治疗性核酸酶组合物和方法

专利名称：治疗性核酸酶组合物和方法
治疗性核酸酶组合物和方法相关申请的交叉引用本申请要求2009年11月2日提交的第61/257，458号美国临时专利申请和2010年8月4日提交的美国临时专利申请第61/370，752号的优先权，其全部内容通过引用整体并入本申请。有关联邦政府赞助研究的声明本发明在美国国立卫生研究院(基金号AI44257、NS065933和AR048796)、红斑狼疮研究联盟和华盛顿州生命科学发现基金(2087750)的资助下进行。政府享有本发明的某些权益。序列表參考
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背景技术：
在死亡和濒死细胞中，(核糖)核蛋白的过度释放可能通过两种机制导致狼疮病理学(i)染色质/抗-染色质复合物沉积或在原位形成，导致肾炎并ー步引起肾功能丧失；和(ii)通过Toll样受体(TLR) 7、8和9以及不依赖于TLR的途径核蛋白活化先天免疫。核蛋白的释放可以作为系统性红斑狼疮自身抗体的有效抗原，通过抗原受体与TLRs的互相接触，使得B细胞扩增和DC细胞激活。需要在所需主体中除去刺激性抗原和/或使免疫刺激、免疫放大和免疫复合物介导疾病减轻的方法。发明概述本发明公开了ー种杂交核酸酶分子，所述杂交核酸酶分子包括第一核酸酶结构域和Fe结构域，其中第一核酸酶结构域与Fe结构域有效偶联。在某些实施方式中，杂交核酸酶分子进ー步包括第一接头结构域，且第一核酸酶结构域通过第一接头结构域与Fe结构域有效地偶联。在某些实施方式中，杂交核酸酶分子是多肽，其中第一核酸酶结构域的氨基酸序列包含人野生型RNase氨基酸序列，其中第一接头结构域是(Gly4Ser)n，其中n为0、1、2、
3、4或5，其中Fe结构域的氨基酸序列包含人野生型IgGlFc结构域的氨基酸序列，且其中第一接头结构域与第一核酸酶结构域的C-末端和Fe结构域的N-末端连接。在某些实施方式中，杂交核酸酶分子是包含表2所示序列的多肽，或由表2中所示的序列组成的多肽。在某些实施方式中，杂交核酸酶分子是包含SEQ ID NO :149的多肽。在某些实施方式中，杂交核酸酶分子是包含SEQ ID NO :145的多肽。在某些实施方式中，杂交核酸酶分子是包含SEQ ID NO :161的多肽。在某些实施方式中，杂交核酸酶分子是包含SEQ ID NO :162的多肽。在某些实施方式中，杂交核酸酶分子是包含SEQ ID NO :163的多肽。在某些实施方式中，杂交核酸酶分子包含与野生型人IgGl偶联的野生型人DNase I。在某些实施方式中，杂交核酸酶分子包含与野生型人IgGlFc结构域连接的人DNaselG105RA114F,所述连接通过(gly4ser)n接头结构域，其中n = 0、1、2、3、4或5。在某些实施方式中，杂交核酸酶分子包含与野生型人IgGl连接的野生型人RNasel，所述野生型人IgGl与野生型人DNasel连接。在某些实施方式中，杂交核酸酶分子包含与野生型人IgGl连接的野生型人RNasel，所述野生型人IgGl与人DNaselG105R A114F连接。在某些实施方式中，杂交核酸酶分子是多肽，其中第一核酸酶结构域的氨基酸序列包含RNase氨基酸序列，其中第一接头结构域的长度在5至32个氨基酸之间，其中Fe结构域的氨基酸序列包含人Fe结构域氨基酸序列，且其中第一接头结构域与第一核酸酶结构域的C-末端和Fe结构域的N-末端偶联。在某些实施方式中，接头结构域包括(gly4ser)5和限制性位点Bglll、AgeI和Xhol。在某些实施方式中，杂交核酸酶分子是多肽，其中第一核酸酶结构域的氨基酸序列包括人RNase氨基酸序列，其中第一接头结构域是长度为5至32个氨基酸的NLG肽，其中Fe结构域的氨基酸序列包含人野生型Fe结构域氨基酸序列，且其中第一接头结构域与第一核酸酶结构域的C-末端和Fe结构域的N-末端偶联。在某些实施方式中，Fe结构域与人细胞上的Fe受体结合。在某些实施方式中，分子的血清半衰期显著长于单独的第一核酸酶结构域的血清半衰期。在某些实施方式中，分子的第一核酸酶结构域的核酸酶活性与单独的核酸酶结构域相同或更高。在某些实施方式 中，小鼠狼疮模型检测的结果显示给予小鼠分子可以增加小鼠的存活率。在某些实施方式中，杂交核酸酶分子包括前导序列。在某些实施方式中，前导序列是来自人K轻链家族的人VK3LP肽，且前导序列与第一核酸酶结构域的N-末端偶联。在某些实施方式中，分子是多肽。在某些实施方式中，分子是多核苷酸。在某些实施方式中，第一核酸酶结构域包含RNase。在某些实施方式中，RNase是人RNase。在某些实施方式中，RNase是多肽，所述多肽包含与表2中所示的RNase氨基酸序列至少90%相似的氨基酸序列。在某些实施方式中，RNase是人RNase A家族成员。在某些实施方式中，RNase是人胰RNasel。在某些实施方式中，第一核酸酶结构域包含DNase。在某些实施方式中，DNase是人DNase。在某些实施方式中，DNase是多肽，所述多肽包含与表2中所示的DNase氨基酸序列至少90%相似的氨基酸序列。在某些实施方式中，DNase选自人DNase I、TREXl和人DNase 1L3。在某些实施方式中，Fe结构域是人Fe结构域。在某些实施方式中，Fe结构域是野生型Fe结构域。在某些实施方式中，Fe结构域是突变Fe结构域。在某些实施方式中，Fe结构域是人IgGlFc结构域。在某些实施方式中，Fe结构域是多肽，所述多肽包含与表2中所示的Fe结构域氨基酸序列至少90%相似的氨基酸序列。在某些实施方式中，第一接头结构域的长度为约I至约50个氨基酸。在某些实施方式中，第一接头结构域的长度为约5至约31个氨基酸。在某些实施方式中，第一接头结构域的长度为约15至约25个氨基酸。在某些实施方式中，第一接头结构域的长度为约20至约32个氨基酸。在某些实施方式中，第一接头结构域的长度为约20个氨基酸。在某些实施方式中，第一接头结构域的长度为约25个氨基酸。在某些实施方式中，第一接头结构域的长度为约18个氨基酸。在某些实施方式中，第一接头结构域包含gly/ser肽。在某些实施方式中，gly/ser肽为通式(Gly4Ser)n所示，其中n为选自1、2、3、4、5、6、7、8、9和10的正整数。在某些实施方式中，gly/ser肽包括(Gly4Ser) 3。在某些实施方式中，gly/set肽包括(Gly4Ser) 4。在某些实施方式中，gly/ser肽包括(Gly4Ser) 5。在某些实施方式中，第一接头结构域包括至少ー个限制性位点。在某些实施方式中，第一接头结构域包括约12个或更多个核苷酸，所述核苷酸包含至少ー个限制性位点。在某些实施方式中，第一接头结构域包括两个或多个限制性位点。在某些实施方式中，第一接头结构域包括多个限制性位点。