专利名称：具有抗血管新生活性的重组腺病毒的制作方法
具有抗血管新生活性的重组腺病毒
技术领域：
本发明涉及一种抑制用于表达嵌合诱饵受体的血管新生的能力得到改善的重组腺病毒及将其包含在内的在药剂学上用于抑制血管新生的组合物。
背景技术：
从已有血管生成新血管的新生血管形成是被精巧调节的一连串过程，始于细胞外基质(extracellular matrix)和基底膜(basementmembrane)的分解，通过毛细血管内皮细胞的分裂、分化、浸润到周边基质(stroma)以及重新组织为新的功能性血管网络来完成I。新生血管形成需要多种生长因子，其中被查明主要参与新生血管形成的生长因子为血管内皮细胞生长因子(vascular endothelial growth factor, VEGF),尤其是血管内皮细胞生长因子-A (VEGF-A)0通过选择性剪接(Alternative splicing)组成的7种人体血管内皮细胞生长因子-A (VEGF-A)的同种型(isoform)血管内皮细胞生长因子(VEGF121、VEGF145, VEGF148, VEGF165、VEGF183、VEGF189, VEGF206)分别以 121、145、148、165、183、189和206个氨基酸组成，其中血管内皮细胞生长因子-121 (VEGF121)的碱基序列被所有同种型(isoform)血管内皮细胞生长因子所共有2_4。通过血管内皮细胞生长因子(VEGF)和血管内皮细胞生长因子(VEGF)受体的结合来调节血管内皮细胞的细胞凋亡抑制、淋巴新生血管形成、免疫抑制、血管通透性(vascular permeability)和造血干细胞生存(hematopoietic stem cell survival)等
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O实体肿瘤在没有血管的状态下能长到以下的大小，但要长到更大，为了供给氧气和营养素则必须要有以血管内皮细胞生长因子(VEGF)为媒介的新生血管形成。在正常的组织当中，血管网络通过诱导因子和抑制因子的适当的比例来形成具有有效的血流速度和均匀的血管宽度的层次结构5。但是在肿瘤中所能看到的血管系统，其血管壁的通透性增加、具有高内压、血管变大等，发育异常。肿瘤内无节制的新生血管形成及异常的血管形态是根据通过肿瘤内部的组织缺氧和低酸碱度(pH)来高表达的血管内皮细胞生长因子(VEGF)和作为其受体的血管内皮细胞生长因子受体2 (VEGFR2)结合而生成的细胞内的信号来产生9。因血管内皮细胞生长因子(VEGF)引起的新生血管形成不仅对肿瘤的成长还对肿瘤的浸润和转移起着重要的作用 ' 在肺癌、胃癌、肾癌、膀胱癌、卵巢癌和子宫癌等多种肿瘤中，已经被查明血管内皮细胞生长因子(VEGF)被过度表达，在报告中也指出血管内皮细胞生长因子(VEGF)的表达越高的癌症，其预后也不好n。对于肿瘤的成长而言，由新生血管生成增加血流供给是必须的，因此抑制在肿瘤内生成血管是治疗癌症的主要目标。目前主要使用的新生血管生成抑制剂为血管生长抑制素(angiostatin)、内皮抑素(endostatin)、凝血酶敏感蛋白-I (thrombospondin-1)和尿激酶型纤溶酶原激活物片段(uPA fragment)等，对通过抑制血管内皮细胞生长因子(VEGF)的活性或抑制作为血管内皮细胞生长因子(VEGF)的细胞受体的血管内皮细胞生长因子受体-I (Flt-I)或血管内皮细胞生长因子受体-2 (KDR)的功能，抑制肿瘤的成长或转移的研究也正在活跃地进行着12_16。不仅在细胞内，还是在细胞外，将可阻止血管内皮细胞生长因子(VEGF)和细胞受体的结合的中和抗体及血管内皮细胞生长因子受体-I或血管内皮细胞生长因子受体-2的特异性中和抗体，处理在裸鼠上形成的人类肿瘤异种移植 物(human tumor xenografts)时,能诱导血管内皮细胞凋亡，并显著抑制了肿瘤的成长17。血管内皮细胞生长因子(VEGF)陷阱(trap)为将位于细胞表面的血管内皮细胞生长因子受体I (VEGFRl)和血管内皮细胞生长因子受体2 (VEGFR2)的细胞域结合而成的水溶性诱饵血管内皮细胞生长因子(decoy VEGF)受体，对血管内皮细胞生长因子(VEGF)具有很高的亲和力。到目前，很多对血管内皮细胞生长因子(VEGF)陷阱的研究正在进行，由此制备出了对血管内皮细胞生长因子-A (VEGF-A)、血管内皮细胞生长因子-B (VEGF-B)和胎盘生长因子(PGF,placental growth factor)的亲和力进一步增加的血管内皮细胞生长因子(VEGF)陷阱18。在多种肿瘤异种移植模型中进行的以往临床试验中，血管内皮细胞生长因子(VEGF)陷阱的抗肿瘤效果得到了验证19_21，比起分别处理血管内皮细胞生长因子(VEGF)陷阱或抗癌剂，将血管内皮细胞生长因子(VEGF)陷阱和常用的抗癌剂合并投入治疗时，可以看到提高了抑制肿瘤生长的效果22。血管内皮细胞生长因子(VEGF)陷阱比作为血管内皮细胞生长因子单一克隆抗体的贝伐单抗(bevacizumab)或作为血管内皮细胞生长因子受体2 (VEGFR2)的抗体DClOl显示出更具优势的抗肿瘤效果的原因在于，不仅是和所有同种型血管内皮细胞生长因子(VEGF isoform)都具有高亲和力，而且还具有与血管内皮细胞生长因子子族(VEGF subfamily)中的胎盘生长因子(PGF)的结合能力23。因此，如果在肿瘤内持续表达与血管内皮细胞生长因子(VEGF)的亲和力强的血管内皮细胞生长因子(VEGF)陷阱，则通过显著减少在肿瘤内分泌的血管内皮细胞生长因子(VEGF)的表达量，可产生卓越的抗肿瘤效果，并通过这种方法可期待产生相当显著的治疗效果。腺病毒因呈现优秀的基因转移效率，以高益价可实现生产并且便于浓缩，因而作为进行癌症基因治疗的基因转移载体备受瞩目24_25。但是为了在临床中使用利用腺病毒的癌症基因治疗剂，就必须开发对周边正常组织的细胞不产生副作用、具有选择性地仅杀伤癌细胞的特殊性、同时能有效杀灭癌细胞的溶瘤活性高的腺病毒。由于在肿瘤细胞中不仅是p53蛋白质的变异，视网膜母细胞瘤(retinoblastoma)蛋白质(pRb)的变异也很频繁或与视网膜母细胞瘤蛋白质(PRb)相关的信号通路的相当一部分受到了损伤，与视网膜母细胞瘤蛋白质(PRb)的结合能力消失的腺病毒在正常细胞中因为视网膜母细胞瘤蛋白质(PRb )的活性腺病毒的复制被抑制，但是在视网膜母细胞瘤蛋白质(PRb )的功能被抑制的肿瘤细胞中可以被活跃地复制，可选择性地杀伤癌细胞。在这种背景下，本研究室曾制备了为了提高特殊杀伤肿瘤腺病毒在癌细胞内的特殊复制能力，将在腺病毒的ElA基因部位中参与与pRb结合的补体受体I (CRl)部位的谷氨酸(Glu)氨基酸置换为甘氨酸(Gly)，将补体受体2 (CR2)部位的7个氨基酸置换为甘氨酸(Gly，GGGGGGG)，使与pRb的结合能力消失，同时去除抑制P53蛋白质的功能的ElB 55 kDa和起到抑制细胞凋亡的ElB 19 kDa基因，从而只在P53惰性化的肿瘤细胞内可选择性地进行复制，由此制备同时诱发由此带来的对癌细胞的特殊细胞杀伤及细胞凋亡的改良的选择性杀伤肿瘤的腺病毒Ad- △ B7，并对优秀的生物体内外抗肿瘤效果进行了报告26_28。本说明书的整体内容参照了多个对比文件及专利文献，并对其引用进行了标注。被引用的文献及专利所公开的内容，其整体作为参照插入到本说明书，能更加明确地说明本发明所属的技术领域的水平及本发明的内容。
发明内容技术问题
本发明的发明者们为了提高腺病毒抑制血管新生的能力尤其为了提高对肿瘤细胞的溶瘤活性(oncolytic activity)，将外来基因序列插入到腺病毒基因组的策略进行努力研究的结果，发现将编码血管内皮细胞生长因子受体(VEGFR)的嵌合诱饵受体的核苷酸序列插入到腺病毒的基因组来表达，将会大大提高腺病毒抑制血管新生的能力，尤其能大大提高对肿瘤细胞的溶瘤活性，由此完成了本发明。因此，本发明的目的在于，提供一种表达嵌合诱饵受体的抑制血管新生的能力得到改善的重组腺病毒。本发明的再一个目的在于，提供一种包含表达嵌合诱饵受体的重组腺病毒的在药剂学上用于抑制血管新生的组合物。本发明的另一个目的在于，提供一种因血管新生过多引起的疾病的预防或治疗方法。本发明的还一个目的及优点将通过对本发明的下述详细说明、权利要求书及附图将变得更加明确。技术解决方法根据本发明的一实施方式，本发明提供一种抑制血管新生的能力得到改善的重组腺病毒。该重组腺病毒包含(a)腺病毒的末端反向重复(ITR, inverted terminal repeat)核苷酸序列；以及(b)核苷酸序列，其对包含(i)血管内皮细胞生长因子受体-I (VascularEndothelial Growth Factor Receptor I)的胞外域和(ii)血管内皮细胞生长因子受体-2(Vascular Endothelial Growth Factor Receptor 2)的胞外域的嵌合诱傅受体(chimericdecoy receptor)进行编码。本发明的发明者们为了提高腺病毒抑制血管新生的能力，尤其为了提高对肿瘤细胞的溶瘤活性(oncolytic activity)，将外来基因序列插入到腺病毒基因组的策略进行努力研究的结果，发现将编码血管内皮细胞生长因子受体(VEGFR)的嵌合诱饵受体的核苷酸序列插入到腺病毒的基因组来表达，将会大大提高腺病毒抑制血管新生的能力，尤其能大大提高对肿瘤细胞的溶瘤活性。