霉素和碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)的完全培养基。培养细胞直至容器中的细胞汇合率达到80%-85%。在本发明的另一个实施方式中，当汇合率达到约80%_85%，吸出完全培养基并用DPBS冲洗两次。添加入胰酶后，在37° C下孵育约4分钟至5分钟，然后用中和培养基中和。收集中和后的样品并在室温下以约1200rpm至1500rpm的速度离心约10分钟至20分钟。将完全培养基加入获得的细胞团块中并计数。然后培养/扩增细胞培养室的细胞以得到下一代，收获细胞并离心。向获得的细胞团块中加入完全培养基并计数，将小瓶在约180° C 至196° C条件下冷冻，因此每个小瓶中在包括85%至95%FBS和约5%至15%的DMSO的冷冻混合液中包含约1-3百万MSC。这构成第3代(P3)的工作细胞库。在本发明中使用的低温储存箱利用液氮且工作细胞库用来进行下一步大规模扩增。为大规模扩增的接种准备在本发明的一个实施方式中，根据IMP制剂所需的细胞数量，将WBC瓶中具体数目的细胞复苏并计数。开始时检测细胞活力并将活性细胞以每平方厘米约1000个细胞的接种密度涂覆。然后将小瓶移至培养室中并放入5%0)2孵育箱中，维持约37° C。在每48小时至72小时后，在显微镜下观测细胞培养室并拍摄两张典型显微照片。然后补充完全培养基并在7至8天后用新鲜制备的完全培养基持续补充。培养细胞直至培养室中含有约80%至85%的汇合率。在本发明的另一实施方式中，当获得约80%至85%的汇合率后，吸出消耗的培养基并用DPBS清洗细胞培养室两次。加入清洗胰酶后，在约37° C孵育约4分钟至5分钟后用中和培养基中和。收集中和后的样品并在范围为20° C至25° C室温下以约1200rpm至1500rpm的速度离心约10分钟至20分钟。向细胞培养室中加入DPBS混合好后以约1200rpm至1500rpm的速度离心约10分钟至20分钟。使细胞悬浮于完全培养基中以计数接种细胞。以上描述的细胞称为第4代(P4)阶段的接种细胞。大规樽牛产:在本发明的一个实施方式中，上述经计数的活性细胞进一步扩增为多个十层细胞培养室(Ten Cell stacks) (TCS)(通常为22. 4TCS)，其接种密度为每平方厘米1000至1100个细胞。然后将培养室转移至5%的CO2孵育箱中。在本发明的一个实施方式中，每48-72小时后在显微镜下观察细胞培养室并拍摄两张典型显微照片。在第7或第8天向现有的十层细胞培养室(Ten Cell stacks)中加入约500mL包含bFGF的完全培养基，但不去除经消耗的培养基，被称为流加培养活化过程(批次活化过程，Fed batch activation process)。在本发明的另一实施方式中，在第7或第8天(培养期)用流加培养活化(批次活化，Fed batch activation)补充培养基并在第14至18天用0. 25%的胰酶收获细胞培养室。培养细胞直至室中含有约80%至85%汇合率。在本发明的另一个实施方式中还公开了，当汇合率达到80%至85%时，收集不同离心管中细胞培养室中被消耗的培养基并用DPBS清洗细胞培养室。清洗后加入胰酶并在37° C孵育约3分钟至4分钟，用消耗培养基中和。收集离心管中经中和的样品并在室温及约1200rpm至1500rpm速度下离心约10分钟至20分钟。使细胞悬浮于DPBS中并在约1200rpm至1500rpm速度下离心约10分钟至20分钟以清洗两次。在用DPBS进行最终清洗之前在血球计下对细胞计数。向经最终清洗的细胞团块中添加新鲜配制的包含勃脉力A液、DMSO和人血清白蛋白的冷冻混合液，并将所有混合液转移至低温袋中。这是本发明的最终頂P/方便(速溶)组合物，包含间充质干细胞、勃脉力A液、人血清白蛋白(HSA)和DMS0，该组合物可以用于治疗/临床应用。在本发明的一个实施方式中，包括从骨髓中获得干细胞的过程如下本发明用一下实施例及图形来进一步描述。然而这些实施例不应仅限于本发明的范围内。 实施例I 步骤I :源于骨髓的MSC的分离以制备主细胞库I、将经过细胞筛(IOOiim)的骨髓抽出物离心以除去骨针及细胞团块。