专利名称：芳香族化合物、低聚核苷酸衍生物合成用修饰载体、低聚核苷酸衍生物及低聚核苷酸构建物的制作方法
技术领域：
本发明涉及芳香族化合物、以及使用其的低聚核苷酸衍生物合成用脲修饰型载体、低聚核苷酸衍生物及低聚核苷酸构建物。
背景技术：
近年来，DNA、RNA等各种低聚核苷酸逐渐用于治疗、诊断等用途。例如，在诊断用途中，可以举出DNA芯片、DNA微阵列，在治疗用途中可以举出治疗相关基因的导入、以及由疾病相关基因的敲减(knock down)而产生的表达抑制等。而且，也进行了将与特定分子特异性结合的核酸分子、作为多肽的适体用作治疗药的尝试。作为备受注目的核酸技术，可以举出利用RNA干扰(RNAi)的特定基因敲减法。所 RNAi产生的基因表达的抑制如下进行dsRNA被作为RNase III家族之一的切酶识别并切断而形成 21 23 聚体的 siRNAs (短干扰 RNA, short interfering RNAs),该 siRNAs 嵌入到RISC (RNA诱导沉默复合物,RNA-induced silencingcomplex)中，相同的mRNA被继续嵌入的siRNA在中央部切断，从而降解。但是，在生物体中，外源性的DNA、RNA暴露在各种核酸酶中，尤其是RNA容易被核酸酶降解，因此存在无法充分地获得需要的敲减效果、或难以稳定地维持敲减效果这方面的问题。为了解决该问题，对化学修饰低聚核苷酸来使核酸酶耐受性提高的方案进行了研究(非专利文献I 3)。例如，如图I所示，对于siRNA也尝试了用各种取代基对糖、碱基、磷酸酯的部位进行化学修饰(非专利文献4)。这种状况下，如专利文献I所记载，本发明人成功地在CPG树脂上修饰用于导入苯骨架、吡啶骨架的亚磷酰胺(amidite)试剂(例如参照图2和图3)、在核苷酸的3’末端导入两个具有苯骨架、吡啶骨架的单元。该技术是考虑如下所示的RNAi的3’末端悬空端的重要作用而开发出的，能够在不降低敲减效果的情况下使低聚核苷酸的核酸酶耐受性提高。S卩，作为与RNAi的靶mRNA的降解过程相关的多结构域蛋白，已知有RISC，近年来，进行了 RISC中的PAZ结构域与siRNA的共晶X射线晶体结构解析(J.B. Ma. ,K. Ye and D. J.Patel. ,Nature.，429，318-322 (2004) )。其结果明确了 PAZ 结构域识别 siRNA 的 3’末端悬空端，3’末端悬空端的2个核苷酸进入PAZ结构域的疏水性口袋从而被识别(J. J. Song.，J. Liu. ,N. H. Tolia. , J. Schneiderman. , S. K. Smith. , R. A. Martienssen. ,G. J. Hannonand L. Joshua-Tor.，Nat. Struct. Biol.，10，1026-1032(2003)、K. S. Yan.，S. Yan.，A.Farooq.，A. Han.，L Zeng and M. M. Zhou.，Nature.，426，468-474 (2003)、Zhang.，F. A.Kolb.，L. Jaskiewicz. ,E. Westhof and W. Filipowicz.，Cell.，118，57-68(2003)和 A.Lingel.，B. Simon.，E. Izaurralde andM. Sattler.，Nature.，426，465-469(2003))。因此，基于如果化学修饰2个具有疏水性的苯骨架、吡啶骨架来代替3’末端悬空端的2个核苷酸能否提高敲减的效果这个构思，开发出在专利文献I中记载的低聚核苷酸衍生物。应予说明，作为与本发明相关的技术，本发明人等也成功地实现了 将siRNA的3’末端悬空端的磷酸二酯键部分转换成氨基甲酸酯键、脲键，由此消除键部分的负电荷，使细胞核对膜的透过性变得良好，由此提高siRNA的核酸酶耐受性与沉默活性(非专利文献5)。现有技术文献专利文献专利文献I :W02007/094135非专利文献 非专利文献I :L. Beigelman.，J. A McSwiggen. , K. G. Draper et al. , JBiolchem270,25702-25708(1995)27非专利文献2 :S. P. Zinnen K. Domenico. , M. Wilson et al. , RNA8，214-228(2002)非专利文献3 :S. Agrawaland E. R. Kandimalla. , Curr. CancerDrugTargets. , I, 197-209(2001)非专利文献4 :H. Hoshi, FEBS Letters 521, 197-199(2002)非专利文献5 Y. Ueno, T. Naito, K. Kawada, A. Shibata, Hye-SookKim Y. ffataya, Y.Kidade, Biochem Biophys Res Commun 330,1168-1175(2005)
发明内容