由已有血管形成新血管的新生血管形成对肿瘤的生长、转移有着极其重要的作用。为了发生新生血管形成需要多种生长因子，其中被查明主要参与新生血管形成的生长因子为血管内皮细胞生长因子(VEGF, vascular endothelial growth factor)。包含搭载到本发明的腺病毒载体的血管内皮细胞生长因子受体-I (VascularEndothelial Growth Factor Receptor I)的胞外域和血管内皮细胞生长因子受体-2(Vascular Endothelial Growth Factor Receptor 2)的胞外域的嵌合诱傅受体(chimericdecoy receptor)作为所谓血管内皮细胞生长因子(VEGF)陷讲(trap)的一种，对血管内皮细胞生长因子-A (VEGF-A)、血管内皮细胞生长因子-B (VEGF-B)和胎盘生长因子(PGF，placental growth factor)具有优秀的亲和力，用作对这些生长因子的诱馆受体,能抑制血管新生。本说明书中所使用的术语“诱饵受体”意味着与血管内皮细胞生长因子-A(VEGF-A)、血管内皮细胞生长因子-B (VEGF-B)、胎盘生长因子(PGF，placental growthfactor)或与这些全部生长因子相结合，来抑制这些生长因子与正常受体相结合的受体。本说明书中所使用 的术语“嵌合诱饵受体”意味着结合来自血管内皮细胞生长因子受体-I (VEGFR-I)的胞外域和来自血管内皮细胞生长因子受体-2 (VEGFR-2)的胞外域制造而成的受体。用于本发明的嵌合诱饵受体是血管内皮细胞生长因子受体-I (VEGFR-I)的7个胞外域中的至少一个胞外域和血管内皮细胞生长因子受体_2 (VEGFR-2)的7个胞外域中的至少一个胞外域结合而成的嵌合受体。根据本发明的优选实例，上述嵌合诱饵受体包含至少一个血管内皮细胞生长因子受体-I (VEGFR-I)的胞外域，其选自由血管内皮细胞生长因子受体-I (VEGFR-I)的第一胞外域、第二胞外域、第三胞外域、第四胞外域、第五胞外域、第六胞外域及第七胞外域组成的群；至少一个血管内皮细胞生长因子受体_2 (VEGFR-2)的胞外域，其选自由血管内皮细胞生长因子受体-2 (VEGFR-2)的第一胞外域、第二胞外域、第三胞外域、第四胞外域、第五胞外域、第六胞外域及第七胞外域组成的群。更为优选的是，上述嵌合诱饵受体包含(i)至少一个血管内皮细胞生长因子受体-2的胞外域，其选自由血管内皮细胞生长因子受体-I的第一胞外域、血管内皮细胞生长因子受体_2的第二胞外域、第三胞外域、第四胞外域、第五胞外域、第六胞外域及第七胞外域组成的群；(ii)至少一个血管内皮细胞生长因子受体-2的胞外域，其选自由血管内皮细胞生长因子受体-I的第二胞外域、血管内皮细胞生长因子受体_2的第一胞外域、第三胞外域、第四胞外域、第五胞外域、第六胞外域及第七胞外域组成的群；(iii)至少一个血管内皮细胞生长因子受体_2的胞外域，其选自由血管内皮细胞生长因子受体-I的第三胞外域、血管内皮细胞生长因子受体_2的第一胞外域、第二胞外域、第四胞外域、第五胞外域、第六胞外域及第七胞外域组成的群；(iv)至少一个血管内皮细胞生长因子受体_2的胞外域，其选自由血管内皮细胞生长因子受体-I的第四胞外域、血管内皮细胞生长因子受体_2的第一胞外域、第二胞外域、第三胞外域、第五胞外域、第六胞外域及第七胞外域组成的群；或者，(V)至少一个血管内皮细胞生长因子受体-2的胞外域，其选自由血管内皮细胞生长因子受体-I的第五胞外域、血管内皮细胞生长因子受体_2的第一胞外域、第二胞外域、第三胞外域、第四胞外域、第六胞外域及第七胞外域组成的群。选择性地，上述嵌合诱饵受体包含(i)至少一个血管内皮细胞生长因子受体-I的胞外域，其选自由血管内皮细胞生长因子受体-2的第一胞外域、血管内皮细胞生长因子受体-I的第二胞外域、第三胞外域、第四胞外域、第五胞外域、第六胞外域及第七胞外域组成的群；(ii)至少一个血管内皮细胞生长因子受体-I的胞外域，其选自由血管内皮细胞生长因子受体-2的第二胞外域、血管内皮细胞生长因子受体-I的第一胞外域、第三胞外域、第四胞外域、第五胞外域、第六胞外域及第七胞外域组成的群；(iii)至少一个血管内皮细胞生长因子受体-I的胞外域，其选自由血管内皮细胞生长因子受体_2的第三胞外域、血管内皮细胞生长因子受体-I的第一胞外域、第二胞外域、第四胞外域、第五胞外域、第六胞外域及第七胞外域组成的群；(iv)至少一个血管内皮细胞生长因子受体-I的胞外域，其选自由血管内皮细胞生长因子受体-2的第四胞外域、血管内皮细胞生长因子受体-I的第一胞外域、第二胞外域、第三胞外域、第五胞外域、第六胞外域及第七胞外域组成的群；或者，(V)至少一个血管内皮细胞生长因子受体-I的胞外域，其选自由血管内皮细胞生长因子受体-2的第五胞外域、血管内皮细胞生长因子受体-I的第一胞外域、第二胞外域、第三胞外域、第四胞外域、第六胞外域及第七胞外域组成的群。用于本发明的嵌合诱饵受 体优选地包含2-4个胞外域，最优选的是包含3个胞外域。更为优选的是，嵌合诱饵受体包含(i)血管内皮细胞生长因子受体_2的第一胞外域、血管内皮细胞生长因子受体-I的第二胞外域及血管内皮细胞生长因子受体_2的第三胞外域；(ii)血管内皮细胞生长因子受体-I的第二胞外域、血管内皮细胞生长因子受体_2的第三胞外域及血管内皮细胞生长因子受体_2的第四胞外域；或者，(iii)血管内皮细胞生长因子受体-I的第二胞外域、血管内皮细胞生长因子受体_2的第三胞外域、血管内皮细胞生长因子受体-2的第四胞外域及血管内皮细胞生长因子受体_2的第五胞外域。更为优选的是，嵌合诱饵受体包含(i)血管内皮细胞生长因子受体-I的第二胞外域、血管内皮细胞生长因子受体-2的第三胞外域及血管内皮细胞生长因子受体-I的第四胞外域；或者，(ii)血管内皮细胞生长因子受体-I的第二胞外域、血管内皮细胞生长因子受体-2的第三胞外域、血管内皮细胞生长因子受体-I的第四胞外域及血管内皮细胞生长因子受体-I的第五胞外域。最为优选的是，用于本发明的嵌合诱饵受体包含血管内皮细胞生长因子受体-I的第二胞外域、血管内皮细胞生长因子受体_2的第三胞外域及血管内皮细胞生长因子受体-2的第四胞外域。血管内皮细胞生长因子受体-I及血管内皮细胞生长因子受体_2的氨基酸序列及核苷酸序列可在基因数据库(GenBank)中确认。例如，血管内皮细胞生长因子受体_1的第二胞外域的核苷酸序列及氨基酸序列为序列目录中的第一序列及第二序列，血管内皮细胞生长因子受体_2的第三胞外域的核苷酸序列及氨基酸序列为序列目录中的第三序列及第四序列，血管内皮细胞生长因子受体-2的第四胞外域的核苷酸序列及氨基酸序列为序列目录中的第五序列及第六序列。根据本发明的优选实例，上述嵌合诱饵受体融合有免疫球蛋白(Ig)的Fe区域。更为优选的是，用于本发明的嵌合诱饵受体融合有免疫球蛋白G (IgG)的Fe区域，最为优选的是融合有人类免疫球蛋白G (IgG)的Fe区域。免疫球蛋白(Ig)的Fe区域通过上述嵌合诱饵受体的N-末端或C-末端，优选地通过C-末端来融合。优选的免疫球蛋白(Ig)的Fe区域的核苷酸序列及氨基酸序列记载于序列目录中的第七序列及第八序列。用于编码嵌合诱饵受体的核苷酸序列搭载于腺病毒基因组。优选的是，用于编码嵌合诱饵受体的核苷酸序列存在于适当的表达结构(expression construct)内。在上述表达结构中，用于编码嵌合诱饵受体的核苷酸序列优选地与启动子进行启动连接(operatively linked)。在本说明书中，术语“启动连接”意味着核酸表达调节序列(例如启动子、信号序列或转录调节因子结合位置的排列)和其他核酸序列之间的功能性结合，由此上述调节序列将调节上述其他核酸序列的转录和/或翻译(translation)。在本发明中，结合到用于编码嵌合诱饵受体的核苷酸序列的启动子，优选在动物细胞，更为优选地在哺乳动物细胞中启动，能调节用于编码嵌合诱饵受体的核苷酸序列的转录，包含来自哺乳动物病毒的启动子及来自哺乳动物细胞基因组的启动子，例如包含U6启动子、Hl启动子、巨细胞病毒(CMV，cytomegalo virus)启动子、腺病毒晚期启动子、牛痘病毒7. 5K启动子、猴空泡病毒40 (SV40)启动子、单纯疱疹病毒(HSV)的tk启动子、呼吸道合胞病毒(RSV)启动子、EFl α启动子、金属硫因启动子、β -肌动蛋白启动子、人IL-2基因的启动子、人IFN基因的启动子、人IL-4基因的启动子、人淋巴毒素基因的启动子、人GM-CSF基因的启动子、诱导型(inducible)启动子、癌细胞特异性启动子(例如，端粒酶逆转录酶(TERT)启动子、前列腺特异性抗原(PSA )启动子、前列腺特异性膜抗原(PSMA )启动子、癌胚抗原(CEA )启动子、转录因子(E2F)启动子及甲胎蛋白(AFP)启动子)及组织特异性启动子(例如，白蛋白启动子)，但并不限定于此。最为优选为巨细胞病毒(CMV, cytomegalo virus)启动子。以癌症为对象实施基因治疗时，没有必要一生持续表达治疗基因，局部投用时因腺病毒引起的免疫反应不会太成问题，反倒可能会成为优点，因此对利用腺病毒的癌基因治疗剂的开发研究进行得非常活跃。