2、用完全培养基按照1:1的比例将骨髓稀释后轻轻混匀，完全培养基包括达尔伯克氏改良伊格尔培养基-KnockOut [DMEM-K0]、胎牛血清(FBS)、谷氨酰胺和青霉素-链霉素。3、在约1200rpm至1500rpm速度下离心约10分钟至20分钟。4、小心吸取去除上层液后用完全培养基稀释细胞团块。5、向一 50mL的离心管中加入淋巴细胞分离液并加入双倍体积的稀释骨髓(1:2比例)。6、将骨髓样品覆盖在淋巴细胞上以使样品与淋巴细胞分离液无混合。7、在室温下以约1200rpm至1500rpm的速度离心约10分钟至20分钟。8、从阻挡层回收单核细胞，阻挡层位于RBC和血浆富含层之间，并将移液器置于阻挡层边缘处，以45°角小心地吸取阻挡层，以保证未吸出其它层溶液。9、将细胞转移至一新离心管中并利用血球计计数细胞。10、冷冻10小瓶单核细胞(MNC)，每个小瓶中含有约10百万个细胞。11、向剩余的阻挡层中加入等体积的完全培养基，然后以约1200rpm至1500rpm的速度离心约10分钟至20分钟。12、向细胞团块中添加约IOmL培养基并轻轻使之再悬浮。13、利用血球计计数细胞。14、将约40百万至50百万MNC细胞转移至T_75烧瓶中。15、将培养室转移至37° C的5%C02孵育箱中，并孵育约10-15天。16、约48小时至72小时后在显微镜中观察细胞培养室并拍摄两张典型的显微照片。17,72小时后补充完全培养基，然后每48小时后补充新鲜制备的完全培养基。18、培养细胞直至培养室中的细胞汇合率达到约80%至85%。19、当汇合率达到约80%至85%时，将完全培养基吸出并用DPBS清洗细胞培养室两次。
20、清洗结束后向每个烧瓶中加入约2mL，0.25%的胰酶并在37° C的孵育箱中孵育约2-3分钟。21、按照1:4的比例用中和培养基将胰酶的作用中和。22、收集中和后的样品至离心管中并在室温及约1200_1500rpm的速度下离心约10分钟-20分钟。23、向细胞团块中加入完全培养基并对细胞计数。 24、在包含85%至95%的FBS和5%至15%的DMSO的冷冻培养基中冷冻3_10小瓶上一传代的细胞，其终浓度为每毫升含有1，00万至3，00万个细胞。以6666个细胞/cm2的密度接种I层细胞培养室(CS)或2CS，扩增培养以得到MCB。25、用胰酶消化收获培养的细胞，使其悬浮于包含85%至95%的FBS和5%至15%的DMSO的冷冻培养基中，且最终细胞浓度为每毫升含I百万至3百万个细胞。步骤2 :从主细胞库中制备工作细胞库26、从多位捐献者每一位的主细胞库小瓶中取一小管(I)。27、在约37° C的水浴中解冻小瓶。28、以1:9的比例用完全培养基中和冷冻培养基以使细胞复活。29、将中和后的悬浮液在室温下以约1200rpm至1500rpm的速度离心约10分钟至20分钟。30、除去上层液并使细胞团块再次悬浮于完全培养基中，分别对每位捐献者的活性细胞总量计数。31、等比例混合所有捐献者的细胞，称为汇集。汇集过程可以在2、3、4、5或更多捐献者中进行。32、对所有1-5或更多捐献者的细胞计数和混合后检测活力，并根据获得的细胞数量将活性细胞以约1000个细胞/cm2的密度接种于2和10个室中。33、然后将培养室转移至约37° C的5%C02孵育箱中。34、每48至72小时后在显微镜下观测细胞培养室并拍摄两张典型显微照片。35、每7至8天用新鲜配制的包含DMEM-KO、FBS、谷氨酰胺、青霉素-链霉素和bFGF的完全培养基补充原来的完全培养基。36、培养细胞直至培养室中的汇合率达到约80%至85%。37、汇合率达到约80%至85%后，将完全培养基吸出并用DPBS清洗细胞培养室两次。38、清洗完成后向每个室中加入20mL约0.25%的胰酶，并在37° C下孵育约4至5分钟。39、按照1:4的比例用完全培养基中和胰酶的作用。40、收集中和后的样品至离心管中，并在室温下以约1200rpm至1500rpm的速度离心约10分钟至20分钟。41、向细胞团块中加入约IOmL至20mL完全培养基并对细胞计数。42、扩增细胞培养室中的细胞以得到下一传代并每次按照步骤37-41收获细胞。