专利名称：使用还原剂的解毒的制作方法
技术领域：
本发明涉及用于降低发酵期间的浆料或水解产物的发酵抑制作用的方法。
背景技术：
基于正在減少的石油供应，由可再生资源生产商品的生物精炼厂提供了对炼油厂的替代，并且允许向改善的能源安全的发展。来自林业和农业的木质纤维素残留物作为原料是有吸引力的，因为它们是丰富的、相对便宜、并且不用于食品。木质纤维素主要由木质素和两种多糖(纤维素和半纤维素)组成。多糖可在基于生物催化剂(例如在エ业上重要的面包酵母(酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)))的エ艺(process)中水解为糖并转化为各种发酵产物如生物醇。纤维素的水解前典型地进行预处理，其中，半纤维素被降解，并使纤维素愈加易受水解纤维素酶的影响(accessible)。然而，该预处理过程典型地产生发酵抑制剂，例如酚类 化合物、脂族酸、以及呋喃醛，其对发酵エ艺的效率具有负面影响。此外，使エ艺用水再循环以获得成本有效且对环境无害的エ艺可为合乎期望的。这样的エ艺循环可导致抑制剂的累积，其将促成发酵能力差的问题。
发明内容
提出了若干种方法以解决与抑制剂有关的问题。这些方法包括预处理条件的选择、发酵程序的设计、菌株筛选、菌株适应、其后有筛选和基因工程的突变。但是，操控预处理条件以减少抑制剂的形成或者选择エ艺设计以避免抑制剂问题，能够导致降低的糖产率、差的糖转化率、或差的こ醇产率和生产率。为了成本有效地生产大批量/低附加值的产品(例如燃料こ醇)，高的糖和こ醇产率和高生产率是必需的。水解产物的解毒(例如通过加入氢氧化钙)是所提出的另ー种方法。但是，这样的碱性解毒(alkali detoxification)可导致能够发酵的糖的大量降解。此外，常规的解毒方法通常需要额外的エ艺步骤，例如其中需要对エ艺物流的PH和/或温度进行调整的步骤。本发明人已经认识到，本领域需要用于克服与在由纤维素材料制造发酵产物中的发酵抑制有关的问题的改进的方法。因此，本发明的目的是提供用于降低发酵抑制的方法。为了满足这个目的，提供了用于降低在由经预处理的纤维素材料生产目标化学品的エ艺(过程，process)中的发酵抑制的方法，所述エ艺包括经预处理的纤维素材料的酶法水解和经水解的材料的发酵，其中，通过向经预处理的材料或经水解的材料中加入至少ー种还原剂来降低经历发酵的材料的发酵抑制性(fermentation inhibitory property)。此外，还提供了连ニ亚硫酸盐在降低正在经历同步酶法水解和发酵的材料、或者正在经历发酵的来源于酶法水解的水解产物的发酵抑制性中的用途。
具体实施例方式作为本发明的第一方面，提供了用于降低在由经预处理的纤维素材料生产目标化学品的エ艺中的发酵抑制的方法，所述エ艺包括经预处理的纤维素材料的酶法水解和经水解的材料的发酵，其中，通过向经预处理的材料或经水解的材料中加入至少ー种还原剂来降低经历发酵的材料的发酵抑制性。“发酵”是本领域技术人员已知的エ艺，且通常是通过微生物进行的。“发酵抑制”是指对发酵反应的负面影响，例如，降低发酵反应的速率或发酵反应中所产生的目标产物的总量。因此，“降低发酵抑制”是指降低这样的负面影响。因此，降低发酵抑制可以是对经历发酵的材料的解毒或调整(conditioning)，即，降低经历发酵的材料的ー种或多种性能(所述性能抑制底物至目标化学品的发酵生物体转化率)的影响。例如，“降低发酵抑制”可提高糖类的消耗速率(例如葡萄糖消耗速率)、提高在发酵期间所产 生的目标化学品的总量、提高在发酵期间关于所消耗的糖类的目标化学品产率(即，提高由所消耗的每个糖类分子产生的目标化学品分子的数目)、或者提高目标化学品的体积生产率(例如，以“目标化学品克数X升-1X小时—1”度量)。“纤维素材料”是指含有纤维素和/或半纤维素的任意材料。纤维素材料可以是木质纤维素材料，即，含有纤维素、木质素以及可能的半纤维素的材料。例如，木质纤维素材料可以是木材残留物或林业残留物(如木屑、锯木厂或造纸厂的废弃物)、或农业残留物(如甘蔗渣)。“经预处理的纤维素材料”是指这样的纤维素材料，其已经经过预处理以便改变其性能，使得纤维素在随后的水解期间变得更易于处理。预处理可涉及ー种或若干种本领域技术人员已知的预处理方法。作为实例，预处理可以是酸性预处理或碱性预处理。