因此，在本发明也基本利用腺病毒基因组结构达成癌 症的基因治疗。腺病毒以中间程度的基因组大小、操作的便利性、高滴度、广泛的靶细胞及优秀的感染性，广泛利用为基因传达载体。基因组的两个末端包含100-200bp的末端反向重复序列(ITR, inverted terminal repeat),这是复制及包装DNA时所需的顺式元件。基因组的El区域(ElA及ElB)编码用于调节转录及宿主细胞基因的转录的蛋白质。E2区域(E2A及E2B)编码参与病毒DNA复制的蛋白质。由于在顺式(cis)中所需的只是腺病毒基因组的一小部分(Tooza，J. Molecularbiology of DNA Tumor viruses, 2nd ed. Cold Spring Harbor Laboratory, Cold SpringHarbor, N. Y. (1981 ))，因此腺病毒具有运输大量外来DNA分子的能力，尤其在利用如293的特定细胞株时如此。在这种方面上讲，对于本发明的重组腺病毒，除了编码嵌合诱饵受体的核苷酸序列之外的其他腺病毒序列至少包含末端反向重复(ITR)序列。编码嵌合诱饵受体的核苷酸序列优选地插入在El区域(ElA区域和/或ElB区域，优选的是ElB区域)或E3区域，更为优选地插入在E3区域。另一方面，其他外来核苷酸序列(如细胞因子、免疫-补助刺激因子、自杀基因及肿瘤抑制基因)也可追加包含于腺病毒，这优选地插入在El区域(ElA区域和/或ElB区域，优选的是ElB区域)或E3区域，更为优选地插入在El区域(ElA区域和/或ElB区域，优选的是ElB区域)。并且，上述插入序列也可以插入在E4区域。并且，因腺病毒可包装到约105%野生型基因组，所以可追加包装约2kb基因。因此，插入到腺病毒的上述外来序列也可追加结合到腺病毒的基因组。在本发明的优选实例中，本发明的重组腺病毒携带惰性化的E1B19基因、ElB 55基因或ElB 19/E1B 55基因。在本说明书中，与基因相关所使用的术语“惰性化”意味着因该基因的转录和/或翻译没能正常进行，无法显示借助该基因编码的正常蛋白质的功能。例如，惰性化ElB 19基因是在该基因发生变异(置换、附加、部分缺失或整体缺失)无法生成活性的ElB 19kDa蛋白质的基因。缺失ElB 19时，可能增强细胞凋亡能力，缺失ElB 55基因时，具有肿瘤细胞特异性(参照专利申请第2002-23760号)。在本说明书中，与病毒基因组序列相关使用的术语“缺失”不仅意味着相关序列完全缺失，还包含部分缺失。根据本发明的优选实例，本发明的重组腺病毒包含活性的ElA基因。包含ElA基因的重组腺病毒具有可复制的特性。根据本发明的更为优选的实例，本发明的重组腺病毒包含惰性化的ElB 19基因及活性的ElA基因。根据本发明的更为优选的实例，本发明的重组腺病毒包含惰性化的ElB 19基因及活性的ElA基因，编码嵌合诱饵受体的核苷酸序列插入在缺失的E3区域。根据本发明的最为优选的实例，本发明的重组腺病毒包含惰性化的ElB 19基因及变异的活性ElA基因，编码嵌合诱饵受体的核苷酸序列插入在缺失的E3区域。在这里变异的活性ElA基因具有用于编码Rb (视网膜母细胞瘤retinoblastoma蛋白质)结合部位的核苷酸序列中的第45个谷氨酸残基被置换为甘氨酸的变异及第121-127个氨基酸序列全部被置换为甘氨酸的变异。在肿瘤细胞中因为不仅是p53蛋白质的变异，还有视网膜母细胞瘤(Rb)的突变或 与视网膜母细胞瘤(Rb)相关的信号通路的相当一部分受到了损伤，与Rb的结合能力消失的腺病毒在正常细胞中因为视网膜母细胞瘤(Rb)的活性腺病毒的复制被抑制，但是在Rb的功能在被抑制的肿瘤细胞中可以被活跃地复制，因此可选择性地杀伤癌细胞。因此，上述包含在视网膜母细胞瘤(Rb)结合部位上的变异的本发明的重组腺病毒具有非常优秀的癌细胞特异性。如同下述实施例中所被证实，表达嵌合诱饵受体的本发明的重组腺病毒选择性地抑制因血管内皮细胞生长因子(VEGF)引起的新生血管的形成，尤其是因血管内皮细胞生长因子(VEGF)引起的肿瘤细胞的血管新生，从而可将抗肿瘤效果极大化。而且，表达嵌合诱饵受体的本发明的重组腺病毒因以低滴度的病毒也能诱导高杀伤效果，因此在经投用的体内中的安全性非常优秀。根据本发明的另一实施方式，本发明提供一种抗血管新生组合物，其特征在于，包含(a)上述重组腺病毒的治疗学有效量；以及(b)药剂学上许可的载体。根据发明的另一实施方式，本发明提供一种因血管新生过多引起的疾病的预防或治疗方法，其特征在于，包括将抗血管新生组合物给需要该组合物的对象(sub ject)投用的步骤，上述抗血管新生组合物包含(a)上述重组腺病毒的治疗学有效量；以及，(b)药剂学上许可的载体。作为有效成分被包含在本发明的药剂学组合物的重组腺病毒与上述的本发明的重组腺病毒是相同的，因此对重组腺病毒的详细说明同样适用于本发明的药剂学组合物。因此，为了避免因说明书上的不必要的重复记载所造成的说明书过度复杂，对共同事项将省略对其的记载。通过本发明的抗血管新生组合物可预防或治疗的疾症或疾病包括因血管新生过多引起的所有疾症或疾病，优选的是癌症、肿瘤、糖尿病性视网膜病变、早产儿视网膜病变、角膜移植排斥反应、新生血管性青光眼、红皮病、增殖性视网膜病变、牛皮癣、血友病性关节炎、动脉粥样硬化血小板内的毛细血管增殖、瘢痕疙瘩、伤口肉芽、血管粘连、类风湿性关节炎、骨关节炎、自身免疫性疾病、克罗恩氏病、再狭窄症、动脉粥样硬化、肠管粘连、猫抓病、溃疡、肝硬化、肾小球性肾炎、糖尿病肾病、恶性肾硬化、血栓性微血管病、器官移植排斥反应、肾小球疾病、糖尿病、炎症或者神经退行性疾病。本发明中开发的表达嵌合诱饵受体的重组腺病毒能有效抑制新生血管形成，对多种与血管新生相关的疾病的效果，尤其是抗肿瘤效果显著提高，特别在E1B55基因被惰性化或在ElA中Rb结合部位变异的情况下，对癌细胞的特殊性非常优秀。这从结果上可以减少治疗癌症所需要的病毒投入量，可大大减少因病毒产生的生物体内的毒性和免疫反应。包含在本发明的组合物的重组腺病毒对多种肿瘤细胞呈现杀伤效果，因此本发明的药剂学组合物可用在与肿瘤相关的多种疾病或疾症，例如脑癌、胃癌、肺癌、乳房癌、卵巢癌、肝癌、支气管癌、鼻咽癌、喉癌、食管癌、胰腺癌、膀胱癌、前列腺癌、大肠癌、头颈癌、皮肤癌、黑色素瘤、结肠癌及宫颈癌等的治疗上。本说明书中的术语“治疗”意味着(i)预防血管新生；(ii)通过抑制血管新生来抑制与血管新生相关的疾病或疾症通过抑制血管新生减轻与血管新生相关的疾病或疾症。因此本说明书中的术语“治疗学有效量”意味着能达到上述药理学效果的充足的量。 包含在本发明的组合物的药剂学上许可的载体为制剂时通常使用的载体，其包含乳糖、葡萄糖、蔗糖、山梨糖醇、甘露醇、淀粉、阿拉伯胶、磷酸钙、藻酸盐、明胶、硅酸钙、微晶纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、纤维素、水、糖浆、甲基纤维素、羟基苯甲酸甲酯、羟基苯甲酸丙酯、滑石、硬脂酸镁及矿物油等，但并不局限于此。本发明的药剂学组合物除了包含上述成分以外还可包含润滑剂、润湿剂、甜味剂、香味剂、乳化剂、悬浮剂、保存剂等。本发明的药剂学组合物优选地进行非经口投用，例如利用静脉内投用、腹腔内投用、肿瘤内投用、肌内投用、皮下投用或局部投用来进行投用。对卵巢癌往腹腔内投用及对肝癌往门静脉投用时，可通过投用的方法进行投用；对乳房癌可通过直接注射到肿块进行投用；对结肠癌可通过灌肠的方式直接注射投用；对膀胱癌可通过直接注射到导尿管内进行投用。本发明的药剂学组合物的适合的投用量根据制剂化方法、投用方式、患者的年龄、体重、性别、疾病症状的程度、饮食、投用时间、投用途径、排泄速度及反应感应性等因素各不相同，一般熟练的医生都能很容易地对治疗目标有效的投用量进行决定或开出处方。一般，本发明的药剂学组合物包含lX105-lX1015PFU/ml的重组腺病毒，通常两天一次注射I X IOiqPFU,共注射两周。本发明的药剂学组合物根据本发明所属技术领域的普通技术人员容易实施的方法，利用药剂学上许可的载体和/或赋形剂来实现制剂化，可被制造成单位用量的形态或投用到多容量容器内进行制造。这时的剂型为油或水性介质中的溶液、悬浮液或乳化液形态，也可能是浸膏剂、粉剂、颗粒剂、锭剂或胶囊剂的形态，还可包含分散剂或稳定剂。本发明的药剂学组合物可用作单独的疗法，但也可以与其他通常的化学疗法或放射疗法一起使用，在实施这种并行疗法时可更有效地治疗癌症。可以跟本发明的组合物一起使用的化学疗法剂为顺氯氨钼(cisplatin)、卡钼(carboplatin)、甲基节肼(procarbazine)、二氯甲基二乙胺(mechlorethamine)、环憐酉先胺(cyclophosphamide)、异环磷酰胺(ifosfamide)、美法仑(melphalan)、苯丁酸氮芥(chlorambucil)、白消安(bisulfan)、亚硝基脲(nitrosourea)、放线菌素 D (dactinomycin)、柔毛霉素(daunorubicin)、阿霉素(doxorubicin)、博来霉素(bleomycin)、普卡霉素(plicomycin)、丝裂霉素(mitomycin)、依托泊苷(etoposide)、三苯氧胺(tamoxifen)、紫杉醇(taxol)、反钼(transplatinum)、5-氟尿卩密唳(5_fluorouraciI)、长春花新碱(vincristin)、长春灭痕碱(vinblastin)及甲氨蝶呤(methotrexate)等。能与本发明的组合物一起使用的放射疗法为X-线照射及Y -线照射等。发明效果本发明的特点及优点概括如下(a)本发明的重组腺病毒表达抑制血管新生的嵌合诱饵受体。(b)表达嵌合诱饵受体的本发明的重组腺病毒能非常有效地抑制血管新生，可用作多种血管新生相关疾病的基因治疗剂。(c)尤其，本发明的重组腺病毒具有优秀的肿瘤细胞溶瘤活性。 (d)现有与血管新生相关的抗癌剂(例如，阿瓦斯汀)只具有抑制细胞生长繁殖的(cytostatic)效果，有着作为癌症治疗剂的限制。但是本发明的重组腺病毒具有杀灭细胞的(cytocidal)效果，可以杀灭癌细胞，因此可以克服以往癌症治疗剂的限制。(e)并且，现有与血管新生相关的抗癌剂也作用于正常细胞来诱发副作用，但本发明的重组腺病毒特异性地作用于癌细胞，可大大减少这种副作用。(f)现有血管内皮细胞生长因子(VEGF)陷阱为蛋白质制剂，在生物体内的半减期短。但是，由于本发明的重组腺病毒持续地过度表达血管内皮细胞生长因子(VEGF)陷阱，因而可解决这种问题。