43、将细胞在室温下以约1200rpm至1500rpm的速度离心约10分钟至20分钟，去除上清液并使细胞团块重新悬浮于包含85%至95%的FBS和5%至15%的DMSO的冷冻培养基中 。44、轻轻混匀并向低温管中加入含有I百万个细胞/mL至3百万个细胞/mL的冷冻培养基中，标记上第3代(P3)WCB。步骤3 :从工作细胞库中制备组合物45、根据IMP的需求将所需数量的工作细胞库小瓶中的细胞复活。对细胞计数并检测其活力。每10层细胞培养室(IOchamber cell stack)接种约6. 36百万活性细胞。46、将培养室转移至温度约为37° C，5%C02的孵育箱中。47、每48小时至72小时后用显微镜观测细胞培养室并拍摄两张典型显微照片。48、每7至8天后用新鲜制备的完全培养基补充原完全培养基。49、培养细胞直至培养室中的汇合率达到约80%至85%。50、汇合率达到约80%至85%后，将完全培养基吸出并用DPBS清洗细胞培养室两次。51、清洗完成后向每个室中加入约20mL 0.25%的胰酶，并在37° C下孵育约2至3分钟。52、按照1:4的比例用完全培养基中和胰酶的作用。53、收集中和后的样品至离心管中，并在室温下以约1200rpm至1500rpm的速度离心约10分钟至20分钟。54、向细胞团块中加入约20mL DPBS,混合好后，以约1200rpm至1500rpm的速度离心约10分钟至20分钟。55、使细胞重新悬浮于完全培养基中测定细胞数量。以上描述的细胞称为P4阶段接种细胞。56、对多个十层细胞培养室(Ten cell stacks)(通常为22. 4TCS)接种P4细胞以获得扩增，接种密度为1000至1100个细胞每平方厘米。57、每48-72小时后在显微镜下观测细胞培养室并拍摄两张典型显微照片。58、在第7天或第8天向十层细胞培养室(Ten cell stacks)中加入约500mL含有bFGF的完全培养基，不去除消耗的培养基。59、在第14至18天当培养室中汇合率达到约80%至85%后用0. 25%的胰酶收获细胞培养室。60、当汇合率达到约80%至85%后，在分开的离心管中从细胞培养室收集经消耗的培养基，并用DPBS清洗细胞培养室两次。61、加入胰酶，并在37° C的孵育箱中孵育约3分钟至4分钟，用收集的经消耗的培养基将其中和。62、收集中和后的样品至离心管中，并在室温下以约1200rpm至1500rpm的速度离心约10分钟至20分钟。63、在DPBS中重悬细胞,清洗两次，以约1200rpm至1500rpm的速度离心约10分
钟至20分钟。64、在最后一次DPBS冲洗之前用血球计对细胞计数。65、向含有约200百万细胞的最终清洗细胞团块中加入约15mL包含约12. 75mL勃脉力A液、约I. 5mL DMSOJS 0. 75mL人血清白蛋白的冷冻混合液。将所有混合液转移至低温袋中。这是本发明的最终组合物，包含间充质干细胞、勃脉力A液、人血清白蛋白和DMSO，可以用于治疗/临床应用。在本发明的一个实施方式中，每小瓶主细胞库组合物的间充质干细胞中包含约I百万个细胞，每小瓶工作细胞库组合物中约 含3百万个细胞。实施例2 律立丰细朐库图I显示了涉及由分离的骨髓中制备主细胞库(MCB)的主要步骤。步骤101是对19-35岁组的健康捐献者进行筛选,步骤103是利用强制筛选测试(mandatory screeningtest)检测所筛选的捐献者抽出的骨髓中人体免疫缺陷病毒、B型肝炎病毒、C型肝炎病毒和巨细胞病毒。将捐献者常规麻醉后，在无菌条件下吸取多位捐献者髂嵴中的骨髓(60-80mL)。步骤105是涂覆/接种单核细胞(MNC)，然后步骤107是收获第0 R(PO)MSC,109为对PO的MSC再接种。步骤111包括收获第I代(Pl)的MSC以建立主细胞库(MCB)。步骤113是MCB的冻存(I百万细胞/mL至3百万细胞/mL)，冷冻保存溶液包含约85%至95% 的 FBS 和约 5% 至 15% 的 DMS0。律立工作细朐库:图2示出了涉及从主细胞库(MCB)中制备工作细胞库(WCB)的主要步骤。