通过质谱分析的手段鉴定至少一种微生物的方法

专利名称：：通过质谱分析的手段鉴定至少一种微生物的方法通过质谱分析的手段鉴定至少一种微生物的方法本发明涉及微生物学领域。本发明更特别是涉及使用质谱分析从样品中鉴定微生物。自从巴斯德发现了微生物，已经通过显微镜和生物化学分析对微生物进行了研究。这些常规方法通常费时且费力，很快就有需要寻求分析性的替代手段。因此，早在1975年J.AnhaltandC.Fenselaut1]就开始通过质谱分析对细菌进行分析。这些初步的研究之后是通过气相色谱结合质谱分析(GC-MS)对微生物壁脂肪酸进行研究[2]。这种方法以FAME(脂肪酸甲酯)的名称普及。其目前是分类学研究的一种参考方法。然而，其使用仍限于某些掌握了经皂化、水解和衍生化而对样品进行处理的专门实验室，。在1996年，M.Claydonetal.[3]和T.KrishnamurthyandP.Ross[4]的研究显不使用MALDI-TOF(MatrixAssistedLaserDesorptionIonization-TimeOfFlight)型质谱分析仪鉴别各种细菌物种的可能性。该分析组合质谱分析的结果并通过专业软件解释。其极其简便且可以在几分钟内进行。然而，其仅在最近在医学检验实验室中展开使用。其临床应用目前限于鉴别细菌和酵母的物种。其既未用于分型(typing)也未用于鉴别抗微生物剂抗性，也未用于分析毒力。然而，微生物的鉴别在临床和工业领域均是重要的。因此，例如，鉴别对于微生物剂如抗生素的抗性及检测毒力因子是保证患者最佳治疗的必要条件。同样，分型对于流行病学研究及对于对抗医院内感染是关键因素。已经提议其它质谱分析方法、特别是串联质谱分析法以符合这些需要。例如可以提及的是c.Fenselau等使用四极-TOF(Q-TOF)鉴别0-内酰胺酶te],D.Ding等用三节四极质谱仪检测葡萄球菌肠毒素C2(毒力因子SEC2)[7]，或者R.Everley等用Q-TOF对梭菌(Clostridium)进行分型[8]。然而，这些研究结果不能应用于常规的临床应用。研究仪器需要高度专业的技术人员。分析时间通常超过I小时/样品，与微生物检验实验室的工作量不相匹配。最后，各个小组所获得的数据是应对特定的问题，但却并不同时应对所有的临床需要。最近，S.Hofstadler等提出一种方法，其符合所有临床需求的要求[9]。其组合了通过PCR扩增微生物基因组及通过电喷雾-TOF(ESI-TOF)检测PCR产物。这种方法目前是完全自动化的[1°]。然而，其需要PCR扩增，PCR扩增具有分子生物学中的固有缺陷，即探针的成本、提取收率等。在本文中，本发明的目的是提出一种鉴定微生物的方法，即鉴别并且确定分型、对至少一种抗微生物剂的抗性及毒力因子的性质，使得可以克服现有方法的缺点，即提供这样一种方法，该方法成本较低、不用特异于每个物种的试剂，特别是与分子生物学方法相比提供少于I小时的短时间结果，且可以在临床常规使用，不需要高度专业的技术人员。另夕卜，鉴定微生物的整个方法可以用同一质谱分析仪有利地进行，从而简化了微生物检验实验室的设备。为此，本发明提出一种在样品中鉴定至少一种微生物的新方法，该方法包括鉴别所述至少一种微生物并且确定分型、对至少一种抗微生物剂的潜在抗性及毒力因子的性质，特征在于确定所述至少一种微生物的分型、对至少一种抗微生物剂的抗性及毒力因子的性质是通过质谱分析进行，使用蛋白质、肽和/或代谢物作为所述分型、对于至少一种抗微生物剂抗性及毒力因子的性质的标记。因此，本发明的方法是，微生物的至少三种性质的鉴定是通过质谱分析技术进行的，使用代表待鉴定的微生物的蛋白质、肽或代谢物作为标记。可以通过本发明的方法鉴定的微生物是在工业和临床上遇到的所有病原性或非病原性微生物。它们可以是细菌、病毒、原生动物或酵母。短语“分型、对至少一种抗微生物剂的抗性及毒力因子的性质的标记”是指蛋白质或者代谢物来源的分子，其是所述性质的特征。短语“对微生物分型”是指区分同一物种内的一些菌株。分型具有流行病学意义；临床医生获知分离自患者的菌株与表面上相同并分离自其它患者或环境的其它菌株是否来自同一来源。这样因而可以揭示在医院内感染的场所或者食物中毒的时间。在细菌中分型性质的标记的非限制性实例是具有特征性突变的肽，如大肠杆菌(Escherichiacoli)的adk、fumC、gyrB、icd、mdh、purA和recA基因的转录产物，以及金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)的arc、aroE、glpF、gmk、pta、tpi和yqiL基因的那些转录产物。在原生动物中分型性质的标记的非限制性实例是溶组织内阿米巴(Entamoebahistolytica)和迪斯帕内阿米巴(E.dispar)的几丁质酶基因产物。在病毒中分型性质的非限制性实例是人免疫缺陷病毒的聚合酶基因产物。最后，在酵母中分型性质的标记的非限制性实例是白色念珠菌(Candidaalbicans)的aatla、accl、adpl、mpib、syal、vpsl3和zwflb基因片段的转录产物。短语“确定对至少一种抗微生物剂的抗性”是指确定微生物对于抗微生物剂破坏的易感性。因此，如果微生物是细菌，其所针对而产生抗性的抗微生物剂是抗生素，如果是原生动物，所述抗微生物剂是抗寄生虫剂，如果是病毒，所述抗微生物剂是抗病毒剂，如果是酵母，所述抗微生物剂是抗真菌剂。