但是，在合成上述专利文献I中所记载的在3’末端化学修饰有2个苯骨架或吡啶骨架的低聚核苷酸衍生物时使用的载体的制备中，必需很多的工序，极其费时费力(例如参照图2和图3)。另外，在该载体的制备中，必须使化学上不稳定的亚磷酰胺体与键合于介由连接体键合在载体上的苯骨架或吡啶骨架上的羟甲基反应，从而存在如下问题为了使该一系列反应成功，高度训练过的技术人员必须小心谨慎地进行。本发明是鉴于上述以往的实际情况而完成的，其目的在于，提供可以容易地合成在3’末端化学修饰有苯骨架和吡啶骨架之中2个骨架的低聚核苷酸衍生物、而且能够以少的工序数容易地合成的低聚核苷酸衍生物合成用修饰载体、以及作为用于制备该低聚核苷酸衍生物合成用修饰载体的前体的芳香族化合物。而且，本发明的目的在于，提供对细胞膜的透过性良好、具有优异的核酸酶耐受性的低聚核苷酸衍生物及低聚核苷酸构建物，所述低聚核苷酸衍生物在3’末端化学修饰有苯骨架和吡啶骨架之中的2个骨架。在合成上述专利文献I中所记载的在3’末端化学修饰有2个苯骨架或吡啶骨架的低聚核苷酸衍生物时使用的载体的制备中，采用与在DNA、RNA的合成中使用的亚磷酰胺体相同的方法，芳香族环彼此通过磷酸二酯键连接。因此，使用化学上不稳定的亚磷酰胺体作为中间体，这就是用于合成的工序数增加、合成困难的原因。因此，本发明人等不用磷酸二酯键连接芳香族环彼此，而是变为用脲键连接。这是由于，通过采用羰基二咪唑来进行偶联，能够使由脲键进行的芳香族环彼此的连接极其容易且定量地形成。另外，对于由硫脲键进行的连接，经由由相同原料对应的异硫氰酸酯，也能使硫脲键极其容易且定量地形成。S卩，本发明的低聚核苷酸衍生物合成用修饰载体的特征在于，在载体上直接或者介由连接体地化学修饰有下述结构式(a)表示的单元(其中，式中的R1 R6各自独立地表示氢或者氢以外的取代基。另外，式中Z1和Z2各自独立地表示CH或者氮，X表示氧或者硫)。在R1 R6中，作为氧以外的取代基，例如可以举出烧基、芳基、齒代烧基和齒素基团等。
权利要求
1.ー种芳香族化合物，其特征在干，以下述结构式(A)表示，
2.根据权利要求I所述的芳香族化合物，其特征在干，以下述结构式(A1)表示，
3.根据权利要求I所述的芳香族化合物，其特征在干，以下述结构式(A2)表示，
4.一种低聚核苷酸衍生物合成用修饰载体，其特征在于，在载体上直接或者介由连接体地化学修饰有下述结构式(a)表示的单元，
5.根据权利要求4所述的低聚核苷酸衍生物合成用修饰载体，其特征在干，在载体上直接或者介由连接体地化学修饰有下述结构式U1)表示的单元，
6.根据权利要求4所述的低聚核苷酸衍生物合成用修饰载体，其特征在干，在载体上直接或者介由连接体地化学修饰有下述结构式(a2)表示的单元，
7.一种低聚核苷酸衍生物，其特征在于，低聚核苷酸的3’末端被下述结构式(a)表示的单元修饰，
8.根据权利要求7所述的低聚核苷酸衍生物，其特征在于，低聚核苷酸的3’末端被下述结构式U1)表示的单元修饰，
9.根据权利要求7所述的低聚核苷酸衍生物，其特征在于，低聚核苷酸的3’末端被下述结构式(a2)表示的单元修饰，
10.根据权利要求7 9中任一项所述的低聚核苷酸衍生物，其中，所述低聚核苷酸具有规定的基因mRNA的部分序列或者其互补序列。
11.根据权利要求7 10中任一项所述的低聚核苷酸衍生物，其中，所述低聚核苷酸的链长为10 35。
12.根据权利要求7 11中任一项所述的低聚核苷酸衍生物，其特征在于，所述低聚核苷酸为寡核糖核苷酸。
13.ー种构建物，是基因表达调节用低聚核苷酸构建物，具有权利要求7 12中任ー项所述的低聚核苷酸衍生物。
14.根据权利要求12所述的构建物，是选自单链和双链DNA、单链和双链RNA、DNA/RNA嵌合体以及DNA/RNA杂化物中的基因表达调节用低聚核苷酸构建物。
15.根据权利要求13或14所述的构建物，其选自反基因、反义、适体、siRNA,miRNA、shRNA及核酶。
16.ー种构建物，是基因诊断用低聚核苷酸构建物，具有权利要求13 15中任ー项所述的低聚核苷酸衍生物。
17.根据权利要求16所述的构建物，其特征在干，是探针或者引物。
全文摘要
本发明提供在3’末端化学修饰有苯骨架和吡啶骨架之中2个骨架的低聚核苷酸衍生物而且能够以少的工序数容易地合成的低聚核苷酸衍生物、以及作为用于制备其低聚核苷酸衍生物合成用修饰载体的前体的芳香族化合物。而且，本发明提供对细胞膜的透过性良好、具有优异的核酸酶耐受性的低聚核苷酸衍生物以及低聚核苷酸构建物，所述低聚核苷酸衍生物在3’末端悬空端化学修饰有苯骨架和吡啶骨架之中的2个骨架。所述低聚核苷酸衍生物合成用修饰载体的特征在于，在载体上介由连接体化学修饰有下述结构式(a)表示的单元(其中，式中的R1～R6各自独立地表示氢或者氢以外的取代基。另外，式中Z1和Z2各自独立地表示CH或者氮，X表示氧或者硫)。
文档编号C12Q1/68GK102666480SQ20108005533
公开日2012年9月12日 申请日期2010年12月8日 优先权日2009年12月8日
发明者北出幸夫, 喜多村德昭 申请人:国立大学法人岐阜大学