此外，预处理可以是浸溃，所述浸溃是指用浸溃流体对纤维素材料进行浸溃，随后加热。所述流体可以是酸性溶液，例如无机酸溶液。也可以使用气体(如SO2气体或CO2气体)或者使用气体与液体的组合进行浸溃。预处理也可包括汽蒸(Steaming)。汽蒸是指用于从纤维素生物质中驱赶出空气以促进纤维素的进ー步水解的エ艺。汽蒸是用于对例如木质纤维素生物质进行预处理的公知方法。作为另ー实例，预处理可涉及蒸汽瀑破(steam explosion)。蒸汽瀑破是结合了蒸汽、快速压カ释放和水解的用于使纤维素纤维破裂的エ艺。“来自经预处理的纤维素材料的目标化学品”是指在包括发酵的エ艺中可由经预处理的纤维素材料制备的任意化学品。“酶法水解”是指由至少ー种酶催化的水解反应。所述至少ー种酶可为至少ー种糖化酶，所述糖化酶是指可将纤维素材料转化或水解为能够发酵的糖类(如单糖和/或ニ糖)的至少ー种酶。这样的糖化酶可以是能够使多糖水解的糖苷酶。糖苷酶的实例包括纤维素水解糖苷酶(如纤维素酶、内切葡聚糖酶、外切葡聚糖酶(exoglucanase)、纤维ニ糖水解酶(cellobiohydrolase)和P -葡糖苷酶)、半纤维素水解糖苷酶(如木聚糖酶、内切木聚糖酶、外切木聚糖酶、P -木糖苷酶、阿拉伯木聚糖酶、甘露聚糖酶、半乳聚糖酶(galactanase)、果胶酶和葡糖醒酸酶(glucuronase))、以及淀粉水解糖苷酶(如淀粉酶、a-淀粉酶、￠-淀粉酶、葡糖淀粉酶、a -葡糖苷酶和异淀粉酶)、或者在EC 3. 2. l.x(如EC3. 2. I. 4,其中EC是Enzyme Commission编号)中找到的酶类别中的任何酶。“还原剂”是指这样的化学试剂，其能够在其自身被氧化时导致另ー种物质的还原，即，能够在氧化还原反应中提供电子的化学试剂。因此，术语“向经预处理的材料或经水解的材料中加入至少ー种还原剂”是指向已经经历预处理的纤维素材料中加入至少ー种还原剂。因此，根据第一方面，在用于生产目标化学品的エ艺中，还原剂的加入发生在纤维素材料的任何预处理的下游。本发明基于这样的发现向经预处理的纤维素材料中加入还原剂是克服与纤维素材料向目标化学品的生物转化有关的障碍的有效方法。发酵能力的显著改善可通过加入相对少量的还原剂而实现，并且，进一歩地，还原剂可与酶和发酵生物体(如酵母)相客，从而导致对酶或酵母性能的很小的影响。此外，根据第一方面的使用还原剂对经预处理的纤维素材料进行解毒或调整不要求在エ业过程中引入经基因改造的微生物。根据本发明第一方面的方法的进ー步好处包 括还原剂的加入可以在适于发酵的pH以及室温或发酵温度下进行，并且导致改善的发酵能力而不发生能够发酵的糖的降解。根据第一方面的方法的这些好处和简単性提供了实现由木质纤维素水解产物更有效地制造发酵产物(例如こ醇)的方法。因此，根据本发明第一方面的方法提供了来自纤维素材料的燃料(如こ醇)和其它化学品的有效生产。在第一方面的实施方案中，酶法水解和发酵以两个单独的步骤进行，并且发酵步骤在发酵罐中进行。“发酵罐”是指可用于通过发酵制备目标化学品的任意类型的容器。作为实例，可以首先对纤维素材料进行酶法水解以产生游离糖，所述游离糖在単独的エ艺步骤中发酵成目标化学品。因此，用于生产目标化学品的エ艺可以作为単独的水解和发酵(SHF)エ艺进行。SHFエ艺提供了在不同エ艺条件下(例如在不同的pH和温度下)进行酶法水解和发酵的可能性。作为实例，如果采用SHFエ艺，可向发酵罐中加入至少ー种还原齐U。向发酵罐中加入还原剂是有利的，因为不需要进行用于加入还原剂的任何额外的単独步骤，所述额外的単独步骤可促成更高的エ艺成本。因此，在发酵期间加入还原剂允许充分的エ艺灵活性，即，为了降低发酵抑制不需要对常规エ艺设计进行调整或修改，因为在发酵步骤中进行了还原剂的加入。在将发酵生物体加入至发酵罐之前或之后，可加入还原剂。进ー步地,还原剂可以与发酵生物体同时加入。在第一方面的另ー实施方案中，酶法水解和发酵在发酵罐中同时进行。因此，用于生产目标化学品的エ艺可以作为同步糖化和发酵(SSF)エ艺进行，其中，纤维素材料的水解通过从外部来源加入酶如纤维素酶来实现，或者，用于生产目标化学品的エ艺可以作为联合生物エ艺(consolidated bioprocess,CBP)进行,其中，转化单糖的生物催化剂也产生使纤维素材料水解的酶。作为实例，如果酶法水解和发酵如在SSFエ艺中那样在发酵罐中同时进行，可向发酵罐中加入所述至少ー种还原剂。这是有利的，因为其允许充分的エ艺灵活性，并且在目标化学品生产期间不需要任何额外的エ艺步骤。进一歩地，如果向发酵罐中加入还原剂，则还原剂可在发酵エ艺的任意阶段加入，例如，仅在需要时加入。如上所述，在向发酵罐中加入酶和/或发酵生物体之前或之后，可加入还原剂。进ー步地，还原剂可以与酶和/或发酵生物体同时加入。因此，如果将还原剂直接加入到发酵罐中，根据第一方面的方法提供了对经历发酵的材料的原位化学解毒。