参与抗性机制的蛋白质根据科和物种而有所不同。在细菌中使用的对于至少一种抗生素抗性的标记的非限制性实例是金黄色葡萄球菌的mecA基因的转录产物，赋予甲氧西林抗性，且使得可以显示出菌株是否是甲氧西林抗性的(MRSA菌株)还是甲氧西林敏感的(MSSA菌株)。也可以提及的是TEM-2蛋白质，其可以示出大肠杆菌菌株对于青霉素是否是抗性的，但是对于其它类抗生素如先锋霉素族抗生素或碳青霉烯类(carbapenems)敏感。另一标记是称作KPC(对于肺炎克雷伯菌(Klebsiellapneumoniae)碳青霉烯酶(carbapenemase))的酶，其赋予对碳青霉烯类的抗性。金黄色葡萄球菌的抗性标记的另一实例是表达万古霉素抗性的代谢形式，如E.Alexanderetal.,intheposter〃Metabolomics_basedapproachtoantibioticresistanceinStaphyloccocusaureus^presentedattheASMSconference,2009描述。原生动物中使用的至少一种抗寄生虫剂抗性的标记的非限制性实例是含铁超氧化物歧化酶(Fe-SOD)和过氧化氧还蛋白(peroxyredoxin),其增加的表达赋予甲硝唑(metronidazole)抗性。在病毒中使用的至少一种抗病毒剂抗性的标记的非限制性实例是人免疫缺陷病毒逆转录酶的突变，赋予对逆转录酶核苷抑制剂的敏感性降低。最后，酵母中使用的至少一种抗真菌剂抗性的标记的非限制性实例是白色念珠菌1，3-b-D-葡聚糖合成酶的突变，其赋予对棘球白素(echinocandins)敏感性降低。另一实例是在白色念珠菌中唑类抗真菌剂的抗性，特别是氟康唑(fluconazole)抗性。氟康唑的靶位是酶-羊毛留醇去甲基酶，其参与麦角固醇的合成，麦角固醇是真菌壁的一种主要成分。对于氟康唑的抗性也许与在编码羊毛留醇去甲基酶的ergll基因中出现点突变相关。应注意抗性特异性标记也可以用作分型标记，如本申请人证实。短语“确定微生物毒力”是指评估所述微生物的病原性、伤害性及毒力(violent)性质。细菌中毒力标记的非限制性实例是PVL(Panton-ValentineLeukocidin),这是存在于金黄色葡萄球菌中的具有两个增效成分(LukFetLukS)的细胞溶解毒素，其是导致皮肤疾病、广泛蜂窝组织炎、骨髓炎和坏死性肺炎的最具毒性的毒素之一，且参与病毒双重感染。其它实例包含在肺炎链球菌中存在的自溶血素和肺炎球菌溶血素，其是与呼吸道感染、脑膜炎及菌血症相关的物种，以及艰难梭状芽孢杆菌毒素A和B，这是肠道共生细菌，其毒素导致肠上皮通透性改变(毒素A)，或者直接侵袭上皮细胞(毒素B)，或者随着时间而降低肠运输和肠吸收。导致腹泻(毒素A和B的组合作用)。也可以提及的是例如大肠杆菌中存在的Shiga毒素Stxl和Stx2。这两种细胞毒素被认为是肠出血性大肠杆菌的重要毒力因子。它们与并发症如溃疡性结肠炎或者溶血性尿毒症综合征相关。在原生动物中毒力标记的非限制性实例是在痢疾内阿米巴(Entamoebahistolytica)中存在的抗氧化剂(Fe-氢化酶2，过氧化还原酶，超氧化物歧化酶)，是与痢疾和肝脓肿相关的物种。在病毒中毒力标记的非限制性实例是I型人免疫缺陷病毒中的Nef蛋白质变体，是在人体中更具病原性的类型。最后，酵母中毒力标记的非限制性实例是白色念珠菌中脂肪酶8，这是对于浅表念珠菌感染相关的菌种，但是与念珠菌败血病和弥散性念珠菌病也相关。应注意毒力特异性标记也可以用作分型标记，如本申请人证实。本发明的方法可以用于鉴定细菌，所述抗微生物剂是抗生素，其构成本发明的一个实施方案。因此，例如可以提及的根据本发明的方法可以鉴定的细菌是-大肠杆菌，使用TEM-2作为抗性和分型标记，以及志贺毒素、OmpA作为毒力和分型标记。-粪肠球菌和尿肠球菌，使用VanA和VanB作为抗性和分型标记，以及ESP(肠球菌表面蛋白)作为毒力和分型标记，-金黄色葡萄球菌，使用已知为免疫球蛋白G-结合蛋白A的蛋白质(也称作蛋白质A)作为分型标记，PBP2a蛋白作为抗性标记或者甚至作为分型标记，以及PVL蛋白作为毒力标记或者甚至作为分型标记。可以提及的根据本发明方法可以鉴定的其它微生物是-白色念珠菌，使用1，3-b-D-葡聚糖合成酶或者羊毛甾醇去甲基酶作为抗性和分型标记，以及脂肪酶8作为毒力和分型标记。本发明方法使用的样品可以是能含有靶微生物的任何样品。所述样品可以是生物来源的，即源于动物、植物或者人。然后其可相应于生物体液样品(如全血、血清、血浆、尿液、脑脊液、器官分泌物)、组织样品或者分离的细胞。只要鉴定所述微生物的标记在检测的样品中可获得或者在分析之前其可根据本领域技术人员已知的方法进行富集、提取、浓缩、纯化和/或培养类型制备，即可使用这种样品。所述样品可以是工业来源的，即根据非穷举的列表，空气样品、水样品、取自表面、物体或生产的产品的的样品，或者食物来源的产品。在食物来源的样品中，非全部的可以提及的是乳制品样品(酸奶，奶酪)、肉制品、鱼制品、蛋制品、水果、蔬菜、水或者饮料(奶，果汁，苏打水等)。这些食物来源样品也可以来自调料或餐具。最后，食物样品可得自动物饲料(animalfeed),如动物餐食(animalmeals)。