步骤201-汇集来自多位捐献者的MCB，203-P1MSC的接种，205-P2MSC的收获，207-P2MSC的冷冻保存，209-P2MSC的再次接种，211-构成工作细胞库(WCB)的P3MSC的收获，213-包含I百万-3百万细胞/mL的等分样低温保存于冷冻保存混合液/冷冻混合液中，其包括约含约85%至95%的FBS和约含5%至15%的DMS0。制备研究产品(IP) /研究医疗产品(頂P) /治疗组合物图3示出了制备称为该用途的研究产品(IP)/研究医疗产品(IMP)的治疗组合物的多个重要步骤。IP主要是由源于骨髓的异源性间充质干细胞(MSC)及微量其他成分组成。将含有规定数量P3细胞的所需数量的袋复活及接种于完全培养基中，以获得4代(P4)细胞301，这些细胞组成IP。可进一步在包含勃脉力A液、DMSO和人血清白蛋白(HSA)的冷冻混合液/冷冻保存混合液中冷冻保存303。最终的研究产品305包含200百万个细胞、12. 75mL勃脉力A液、I. 5mL DMSO和0. 75mL人血清白蛋白(HSA)0在一个实施方式中，MP包含浓度为约2，500万至20，000万细胞的间充质干细胞、浓度范围为约1%至约6%的人血清白蛋白、浓度范围为约80%至约90%的勃脉力A液和浓度范围为约5%至约10%的二甲基亚砜。实施例3 在一个实施方式中，选取19-35年龄组中的3位健康捐献者(A、B和C)，病人通过强制筛选实验(mandatory screening test)检测了人体免疫缺陷病毒、B型肝炎病毒、C型肝炎病毒和巨细胞病毒，考虑到骨髓中MSC的含量为0. 01至0. 001%，低于该范围时难以进行实验且高于该范围时可能会引入其他杂物成分，例如RBC，深度麻醉捐献者后，在无菌条件下抽取其髂嵴中的骨髓(60-80mL)。
权利要求
1.一种制备包括间充质干细胞、胎牛血清(FBS)和二甲基亚砜(DMSO)的主细胞库组合物的方法，所述方法包括以下步骤 a.获取骨髓细胞并在培养基中稀释骨髓细胞，将经稀释的细胞离心以获得第一团块，并用所述培养基再次稀释所述第一团块； b.向再次稀释的团块中加入浓度梯度溶液并离心以在界面处获得阻挡层； c.向所述阻挡层中再次加入等体积的所述培养基并离心以获得第二团块，然后使所述第二团块悬浮于所述培养基中并孵育以达到约80%至85%的汇合率； d.将所述培养基吸出并用杜氏磷酸盐缓冲液(DPBS)清洗汇合细胞，然后用O.25%的胰酶处理细胞并再次孵育经处理的细胞； e.用中和培养基中和经再次孵育的细胞并再次离心所述细胞以获得第三团块，然后将所述第三团块悬浮于培养基中，并用包含约85%至95%的FBS和约5%至15%的DMSO的冷冻培养基将所述细胞冷冻；以及 f.将经冷冻的所述细胞用胰酶消化并将经胰酶消化的细胞再次悬浮于所述冷冻培养基中以获得主细胞库组合物。
2.根据权利要求I所述的方法，其中所述孵育是在温度为约37°C的5%C02的孵育箱中进行的；通过在约7天至8天后补充所述培养基达到所述汇合率；所述中和培养基包括达尔伯克氏改良伊格尔培养基-KnockOut [DMEM-K0]、约10%的胎牛血清[FBS]和约O. 5%的青霉素-链霉素；所述再次孵育过程是在37° C的孵育箱中进行约2分钟至3分钟。
3.一种制备包含间充质干细胞、胎牛血清(FBS)和二甲基亚砜(DMSO)的工作细胞库组合物的方法，所述方法包括以下步骤 a.根据权利要求I由获自不同捐献者的骨髓细胞制备主细胞库组合物； b.从所述组合物中获得细胞团块，然后将所述细胞团块悬浮于培养基中，并按相同的比例将所述细胞汇集以得到细胞集合； c.用所述培养基培养所述细胞集合，然后孵育以达到约80%至85%的汇合率并再次执行权利要求I的步骤(d); d.用所述培养基中和经再次孵育的细胞，然后离心所述细胞以获得第二团块，并将所述第二团块悬浮于所述培养基中以获得经培养的细胞；以及 e.将经培养的细胞再次离心并用包含约85%至95%的FBS和约5%至15%的DMSO的冷冻培养基冷冻所述细胞团块以获得所述工作细胞库组合物。
4.根据权利要求3所述的方法，其中所述主细胞库组合物包括范围在约I百万细胞至.3百万细胞的间充质干细胞、范围在约85%至95%的胎牛血清(FBS)和范围在约5%至15%的二甲基亚砜(DMSO)。