在某些实施方式中，第接头结构域包括NLG肽。在某些实施方式中，第一接头结构域包括N-连接糖基化位点。在某些实施方式中，第一核酸酶结构域与Fe结构域的N-末端连接。在某些实施方式中，第一核酸酶结构域与Fe结构域的C-末端连接。在某些实施方式中，杂交核酸酶分子进ー步包括第二核酸酶结构域。在某些实施方式中，第一和第二核酸酶结构域是不同的核酸酶结构域。在某些实施方式中，第一和第二核酸酶结构域是相同的核酸酶结构域。在某些实施方式中，第二核酸酶结构域与Fe结构域的C-末端连接。在某些实施方式中，第二核酸酶结构域与Fe结构域的N-末端连接。在某 些实施方式中，第二核酸酶结构域与第核酸酶结构域的C-末端连接。在某些实施方式中，第二核酸酶结构域与第一核酸酶结构域的N-末端连接。本发明还公开了包含第一多肽和第二多肽的ニ聚体多肽，其中第一多肽包含第一核酸酶结构域和Fe结构域，其中第一核酸酶结构域与Fe结构域有效偶联。在某些实施方式中，第二多肽是包含第二核酸酶结构域的第二杂交核酸酶和第二 Fe结构域，其中第二核酸酶结构域与第二 Fe结构域有效偶联。本发明还公开了药物组合物，所述药物组合物包含如本发明所述的至少ー个杂交核酸酶分子和/或至少ー个ニ聚体多肽，以及药学上可接受的赋形剂。本发明还公开了编码本发明所公开的杂交核酸酶分子的核酸分子。本发明还公开了包含本发明所公开的核酸分子的重组表达载体。本发明还公开了用本发明所公开的重组表达载体转染的宿主细胞。本发明还公开了ー种制备本发明所公开的杂交核酸酶的方法，所述方法包括提供包含编码杂交核酸酶分子核酸序列的宿主细胞；以及在表达杂交核酸酶分子的条件下维持宿主细胞。本发明还公开了ー种治疗或预防与免疫应答异常相关状况的方法，所述方法包括给予所需患者有效量的本发明所公开的分离杂交核酸酶分子。在某些实施方式中，所述状况是自身免疫病。在某些实施方式中，自身免疫病选自胰岛素依赖性糖尿病、多发性硬化症、实验性自身免疫性脑脊髄炎、类风湿性关节炎、实验性自身免疫性关节炎、重症肌无力、甲状腺炎、实验性葡萄膜炎、桥本氏甲状腺炎、原发性粘液性水肿、甲状腺毒症、恶性贫血、自身免疫性萎縮性胃炎、爱迪生氏病、过早绝经、男性不育、青少年糖尿病、肺出血肾炎综合征、寻常型天疱疮、类天疱疮、交感性眼炎、晶状体炎性葡萄膜炎、自身免疫性溶血性贫血、特发性白细胞減少症、原发性胆汁性肝硬化、慢性活动性肝炎ffis-ve、隐源性肝硬化、溃疡性结肠炎、舍格伦综合征、硬皮病、韦格纳肉芽肿、多肌炎、皮肌炎、盘状红斑狼疮、系统性红斑狼疮(SLE)和结缔组织病。在某些实施方式中，自身免疫病是系统性红斑狼疮(SLE)。附图的简要说明通过下面的描述及相应附图，使本发明的这些和其它特征、方面和益处更加便于理解，其中
图I显示了在P238S、K322S和P331S位点发生突变的mRNase-mIgG2a的核苷酸和氨基酸序列。该序列在序列表中表示为huVK3LP+mribl+mIgG2A-C_2S(SEQ ID NO :114)。图2显示了本发明所述某些实施方式的杂交核酸酶分子的示意图。
图3显示了在还原和非还原条件下mRNase-mIgG2a_c的SDS-PAGE凝胶分析结果。图4显示了 mRNasemIg2a_c的凝胶免疫沉淀分析结果。图5显示了在RNase-Ig杂交核酸酶分子注射前后小鼠410中抗-RNA抗体ELISA滴度。该数据显示RNase-Ig的注射导致抗-RNA抗体的滴度降低并持续3周以上。图6显示加入RNase-Ig使人外周血单核细胞中干扰素-a的诱导停止，所述细胞受系统性红斑狼疮患者(Jll)的血清与核酸提取物(NE)形成的免疫复合物刺激。注射RNase-Ig后抗-RNA抗体的滴度降低。图7显示了加入RNase-Ig使人外周血单核细胞中干扰素-a的诱导停止，所述细胞受系统性红斑狼疮患者(Jll)的血清与核酸提取物形成的免疫复合物刺激。图8显示了两只RNase转基因(Tg)小鼠对比正常B6小鼠的单相酶扩散(SRED)分析結果。图9显示了在Tg和双Tg(DTg)小鼠中利用ELISA检测得到的RNaseA浓度。各点表示在各只小鼠中检测得到的浓度。

图10显示了 TLR7. ITg对比TLR7. IxRNaseA DTg小鼠的存活情况。图11显示了在Tg对比DTg小鼠的脾脏中IRG的定量PCR結果。图12显示了在创建的不同实施方式中杂交核酸酶分子的示例结构。图 13 显示了使用 RNase Alert SubstrateTM 检测的 hRNasel-G88D-hIgGlSCCH_P238S-K322S-P331S杂交核酸酶分子的酶动力学。图14显示了 hRNasel-WT-hlgGl-WT与人单核细胞系U937和TNPl的结合。在这两幅图中左侧的峰均为对照，在这两幅图中右侧的峰均为hRNase I_WT_hIgGI-WT。图15显示了 hRNase 1-WT-hIgGl-WT对人IVIg与U937和THP-1细胞的阻断活性。图16显不了 Trexl-(g4s)n_mIgG替代形式的DNA酶切检测结果。图17 显示了来自 C0S-7 瞬时转染的 trexl-(Gly4S)4_Ig 和 trexl-(Gly4S)5_Ig培养基上清液Western印迹检测結果。图18显示了命名为2A3、3A5和8H8的不同稳定转染CHO DG44克隆的DNA酶切模式，所述克隆表达DNAselL3-mIgG2a-C杂交核酸酶分子。图19显示了加入或不加入肝素作为酶抑制剂,孵育不同时间后DNaselL3_Ig杂交核酸酶分子的量降低的DNA酶切模式。图20显示了来自瞬时转染COS细胞的免疫沉淀融合蛋白的Western印迹,所述COS细胞表达不同实施方式hRNasel-Ig-hDNasel或hDNasel-Ig杂交核酸酶分子。图21显示了评估COS上清液中RNase活性的SRED分析结果，所述COS上清液中表达不同实施方式hRNasel-Ig-hDNasel或hDNasel-Ig杂交核酸酶分子。图22的复合图显示了在转染细胞的COS上清液中进行的DNase核酸酶活性检测結果。此图中编号的描述(例如，090210-8和091210-8)与图21相同。图23显示了使用Rnase Alert底物(Ambion/IDT)进行的酶动力学检测和使用SpectramaxM2酶标仪进行的突光定量检测结果。使用Softmax Pro软件(MolecularDevices)进行数据分析。测定不同底物浓度时的反应速率，数据以Lineweaver-Burk图表示。经体积校正的表观Km为280nM。 图24显示了随转基因小鼠年龄增长的连续时间间隔内，小鼠血清中的抗-RNA抗体水平，所述小鼠血清来自H564和H564-RNaseA双转基 因小鼠。发明详述除非另有说明，对权利要求书和说明书中术语的定义如下文所示。如果与原临时专利申请中的术语发生直接冲突，则以本申请说明书中使用的术语为准。