当鉴定微生物的标记是蛋白质来源时，在通过质谱分析检测之前，优选将待分析的样品进行预处理，以从该样品中存在的所有蛋白质中产生肽，使这些蛋白质分解成肽，例如通过用分解蛋白质的酶(蛋白酶)消化，或者通过化学试剂的作用分解。事实上，蛋白质可以通过物理化学处理、通过生物学处理或者通过组合这两种处理方式而被裂解。在可以使用的处理中，可以提及的是羟基自由基，特别是氏02。用羟基自由基处理导致肽键裂解，其随机发生在蛋白质的任何肽键上。羟基自由基的浓度调节所产生的裂解数目，因此调节所获得的肽的长度。也可以使用其它化学处理，例如用溴化氰(CNBr)处理，其在甲硫氨酰残基的羧基水平特异性破坏肽键。也可以通过在1000°C加热在三氟乙酸中蛋白质溶液而在天冬氨酰残基进行部分酸裂解。然而，与通过物理化学方式处理相比，通过酶消化处理蛋白质是优选的，因为其更广泛地保护蛋白质结构，且易于控制。术语“酶消化”是指一或多种酶在合适的反应条件下的单一或组合作用。进行蛋白质分解的酶被称作蛋白酶，其在特定位点裂解蛋白质。每种蛋白酶通常识别这样的氨基酸序列，在其内总是进行相同裂解。某些蛋白酶识别单一氨基酸或者两个氨基酸的序列，在其间进行裂解，而其它蛋白酶仅识别较长的序列。这些蛋白酶可以是内切蛋白酶或者外切蛋白酶(exoproteases)。在已知的蛋白酶中，如在W02005/098071中所述，可以提及的是-特异性酶，如胰蛋白酶，其在Arg和Lys残基的羧基基团水平分裂肽键；内溶素，其裂解赖氨酸-CO基团的肽键；糜蛋白酶，其在芳香残基(Phe、Tyr和Trp)的羧基基团水平水解肽键；胃蛋白酶，其在芳香残基(Phe、Tyr和Trp)的NH2基团水平裂解；金黄色葡萄球菌的V8菌株的V8蛋白酶，其在Glu残基的羧基基团水平裂解肽键；-非特异性酶，如源自嗜热溶蛋白芽孢杆菌(Bacillusthermoproteolyticus)的嗜热菌蛋白酶，其水解疏水性氨基酸(Xaa-Leu、Xaa-IIe、Xaa-Phe)NH2基团的肽键；枯草杆菌蛋白酶和链霉蛋白酶，其是细菌蛋白酶，实际上水解所有键，且在控制的反应条件(酶浓度和反应时间)下能将蛋白质转换为寡肽。如果作用方法是相容的，一些蛋白酶可同时使用，或者可相继使用。在本发明中，样品的消化优选通过蛋白酶如胰蛋白酶的作用进行。使用化学试剂或蛋白酶产生肽可以通过简便的反应在溶液中获得。也可以用微波炉进行[11]，或者在压力下[12]，或者使用超声装置进行[13]。在后三种情况中，所述方案将更快。在由此获得的肽中，特异于蛋白质的肽被称作蛋白酶解肽。这些将通过质谱分析测定。根据本发明的一个实施方案，鉴定标记是被鉴定的微生物的蛋白质。特别地，所述蛋白质被消化成肽，优选用酶，更优选用胰蛋白酶。相似地，含有蛋白质源鉴定标记的样品也可以进行预处理纯化。当所述标记是蛋白质源时，这种纯化预处理可以在如上述产生肽的步骤之前或之后进行。样品纯化预处理为本领域技术人员已知，可特别提及的是离心、过滤、电泳或者色谱技术。这些分离技术可以单独或者彼此组合使用，以获得多维分离。例如，多维色谱可以通过组合离子交换色谱与反相色谱进行，如T.Fortinetal.[14]或H.Keshishianetal.[15]所述。在这些出版物中，色谱介质可以是在柱中或者在盒子(固相提取)中。蛋白酶解肽的电泳或色谱级分(或者在一维或多维色谱中的保留时间)是每种肽的特征，这些技术的实施因此使得可以选择待测定的蛋白酶解肽。产生的肽的这种分级分离使得可以增加随后通过质谱分析测定的特异性。用于肽分级分离的代替电泳或色谱技术的技术包括特异性纯化N-糖肽([16]及专利申请WO2008/066629)。然而，这种纯化仅使得可以量化经历N-糖基化类型翻译后修饰的肽。然而，不是所有的蛋白质均是糖基化的，因此限制了其应用。本发明方法中使用的质谱分析为本领域技术人员已知是分析和检测各种类型分子的一种有效方式。通常地，可以电离的任何类型分子均可以使用质谱分析仪根据其分子量进行检测。根据检测的蛋白质或代谢物源的分子的性质，某些质谱分析技术更适合。然而，无论用于检测的质谱分析方法如何，后者包括使靶分子电离为称作分子离子的离子的步骤，在这种情况中鉴定标记电离步骤，以及获得的分子离子根据其分子量分离的步骤。因此所有质谱分析仪均包含i)用于使分析样品中存在的标记电离的电离来源，即为这些标记提供正电荷或负电荷；ii)用于根据其质量-电荷比率(m/z)分离电离标记或者分子离子的质量分析仪；iii)用于测量由分子离子或者由分子离子产生的离子直接产生的信号的检测仪，如后文详细描述。实施质谱分析必需的电离步骤可以通过本领域技术人员已知的任何方法进行。所述电离来源可以使测定的分子成为离子和气体状态。可以使用的电离来源是研究正离子的正离子模式，或者研究负离子的负离子模式。现有一些类型的来源，根据希望的结果和分子的分子选择使用。可以提及的是-电子电离(EI)、化学电离(Cl)以及解吸-化学电离(DCI)，-快速原子轰击(FAB)、可代谢的原子轰击，亚稳态原子轰击(MAB)或者离子轰击(SIMS,LSIMS)，-电感f禹合等离子体质谱(inductivelycoupledplasma)(ICP),-大气压化学电离(APCI)及大气压光化电离(APPI)，-电喷雾电离(ESI)，-基质辅助激光解吸电离(MALDI)，表面增强的激光解吸电离(SELDI)或者在硅上解吸/电离(DIOS)，-通过与亚稳态种类(metastablespecies)相互作用的电离-解吸(DART)。