图Ia-图Ib所示的是重组腺病毒(Ad)载体的结构。图Ia所示的是缺失El的复制缺陷型腺病毒。dEl_k35在巨细胞病毒(CMV, cytomegalo virus)启动子的调节下表达β-半乳糖苷酶。dEl-k35/KH903在Ε3部位包含嵌合诱饵受体ΚΗ903。图Ib所示的是可复制的腺病毒。RdB包含变异的E1A，缺失E1B19及55kDa。RdB/KH903在E3部位包含嵌合诱饵受体KH903。图Ic所不的是测定分泌到培养基的KH903的结果。腺病毒(Ad, adenovirus);末端反向重复序列(ITR, inverted terminal repeat)。图2a-图2b所示的是dEl_k35/KH903抑制血管内皮细胞生长因子(VEGF)表达的血管内皮细胞生长因子(VEGF)水平定量化结果。在图2a中，多种人类肺癌细胞株感染为20-100 MOI dEl-k35或dEl-k35/KH903。在感染48小时后，通过酶联免疫吸附测定法(ELISA)对培养基上清液的血管内皮细胞生长因子(VEGF)浓度进行了测定。图2b所示的是对A549细胞碎片的血管内皮细胞生长因子(VEGF)水平进行测定的结果。图3所示的是dEl_k35/KH903对人脐静脉内皮细胞(HUVECs)的血管内皮细胞生长因子(VEGF)诱导增殖的抑制实验结果。用30M0I dEl_k35或dEl_k35/KH903对人脐静脉内皮细胞(HUVECs)进行处理。在感染72小时后，通过实施MTT分析测定了总生存细胞量。所显示的结果是三次重复实验的平均值。图4a_图4b所示的是dEl_k35/KH903对人脐静脉内皮细胞(HUVEC)移动性的影响。将细胞放置在包含EBM的24孔组织培养平皿的上部腔室。经过3. 5小时后固定通过的细胞，用苏木精-伊红(H&E,Hematoxilyn and Eosin)进行染色。图4a所示的是关于人脐静脉内皮细胞(HUVECs)移动的代表性照片(40倍率)。在图4b中，以对高输出域(X 200)的移动细胞的数量来表示移动细胞，对8个域分别计算了两遍。误差棒显示为土s.e。(*P< O. 05，* * P < O. 001)图5a_图5b所示的是dEl_k35/KH903对形成人脐静脉内皮细胞(HUVEC)管的影响。在基质胶-涂敷平皿上以I. 5X105cells/well的密度将人脐静脉内皮细胞(HUVECs)平皿接种，接着以dEl-k35或dEl-k35/KH903感染(20M0I)A549或H460的调节培养基培养了48小时。图5a所示的是关于管形成的代表性照片(40倍率)。图5b所示的是关于管形成的定量分析结果。用通用测定仪对被管网覆盖的宽度进行测定，来实施了对管形成的定量化。该实验实施了 3回，其值用这些的平均值来表示。误差棒显示为土s.e。(*P<0. 05,女女 P < O. 001)。图6所示的是关于dEl-k35/KH903抑制血管芽生的曲线图。运输KH903的复制缺陷型腺病毒在活体抑制血管内皮细胞生长因子(VEGF)的诱导血管的芽生。分析结果得到了 O (最小阳性)至5 (最大阳性)的值。图7所示的是显示RdB/KH903的离体细胞病变效果的照片。将细胞用指定的MOI 的dEl-k35、dEl-k35/KH903、RdB或RdB/KH903进行感染。将复制缺陷型腺病毒dEl_k35用作阴性对照组。在感染4-10日时，将平皿上的细胞固定化，用结晶紫进行了染色。图8所示的是显示KH903表达-腺病毒的抗肿瘤效果的曲线图。通过将肿瘤细胞H460 I X IO7细胞投用皮下来构建异种移植模型，使其成长到80mm3-120mm3。将带有肿瘤的裸鼠随机分为3个实验组(各5只鼠)。针对各实验组，分别在第I天、第3天及第5天，将腺病毒(1X1010 vp of adenovirus in 30 μ I of PBS)投用肿瘤内。并测定肿瘤的短轴(w)及长轴(L)，每天对肿瘤的成长进行了监测。图9a_图9b所示的是关于用RdB/KH903处理的H460肿瘤组织的血管新生的组织学评价结果。在图9a中，用抗血小板内皮细胞粘附分子(PECAM)抗体(CD31)对微脉管进行了染色。该图为关于CD31染色组织的代表性照片。图9b所示的是在肿瘤组织内将血管数量定量化的结果。数据以平均(n=3) 土SE显示。实施方式以下，将通过实施例更详细地说明本发明。这些实施例仅仅是为了更具体地说明本发明，根据本发明的要旨本发明的范围并不局限于这些实施例，这对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说是显而易见的。
实施例实验材料及方法I.对象细胞株及细胞培养作为实验中所使用的细胞株，人体肺癌细胞株A549和H460从美国模式培养物集存库(ATCC, American Type culture Collection, Manassas, VA,美国USA)购买，人胳静脉血管内皮细胞(HUVEC, Human umbilical vascular endothelial cell)从龙沙(Lonza,巴塞尔Basel，瑞士)购买，将作为腺病毒初期表达基因的在宿主基因组内包含El部位的HEK293细胞株(ATCC)用作生产腺病毒的细胞株。除了人脐静脉血管内皮细胞(HUVEC)的所有细胞株在包含10%胎牛血清(FBS ;Gibco-BRL，格兰德岛Grand Island，NY，美国USA)的杜尔伯科改良伊格尔(DMEM)培养液添加作为抗生剂的100U/ml青霉素、100μ g/ml链霉素(Gibco-BRL),并在5%C02的存在之下,于37°C恒温培养器中进行培养。人脐静脉血管内皮细胞(HUVEC)则用在包含5%胎牛血清(FBS)的微血管内皮细胞生长培养基(EGM-2MV，龙沙Lonza,沃克斯维尔Walkersville, MC,美国USA)添加作为抗生剂的100U/ml青霉素、100 μ g/ml链霉素(Gibco-BRL)而进行培养的继代培养5_8之间的细胞进行了实验。2.用于表达KH903的腺病毒的制备、生产及计算滴度为了制备用于表达KH903的重组腺病毒，将KH903的质体pKH903(康鸿KangHong，成都=Chengdu，中国)用EcoRI切断之后插入到腺病毒El的穿梭载体pCA14 (微毕克斯=Microbix)后，将其再用BglII切断后得到的KH903 DNA切片插入到用BamHI切断的E3的穿梭载体pSP72AE3 (本研究室制备，肿瘤基因治疗Cancer Gene Therapy,12 :61-71 (2005))。KH903是在血管内皮细胞生长因子受体-I (VEGFR-I)的第二胞外域(序列目录第一序列及第二序列)、血管内皮细胞生长因子受体-2 (VEGFR-2)的第三胞外域(序列目录第三序列及第四序列)及血管内皮细胞生长因子受体-2的第四胞外域(序列目录第五序列及第六序列)依次结合制造而成的嵌合诱饵受体上融合人免疫球 蛋白G (IgG)Fc区域(序列目录第七序列及第八序列)而成。将制备好的pSP72AE3/KH903载体用XbaI切割，插入pSP72 Λ E3/CMV载体(本研究室制备，肿瘤基因治疗=CancerGene Therapy, 12 :61-71 (2005))的巨细胞病毒(CMV, cytomegalo virus)启动子制造了PSP72 Δ E3-CMV-KH903E3穿梭载体。为了制备用于表达KH903的复制缺陷型腺病毒，将在上述中制备的PSP72AE3-CMV-KH903E3穿梭载体用PvuI处理使其线性化，E3基因被消失，在El部位插入有lacZ，将置换为腺病毒型35的纤维节(knob)的pdEl_k35总载体[从具有Ad35纤维节部分的腺病毒(Cell Genesys)通过聚合酶链式反应(PCR)得到700bp的35knob部分，用 Ncol/Mfel 切割，与事先用 Ncol/Mfel 切割的 pSK5543(Coxsackie and adenovirusreceptor binding ablation reduces adenovirus liver tropism and toxicity, HumanGene Ther 16:248-261 (2005))相连接而制备了 pSK5543/35k。