“氨基酸”指天然存在的和合成的氨基酸，以及与天然存在的氨基酸具有类似功能的氨基酸类似物和氨基酸模拟物。天然存在的氨基酸指经遗传编码的氨基酸以及随后经修饰的氨基酸，例如羟脯氨酸、Y-羧基谷氨酸和0-磷酸丝氨酸。氨基酸类似物指与天然存在的氨基酸具有相同的基本化学结构的化合物，即与氢结合的a碳、羧基、氨基和R基团连接，例如高丝氨酸、正亮氨酸、甲硫氨酸亚砜、甲硫氨酸甲基锍。此类类似物具有修饰的R基团(例如，正亮氨酸)或修饰的肽骨架，但是保留与天然存在的氨基酸相同的基本化学结构。氨基酸模拟物指结构与氨基酸的一般化学结构不同，但是功能与天然存在的氨基酸类似的化合物。本发明中氨基酸既可以以通常已知的三个字母的形式表示，也可以以IUPAC-IUB生物化学命名委员会推荐的ー个字母的形式表示。同样地，核苷酸可以以常规的单一字母代码表示。“氨基酸取代”指预设氨基酸序列(初始多肽的氨基酸序列)中的至少ー个存在的氨基酸残基被另ー个不同的“替代”氨基酸残基所替代。“氨基酸插入”指将至少一个额外的氨基酸加入预设的氨基酸序列。插入通常由一个或两个氨基酸残基的插入组成，但可以进行更长的“肽插入”，例如插入约三个至约五个或甚至约十个、十五个或二十个氨基酸残基。插入的残基可以是上文所述的天然存在的或非天然存在的残基。“氨基酸删除”指从预设的氨基酸序列中除去至少ー个氨基酸残基。“多肽”、“肽”、和“蛋白”在本发明中可以互换使用是指氨基酸残基的聚合物。这些术语用于描述天然存在的氨基酸聚合物和非天然存在的氨基酸聚合物，也可以描述这样的氨基酸聚合物，其中一个或多个氨基酸残基是与天然存在的氨基酸相对应的人工化学模拟物。“核酸”指脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸及其单链或双链形式的聚合物。除特别限定，该术语包括含有天然核苷酸已知类似物的核酸，所述核酸与标准核酸具有类似的结合性质，且通过与天然存在的核苷酸类似的方式代谢。除另有说明，特定核酸序列还隐含了其适当的修饰变体(例如，简并密码子取代)和互补序列以及其明确表示的序列。特别地，通过将序列中的一个或多个选定(或全部)密码子的第三位用混合碱基和/或脱氧肌苷残基取代(Batzer et al. , Nucleic Acid Res. 19 :5081,1991 ；Ohtsuka et al. , J. Biol.Chem. 260 :2605-2608,1985 ;和Cassol et al.，1992 ；Rossolini et al.，Mol. Cell. Probes8 :91-98,1994)，可以在获得的序列中实现简并密码子取代。对于精氨酸和亮氨酸，在第二个碱基的修饰也可以是保守的。术语核酸可以与基因、cDNA和基因编码的mRNA互換使用。本发明的多核苷酸可以由任意多聚核糖核苷酸或多聚脱氧核糖核苷酸组成，其可以是未经修饰的RNA或DNA，或修饰的RNA或DNA。例如，多核苷酸可以由下列分子组成单链和双链DNA、单链和双链区域混合物DNA、单链和双链RNA、以及单链和双链区域混合物RNA,以及杂交分子，所述杂交分子包含单链DNA和RNA，或更典型地双链DNA和RNA，或单链和双链区混合的DNA和RNA。此外，多核苷酸可以由三链区域组成，其包含RNA、或DNA、或RNA和DNA二者都有。多核苷酸还可以包含ー个或多个修饰的碱基,或出于稳定或其它原因而修饰的DNA或RNA骨架。“修饰的”碱基包括，例如，三苯基碱基和罕见碱基如肌苷。可以对DNA和RNA进行多种修饰；因此，“多核苷酸”包括经化学、酶或代谢而修饰的形式。在本申请中，术语“杂交核酸酶分子”指包含至少ー个核酸酶结构域和至少ー个Fe结构域的多核苷酸或多肽。杂交核酸酶分子也指融合蛋白和融合基因。例如，在某个实施方式中，杂交核酸酶分子可以是多肽，其包含与核酸酶结构域，如DNase和/或RNase，相连接的至少ー个Fe结构域。作为另ー个例子，杂交核酸酶分子可以包含RNase核酸酶结构域、接头结构域和Fe结构域。SEQ ID NO :161是杂交核酸酶分子的ー个例子。其它例子将在下文中更详细的描述。在某个实施方式中，本发明的杂交核酸酶分子可以包括附加的修饰。在另ー个实施方式中，可以修饰杂交核酸酶分子来加入功能性基团(例如，PEG、药物或标记)。
在某些方面，本发明的杂交核酸酶分子可以引入一个或多个“接头结构域”，如多肽接头。本申请使用的术语“接头结构域”指在线性序列中连接两个或多个结构域的序列。本申请使用的术语“多肽接头”指在多肽链的线性氨基酸序列中连接两个或多个结构域的肽或多肽序列(例如，合成肽或多肽序列)。例如，多肽接头可以将核酸酶结构域与Fe结构域连接。优选地，此类多肽接头可以为多肽分子提供柔韧性。在某些实施方式中，多肽接头用于连接(例如，基因融合)ー个或多个Fe结构域和/或ー个或多个核酸酶结构域。本发明的杂交核酸酶分子可以包含多于ー个的接头结构域或肽接头。本申请所使用的术语“gly-ser多肽接头”指由甘氨酸和丝氨酸残基组成的肽。示例性的gly/ser多肽接头包含氨基酸序列Ser (Gly4Ser)n。在某个实施方式中，n = I。在某个实施方式中，n = 2。在另ー个实施方式中，n = 3,即Ser (Gly4Ser) 3。在另ー个实施方式中，n = 4,即Ser (Gly4Ser)4。在另ー个实施方式中，n = 5。在又一个实施方式中，n=6。在另ー个实施方式中，n = 7。在又一个实施方式中，n = 8。在另ー个实施方式中，n = 9。在又一个实施方式中，n = 10。另ー个示例性gly/ser多肽接头包含氨基酸序列Ser(Gly4Ser)n。在某个实施方式中，n = I。在某个实施方式中，n = 2。在ー个优选实施方式中，n = 3。在另ー个实施方式中，n = 4。在另ー个实施方式中，n = 5。在又ー个实施方式中，n = 6。本申请使用的术语“连接的”、“融合的”、或“融合”可以互换使用。这些术语指两个以上元件或部分或结构域通过任意方式连接在一起，包括化学偶联或重组的方式。化学偶联的方法(例如，使用异双功能交联剂)是本领域已知的。本申请使用的术语“Fe区域”的定义为，由两条重链各自的Fe结构域(或Fe部分)形成的天然免疫球蛋白的一部分。本申请使用的术语“Fe结构域”指单个免疫球蛋白(Ig)重链的一部分。因此，也可以将Fe结构域称作“Ig”或“IgG”。在某些实施方式中，Fe结构域刚好起始于铰链区的本瓜蛋白酶裂解位点的上游，且终止于抗体的C-末端。相应地，完整的Fe结构域包含至少ー个铰链结构域、CH2结构域和CH3结构域。在某些实施方式中，Fe结构域包含以下区域中的至少ー个铰链(例如，上、中和/或下铰链区)结构域、CH2结构域、CH3结构域、CH4结构域，或者其变体、部分或片段。