特别地，电离可以如下所述进行将含有靶分子的样品导入电离源中，在此所述分子被电离成气态，因此被转换成相应于原始分子的分子离子。电喷雾型电离源(ESI，ElectroSprayIonisation)使得可以电离分子，同时使其从液态转换为气态。然后获得的分子尚子在正尚子模式(positivemode)中相应于液态存在的分子,具有一个、两个或者甚至三个或更多个另外的质子，因此携带一个、两个或者甚至三个或更多个电荷。例如，当靶分子是蛋白质时，在借助于以正离子模式运行的电喷雾类型电离源，在靶蛋白质分级分离后获得的蛋白酶解肽的电离产生气态的多肽离子，具有一个、两个或或者甚至三个或更多个另外的质子，其因此携带一个、两个或者甚至三个或更多个电荷，使得从液态改变为气态形式[17]。当靶分子或获得的蛋白酶解肽预先通过反相液相色谱分离时，这种类型的电离源特别适合。然而，样品中存在的分子电离收率可以根据存在的各物种的浓度和性质而变化。这种现象导致为本领域技术人员已知的基质效应。MALDI电离源使得可以在固态从样品中电离分子。在其中根据质量/电荷比率(m/z)进行分离电离的标记的步骤的质量分析仪是本领域技术人员已知的任何质量分析仪。可以提及的是低分辨率分析仪，四极(Q)、3D离子阱(IT)或者线性离子阱(LIT)类型，也称作离子阱；以及高分辨率分析仪，以测量分析物的精确质量，其特别使用结合至电力区(electricalsector)的磁力区(magneticsector),飞行时间(TOF)。根据m/z比率分离分子离子可以在单一时间实施(单一质谱分析或MS)，或者可以进行一些连续的MS分离。当进行两个连续MS分离时，该分析被称作MS/MS或MS2。但进行三个连续MS分离时，该分析被称作MS/MS/MS或MS3，及更通常地，但进行n次连续MS分离时，该分析被称作MSn。在实施几次连续分离的技术中，在检测或测定单一靶分子的情况中的SRM(选择的反应监测)模式或者在检测或测定几个靶分子的情况中的MRM(多个反应监测)模式中，特别使用MS2分离。相似地，MRM3模式特别使用通过MS/MS/MS分离。然后使用靶向质谱分析。在单一MS模式检测的情况中，获得的分子离子的质量/电荷比与被检测的靶分子相关。在MS/MS模式检测的情况中，与MS测定相比基本上加上两个步骤，这两个步骤是i)使分子离子碎裂，然后称作先驱离子，以提供称作第一代碎片离子的离子，以及ii)根据其质量(m/z)2分离称作第一代碎片离子的离子，比率(m/zh相应于先驱尚子的比率(m/z)。然后将因此获得的第一代碎片离子的质量/电荷比率与被检测的靶分子相关。术语“第一代碎片离子”是指在碎裂步骤后得自先驱离子的离子，其质量与电荷比率m/z与先驱离子不同。成对的(!!!/^、和(m/z)2被称作跃迁(transition),其代表被检测的特征性离子。被检测的以与靶分子关联的特征性离子的选择由本领域技术人员根据标准方法进行。其选择有利地使得测定在再现性和可靠性方面尽可能地灵敏、尽可能地特异性及尽可能地稳健(robust)。在选择蛋白酶解肽(m/zh及第一代碎片(m/z)2而揭示的方法中，所述选择基本上基于反应的强度。更详细的描述可参见V.Fusaroetal.[18]。本领域技术人员可以使用商购的软件如得自AppliedBiosystems或MRMaidt19]的MIDAS软件和MRMPilot软件，以使其预测所有可能的跃迁对(transitionpairs)。也可以使用由F.Desiereetal.[20]构建的称作P印tideAtlas的数据库，以汇编由科学界描述的所有肽MRM跃迁。这个P印tideAtlas数据库可以在互联网上免费获得。多于非蛋白质分子，可以使用数据库，如得自AppliedBiosystems(UnitedStatesofAmerica)公司的通过Cliquid软件登陆的数据库。选择蛋白酶解肽(m/zh和(m/z)2的另一种方法包括使用基于其它研究获得的MS/MS碎裂谱。这些研究可以是例如通过蛋白质组分析揭示和鉴别生物标记。这种方法由ThermoScientific在用户聚会期间提出[19]。这使得可以通过SIEVE软件(ThermoScientific)从实验性鉴别的肽中产生一列候选跃迁。针对(!!!/^^和(m/z)2离子选择的某些标准已经由J.Meadetal.[19]详细描述及在下文详细描述应避免具有内部裂解位点、即具有内部赖氨酸或精氨酸的肽，除非所述赖氨酸或精氨酸随后是脯氨酸。应避免具有天冬酰胺或谷氨酰胺的肽，因为其可以去氨基。应避免具有N-末端谷氨酰胺或谷氨酸的肽，因为其可以自发环化。应避免具有甲硫氨酸的肽，因为其可以被氧化。应避免具有半胱氨酸的肽，因为其在可能的变性、还原和阻断硫醇功能的步骤期间可以被非再现地修饰。具有脯氨酸的肽被认为是有利的，因为其在MS/MS中通常产生具有非常占优势的单峰的密集(intense)碎片。然而，非常占优势的单一碎片不能确证在复杂混合物中跃迁的性质。事实上，仅同时存在一些特征性碎片才可以证实希望的先驱离子确实被检测。避免具有脯氨酸的肽，所述脯氨酸与C末端相邻(位置n-1)或者在与C末端相关的第二个位置(位置n-2)，因为在这种情况中，第一代碎片肽的大小通常被认为太小以至于不足以是特异性的。优选选择质量大于先驱的碎片，以提升特异性。