所制备的 pSK5543/35k 用SacII/XmnI切割，通过与用SpeI切割的dEl/lacZ进行同源重组制备了 pdEl_k35]，用SpeI限制酶进行处理并实现线性化。将这些一同在大肠杆菌BJ5183 (瑞士弗里堡(Fribourgh)大学的 Verca ;Heider，H. et al. , Biotechniques, 28 (2) :260-265,268-270 (2000))中同时进行转化来诱导基因的同源重组(homologous recombination),制备了同时表达IacZ基因和KH903的复制缺陷型腺病毒载体pdEl-k35/KH903。为了制备用于表达能有效抑制血管内皮细胞生长因子(VEGF)的血管内皮细胞生长因子(VEGF)陷阱的肿瘤特异性杀伤腺病毒，将上述当中制备的PSP72 Δ E3-CMV-KH903E3穿梭载体用PvuI进行处理并实现线性化后，与处理SpeI限制酶而实现线性化的pRdB腺病毒总载体(ElA的Rb结合部位发生变异，ElB 19 kDa基因和ElB 55 kDa基因一同消失的肿瘤特异性杀伤腺病毒，参照韩国专利第0746122号)一同在大肠杆菌BJ5183中同时进行转化，来制备了选择性杀伤肿瘤的腺病毒载体pRdB/KH903。ElA的Rb结合部位变异为在对位于ElA基因序列的Rb结合部位进行编码的核苷酸序列中第45个谷氨酸(Glu)残基置换为甘氨酸(Gly)的变异及第121-127个氨基酸序列全部被置换为甘氨酸的变异。将同源重组的腺病毒载体用Hind III限制酶进行处理，确认是否有同源重组后，将确认的质体用Pac I限制酶切割后，使其转化到HEK293细胞株而生产腺病毒。作为对照组使用的病毒为缺损了 El部位的基因，与在其部位的携带IacZ基因的dEl-k35同时ElB 19 kDa和ElB 55 kDa基因全部缺损的RdB，各个腺病毒在HEK293细胞株进行增殖以氯化铯(CsCl)浓度梯度浓缩后纯化分离，通过限制滴定法分析(limiting titration assay)及光电比色计(photospectrometer)算出了滴定量(plaqueforming unit, PFU)。3.蛋白质印迹法为了验证用于表达KH903的腺病毒感染在人肺癌细胞株时，是否在细胞内生成KH903蛋白质而分泌到细胞培养液，在A549细胞制备的腺病毒dEl-k35/KH903用20、50及100M0I分别进行处理，48小时后将细胞培养液和细胞全部回收进行了聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE, sodium-dodecyl sulfate poly-acrylamide gel electrophoresis)。经过电泳后，将凝胶上的蛋白质电子转移(electro-transfer)到聚偏氟乙烯(PVDF,polyvinylidene fluoride)膜,之后,将特异性地识别KH903的结构中的人免疫球蛋白G(IgG) Fe部位的抗体作为第一抗体(细胞信号传导Cell signaling,丹弗斯Danvers,MA,美国USA)进行结合。将结合有辣根过氧化物酶(HRP, horseradish peroxidase)的山羊抗小鼠免疫球蛋白G (IgG)用第二抗体(细胞信号传导Cell signaling,丹弗斯Danvers,MA，美国USA)反应之后，通过增强化学发光(ECL, enhanced chemiluminescence)(穿透 Pierce，罗克福德=RockforcU IL，美国USA)方法，利用LAS4000调查了膜上的蛋白质和抗体是否结合，并确认了各蛋白质的表达样态。4.血管内皮细胞生长因子(VEGF)的表达变化为了验证用于表达能有效抑制从肿瘤分泌的血管内皮细胞生长因子(VEGF)的KH903的腺病毒是否能够减少血管内皮细胞生长因子(VEGF)的表达，实施了酶联免疫吸附测定(ELISA, enzyme-linked immunosorbent assay)。首先，为了验证血管内皮细胞生长因子(VEGF)的表达是否能被有效抑制，在6孔平底板上将肺癌细胞株A549、H460、H322(ATCC)、H358(ATCC)及 H1299(ATCC)分别以 3X105cells/well 分注后，第二天通过 2-100 的多重性感染(M01，multiplicity of infection)对腺病毒进行感染，6小时后用包含5%FBS的DMEM培养基进行更换。为了在病毒感染后48小时回收培养基，在回收培养基24小时前用不包含FBS的DMEM培养基进行了更换。回收的培养基通过800 Xg离心分离来分离上清液后，利用其中的150 μ g进行了血管内皮细胞生长因子(VEGF)酶联免疫吸附测定(ELISA)分析。5·MTT分析为了定量化随着腺病毒感染因KH903的表达引起的血管内皮细胞增殖能力的抑制，实施了 3-(4，5_ 二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴盐(MTT，3- (4，5-dimethylathiazol-2yl)-2, 5-diphenyltetrazoIium bromide, 2mg/ml)分析。将人胳静脉血管内皮细胞(HUVEC)分注到用2%明胶涂敷的48孔平底板，24小时后处理了 30M0I的已制备的重组腺病毒。对处理病毒前的人脐静脉血管内皮细胞(HUVEC)用EBM-2 (龙沙Lonza,沃克斯维尔，MC,美国USA)培养基实施了血清饥饿(starvation)。为了测定处理病毒后经过72小时后细胞的生存率，在去除培养基后，每孔各倒入150 μ I MTT溶液在5%C02存在之下，于37°C恒温培养器上进行4个小时反应后，去除了上清液。在去除上清液的孔平底板添加Iml的二甲基亚枫(DMS0, dimethyl sulphoxide),在37°C下反应10分钟之后，在540nm下，测定用二甲基亚枫(DMSO)进行洗脱的上清液的吸光度，以此来测定细胞的相对生存率。
6.内皮细胞的移动性分析为了查看人脐静脉血管内皮细胞(HUVEC)的趋化性，利用直径为6. 5-mm的聚碳酸酯滤纸(8-μ m瞳孔大小)的双层细胞培养板(Transwell,美国康宁Corning Costar,剑桥Cambridge，MA，美国USA)进行了内皮细胞的移动性分析。首先利用O. 1%明胶在上部腔室的过滤器进行涂敷。等明胶全部干燥后，在血清缺失培养基培养6个小时，将实施血清饥饿的人脐静脉血管内皮细胞(HUVEC)以I X IO5细胞计算放入上部腔室，将感染dEl-k35和dEl-k35/KH903腺病毒来回收的细胞培养液放入下部腔室，平皿在37°C下培养了 3小时30分钟。3小时30分钟后取出平皿，将上部腔室的培养基倒出后用甲醇固定细胞一分钟，进行苏木精-伊红(H & E)染色，由此制备了载 玻片。此后，按不同组，在200倍的倍率下对8处进行拍照求其平均，来对细胞的移动性进行定量化。7.管形成分析为了查看能有效抑制从肿瘤分泌的血管内皮细胞生长因子(VEGF)的KH903引起的血管内皮细胞生长因子(VEGF)的表达减少能否使血管内皮细胞的管形成功能发生变化，因此实施了利用人脐静脉血管内皮细胞(HUVEC)的管形成分析。首先将250 μ I的成长因子减少基质胶(Collabo-rative Biomedical Products,贝德福德Bedford, MA,美国USA)均匀分注到事先放在_20°C的24孔平底板后，在37°C下将其固化30分钟。人脐静脉血管内皮细胞(HUVEC) (5-7继代培养)在血清缺失的EBM-2 (龙沙Lonza，沃克斯维尔Walkersville，MC，美国USA)培养基培养6小时而实施血清饥饿后，处理胰蛋白酶测定了细胞数量。将对dEl-k35或dEl-k35/KH903腺病毒分别进行20M0I处理后48小时后收得的A549及H460细胞培养液与经过血清饥饿预处理的人脐静脉血管内皮细胞(HUVEC)(1.5X105cells/well)混合后，分注到已分注基质胶的24孔平底板进行培养。作为阳性对照组使用的是20ng/ml的血管内皮细胞生长因子(VEGF)蛋白质。在培养后12小时至16小时之间去除培养液，用磷酸盐缓冲溶液(PBS)清洗两次后，使用显微镜观察了管形成。8.活体大动脉环芽生分析为了观察能有效抑制从肿瘤中分泌的血管内皮细胞生长因子(VEGF)的KH903引起的血管形成抑制，实施了大动脉环芽生分析。从澳瑞特(韩国澳瑞特生物科技有限公司Orient Bio, Korea, Inc.,)购买的 6 周龄的斯普拉-道来(氏)大鼠(Sprague Dawley rat)中分离大动脉，去除大动脉周边的纤维-脂肪组织后，切细成Imm厚度的环状。在事先冷却的48孔平底板上各分注200 μ I基质胶，将大动脉环植入各个孔中的基质胶后，在37°C下固化20分钟。经过30分钟后，待基质胶(matrigel)凝固，就把管形成分析中使用过的250 μ I细胞培养液处理到各个孔进行培养，每天用显微镜观察从大动脉环生成的血管。将血管内皮细胞生长因子(VEGF)蛋白质(20ng/ml)作为阳性对照组进行了处理。