在其它实施方式中，Fe结构域包含完整的Fe结构域(即，铰链结构域、CH2结构域和CH3结构域)。在某个实施方式中，Fe结构域包含与CH3结构域(或其部分)融合的铰链结构域(或其部分)。在另ー个实施方式中，Fe结构域包含与CH3结构域(或其部分)融合的CH2结构域(或其部分)。在另ー个实施方式中，Fe结构域由CH3结构域或其部分組成。在另ー个实施方式中，Fe结构域由铰链结构域(或其部分)和CH3结构域(或其部分)组成。在另ー个实施方式中，Fe结构域由CH2结构域(或其部分)和CH3结构域组成。在另ー个实施方式中，Fe结构域由铰链结构域(或其部分)和CH2结构域(或其部分)组成。在某个实施方式中，Fe结构域缺少CH2结构域的至少一部分(例如，全部或部分CH2结构域)。在某个实施方式中，本发明的Fe结构域至少包含本领域已知的FcRn结合所需的那部分Fe分子。在另ー个实施方式中，本发明的Fe结构域至少包含本领域已知的Fe Y R结合所需的那部分Fe分子。在某个实施方式中，本发明的Fe结构域至少包含本领域已知的蛋白A结合所需的那部分Fe分子。在某个实施方式中，本发明的Fe结构 域至少包含本领域已知的蛋白G结合所需的那部分Fe分子。本发明中的Fe结构域通常指包含免疫球蛋白重链的全部或部分Fe结构域的多肽。即包括，但不限于，包含整个CH1、铰链、CH2和/或CH3结构域的多肽，以及仅包含例如铰链、CH2和/或CH3结构域的此类肽的片段。Fe结构域可以来自任意种属和/或任意亚型的免疫球蛋白，包括但不限于，人IgGl、IgG2、IgG3、IgG4、IgD、IgA、IgE或IgM抗体。Fe结构域包含天然Fe和Fe变体分子。对于Fe变体和天然Fe，术语Fe结构域包括単体或多聚体形式，无论是从完整的抗体上酶切得到还是通过其它方式产生。如本申请所述，本领域的普通技术人员知晓，对任意Fe结构域进行修饰后的氨基酸序列将不同于天然存在的免疫球蛋白分子的天然Fe结构域的氨基酸序列。在某些示例性实施方式中，Fe结构域保留了效应器功能(例如，FcyR结合)。本发明多肽的Fe结构域可以来自不同的免疫球蛋白分子。例如，多肽的Fe结构域可以包括来自IgGl分子的CH2和/或CH3结构域和来自IgG3分子的铰链区。在另ー个例子中，Fe结构域可以包括嵌合铰链区，所述嵌合铰链区部分来自IgGl分子以及部分来自IgG3分子。在另ー个例子中，Fe结构域可以包括嵌合铰链区，所述嵌合铰链区部分来自IgGl分子以及部分来自IgG4分子。“来自”指定多肽或蛋白的多肽或氨基酸序列是指多肽的来源。优选地，来自特定序列的多肽或氨基酸序列具有与所述序列或其部分基本上相同的氨基酸序列，其中所述部分由至少10-20个氨基酸组成，优选地至少20-30个氨基酸，更优选地至少30-50个氨基酸，或其他的能被本领域技术人员鉴定为在序列中具有该来源的部分。来自另ー个肽的多肽可以具有相对于初始多肽的一个或多个突变，例如一个或多个氨基酸残基被另ー个氨基酸残基所取代，或具有一个或多个氨基酸残基插入或删除。多肽可以包含非天然存在的氨基酸序列。此类变体必然与初始杂交核酸酶分子具有低于100%的序列相同性或相似性。在ー个优选实施方式中，变体的氨基酸序列例如，在覆盖变体分子全长的范围内，与初始多肽的氨基酸序列具有约75%至低于100%的氨基酸序列相同性或相似性，更优选地约80%至低于100%、更优选地约85%至低于100%、更优选地约 90%至低于 100% (例如，91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99% )以及最优选地约95%至低于100%。在某个实施方式中，在初始多肽序列与来自所述初始多肽的序列之间有ー个氨基酸的不同。与所述序列的相同性或相似性在本申请中定义为，在对序列进行比对并根据需要引入空位以使得序列的相同性达到最高百分比后，在參比序列中与起始氨基酸残基相同(即，相同残基)的氨基酸残基的百分比。在某个实施方式中，本发明的多肽包含、由、或基本上由选自表2的氨基酸序列及其功能上有活性的变体组成。在一个实施方式中，多肽包括与表2所示的氨基酸序列至少 80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%相同的氨基酸序列。在一个实施方式中，多肽包括与表2所示的连续的氨基酸序列至少 80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%相同的连续的氨基酸序列。在ー个实施方式中，多肽包括具有表2所示的氨基酸序列的至少10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、200、300、400或500个(或这些数字之间的任意整数)连续氨基酸的氨基酸序列。 在一个实施方式中，本发明的多肽由核苷酸序列编码。本发明的核苷酸序列可以用于多种用途，包括克隆、基因治疗、蛋白表达和纯化、引入突变、对所需宿主进行DNA免疫、生成抗体用于例如被动免疫、PCR、生成引物和探针、siRNA的设计和生成(參见，例如Dharmacon siDesign网站)，等等。在一个实施方式中，本发明的核苷酸序列包含、由或基本上由选自表2的核苷酸序列组成。在一个实施方式中，核苷酸序列包括与表2所不的核苷酸序列至少 80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%相同的核苷酸序列。在一个实施方式中，核苷酸序列包括与表2所示的连续的核苷酸序列至少80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或 99%相同的连续的核苷酸序列。在一个实施方式中，核苷酸序列包括具有表2所不的核苷酸序列的至少10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、200、300、400或500个(或这些数字中的任意整数)连续核苷酸的核苷酸序列。本申请优选的杂交核酸酶分子包含来自人免疫球蛋白序列的序列(例如，至少ー个Fe结构域)。但是，序列可以包含来自其它哺乳动物种属的ー个或多个序列。例如，在所述序列中可以包括灵长类的Fe结构域或核酸酶结构域。或者，在多肽中可以存在一个或多个鼠源性的氨基酸。在某些实施方式中，本发明的多肽序列无免疫原性和/或具有降低的免疫原性。本领域的普通技术人员还知晓，可以改变本发明的杂交核酸酶分子，使其与天然存在的序列或其来自的天然序列相比，序列发生改变，但仍保留天然序列的所需活性。例如，可以进行核苷酸或氨基酸取代，使“非必需”氨基酸残基处发生保守取代或改变。可以在免疫球蛋白的核苷酸序列中引入一个或多个核苷酸的取代、加入或删除，使得在编码的蛋白中引入一个或多个核苷酸的取代、加入或删除，由此构建得到分离的核酸分子，其编码来自免疫球蛋白(例如，Fe结构域)的杂交核酸酶分子的非天然变体，可以通过标准技术引入突变，如位点直接突变和PCR介导的突变。