为此，需要选择双电荷的先驱离子及选择质量大于先驱的最致密的第一代碎片，即单电荷的第一代碎片离子。选择的先驱离子的碎裂是在碎裂池中进行，如三元四极型分析仪模型[21]，或者离子阱型模型[22]，或者飞行时间(TOF)型模型[23]，这也可以分离离子。所述碎裂通常通过在电场中用惰性气体如氩气或氮气碰撞而进行，通过光激发或光解离，使用强光源，用电子或自由基碰撞，应用电位差，例如在飞行时间管中，或者通过任何其它激活模式。电场的特征限制碎裂的强度和性质。因此，在例如四极分析仪中在存在惰性气体条件下施加的电场限制提供给离子的碰撞能量。这种碰撞能量可以由本领域技术人员优化，以增加被测定的跃迁(transition)的敏感性。例如，在得自AppliedBiosystems公司(FosterCity,UnitedStatesofAmerica)的ABSCIEXQIRAP:..r.:5500质谱分析仪的q2中，可以改变碰撞能量为5-180e_V。相似地，碰撞步骤的时序时间及如在离子阱内的激发能量可以由本领域技术人员优化，以产生最敏感的测定。例如，在得自AppliedBiosystems公司的ABSCIEXQ'1'RAP'H5500质谱分析仪的Q3中，可以改变重编称作激发时间的这个持续时间为0.010-50ms，及激发能量为0-1(任意单位)。最后，常规进行选择的特征性离子的检测，特别是通过检测仪和加工系统进行。所述检测仪收集离子并产生电子信号，其强度依赖于收集的离子的量。然后将获得的信号扩大以便可以通过计算机处理。处理数据的计算机装备使得可以将由检测仪接受的信息转换为质谱。SRM模式或MRM模式的原理是特异性选择先驱离子，使其碎裂，然后特异性选择其碎片离子之一。对于这种应用，通常使用三元四极分析仪型或者三元四极-离子阱混合装置。在MS2模式使用的三元四极分析仪(triplequadrupole)装置(Qlq2Q3)的情况中，为了测定或检测靶蛋白质，第一个四极分析仪(Ql)可以根据其质量与电荷的比率(m/z)过滤分子离子，相应于在先前的消化步骤期间测定和获得的蛋白质特征性蛋白酶解肽。仅具有蛋白酶解肽的质量/电荷比率为(m/zh的肽被传递至第二个四极分析仪(q2)并发挥先驱离子作用以进行随后的碎裂。q2分析仪可以使质量/电荷比率为(HiA)1的肽碎裂成第一代碎片离子。所述碎裂通常通过在q2中用惰性气体如氮气或氩气碰撞前体肽而获得。第一代碎片离子被传递至第三个四极分析仪(Q3)，其根据特定的质量与电荷比率过滤第一代碎片离子，该比率称作(m/z)2。仅具有所述蛋白酶解肽的特征性碎片的质量/电荷比率(m/z)2的第一代碎片离子被传递至检测仪进行检测，或者甚至量化。这种操作模式具有双重选择性，一方面，关于选择先驱离子，另一方面关于选择第一代碎片离子。SRM或MRM模式中的质谱分析因此有利于量化。当本发明方法中的质谱分析是串联质谱分析(MS2、MS3、MS4或MS5)时，可以将一些质谱分析仪结合在一起。例如，第一个分析仪分离离子，碰撞室(collisioncell)使得离子碎裂，第二个分析仪分离碎裂的离子。一些分析仪如离子阱或FT-ICR组合几个分析仪为一体，及使得可以碎裂离子并直接分析所得碎片。根据本发明的优选实施方案，本发明的方法包括一或多个如下特征-质谱分析，用于确定分型、对至少一种抗微生物剂的潜在抗性及毒力因子的性质，其是MS/MS型质谱分析，具有产生特异于被检测或量化的分子的碎片及因此提供具有更高特异性的测定方法的优势；-所述MS/MS质谱分析是MRM，其具有使用在质谱分析仪中几十毫秒的分析循环时间的优势，使得可以高灵敏性检测或量化，及以多元方式检测或量化大量不同分子；-确定分型、对抗微生物剂的抗性和毒力因子的性质是在同一质谱分析仪中进行，优选同时进行，其具有减少分析时间及仪器成本的优势，这也便于结果的处理和报告。除了确定分型、对于抗微生物剂的抗性及毒力因子的性质之外，可以鉴别检测样品中存在的微生物。鉴别微生物的方法为本领域技术人员熟知，如P.R.Murrayelal.,inManualofClinicalMicrobiology，2007，9thedition,andinparticularinVol.I,SectionIII，chapters15and16forbacteriaandyeasts,Vol.II,SectionVI，chapter82forviruses,andVol.II，SectionX，chapter135forprotozoa所述。对于常规的鉴别方法，可以提及的是确定生物谱，使用如Vitek2鉴别卡(bioM^ieux)，或者使用具有鉴别标准的分子生物学技术，基于研究某些基因的存在及基于研究其序列而进行。所述鉴别可以从在其中进行鉴别的样品中直接进行，或者样品中含有的微生物可以使用根据所述微生物物种适合的培养基和最佳培养条件通过本领域技术人员熟知的方法培养，如P.R.Murrayetal.，inManualofClinicalMicrobiology,2007,9thedition,Vol.I,SectionIII，chapter14，inparticularinVol.I,SectionIV，chapter21forbacteria,Vol.II,SectionVI，chapter81forviruses,Vol.II,SectionVIII,chapter117foryeasts,andVol.II,SectionX,chapter134forprotozoa所述。