培养后对新形成的血管，通过双盲分析以阳性对照组为5分、没有形成血管的实验组为O分的分值进行了分析，对各个实验组以12个大动脉环为对象实施了大动脉环芽生分析。9.验证用于表达KH903的选择性杀伤肿瘤的腺病毒的溶瘤活性为了验证减少从肿瘤中分泌的血管内皮细胞生长因子(VEGF)的KH903的表达与否对腺病毒的复制产生怎样的影响，实施了细胞病变效果(cytopathic effect :CPE)分析。将包括肺癌细胞株的人体肿瘤细胞株分注到48孔平底板，经过24小时后，以0. 1-10M0I感染dEl-k35、dEl-k35/KH903、RdB或RdB/KH903腺病毒。在与对照组病毒的差异最明显时去除培养基，将留在平皿底部的细胞用O. 5%结晶紫固定、染色后进行了分析。10.验证生物体内的抗肿瘤效果在从澳瑞特(Orient)购买的出生后经过6-8周的裸鼠腹部皮下注射了 I X IO7个人体肺癌细胞株H460。肿瘤的体积达到约70-100mm3程度时，将RdB、RdB/KH903腺病毒与阴性对照组磷酸盐缓冲溶液(PBS)—起各以两天为间隔三次直接注射到肿瘤内后，对肿瘤的大小以两天为间隔进行了测定。就肿瘤的体积而言，用测径器测定肿瘤的短轴和长轴，用如下公式计算得出，(mm3)=(短轴mm) 2X长轴mmXO.523。11.验证用于表达与血管内皮细胞生长因子(VEGF)结合的KH903的选择性杀伤肿瘤的腺病毒投用引起的肿瘤组织内新生血管形成的抑制效果在6-8周龄的裸鼠腹部皮下注射肺癌细胞株H460后，待肿瘤大小变为约 100-120mm3程度时，将RdB、RdB/KH903腺病毒或阴性对照组磷酸盐缓冲溶液(PBS )以两天为间隔三次投用到肿瘤内。将最后的病毒投用后的第10天摘除肿瘤来固定到固定化锋(IHC zinc fixative, Formalin-free)(美国生物技术供应商BD BiosciencesPharmingen, San Diego, CA, USA)溶液后制备了石腊块。将制备的石腊块切成4μηι厚度，并制备成载玻片后，将其依次放入二甲苯，100%、95%、80%、70%乙醇溶液，去除(deparafinization)石腊后,用苏木精-伊红(H & E)进行了染色。为了确认与肿瘤分泌的血管内皮细胞生长因子(VEGF)结合，减少表达的KH903是否抑制了肿瘤组织内的血管形成，利用作为能选择性地识别血管内皮细胞特异性抗原CD31的抗体的大鼠抗-小鼠CD31单克隆抗体(MEC13. 3 ;美国生物技术供应商BD Biosciences Pharmingen)实施了组织免疫染色。使去除石蜡后的4 μ m厚度的肿瘤组织载玻片在3% H2O2溶液内反应10分钟来阻断内因性过氧化酶的作用，通过蛋白质块血清游离(Protein Block Serum free,丹麦生化科技公司DakoCytomation,卡平特里亚Carpinteria, CA,美国USA)进行30分钟不产生非特异性抗体反应后，将CD31抗体作为第一抗体进行杂交。将结合有生物素的多克隆抗大鼠免疫球蛋白G (IgG)抗体(美国生物技术供应商BD Biosciences Pharmingen)作为第二抗体进行反应后，利用二甲氨基偶氮苯(DAB,丹麦生化科技公司DakoCytomation,卡平特里亚Carpinteria，CA，美国USA)查明了 CD31的表达样态。12.肿瘤内血管数量的计算对染色成血管内皮细胞特异性抗原⑶31 (血小板-内皮细胞黏附分子plateletendothelial cell adhesion moleculel)阳性的肿瘤内血管首先通过低倍率观察而随机拍照后，提高倍率对在100倍的视野下能观察到的血管的数量进行定量。从三张载玻片各选择5个视野来计算血管数量算出平均值将其值用作代表值。实验结果I.表达与血管内皮细胞生长因子(VEGF)特异结合的KH903的腺病毒的制备及血管内皮细胞生长因子(VEGF)表达变化的验证制备了用于表达与血管内皮细胞生长因子(VEGF)特异结合而抑制从肿瘤分泌的血管内皮细胞生长因子(VEGF)的表达的血管内皮细胞生长因子(VEGF)陷阱KH903的腺病毒dEl-k35/KH903 (图la)。为了确认插入在dEl_k35/KH903腺病毒的E3部位的KH903在细胞感染时是否在实际细胞中形成而分泌到培养基，将被感染的肿瘤细胞和培养基全部回收，利用测定KH903的结构中人免疫球蛋白G (IgG)的Fe部位的抗体进行了蛋白质印迹法。实验结果，在细胞碎片只能观测到能确认KH903的生成的程度的量，但是在培养基则能观测到大量的KH903。由此，可以确认KH903是生成于被感染的细胞内而分泌到培养基(图IcX根据因表达腺病毒的初期基因ElA的可复制的腺病毒血管内皮细胞生长因子(VEGF)的表达将减少的报告28，为了验证KH903引起的血管内皮细胞生长因子(VEGF)表达的变化，制备了 ElA消失，同时表达IacZ基因和KH903的复制缺陷型腺病毒dEl_k35/KH903。将 dEl-k35/KH903 感染到人体肺癌细胞株(A549、H460、HCC827、H1299、H2172、H322)，从细胞中回收培养基来通过酶联免疫吸附测定(ELISA)对血管内皮细胞生长因子(VEGF)表达量进行了定量。其结果，可以确认在使用到实验的所有种类的肺癌细胞株中，因感染dEl-k35/KH903腺病毒，血管内皮细胞生长因子(VEGF)的表达显著减少(图2a)。为了验证在实际肿瘤细胞中能生成多少血管内皮细胞生长因子(VEGF)、所分泌的血管内皮细胞生长因子(VEGF)因KH903的表达而减少，对回收培养基的细胞进行破碎，确认了细胞中血管内皮细胞生长因子(VEGF)的表达量。如图2b所不，与利用感染腺病毒后的培养基实施的血管内皮细胞生长因子(VEGF)酶联免疫吸附测定(ELISA)的结果相同，比起感染dEl-k35的细胞，在感染dEl-k35/KH903的细胞中血管内皮细胞生长因子(VEGF)表达量明显减少(图2b)。2.对表达与血管内皮细胞生长因子(VEGF)特异结合的KH903的腺病毒引起的新生血管形成的抑制能力的观察首先，确认了抑制血管内皮细胞生长因子(VEGF)的KH903的表达引起的血管内皮细胞生长因子(VEGF)浓度的变化对人脐静脉血管内皮细胞(HUVEC)的血管内皮细胞生长因子(VEGF)诱导增殖的影响。在基质胶-涂敷48孔平底板将人脐静脉血管内皮细胞(HUVEC)以 2X 104cells/well 播种后，用 30M0I 的 dEl_k35 或 dEl_k35/KH903 腺病毒进行感染，72小时后实施MTT分析，测定了活细胞的生存率。其结果，可以观察到感染dEl-k35/KH903的组比未处理病毒的组生存率减少了 53%，比感染阳性对照组dEl-k35的组生存率减少了 30% (图 3)。为了验证用于抑制血管内皮细胞生长因子(VEGF)表达的KH903引起的血管内皮细胞生长因子(VEGF)量的变化对血管内皮细胞的移动能力造成的影响，利用人脐静脉血管内皮细胞(HUVEC)实施了移动性分析。使A549、H460细胞株分别感染20M0I的dEl_k35或dEl-k35/KH903腺病毒，用48小时后回收的培养基培养了人脐静脉血管内皮细胞(HUVEC)。其结果，可以观测到处理未经过任何处理的细胞培养液或感染dEl-k35腺病毒的细胞培养液时，大量的细胞从上部腔室移动到下部腔室，相反，处理感染dEl-k35/KH903腺病毒的细胞培养液时，人脐静脉血管内皮细胞(HUVEC)的移动比起上两个组并不顺畅(图4)。 为了验证因KH903的表达引起的血管内皮细胞生长因子(VEGF)量的变化对血管内皮细胞的血管形成能力产生的影响，利用人脐静脉血管内皮细胞(HUVEC)实施了管形成分析。使A549、H460细胞株分别感染20M0I的dEl_k35或dEl_k35/KH903腺病毒，用48小时后回收的培养基培养了人脐静脉血管内皮细胞(HUVEC)。其结果，可以观测到处理未经过任何处理的细胞培养液或感染dEl-k35腺病毒的细胞培养液时，形成大而粗的管，相反，处理感染dEl-k35/KH903腺病毒的细胞培养液时，人脐静脉血管内皮细胞(HUVEC)的血管形成并不顺利，形成细而部分断掉的管(图5)。