本发明的肽杂交核酸酶分子可以在ー个或多个氨基酸残基处包含保守性氨基酸取代，例如在必需或非必需氨基酸残基处。“保守性氨基酸取代”指氨基酸残基被与之有相似侧链的氨基酸残基取代。本领域对具有相似侧链的氨基酸残基家族进行了定义，包括碱性侧链(例如，赖氨酸、精氨酸、组氨酸)，酸性侧链(例如，天冬氨酸、谷氨酸)，不带电的极性侧链(例如，甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸)，非极性侧链(例如，丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸)和芳香侧链(例如，酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)。因此，优选地，结合多肽的非必需氨基酸残基被来自相同侧链家族的其它氨基酸残基所替代。在另ー个实施方式中，一串氨基酸可以被结构上类似但序列和/或侧链家族成员的组成不同的ー串氨基酸替代。或者，在另ー个实施方式中，可以将突变随机引入全部或部分编码序列，如利用饱和突变，再将产生的变异体加入本发明的结合多肽中，并筛选其与所需靶点的结合能力。
术语“改善”指对疾病状态，例如自身免疫病状态(例如，系统性红斑狼疮)进行治疗后的任意有益的治疗结果，包括状态的预防、严重性减轻或进展延缓、消除、或治愈。术语“原位”指活细胞在活的有机体外的生长过程，例如，在组织培养物中生长。术语“体内”指发生在活的有机体内的过程。本申请中使用的术语“哺乳动物”或“主体”或“患者”包括人类和非人类，并且包括但不限于人类、非人灵长类、犬、猫、鼠、牛、马和猪。当术语“相同”百分率用于两个或多个核酸或多肽序列时，是指当对两个或多个序列或子序列，采用下文所述的序列比较算法之一(例如，本领域技术人员可采用的BLASTP和BLASTN或其它算法)或目測检测进行比较或比对，以实现最大一致性时，相同的核苷酸或氨基酸残基的特定百分率。根据其应用不同，“相同”百分率可以存在于被比较的序列区域，例如功能性机构域，或者存在于被比较的两个序列的全长。对于序列比较而言，一般地将一条序列作为对照序列与待测序列进行比较。当使用序列比较算法吋，将待测和对照序列输入计算机，如有必要，指定子序列坐标，并且指定序列算法程序參数。随后采用该序列比较算法根据指定的程序參数计算待测序列相对于对照序列的序列相同百分率。可以通过以下方法对序列进行最优比对以进行比较,例如Smith & Waterman,Adv. Appl. Math. 2 :482 (1981)的局部同源性算法、Needleman & ffunsch, J. Mol. Biol. 48 443(1970)的同源性比对算法、Pearson & Lipman, Proc. Nat ' I. Acad. Sci. USA 85:2444(1988)的相似性研究方法，可以使用这些算法的计算机执行形式(Wisconsin遗传学
Computer Group, 575Science Dr.,Madison, Wis.),或通过目测(通常參见上文所述的Ausubel et al.)。适于确定序列相同性和序列相似性百分率算法的ー个例子为BLAST算法，已在Altschul et al.，J. Mol. Biol. 215 :403-410(1990)中对其进行了描述。公众可在国家生物技术信息中心的网站获得进行BLAST分析的软件。术语“足量”指足以产生所需结果的量，例如足以调节细胞内蛋白聚集的量。术语“治疗有效量”是指有效改善疾病症状的量。当将预防认为是治疗时，治疗有效量可以是“预防有效量”。必须注意的是，除非文中明确表示为其它含义，否则在说明书和所附权利要求书中使用的単数形式的“ー个”、“ー个”和“这种”包括复数含义。
鉬合物杂交核酸_分子在某些实施方式中，本发明的组合物包括杂交核酸酶分子。在某些实施方式中，杂交核酸酶分子包括与Fe结构域有效连接的核酸酶结构域。在某些实施方式中，杂交核酸酶分子包括与Fe结构域连接的核酸酶结构域。在某些实施方式中，杂交核酸酶分子是核酸酶蛋白。在某些实施方式中，杂交核酸酶分子是核酸酶多核苷酸。在某些实施方式中，核酸酶结构域通过接头结构域与Fe结构域连接。在某些实施方式中，接头结构域是接头肽。在某些实施方式中，接头结构域是接头核苷酸。在某些实施方式中，杂交核酸酶分子包括前导分子，例如前导肽。在某些实施方式中，前导分子是位于 核酸酶结构域N-末端的前导肽。在某些实施方式中，杂交核酸酶分子将包括終止密码子。在某些实施方式中，终止密码子位于Fe结构域的C-末端。在某些实施方式中，杂交核酸酶分子进ー步包括第二核酸酶结构域。在某些实施方式中，第二核酸酶结构域通过第二接头结构域与Fe结构域连接。在某些实施方式中，第ニ接头结构域位于Fe结构域的C-末端。图12显示了杂交核酸酶分子的至少ー个实施方式。在某些实施方式中，杂交核酸酶分子包括表2所不的序列。在某些实施方式中，杂交核酸酶分子是与Fe结构域连接的RNase分子或DNase分子或多酶分子(例如，RNase和DNase 二者都有，或具有不同底物特异性的两个RNA或DNA核酸酶)，所述Fe结构域与细胞外免疫复合物特异性结合。在某些实施方式中，Fe结构域不能有效地与Fe Y受体结合。在ー个方面，杂交核酸酶分子不能有效地与Clq结合。在其它方面，杂交核酸酶分子包含来自IgGl的框内Fe结构域。在其它方面，杂交核酸酶分子进ー步包含在铰链、CH2、和/或CH3结构域的突变。在其它方面，突变是P238S、P331S或N297S，且可以在三个铰链半胱氨酸中包含ー个或多个的突变。在某些此类方面，在三个铰链半胱氨酸中的ー个或多个的突变可以是SCC或SSS。在其它方面，分子包含SCC铰链，但除此之外具有野生型的人IgGl Fe CH2和CH3结构域，且与Fe受体有效地结合，促进杂交核酸酶分子被摄取进入与之结合的细胞的内吞小泡。在其它方面，分子具有针对单链和/或双链RNA底物的活性。在某些方面，杂交核酸酶分子的活性可以在体外和/或体内检测。在某些方面，杂交核酸酶分子与细胞、恶性细胞或癌细胞结合，并且干扰所述细胞的生物活性。在其它方面，提供了多功能RNase分子，其连接于另ー个具有结合特异性的酶或抗体，如靶向于RNA的scFv，或与第一结构域具有相同或不同特异性的第二核酸酶结构域。在另一方面，提供了多功能的DNase分子，其连接于另ー个具有结合特异性的酶或抗体，如scFv，所述scFv靶向于DNA，或以与第一结构域相同或不同的特异性靶向于第二核酸酶结构域。在另一方面，杂交核酸酶分子适于在哺乳动物中预防或治疗疾病或状况，通过对有需要的哺乳动物给药治疗有效量的连接至Fe区域的杂交核酸酶分子，以预防或治疗疾病。