因此，通常在通过生物化学方法鉴别样品中细菌的情况中，首先需要其得以纯化培养，例如在琼脂上接种之后。在某些情况中可以对被分析的样品直接应用分子生物学技术(PCR)。代替培养微生物，后者可以通过活性表面在样品中直接捕获而浓缩。这种方法已经由W.-J.Chenetal.[11]描述，其通过磁珠用Fe304/Ti02_激活的表面捕获了各种细菌物种。通过其它方式捕获也是可以的，如通过凝集素捕获[24]，或者通过抗体捕获[25]，或者通过万古霉素捕获[26]。所述捕获使得可以浓缩微生物，及因此减少或者甚至消除培养步骤。这样使得明显节省时间。所述鉴别也可以通过先前描述的质谱分析技术进行，优选通过MS、MS/MS或者通过MS及随后的MS/MS型质谱分析进行，这些技术组成本发明的一个实施方案。在这种情况中，样品可以预先进行培养步骤，如在琼脂上接种。使用MS鉴别方法是有利的，因此其可以在几分钟内进行，及其需要具有单一分析仪的质谱分析仪，即与在MS/MS中使用的串联质谱分析仪相比复杂性降低的仪器。使用MS鉴别方法及随后MS/MS型质谱分析也是有利的。这样可以保证鉴别在MS中观测到的离子的身份，这样增加了分析的特异性。使用MRM型的MS/MS鉴别方法与常规MS及MS/MS方法具有更敏感和更简便的优势。这种方法既不需要有效软件处理获得MS质谱与MS/MS质谱之间的信息，也不需要调节连接MS与MS/MS质谱的机械参数中的任何改变。通过MS的鉴别方法可以用在粗制样品上的电喷雾源进行,如S.Vaidyanathanetal.[27]所述，或者如R.Everleyetal.M所述在色谱分离之后进行。不同范围的m/z使得可以鉴别微生物。S.Vaidyanathan等使用在200_2000Th之间的窗，R.Everley等使用在620_2450Th之间的窗。也可以对质谱进行去卷积(deconvoluted),以评定与其电荷状态无关的蛋白质质量。R.Everley等因此利用在大约5000-50000Da之间的质量。或者，通过MS的鉴别模式也可以通过MALDI-T0F进行，如Claydonetal.[3]和T.Krishnamurthyandp.Ross[4]所述。所述分析组合质谱的获得及通过专门的软件解释。这种方法是非常简便的，且可以在几分钟内进行。目前在医学检验实验室中开展这种鉴别方法[28]。通过MS及随后MS/MS通过样品中存在的其蛋白质鉴别细菌已经由许多小组广泛应用。例如可以提及的是由N.Manesetal.[29]最近进行的研究，其研究了肠炎沙门氏菌(Salmonellaenterica)的妝组(peptidome),或者由R.Nandakumaretal.[30]或L.Hernychovaetal.[31]进行的研究，其研究了在用胰蛋白酶消化蛋白质之后细菌的蛋白质组。常规的方法包括i)获得MS质谱，ii)连续选择在MS质谱上观测到的具有强烈信号的每种先驱离子，iii)使每种先驱离子连续碎裂及获得其MS/MS质谱，iv)通过软件如Mascot(MatrixScience,London,UnitedKingdom)或SEQUEST(ThermoScientific,Waltham,UnitedStatesofAmerica)搜索蛋白质数据库如SWISS-PR0T或NCBI,以鉴别具有相应于观测到的MS/MS质谱的强概率的肽。如果鉴别了物种的特征性蛋白质或肽，则这种方法可以鉴别微生物。根据另一实施方案，所述至少一种微生物的鉴别是通过常规鉴别方法进行的，本发明的方法包括证实所述至少一种微生物的鉴别的额外步骤，所述证实步骤根据先前描述的鉴别微生物的技术通过质谱分析进行。根据一个特殊的实施方案，证实步骤的质谱分析是MS/MS型质谱分析，优选MRM。使用质谱分析的一个优势在于这样的事实，即其特别适用于量化分子，在本发明中是分型及对于至少一种抗微生物剂的抗性的性质的标记。为此，使用与靶分子的量成比例的检测的电流强度。由此测量的电流强度可作为确定存在的靶分子的量的定量测量，其特征在于以国际系统(SI)单位mol/m3或kg/m3类型，或者这些单位的倍数或约数，或者SI单位的通常导数(usualderivative),包括其倍数或约数。非限制性例如单位如ng/ml或fmol/1是鉴定定量测量的单位。然而，校准是必需的，以能使相应于由检测的离子诱导的电流强度的测量的峰面积与测定的靶分子的量相关。为此，在本发明中可以实施在质谱分析中常规使用的校准。MRM测定常规使用外部标准校准，或者优选使用如T.Fortinetal.M描述的内部标准校准。当靶分子是蛋白酶解肽时，可以测定感兴趣的蛋白质，使定量测量与靶蛋白酶解肽及因此的感兴趣的蛋白质的量之间的相关性通过校准相对于测定量已知的标准信号测量的信号获得。所述校准可以利用校准曲线进行，例如通过连续注射不同浓度的标准的蛋白酶解肽(外部校准)或者优选通过使用重肽作为内部标准的内部校准获得，例如根据后文详述的AQUA、QconCAT或PSAQ方法。术语“重肽”是指相应于蛋白酶解肽的肽，但其中一或多个碳12(1)原子由碳13(13C)置换，和/或一或多个氮14(14N)原子由氮15(15N)置换。使用重肽作为内部标准(AQUA)也已经在专利申请US2004/0229283中提议。