为了在活体确认以上确认的新生血管形成能力的差异，利用大鼠的大动脉实施了血管芽生分析。首先，将dEl-k35或dEl-k35/KH903腺病毒用20M0I进行处理，将在48小时后回收的A549、H460细胞培养液处理到大动脉环并培养5天的结果，与未经过任何处理的细胞培养液或处理感染dEl-k35的A549细胞培养液的大动脉环相对照，用处理dEl-k35/KH903腺病毒的细胞培养液培养大动脉环时，可以确认到几乎不发生血管芽生(图6)。为了更定量地比较验证这一点，对形成的血管通过双盲方式以阳性对照组(most positive)为5分、血管未芽生的实验组(least positive)为O分的分值进行了分析。可以确认,在未经过任何处理的细胞培养液或处理感染dEl-k35的A549、H460细胞培养液的所有大动脉中血管形成非常活跃，但是在处理感染dEl-k35/KH903腺病毒的细胞培养液时只有血管发生了芽生，因此与对照组病毒dEl-k35相比血管形成被显著抑制。3.验证用于表达与血管内皮细胞生长因子(VEGF)特异结合的KH903的选择性杀伤肿瘤的腺病毒的细胞杀伤能力由于抑制血管内皮细胞生长因子(VEGF)表达引起的新生血管形成能力的减弱能抑制肿瘤的成长，因此为确认KH903的抗癌效果分别制备了表达KH903的选择性杀伤肿瘤的腺病毒RdB/KH903和作为对照组的选择性杀伤肿瘤的腺病毒RdB。为确认KH903的表达能否阻碍腺病毒的复制，使几种癌细胞株及正常细胞株感染到dEl-k35、dEl-k35/KH903、RdB或RdB/KH903腺病毒，通过CPE分析观察了病毒复制所引起的细胞凋亡程度。在作为阴性对照组的感染dEl-k35复制缺陷型腺病毒的细胞中由于腺病毒不会被复制，因而不会产生细胞杀伤效果，但是感染可复制的腺病毒RdB或RdB/KH903时，随着病毒数量的增加细胞杀伤效果也随之增加。可以观察到的是，在实验中所使用的所有细胞株中表达KH903的腺病毒RdB/KH903的细胞杀伤能力比对照组病毒RdB更为出色(图7)4.验证用于表达与血管内皮细胞生长因子(VEGF)特异结合的KH903的选择性杀伤肿瘤的腺病毒在生物体内的抗肿瘤效果为了验证用于表达抑制血管内皮细胞生长因子(VEGF)表达的KH903的腺病毒在生物体内的抗肿瘤效果，在裸鼠的腹部皮下注射人体肺癌细胞株H460细胞，所形成的肿瘤的体积达到约8(Tl00mm3时，将IX IOicVp的RdB、RdB/KH903腺病毒与阴性对照组磷酸盐缓冲溶液(PBS)—起以两天为间隔三次投用到肿瘤内，之后观察了肿瘤的成长(图8)。可以确认的是，投用阴性对照组磷酸盐缓冲溶液(PBS)的裸鼠，在投用病毒后经过23天时，肿瘤的体积已经急剧成长到约达2170. 238±455. 1216mm3，但是投用用于表达KH903的特异杀伤肿瘤的腺病毒RdB/KH903时，肿瘤的成长被大大延迟。即，对小白鼠投用RdB、RdB/KH903腺病毒时，肿瘤的体积为 1181. 391 ±985. 9131mm3,252. 67±103. 8464mm3，可以观察到 KH903的抑制新生血管形成引起的抗肿瘤效果和选择性杀伤肿瘤的腺病毒的显著的抗肿瘤效果。5.对表达用于抑制血管内皮细胞生长因子(VEGF)表达的KH903的选择性杀伤肿瘤的腺病毒的投用引起的肿瘤内血管分布的观察将人体肺癌细胞株H460注射到裸鼠腹部皮下后，待形成肿瘤就以两天为间隔将RdB和RdB/KH903腺病毒及阴性对照组磷酸盐缓冲溶液(PBS)以I X IO10Vp三次注射到肿瘤内。在最后一次投用后经过一天之后摘除肿瘤，通过组织免疫染色法对血管内皮细胞特异性抗原⑶31进行了观察。其结果，确认了相比阴性对照组磷酸盐缓冲溶液(PBS)组，处理了选择性杀伤肿瘤的腺病毒RdB的实验组中肿瘤内的血管数量减少了 21%，投用RdB/KH903时，可以观察到血管数量的71%被抑制(图9)。追加议论的事项新生血管形成作为从已经存在的血管形成新血管的过程，对胚胎的发生、器官的形成及组织的再生起着重要的作用。并且新生血管形成是初期的肿瘤成长所需的必要条件，随着肿瘤的体积变大肿瘤细胞或被浸润的巨噬细胞生成多种血管形成因子使肿瘤内的微脉管增殖。这样增殖的血管向肿瘤细胞供给营养，分泌各种成长因子使肿瘤成长。众所周知，在参与新生血管形 成的多种成长因子中血管内皮细胞生长因子(VEGF)在肿瘤的成长和转移中的参与很重要。血管内皮细胞生长因子(VEGF)与两个酪氨酸受体-血管内皮细胞生长因子受体2 (VEGFR2)、血管内皮细胞生长因子受体(激酶插入区受体KDR)结合，直接促进血管内皮细胞的分裂用作强力血管新生因子，增加微脉管的渗透度使血浆蛋白质排出到周边组织来改变细胞外基质，使血管生成变得容易。因此，要阻碍癌的成长就必须抑制作为血管生长因子的血管内皮细胞生长因子(VEGF)。通过抑制肿瘤内的血管形成来抑制肿瘤的成长成为了最近30年间抗癌治疗的目标，对通过抑制肿瘤内的血管形成来抑制肿瘤的成长的研究也进行得非常活跃。但是到现在这种血管形成抑制剂比起作为单一治疗剂使用更多使用在合并治疗，具有费用高和因反复投用可能引起毒性的缺点。本研究为了克服这种限制点，将作为水溶性血管内皮细胞生长因子(VEGF)特异性诱饵受体的KH903表达在选择性杀伤肿瘤的腺病毒，由此有效抑制血管内皮细胞生长因子(VEGF)的同时致力于通过使用选择性杀伤肿瘤的腺病毒来提高整个抗肿瘤效果。KH903作为结合细胞生长因子受体I (VEGFR1)和细胞生长因子受体2 (VEGFR2)的血管内皮细胞生长因子(VEGF)结合区域制备而成的血管内皮细胞生长因子(VEGF)特异水溶性诱饵受体，能有效抑制肿瘤细胞分泌的血管内皮细胞生长因子(VEGF)。即，利用直接参与血管内皮细胞生长因子(VEGF)和血管内皮细胞生长因子受体(VEGFR)的结合相互作用的血管内皮细胞生长因子受体1、2 (VEGFRU2)的主要区域制备而成的KH903，以从肿瘤细胞中分泌的血管内皮细胞生长因子(VEGF)代替血管内皮细胞生长因子受体(VEGFR)进行结合，通过阻断受体-配体反应来抑制新生血管形成的过程29，3°。初期制备的血管内皮细胞生长因子(VEGF)陷阱是作为与血管内皮细胞生长因子(VEGF)结合的主要部位的血管内皮细胞生长因子受体I (VEGFRl)的第二区域和血管内皮细胞生长因子受体2 (VEGFR2)的第三区域融合到人免疫球蛋白G (IgG)Fc部位的形态n。在本研究中，由于不仅与血管内皮细胞生长因子-A (VEGF-A)还可能与血管内皮细胞生长因子-B (VEGF-B)、血管内皮细胞生长因子-C (VEGF-C)以及胎盘生长因子(PGF，placentagrowth factor)进行结合，因此使用了与血管内皮细胞生长因子(VEGF)的结合能力比现有血管内皮细胞生长因子(VEGF)陷阱提高约2倍的KH903。KH903与包括血管内皮细胞生长因子-A (VEGF-A)在内的所有种类的血管内皮细胞生长因子(VEGF)家族表现出优秀的结合能力的原因是因为在现有的血管内皮细胞生长因子(VEGF)陷阱结构中追加了对维持血管内皮细胞生长因子(VEGF)和受体的强力结合进行参与的血管内皮细胞生长因子受体2(VEGFR2)的第四区域。并且，此区域不仅能使KH903稳定形成第三结构，还提高了形成二聚体形态的效率，使KH903具有半减期比现有血管内皮细胞生长因子(VEGF)陷阱更延长的优点29。为了观察具有这种优点的KH903的新生血管形成抑制效果，在El部位作为报道基因插入有β -半乳糖苷酶，在Ε3部位的基因消失的腺病毒的Ε3部位插入ΚΗ903，来制备了复制缺陷型腺病毒dEl-k35/KH903。对包括血管形成旺盛的A549和H460在内的多个肺癌细胞株用多种MOI进行感染后比较验证血管内皮细胞生长因子(VEGF)表达量的结果，可以确认在实验中所使用的所有细胞株中KH903抑制血管内皮细胞生长因子(VEGF)的表达的效果表现得非常强(图2)。这样观察因KH903，在肿瘤细胞中血管内皮细胞生长因子(VEGF)的表达得到有效抑制后，对所减少的血管内皮细胞生长因子(VEGF)的量对如实际血管内皮细胞的移动、增殖和血管形成及扩张等的新生血管形成的一连串过程产生怎样的影响，就此在离体(in vitro)和活体(ex vitro)状态下进行了观察。首先，使作为血管内皮细胞的人脐静脉血管内皮细胞(HUVEC)感染用于表达KH903的复制缺陷型病毒dEl-k35/KH903时，确认了因血管内皮细胞生长因子(VEGF)表达量的减少血管内皮细胞生存率也随之减少。接着，利用分别感染用于表达KH903的复制缺陷型病毒和对照组病毒的细胞以及未感染细胞的培养液进行了能够观察血管内皮细胞的移动能力的移动性分析。使用具有充分的成长因子的对照组病毒和未感染细胞的培养液时，可以观察到人脐静脉血管内皮细胞(HUVEC)的移动非常活跃，但是使用从处理了用于表达KH903的病毒的细胞中得到的培养液时，可以观察到因血管内皮细胞生长因子(VEGF)减 少而导致人脐静脉血管内皮细胞(HUVEC)的移动相当减少。通过管形成分析和大动脉芽生分析验证了血管形成能力和血管的芽生也被抑制。这种通过KH903的对新生血管形成的抑制可期待产生抗癌效果，为了验证搭载到选择性杀伤肿瘤的腺病毒后增强的抗肿瘤效果，制备了在本研究室开发的ElA的Rb结合部位变形、去除ElB部位的选择性杀伤肿瘤的腺病毒RdB插入KH903的RdB-KH903腺病毒，在H460异种移植模型上确认了其优秀的抗肿瘤效果。选择性杀伤肿瘤的腺病毒RdB-KH903不仅能抑制ElA基因表达引起的血管内皮细胞生长因子(VEGF)的表达，还因有效、持续的基因传达能同时诱导对KH903引起的血管内皮细胞生长因子(VEGF)的表达的抑制，比对照组RdB腺病毒显著提高了生物体内抗肿瘤效果。在观察肿瘤组织内血管分布的结果中也能再一次验证RdB/KH903的效果。在肿瘤组织内与磷酸盐缓冲溶液(PBS)组相比较可以确认处理选择性杀伤肿瘤的腺病毒时因血管的数量减少而仅用选择性杀伤肿瘤的腺病毒也能抑制新生血管形成。并且，因KH903证明了更加明确的抑制新生血管形成的效果，从而可知KH903有效地抑制了血管内皮细胞生长因子(VEGF)0从结论上讲，本研究中制备的表达KH903的选择性杀伤肿瘤的腺病毒RdB_KH903通过血管内皮细胞生长因子(VEGF)特异水溶性诱饵受体KH903能得到的对肿瘤内新生血管形成的阻断和同时诱导腺病毒的肿瘤特异性杀伤能力，可以判断将诱导更加提升的抗肿瘤效果。血管内皮细胞生长因子受体I (VEGFRl)和血管内皮细胞生长因子受体2(VEGFR2)的血管内皮细胞生长因子(VEGF)结合区域结合到人免疫球蛋白G (IgG) Fe部位而制备的KH903能有效地抑制肿瘤细胞分泌的血管内皮细胞生长因子(VEGF)。本研究中所使用的表达KH903的选择性杀伤肿瘤的腺病毒RdB-KH903因其肿瘤选择性腺病毒的复制引起的选择性杀伤肿瘤的能力及因ElA表达和KH903诱导的对血管内皮细胞生长因子(VEGF)的抑制，展现出得到提升的抗肿瘤效果，期待将有效地利用在癌的治疗。以上对本发明的特定部分进行了详细的记述。对于在本发明所属技术领域的普通技术人员来讲，这些具体技术仅仅是优选的实例，可以明确的是本发明的范围并不局限于此。因此，本发明的实质性范围将通过所附的权利要求及其等同物来定义。参考文献I. 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1.一种抑制血管新生的能力得到改善的重组腺病毒，其特征在于，包含 Ca)腺病毒的末端反向重复核苷酸序列；以及 (b)核苷酸序列，其对包含(i )血管内皮细胞生长因子受体-I的胞外域和(ii )血管内皮生长因子受体-2的胞外域的嵌合诱饵受体进行编码。