在其它方面，疾病或状况是自身免疫病或癌症。在某些此类方面，自身免疫病是胰岛素依赖性糖尿病、多发性硬化症、实验性自身免疫性脑脊髄炎、类风湿性关节炎、实验性自身免疫性关节炎、重症肌无力、甲状腺炎、实验性葡萄膜炎、桥本氏甲状腺炎、原发性粘液性水肿、甲状腺毒症、恶性贫血、自身免疫性萎縮性胃炎、爱迪生氏病、过早绝经、男性不育、青少年糖尿病、肺出血肾炎综合征、寻常型天疱疮、类天疱疮、交感性眼炎、晶状体炎性葡萄膜炎、自身免疫性溶血性贫血、特发性白细胞減少症、原发性胆汁性肝硬化、慢性活动性肝炎Hbs-ve、隐源性肝硬化、溃疡性结肠炎、舍格伦综合征、硬皮病、韦格纳肉芽肿、多肌炎、皮肌炎、盘状红斑狼疮、系统性红斑狼疮或结缔组织病。在某些实施方式中，RNase杂交核酸酶分子的RNase酶活性靶点主要在细胞外，由例如抗-RNP自身抗体免疫复合物中的RNA和凋亡中的细胞表面表达的RNA组成。在某些实施方式中，RNase核酸酶分子在内吞小泡的酸性环境中有活性。在某些实施方式中，RNase杂交核酸酶分子包括野生型(wt)的Fe结构域,从而例如允许分子与FcR结合,并且通过免疫复合物利用的进入途径进入内吞小泡。在某些实施方式中，包括野生型Fe结构域的RNase杂交核酸酶分子被改造成在细胞外和内吞环境(此处可以表达TLR7)中均具有活性。在某些方面，这使得包含野生型Fe结构域的RNase核酸酶分子通过之前吞入的免疫复合物或病毒感染后活化TLR7的RNA来终止TLR7信号转导。在某些实施方式中，RNase杂交核酸酶分子的野生型RNase对RNase胞质抑制剂的抑制作用没有抗性。在某些实施方式中，RNase杂交核酸酶分子的野生型RNase在细胞的胞质中无活性。 在某些实施方式中，包含野生型Fe结构域的杂交核酸酶分子用于治疗自身免疫病，例如系统性红斑狼疮。在某些实施方式中，Fe结构域与Fe受体(FcR)的结合增加，例如通过糖基化的改变和/或氨基酸序列的变化。在某些实施方式中，杂交核酸酶分子具有ー个或多个Fe改变，使FcR结合增加。设想了构建杂交核酸酶分子与Fe结构域连接的替代方式。在某些实施方式中，可以改变结构域的方向以构建Ig-RNase分子或Ig-DNase分子或RNase-Ig分子或RNase-Ig分子，其仍能与FcR结合且具有活化的核酸酶结构域。在某些实施方式中，DNase杂交核酸酶分子包括野生型Fe结构域,所述结构域能够允许例如分子在与FcR结合后被胞吞。在某些实施方式中，DNase杂交核酸酶分子可作用于包含DNA的细胞外免疫复合物，其可以是可溶性形式或不可溶的复合物沉淀。在某些实施方式中，杂交核酸酶包括DNase和RNase。在某些实施方式中，这些杂交核酸酶分子可以改善系统性红斑狼疮的治疗，因为其可以例如消化包含RNA、DNA，或RNA和DNA组合的免疫复合物；并且当其进ー步包含野生型Fe结构域时，其在细胞外以及在TLR7和TLR9可以定位的内吞小泡中均具有活性。在某些实施方式中，包括(gly4ser)3、4或5变体的接头结构域以5个氨基酸为级数改变接头结构域的长度。在另ー个实施方式中，接头结构域的长度约18个氨基酸，且包括ー个N-连接糖基化位点，其在体内对蛋白酶裂解敏感。在某些实施方式中，N-连接糖基化位点可以保护杂交核酸酶分子的接头结构域不被裂解。在某些实施方式中，N-连接糖基化位点可以协助将独立的功能性结构域的折叠分隔开来，所述独立的功能性结构域被接头结构域分隔。在某些实施方式中，杂交核酸酶分子可以包括突变和/或野生型人IgGlFc结构域。在某些实施方式中，杂交核酸酶分子可以由COS瞬时和CHO稳定转染表达。在某些实施方式中，在杂交核酸酶分子中均保持了 CD80/86结合能力和RNase活性。在某些实施方式中，杂交核酸酶分子包括DNase 1L3-Ig_接头-RNase构建体。在某些实施方式中，杂交核酸酶分子包括DNasel-Ig-接头-RNase构建体或RNase-Ig-接头-DNase构建体。在某些实施方式中，杂交核酸酶分子的酶结构域和其它结构域之间的融合连接点是经优化的。在某些实施方式中，杂交核酸酶分子包括DNase-Ig杂交核酸酶分子和/或杂交DNase-RNase杂交核酸酶分子。在某些实施方式中，杂交核酸酶分子包括TREXl。在某些实施方式中，TREXl杂交核酸酶分子可以酶切染色质。在某些实施方式中，TREXl杂交核酸酶分子由细胞表达。在某些实施方式中，表达的杂交核酸酶分子包括鼠源性的TREX-I和鼠源性的(野生或突变)Fe结构域。在某些实施方式中，TREXl和IgG铰链之间的20-25个氨基酸(aa)的接头结构域为DNase活性所需。在某些实施方式中，带有15个氨基酸的接头结构域的杂交核酸酶分子无活性。在某些实施方式中，染色质酶切检测结果显示，使用20和25个氨基酸的接头结构域(加上2个或多个氨基酸以引入限制性位点)可以获得功能性活性。在某些实施方式中，可以从TREX-I的COOH末端除去约72个氨基酸的疏水性区域，然后再通过接头结构域与Fe结构域融合。在某些实施方式中，与对照和/或其它杂交核酸酶分子相比，具有20个氨基酸的接头结构域的杂交核酸酶分子显示出较高的表达水平。在某些实施方式中，使用 动态酶实验对杂交核酸酶分子的酶活性同对照进行定量比较。在某些实施方式中，可以选择用于TREXl酶截短的融合连接点进行进ー步优化，以改善杂交核酸酶分子的表达。在某些实施方式中，杂交核酸酶分子包括带有20和/或25个氨基酸接头结构域的人TREXl-接头-Ig Fe结构域杂交核酸酶分子。在某些实施方式中，接头结构域是(gly4ser)4或(gly4ser)5表达盒的变体,其连有ー个或多个限制性位点以引入到杂交核酸酶分子构建体中。在某些实施方式中，由于头部至尾部的ニ聚化对TREXl的酶活性有用；因此可以使用ー个柔性的、更长的接头结构域以促进适当的折叠。在某些实施方式中，杂交核酸酶分子是TREXl-串联杂交核酸酶分子。在某些实施方式中，另ー种促使TREXl从头部至尾部折叠的方法是，产生ー个TREXl-TREXl-Ig杂交的杂交核酸酶分子，其中加入两个串联的TREXl结构域，然后是一个接头结构域和ー个Ig Fe结构域。在某些实施方式中，TREXl表达盒头尾连接的定位方式可以修正为在免疫酶的各臂上头尾折叠的方式，并且在该分子的各臂上均引入了一个单ー的TREXl功能性结构域。在某些实施方式中，杂交核酸酶分子的每个免疫酶均具有两个功能性TREXl酶，其与ー个单一的IgG Fe结构域连接。在某些实施方式中，杂交核酸酶分子包括TREXl-接头I-Ig-接头2-RNase。在某些实施方式中，杂交核酸酶分子包括RNase-Ig-接头-TREXl。在某些实施方式中，当酶是反向构型时，对各个酶生成其氨基融合和羧基融合的表达盒，用于引入杂交核酸酶分子。在某些实施方式中，无论RNase在杂交核酸酶分子中处于什么位置，其均表现出相当的功能性活性。在某些实施方式中，可以设计替代的杂交核酸酶分子以检测是否存在特定构型，使改进杂交核酸酶分子成分的表达和/或功能。在某些实施方式中，杂交核酸酶分子包括1L3-Ig。在某些实施方式中，lL3DNase由鼠源性序列构建和表达。在某些实施方式中，酶是有活性的。在某些实施方式中，构建和表达鼠源性的lL3DNaSe-Ig-RNaSe杂交核酸酶。在某些实施方式中，分子包括人lL3_Ig、人lL3-Ig-RNase 和 / 或人 RNase_Ig-lL3。