原理是人工合成蛋白酶解肽，其具有包含比通常的天然同位素重的同位素的氨基酸。这种氨基酸例如通过用碳13(1)置换一些碳1212(1)原子，或者通过用氮1515(15N)置换一些氮1414(14N)原子而获得。由此合成的人工肽(AQUA)与天然肽具有严格相同的物理化学性质(除了较高质量之外)。其通常以指定浓度在质谱分析测定之前加入样品中，例如在使感兴趣的样品的蛋白质裂解的处理与在所述处理步骤之后获得的肽的分级分离之间进行。结果，AQUA肽与待测定的天然肽在所述肽的分级分离期间共纯化。这两个肽因此被同时注射进质谱分析仪中进行测定。它们然后在电离源中经历相同的电离收率(ionizationyield)。对比天然与AQUA肽的峰面积，其浓度已知，由此可计算天然肽的浓度，及因此推出测定的蛋白质的浓度。AQUA技术的一种变化方式由J.-M.Prattetal.[32]以QconCat名称提议。这种变化方式也在专利申请WO2006/128492中描述。其在于并置各种AQUA肽及产生重重组蛋白质形式的人工多肽。合成所述重组蛋白质，其具有包含重同位素的氨基酸。以此方式，可以获得校准以较低成本同时测定多个蛋白质的标准。QconCAT标准在开始时、在使得蛋白质裂解的处理之前及在蛋白质分级分离、变性、还原及随后阻断蛋白质的硫醇官能团的步骤之前加入，如果这些步骤存在的话。因此，QconCAT标准经历与天然蛋白质相同的导致蛋白质裂解的处理循环，从而可以考虑从导致蛋白质裂解的处理步骤中的收率。这是因为天然蛋白质的处理、特别是消化是不全的。在这种情况中，使用AQUA标准将获得低于估计值的天然蛋白质的量。对于绝对测定，因此重要的是考虑来自导致蛋白质裂解的处理的收率。然而，V.Brunetal.[33]已经示出有时QconCAT标准不精确再现来自天然蛋白质处理、特别是消化的收率，无疑是由于QconCAT蛋白质的不同三维构象所致。V.Brun等[33]因此提议使用称作PSAQ的方法，其在专利申请W02008/145763中描述。在这种情况中，内部标准是重组蛋白质，其具有与天然蛋白质相同的序列，但是已经被合成为具有重氨基酸。所述合成是在离体用重氨基酸进行。这个标准具有与天然蛋白质严格相同的物理化学性质(除了较高的质量之外)。其在从开始时在蛋白质分级分离步骤(当所述步骤存在时)之前加入。因此在蛋白质分级分离步骤期间其与天然蛋白质共纯化。其在经处理、特别是通过消化处理呈现出与天然蛋白质相同收率。如果进行肽分级分离步骤的话，在裂解后获得的重肽也与天然肽共纯化。这两个肽因此被同时注射进质谱分析仪中，以进行量化测定。它们然后在电离源中经历相同的电离收率。在PSAQ方法中对比天然肽与参考肽的峰面积使得可以计算测定的蛋白质浓度及考虑到测定方法的所有步骤。所有这些技术，S卩AQUA、QconCAT或PSAQ或者用于通过质谱分析的测定及特别是在MRM或MS测定中使用的任何其它校准技术均可以用于在本发明中进行校准(calibration)。根据一个优选的实施方案，本发明的方法可以鉴定金黄色葡萄球菌。特别地，金黄色葡萄球菌的鉴定使用如下至少一种肽I.分型属于具有如下SEQIDNo.I序列的蛋白质AMKKKNIYSIRKLGVGIASVTLGTLLISGGVTPAANAAQHDEAQQNAFYQVLNMPNLNADQRNGFIQSLKDDPSQSANVLGEAQKLNDSQAPKADAQQNKFNKDQQSAFYEILNMPNLNEEQRNGFIQSLKDDPSQSTNVLGEAKKLNESQAPKADNNFNKEQQNAFYEILNMPNLNEEQRNGFIQSLKDDPSQSANLLAEAKKLNESQAPKADNKFNKEQQNAFYEILHLPNLNEEQRNGFIQSLKDDPSQSANLLAEAKKLNDAQAPKADNKFNKEQQNAFYEILHLPNLTEEQRNGFIQSLKDDPSVSKEILAEAKKLNDAQAPKEEDNNKPGKEDGNKPGKEDGNKPGKEDNKKPGKEDGNKPGKEDNKKPGKEDGNKPGKEDGNKPGKEDGNKPGKEDGNKPGKEDGNGVHVVKP⑶TVNDIAKANGTTADKIAADNKLADKNMIKPGQELVVDKKQPANHADANKAQALPETGEENPFIGTTVFGGLSLALGAALLAGRRREL所述肽优选选自具有如下文定义的SEQIDNo.2、3、4、5、6、7和8所示序列的肽。权利要求1.从样品中鉴定至少一种微生物的方法，包括鉴别所述至少一种微生物以及确定分型、对至少一种抗微生物剂的潜在抗性及毒力因子的性质，特征在于对所述至少一种微生物的分型、对至少一种抗微生物剂的抗性及毒力因子的性质所进行的确定是通过质谱分析实施的，使用蛋白质、肽和/或代谢物作为所述分型、对至少一种抗微生物剂抗性及毒力因子的性质的标记。2.权利要求I的鉴定至少一种微生物的方法,特征在于对于分型、对至少一种抗微生物剂的潜在抗性及毒力因子的性质所实施的质谱分析是MS/MS型的质谱分析。3.权利要求2的鉴定至少一种微生物的方法，特征在于所述MS/MS质谱分析是MRM。4.权利要求1-3任一项的鉴定至少一种微生物的方法，特征在于对于分型、对至少一种抗微生物剂的抗性及毒力因子的性质所进行的确定是在相同的质谱分析装置中实施的。5.