2.根据权利要求I所述的重组腺病毒，其特征在于， 上述嵌合诱馆受体包含 至少一个血管内皮细胞生长因子受体-I的胞外域，其选自由血管内皮细胞生长因子受体-I的第一胞外域、第二胞外域、第三胞外域、第四胞外域、第五胞外域、第六胞外域及第七胞外域组成的群； 至少一个血管内皮细胞生长因子受体-2的胞外域，其选自由血管内皮细胞生长因子受体-2的第一胞外域、第二胞外域、第三胞外域、第四胞外域、第五胞外域、第六胞外域及第七胞外域组成的群。
3.根据权利要求2所述的重组腺病毒，其特征在于， 上述嵌合诱馆受体包含 (i)至少一个血管内皮细胞生长因子受体-2的胞外域，其选自由血管内皮细胞生长因子受体-I的第一胞外域、血管内皮细胞生长因子受体-2的第二胞外域、第三胞外域、第四胞外域、第五胞外域、第六胞外域及第七胞外域组成的群； (ii)至少一个血管内皮细胞生长因子受体-2的胞外域，其选自由血管内皮细胞生长因子受体-I的第二胞外域、血管内皮细胞生长因子受体-2的第一胞外域、第三胞外域、第四胞外域、第五胞外域、第六胞外域及第七胞外域组成的群； (iii)至少一个血管内皮细胞生长因子受体-2的胞外域，其选自由血管内皮细胞生长因子受体-I的第三胞外域、血管内皮细胞生长因子受体-2的第一胞外域、第二胞外域、第四胞外域、第五胞外域、第六胞外域及第七胞外域组成的群； (iv)至少一个血管内皮细胞生长因子受体-2的胞外域，其选自由血管内皮细胞生长因子受体-I的第四胞外域、血管内皮细胞生长因子受体-2的第一胞外域、第二胞外域、第三胞外域、第五胞外域、第六胞外域及第七胞外域组成的群；或者， (V)至少一个血管内皮细胞生长因子受体-2的胞外域，其选自由血管内皮细胞生长因子受体-I的第五胞外域、血管内皮细胞生长因子受体-2的第一胞外域、第二胞外域、第三胞外域、第四胞外域、第六胞外域及第七胞外域组成的群。
4.根据权利要求2所述的重组腺病毒，其特征在于， 上述嵌合诱馆受体包含 (i)至少一个血管内皮细胞生长因子受体-I的胞外域，其选自由血管内皮细胞生长因子受体-2的第一胞外域、血管内皮细胞生长因子受体-I的第二胞外域、第三胞外域、第四胞外域、第五胞外域、第六胞外域及第七胞外域组成的群； (ii)至少一个血管内皮细胞生长因子受体-I的胞外域，其选自由血管内皮细胞生长因子受体-2的第二胞外域、血管内皮细胞生长因子受体-I的第一胞外域、第三胞外域、第四胞外域、第五胞外域、第六胞外域及第七胞外域组成的群； (iii)至少一个血管内皮细胞生长因子受体-I的胞外域，其选自由血管内皮细胞生长因子受体-2的第三胞外域、血管内皮细胞生长因子受体-I的第一胞外域、第二胞外域、第四胞外域、第五胞外域、第六胞外域及第七胞外域组成的群； (iv)至少一个血管内皮细胞生长因子受体-I的胞外域，其选自由血管内皮细胞生长因子受体-2的第四胞外域、血管内皮细胞生长因子受体-I的第一胞外域、第二胞外域、第三胞外域、第五胞外域、第六胞外域及第七胞外域组成的群；或者， (v)至少一个血管内皮细胞生长因子受体-I的胞外域，其选自由血管内皮细胞生长因子受体-2的第五胞外域、血管内皮细胞生长因子受体-I的第一胞外域、第二胞外域、第三胞外域、第四胞外域、第六胞外域及第七胞外域组成的群。
5.根据权利要求3所述的重组腺病毒，其特征在于，上述嵌合诱饵受体包含2-4个胞外域。
6.根据权利要求4所述的重组腺病毒，其特征在于，上述嵌合诱饵受体包含2-4胞外域。
7.根据权利要求5所述的重组腺病毒，其特征在于， 上述嵌合诱馆受体包含 (i)血管内皮细胞生长因子受体-2的第一胞外域、血管内皮细胞生长因子受体-I的第二胞外域及血管内皮细胞生长因子受体-2的第三胞外域； (ii)血管内皮细胞生长因子受体-I的第二胞外域、血管内皮细胞生长因子受体-2的第三胞外域及血管内皮细胞生长因子受体-2的第四胞外域；或者， (iii)血管内皮细胞生长因子受体-I的第二胞外域、血管内皮细胞生长因子受体-2的第三胞外域、血管内皮细胞生长因子受体-2的第四胞外域及血管内皮细胞生长因子受体-2的第五胞外域。
8.根据权利要求6所述的重组腺病毒，其特征在于， 上述嵌合诱馆受体包含 (i)血管内皮细胞生长因子受体-I的第二胞外域、血管内皮细胞生长因子受体-2的第三胞外域及血管内皮细胞生长因子受体-I的第四胞外域；或者， (ii)血管内皮细胞生长因子受体-I的第二胞外域、血管内皮细胞生长因子受体-2的第三胞外域、血管内皮细胞生长因子受体-I的第四胞外域及血管内皮细胞生长因子受体-I的第五胞外域。
9.根据权利要求I所述的重组腺病毒，其特征在于，上述嵌合诱饵受体融合有免疫球蛋白的Fe区域。
10.根据权利要求I所述的重组腺病毒，其特征在于，上述重组腺病毒缺失E3基因区域，编码上述嵌合诱饵受体的核苷酸序列插入在上述E3基因区域。
11.根据权利要求I所述的重组腺病毒，其特征在于，上述重组腺病毒带有惰性ElB19基因、惰性ElB 55基因或惰性ElB 19/E1B 55基因。
12.根据权利要求I所述的重组腺病毒，其特征在于，上述重组腺病毒包含活性ElA基因。
13.根据权利要求I所述的重组腺病毒，其特征在于，上述重组腺病毒具有在对位于ElA基因序列的Rb结合部位进行编码的核苷酸序列中，第45个谷氨酸残基置换为甘氨酸的变异及第121-127个氨基酸序列全部置换为甘氨酸的变异。
14.一种抗血管新生组合物，其特征在于，包含(a)上述权利要求I至13中的任一项的重组腺病毒的治疗学有效量；以及 (b)药剂学上许可的载体。
15.根据权利要求14所述的组合物，其特征在于，上述组合物是用于预防或治疗癌症、糖尿病性视网膜病变、早产儿视网膜病变、角膜移植排斥反应、新生血管性青光眼、红皮病、增殖性视网膜病变、牛皮癣、血友病性关节炎、动脉粥样硬化血小板内的毛细血管增殖、瘢痕疙瘩、伤口肉芽、血管粘连、类风湿性关节炎、骨关节炎、自身免疫性疾病、克罗恩氏病、再狭窄症、动脉粥样硬化、肠管粘连、猫抓病、溃疡、肝硬化、肾小球性肾炎、糖尿病性肾病、恶性肾硬化、血栓性微血管病、器官移植排斥反应、肾小球疾病、糖尿病、炎症或者神经退行性疾病的组合物。
16.一种因血管新生过多引起的疾病的预防或治疗方法，其特征在于，包括将抗血管新生组合物给需要该组合物的对象投用的步骤， 上述抗血管新生组合物包含 Ca)上述权利要求I至13中的任一项的重组腺病毒的治疗学有效量；以及， (b)药剂学上许可的载体。
17.根据权利要求16所述的因血管新生过多引起的疾病的预防或治疗方法，其特征在于， 上述因血管新生过多引起的疾病为癌症、糖尿病性视网膜病变、早产儿视网膜病变、角膜移植排斥反应、新生血管性青光眼、红皮病、增殖性视网膜病变、牛皮癣、血友病性关节炎、动脉粥样硬化血小板内的毛细血管增殖、瘢痕疙瘩、伤口肉芽、血管粘连、类风湿性关节炎、骨关节炎、自身免疫性疾病、克罗恩氏病、再狭窄症、动脉粥样硬化、肠管粘连、猫抓病、溃疡、肝硬化、肾小球性肾炎、糖尿病性肾病、恶性肾硬化、血栓性微血管病、器官移植排斥反应、肾小球疾病、糖尿病、炎症或者神经退行性疾病。
全文摘要
本发明涉及一种抑制血管新生的能力得到改善的重组腺病毒及将其包含在内的在药剂学上用于抑制血管新生的组合物，该重组腺病毒包含(a)腺病毒的末端反向重复(ITR，inverted terminal repeat)核苷酸序列；以及(b)核苷酸序列，其对包含(i)血管内皮细胞生长因子受体-1(Vascular Endothelial Growth Factor Receptor 1)的胞外域和(ii)血管内皮细胞生长因子受体-2(Vascular Endothelial Growth Factor Receptor 2)的胞外域的嵌合诱饵受体(chimeric decoy receptor)进行编码。表达嵌合诱饵受体的本发明的重组腺病毒，能非常有效地抑制血管新生，可被利用为多种血管新生有关疾病的基因治疗剂。尤其，本发明的重组腺病毒具有优秀的溶瘤活性。
文档编号C12N15/33GK102712934SQ201080059905
公开日2012年10月3日 申请日期2010年11月9日 优先权日2009年12月31日
发明者尹彩钰 申请人:汉阳大学校产学协力团