在某些实施方式中，杂交核酸酶分子包括DNasel-Ig。在某些实施方式中，在DNasel-Ig杂交核酸酶分子中包括天然存在的变体等位基因A114F，所述A114F对肌动蛋白的敏感性降低。在某些实施方式中，将该突变引入杂交核酸酶分子以产生更加稳定的人DNasel衍生物。在某些实施方式中，制备包含20或25个氨基酸的接头结构域的DNasel-接头-Ig。在某些实施方式中，杂交核酸酶分子包括RNase-Ig-接头-DNasel，其中DNasel结构域位于Ig Fe结构域的COOH—侧。在某些实施方式中，制备加入DNasel的杂交核酸酶分子，所述分子包括DNasel_接头-I g-接头2-RNase和/或RNase-Ig-接头-DNasel。本发明的另一方面为利用一种或多种杂交核酸酶分子，采用基因治疗的方法治疗或预防状况、疾病和状态。基因治疗的方法涉及将杂交核酸酶分子的核酸(DNA、RNA和反义DNA或RNA)序列引入动物，以表达一种或多种本发明的多肽。该方法可以包括，引入ー种或多种与启动子和遗传元件有效连接的编码本发明杂交核酸酶分子多肽的多核苷酸，所述遗传元件为靶组织中表达多肽所必需。在基因治疗应用中，将杂交核酸酶分子基因引入细胞，以实现在体内合成治疗有效的基因产物。“基因治疗”包括全部两种常规的基因治疗，即一次治疗长期有效，以及给药基因治疗剂，其包括一次或多次给药治疗有效的DNA或mRNA。可以对寡核苷酸进行修饰以增强其摄取，例如使用不带电的基团取代带负电的磷酸ニ酯基团。Fe结构域在某些实施方式中，杂交核酸酶分子包括Fe结构域。可以从多种不同来源获得用于产生本发明杂交核酸酶分子的Fe结构域。在优选实施方式中，杂交核酸酶分子的Fe结构域来自人免疫球蛋白。但是，可以理解，Fe结构域可以来自其它哺乳动物种属的免疫球蛋白，包括例如，啮齿类(例如小鼠、大鼠、家兔、豚鼠)或非人灵长类(例如，黒猩猩、短尾猴)种属。而且，杂交核酸酶分子的Fe结构域或其部分可以来自于任意免疫球蛋白种类，包括IgM、IgG、IgD、IgA和IgE,以及任意免疫球蛋白亚型,包括IgGl、IgG2、IgG3和IgG4。在ー个优选实施方式中，使用人IgGl亚型。各种Fe结构域基因序列(例如，人恒定区序列)均可以通过公众易于取得的形式获得。恒定区结构域包含Fe结构域序列，可以选择具有特定效应器功能(或缺乏特定效应器功能)或带有特定修饰的恒定区结构域，以降低免疫原性。很多抗体和抗体编码基因的序列已被公开，使用本领域已知的技术可以从这些序列中选取合适的Fe结构域序列(例如，铰链、CH2和/或CH3序列，或其部分)。随后，可以对使用任意前述方法获得的遗传材料进行改造或合成，以获得本发明的多肽。本发明的范围将进ー步理解为包括恒定区DNA序列的等位基因、变体和突变。可以将Fe结构域序列克隆，例如采用聚合酶链式反应和引物，选择的所述引物可用于扩增目标结构域。为了克隆来自抗体的Fe结构域序列，可以从杂交瘤、脾脏或淋巴细胞中分离mRNA，将其逆转录为DNA，并且利用PCR扩增抗体基因。对PCR扩增方法的详细描述，參见美国专利号 4，683，195 ;4，683，202 ;4，800，159 ;4，965，188 ;以及例如"PCRProtocols A buide to Methods and Applications " Innis et al. eds. , AcademicPress, San Diego, Calif. (1990) ；Ho et al. 1989. Gene 77 :51 ；Horton et al. 1993.Methods EnzymoI. 217 :270。PCR的启动可以通过通用的恒定区引物,或基于公开发表的重链和轻链DNA和氨基酸序列的更为特异的引物。如上文所讨论的，PCR还可以用于分离编码抗体轻链和重链的DNA克隆。在此情况下，可以利用通用引物或更大的同源探针如小鼠恒定区探针来筛选文库。许多适于抗体基因扩增的引物集合是本领域所公知的(例如，基于纯化抗体的 N-末端序列的 5'引物(Benhar and Pastan. 1994. Protein Engineering 7 1509) ;cDNA末端的快速扩增(Ruberti,F. et al. 1994. J. TmmunoI. Methods 173 :33);抗体前导序列(Larrick et al. 1989Biochem. Biophys. Res. Commun. 160 :1250))。对抗体序列克隆的进一步描述，參见Newman et al.，美国专利号5，658，570，申请日1995年I月25日，其通过引用并入本申请。本发明的杂交核酸酶分子可以包含ー个或多个Fe结构域(例如，2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多Fe结构域)。在一个实施方式中，Fe结构域可以是不同类型。在一个实施方式中，杂交核酸酶分子中的至少ー个Fe结构域包含铰链结构域或其部分。在另ー个实施方式中，本发明的杂交核酸酶分子包含至少ー个Fe结构域，所述Fe结构域包括至少ー个CH2结构域或其部分。在另ー个实施方式中，本发明的杂交核酸酶分子包含至少个Fe结构域，所述Fe结构域包括至少ー个CH3结构域或其部分。在另ー个实施方式中，本发明的杂交核酸酶分子包含至少ー个Fe结构域,所述Fe结构域包括至少ー个CH4结构域或其部分。在另ー个实施方式中，本发明的杂交核酸酶分子包含至少ー个Fe结构域，所述Fe结构域包括至少一个铰链结构域或其部分和至少ー个CH2结构域或其部分(例如，在铰链-CH2方向)。在另ー个实施方式中，本发明的杂交核酸酶分子包含至少ー个Fe结构域，所述Fe结构域包括至少ー个CH2结构域或其部分和至少ー个CH3结构域或其部分(例如，在CH2-CH3方向)。在另ー个实施方式中，本发明的杂交核酸酶分子包含至少ー个Fe结构域，所述Fe结构域包括至少ー个铰链结构域或其部分、至少ー个CH2结构域或其部分以及至少ー个CH3结构域或其部分，例如按以下方向铰链-CH2-CH3、铰链-CH3-CH2或CH2-CH3-铰链。在某些实施方式中，杂交核酸酶分子包含至少ー个来自ー个或多个免疫球蛋白重链的完整Fe区域(例如，Fe结构域包括铰链、CH2和CH3结构域，但不需要其都来自相同的抗体)。