权利要求4的鉴定至少一种微生物的方法，特征在于对于分型、对至少一种微生物的抗性及毒力因子的性质所进行的确定是同时实施的。6.前述任一项权利要求的鉴定至少一种微生物的方法，特征在于鉴别所述至少一种微生物也是通过质谱分析实施的。7.权利要求6的鉴定至少一种微生物的方法，特征在于鉴别所述至少一种微生物的质谱分析是MS型、MS/MS型、或者MS型及随后MS/MS型的质谱分析。8.前述任一项权利要求的鉴定至少一种微生物的方法，特征在于其包括证实所述至少一种微生物的鉴别的额外步骤，所述证实步骤是通过质谱分析实施的。9.权利要求8的鉴定至少一种微生物的方法，特征在于所述证实步骤中的质谱分析是MS/MS型的质谱分析。10.权利要求9的鉴定至少一种微生物的方法，特征在于所述证实步骤中的质谱分析是MRM。11.前述任一项权利要求的鉴定至少一种微生物的方法，特征在于所述分型、对至少一种抗微生物剂抗性及毒力因子的性质的标记是所述至少一种微生物的蛋白质。12.权利要求11的鉴定至少一种微生物的方法，特征在于所述微生物的蛋白质被消化成肽。13.权利要求12的鉴定至少一种微生物的方法，特征在于所述消化是用酶来进行的。14.权利要求13的鉴定至少一种微生物的方法，特征在于所述酶是胰蛋白酶。15.前述权利要求的鉴定至少一种微生物的方法，特征在于所述至少一种微生物是细菌，并且所述抗微生物剂是抗生素。16.权利要求15的鉴定至少一种微生物的方法,特征在于所述细菌是金黄色葡萄球菌(Stphylococcusaureus)。17.权利要求16的鉴定至少一种微生物的方法，特征在于对分型性质的确定是使用具有SEQIDNo.2、3、4、5、6、7、8、10、11、12、13、14、15、16、17、19、20、21、23、24、26、27、29、30、32、34、35、37、38、40、42、44或45所示序列的至少一种肽。18.权利要求16或17的鉴定至少一种微生物的方法，特征在于对至少一种抗生素潜在抗性的性质的确定是使用具有SEQIDNo.10-17所示序列的至少一种肽。19.权利要求16-18任一项的鉴定至少一种微生物的方法，特征在于对毒力的确定是使用具有SEQIDNo.19、20、21、23或24所示序列的至少一种肽。20.权利要求16-19任一项的鉴定至少一种微生物的方法，特征在于所述鉴别是使用具有SEQIDNo.26、27、29、30、32、34、35、37、38、40、42、44和45所示序列的至少一种肽。21.权利要求15的鉴定至少一种微生物的方法，特征在于所述细菌是大肠杆菌(Escherichia,coli)。22.权利要求21的鉴定至少一种微生物的方法，特征在于对分型性质的确定是使用具有SEQIDNo.46-87所示序列的至少一种肽。23.权利要求21或22的鉴定至少一种微生物的方法，特征在于对于至少一种抗生素潜在抗性的性质的确定是使用具有SEQIDNo.85、86和87所示序列的至少一种肽。24.权利要求21-23任一项的鉴定至少一种微生物的方法，特征在于对毒力的确定是使用具有SEQIDNo.62-66所示序列的至少一种肽。25.权利要求21-24任一项的鉴定至少一种微生物的方法，特征在于所述鉴别是使用具有SEQIDNo.46-61所示序列的至少一种肽。26.权利要求1-14的鉴定至少一种微生物的方法，特征在于所述至少一种微生物是酵母，并且所述抗微生物剂是抗真菌剂。27.权利要求26的鉴定至少一种微生物的方法，特征在于所述酵母是白色念珠菌(Candidaalbicans)。28.权利要求27的鉴定至少一种微生物的方法，特征在于对分型性质的确定是使用具有SEQIDNo.88-125和177所示序列的至少一种肽。29.权利要求27或28的鉴定至少一种微生物的方法，特征在于对于至少一种抗真菌剂的潜在抗性的性质的确定是使用具有SEQIDNo.117-122和177所示序列的至少一种肽。30.权利要求27-29任一项的鉴定至少一种微生物的方法，特征在于对毒力的确定是使用具有SEQIDNo.123-125所示序列的至少一种肽。31.权利要求27-30任一项的鉴定至少一种微生物的方法，特征在于所述鉴别是使用具有SEQIDNo.88-116所示序列的至少一种肽。32.前述任一项权利要求的鉴别至少一种微生物的方法，特征在于所述代谢物是麦角固醇。33.具有SEQIDNo.2、3、4、5、6、7、8、10、11、12、13、14、15、16、17、19、20、21、23、24、26、·27、29、30、32、34、35、37、38、40、42、44-125和177所示序列的肽。全文摘要本发明涉及鉴定样品中至少一种微生物的方法，所述方法包括鉴别所述至少一种微生物及确定分型、对于至少一种抗微生物剂的潜在抗性、及毒力因子的性质，特征在于对于所述至少一种微生物的分型、对至少一种抗微生物剂的抗性及毒力因子的性质所进行的确定是通过质谱分析实施的，通过使用蛋白质、肽和/或代谢物作为所述分型、对至少一种抗微生物剂的抗性及毒力因子的性质的标记。文档编号C12Q1/14GK102656276SQ201080057129公开日2012年9月5日申请日期2010年10月14日优先权日2009年10月15日发明者C·博利厄,C·弗兰切斯基,J-P·沙里耶,P·迪富尔,S·庞斯,S·沙泰利耶,V·吉拉德,Y·沙勒捷申请人:生物梅里埃公司