5.根据权利要求3所述的方法，其中所述细胞团块的获得是通过解冻干细胞、用完全培养基中和冷冻培养基并以约1200rpm至1500rpm持续离心约10至20分钟以获得细胞团块。
6.一种制备包含间充质干细胞、勃脉力A液、人血清白蛋白(HSA)、二甲基亚砜(DMSO)的组合物的方法，所述组合物可选地包含药用添加剂，所述方法包括以下步骤 a.根据权利要求3制备工作细胞库组合物； b.从所述组合物中获得间充质干细胞，然后用培养基培养所述细胞并孵育以达到约80%至85%的汇合率，并再次执行权利要求I的步骤(d)； c.用所述培养基中和经再次孵育的细胞，然后离心所述细胞以获得细胞团块；用DPBS清洗所述细胞团块然后再次离心以获得第二细胞团块； d.在所述完全培养基中重悬所述第二细胞团块并培养所述细胞，接着孵育所述培养细胞并向经孵育的细胞添加所述完全培养基以达到约80%至85%的汇合率； e.将汇合的所述细胞用胰酶消化并用DPBS再次清洗；然后用O.25%的胰酶处理经再次清洗的细胞并孵育经处理的细胞，然后用所述完全培养基中和经孵育的细胞； f.将经中和的细胞离心并用DPBS清洗经离心的细胞，然 后再次离心以获得第三团块；以及 g.用勃脉力A液、DMSO和人血清白蛋白冷冻所述第三团块，可选地添加药用添加剂以获得所述组合物。
7.根据权利要求6所述的方法，其中所述工作细胞库组合物具有范围在约I百万至3百万的间充质干细胞、范围在约85%至95%的胎牛血清(FBS)和范围在约5%至15%的二甲基亚讽(DMSO )。
8.根据权利要求1、3和6所述的方法,其中所述离心是在约1200rpm至1500rpm,温度范围在约20° C至25° C，持续时间为约10分钟至20分钟的范围内实施的。
9.根据权利要求3和6所述的方法，其中所述孵育是在温度为约37°C的5%C02孵育箱中完成的；并且其中所述汇合率是通过在约7天至8天后补充所述培养基获得的；且其中所述再次孵育是在37° C的孵育箱进行约2分钟至3分钟完成的。
10.根据权利要求1、3和6所述的方法，其中所述培养基包括浓度范围为约85%至95%的达尔伯克氏改良伊格尔培养基-KnockOut [DMEM-K0]、浓度范围为约5%至15%的胎牛血清[FBS]、浓度范围为约O. 5%至2%的谷氨酰胺；浓度范围为约O. 1%至1%的青霉素-链霉素和浓度范围为约O. 5ng/mL至5ng/mL的碱性成纤维细胞生长因子[bFGF]。
11.一种包含间充质干细胞、人血清白蛋白(HSA)、勃脉力A液和二甲基亚砜(DMS0)，可选的药用添加剂的组合物。
12.一种包含间充质干细胞、胎牛血清(FBS)和二甲基亚砜(DMSO)的主细胞库或工作细胞库组合物。
13.根据权利要求11所述的组合物，其中在每个冻存小瓶中，所述间充质干细胞的浓度范围为约25百万至200百万细胞；所述人血清白蛋白的浓度范围为约1%至6% ;所述勃脉力液的浓度范围为约80%至90% ;所述二甲基亚砜的浓度范围为约5%至10%。
14.根据权利要求12所述的组合物，其中在每个冻存小瓶中，所述间充质干细胞的浓度范围为约I百万至3百万个细胞；所述胎牛血清的浓度范围为约85%至95% ;以及所述二甲基亚砜的浓度范围为约5%至约15%。
15.根据权利要求11所述的组合物和权利要求6所述的方法，其中所述药用添加剂为勃脉力A液。
16.一种试剂盒，包含权利要求11或权利要求12所述的组合物和说明书。
全文摘要
本发明公开了一种分离、汇集且进一步培养用于临床应用的间充质干细胞(MSC)的方法。本发明也公开了建立主细胞库(Master Cell bank)的方法，然后从工作细胞库(Working Cell Bank)制备最终治疗组合物供临床应用，该最终治疗组合物称为研究产品/研究医疗产品，其包含源于骨髓的异源MSC。
文档编号C12N5/074GK102639694SQ201080053627
公开日2012年8月15日 申请日期2010年11月25日 优先权日2009年11月27日
发明者乌门什·拜库吉·戈利塔德卡, 乔蒂·普拉桑纳, 帕万·库马尔·古普塔, 拉克希·帕尔, 拉维拉加·尼拉瓦尔·塞塔拉姆, 普拉桑纳·库马尔·肯布鲁, 萨蒂什·托特, 阿尼什·森·马宗达 申请人:斯蒂姆普优提克斯个人研究有限公司