在其它实施方式中，杂交核酸酶分子包含至少两个来自ー个或多个免疫球蛋白重链的完整Fe区域。在优选实施方式中，完整Fe结构域来自人IgG免疫球蛋白重链(例如，人IgGl)。在另ー个实施方式中，本发明的杂交核酸酶分子包含至少ー个Fe结构域，所述Fe结构域包括完整的CH3结构域。在另ー个实施方式中，本发明的杂交核酸酶分子包含至少ー个Fe结构域，所述Fe结构域包括完整的CH2结构域。在另ー个实施方式中，本发明的杂交核酸酶分子包括至少ー个Fe结构域,所述Fe结构域包括至少ー个CH3结构域、至少ー个铰链区域和ー个CH2结构域。在一个实施方式中，本发明的杂交核酸酶分子包含至少ー个Fe结构域，所述Fe结构域包括铰链和CH3结构域。在另ー个实施方式中，本发明的杂交核酸酶分子包含至少ー个Fe结构域，所述Fe结构域包括铰链、CH2和CH3结构域。在优选实施方式中，Fe结构域来自人IgG免疫球蛋白重链(例如，人IgGl)。组成本发明的杂交核酸酶分子Fe结构域的恒定区结构域或其部分可以来自不同免疫球蛋白分子。例如，本发明的多肽可以包含来自IgGl分子的CH2结构域或其部分和来自IgG3分子的CH3区域或其部分。在另ー个实施例中，杂交核酸酶分子可以包含Fe结构域，所述Fe结构域包括ー个铰链结构域，其部分来自IgGl分子和部分来自IgG3分子。如本申请所述，本领域的普通技术人员能够理解，可以对Fe结构域进行改变，使得其不同于天然存在的抗体分子中的氨基酸序列。在另ー个实施方式中，本发明的杂交核酸酶分子包含一个或多个截短的Fe结构域，但仍足以赋予Fe区域与Fe受体(FcR)结合的性质。因此，本发明杂交核酸酶分子的Fe结构域可以包含FcRn结合部分,或由FcRn结合部分组成。FcRn结合部分可以来自任意同种型的重链，包括IgGl、IgG2、IgG3和IgG4。在一个实施方式中，使用人同种型IgGl抗体的FcRn结合部分。在另ー个实施方式中，使用人同种型IgG4抗体的FcRn结合部分。在一个实施方式中，本发明的杂交核酸酶分子缺乏完整Fe区域的ー个或多个恒定区结构域，即其部分或全部被删除。在某些实施方式中，本发明的杂交核酸酶分子将缺乏整个CH2结构域(ACH2构建体)。本领域技术人员会理解，可以优选此类构建体，因为CH2结构域可以调控抗体的分解代谢速率。在某些实施方式中，本发明的杂交核酸酶分子包含删除了 CH2结构域的Fe区域，所述Fe结构域来自编码IgGl人恒定区结构域(參见，例如 W002/060955A2 和 W002/096948A2)的载体(例如，来自 IDEC Pharmaceuticals, SanDiego)。该示例性载体被改造为删除CH2结构域，并提供合成载体，所述合成载体表达结构 域删除的IgGl恒定区。值得注意的是，这些示例性构建体优选被改造为将结合的CH3结构域直接与各自Fe结构域的铰链区融合。在其它构建体中，可能需要在ー个或多个Fe结构域组分之间提供ー个肽间隔区。例如，肽间隔区可以位于铰链区和CH2结构域之间，和/或CH2和CH3结构域之间。例如，可以表达得到相容的构建体，其中CH2结构域被删除，并且将其余的CH3结构域(合成的或非合成的)与铰链区连接，所述铰链区带有1-20、1-10或1-5个氨基酸肽间隔区。引入此类肽间隔区可以，例如，确保恒定区结构域的调控元件保持游离且可接近，或确保铰链区仍保持柔韧性。优选地，与本发明相容的任意接头肽将具有相対的非免疫原性，且不会阻碍Fe的适当折叠。Fe氨基酸的改变在某些实施方式中，在本发明的杂交核酸酶分子中使用的Fe结构域被改变，例如通过氨基酸突变(例如，加入、删除或取代)。如本申请所使用，术语“Fe结构域变体”指与作为Fe结构域来源的野生型Fe相比，具有至少ー个氨基酸取代的Fe结构域。例如，变体中Fe结构域来自人IgGl抗体，与人IgGlFc区域相应位置的野生型氨基酸相比，变体包含至少ー个氨基酸突变(例如，取代)。Fe变体的氨基酸取代可以定位于Fe结构域内的某个位点，该位点的指代编号对应于该残基在抗体的Fe区域中被指定的编号。在个实施方式中，Fe变体包含位于铰链结构域或其部分的氨基酸位点的取代。在另ー个实施方式中，Fe变体包含位于CH2结构域或其部分的氨基酸位点的取代。在另ー个实施方式中，Fe变体包含位于CH3结构域或其部分的氨基酸位点的取代。在另ー个实施方式中，Fe变体包含位于CH4结构域或其部分的氨基酸位点的取代。在某些实施方式中，本发明的杂交核酸酶分子包含Fe变体，所述Fe变体包括ー个以上氨基酸取代。本发明的杂交核酸酶分子可以包含，例如2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多个氨基酸取代。优选地，各氨基酸取代之间在空间定位上间隔至少I个氨基酸位点或更多，例如，至少2、3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸位点或更多。更优选地，经改造的各氨基酸之间在空间定位上间隔至少5、10、15、20或25个氨基酸位点或更多。
在某些实施方式中，由于具有包含所述野生型Fe结构域的Fe结构域，Fe变体可改进至少一个效应器功能(例如，Fe结构域与Fe受体(例如，Fe YRI、Fc YRII或Fe Y RII I)或补体蛋白(例如，Clq)的结合能力提高，或触发抗体依赖的细胞介导的细胞毒作用(ADCC)、吞噬作用或补体依赖性细胞毒作用(CDCC))。在其它实施方式中，Fe变体提供经改造的半胱氨酸残基。本发明的杂交核酸酶分子可以引入本领域认可的Fe变体，所述Fe变体已知能够改进效应器功能和/或FcR结合。特别地，本发明的杂交核酸酶分子可以包括，例如，在一个或多个氨基酸位点的改变(例如，取代)，參见国际PCT公布号W088/07089A1、W096/14339A1、W098/05787AI、W098/23289A1、W099/51642A1、W099/58572A1、W000/09560A2、W000/32767A1、W000/42072A2、W002/44215A2、W002/060919A2、W003/074569A2、W004/016750A2, W004/029207A2, W004/035752A2, W004/063351A2,W004/074455A2, W004/099249A2, W005/040217A2, W004/044859, W005/070963A1,W005/077981A2、W005/092925A2, W005/123780A2、W006/019447AU W006/047350A2 和 W006/085967A2 ;美国专利
发明者J·A·莱德贝特, K·艾肯, M·海登-莱德贝特, 孙锡章 申请人:华盛顿大学