但是，如果采用的是SHF或SSF工艺，还原剂也可以在发酵罐之前加入，例如，在纤维素材料的预处理期间或之后加入。进一步地，本发明人还已经发现可以不必对经历发酵的材料进行任何pH和/或温度的调整以实现所需的降低发酵抑制性的效果。因此，在本发明第一方面的实施方案中，在20-80° C、例如20-75° C、例如20-45° C、例如28-38° C的温度下加入所述至少一种还原剂。因此，当经历发酵的材料的温度为20-45° C、例如28-38° C时，可加入还原剂，这意味着，还原剂可以在室温或者适宜发酵的温度下加入。因此，可不需要额外的用于调节温度的工艺步骤。嗜热酶可在最高达80° C的温度下起作用，且在这样的情况中，还原剂的加入可以与水解反应结合，例如，向其中进行水解的容器中加入还原剂 。初步结果表明，使用还原剂的解毒可以在多种pH水平下进行。但是，本发明人已经注意到，使用还原剂的解毒似乎在高于3(例如高于4)的pH下比在低于3(例如低于2. 5)的PH下更有效率。这意味着，本发明人相信，如果在使经预处理的材料(其经常具有约2的pE>中和之后进行使用还原剂的解毒，则解毒更有效率。因此，在第一方面的实施方案中，在3-8、例如3-6、例如4-6、例如5-6的pH下加入所述至少一种还原剂。这意味着，还原剂可在适于水解和/或发酵的pH下加入。例如，发酵和SSF经常在约5. 5的pH下进行。因此，可不需要额外的用于调节pH的工艺步骤。本发明人已经发现，如果还原剂在发酵期间的最终浓度在一定区间内，则其是优选的。因此，在本发明的实施方案中，加入还原剂以使发酵期间的最终浓度为l_75mM，例如5_60mM、例如 10_50mM、例如 10_40mM、例如 10_30mM。进一步地，在本发明的实施方案中，所述至少一种还原剂含有硫。作为实例，所述至少一种还原剂可以选自连二亚硫酸盐和亚硫酸盐。已经表明，这些还原剂适用于降低发酵抑制，如在本公开内容的实施例1-5中所示的。亚硫酸盐(S032_)用于若干种大规模工业过程中。连二亚硫酸盐(S2O42O是在纸浆和造纸工业中用于还原漂白且在纺织工业中用作染色工艺中的还原剂的工业化学品。因此，亚硫酸盐和连二亚硫酸盐两者都可以大的量获得。进一步地，应理解，还原剂可包括盐形式的亚硫酸盐和/或连二亚硫酸盐，即，与不同的阳离子复合。实例包括Na2SO3' NaHSO3' KHSO3和Na2S2O40作为实例，还原剂可以是连二亚硫酸盐，并且连二亚硫酸盐的加入量可使得连二亚硫酸盐在发酵期间的浓度为l_30mM，例如5-25mM、例如7. 5_20mM。作为进一步的实例，还原剂可以是亚硫酸盐，并且亚硫酸盐的加入量可使得亚硫酸盐在发酵期间的浓度为10-75mM，例如15-75mM、例如20_75mM。进一步地，亚硫酸盐的加入量可使得亚硫酸盐在发酵期间的浓度为10-60mM，例如15-50mM、例如20_40mM。已经表明，连二亚硫酸盐和亚硫酸盐各自的这些浓度适用于降低发酵抑制，如在本公开内容的实施例1-5中所示的。但是，对于发酵工艺，加入超过IOOmM的亚硫酸盐可为不利的。因此，为了实现发酵抑制性的降低所需的连二亚硫酸盐或亚硫酸盐的量相对低，而且，得自本公开内容的实施例1-5的结果表明，连二亚硫酸盐或亚硫酸盐的这样的量允许采用SHF或SSF程序生产高水平的乙醇。进一步地，与亚硫酸盐相比，加入连二亚硫酸盐可更为有利，因为当添加至相同浓度时，连二亚硫酸盐导致比亚硫酸盐更大的发酵抑制降低，如本公开内容的实施例1-5中所示的。因此，通过加入比亚硫酸盐低的浓度的连二亚硫酸盐可以实现相同的发酵抑制效果。加入比亚硫酸盐低的浓度的连二亚硫酸盐还意味着，在发酵期间的总的盐浓度较低，这对于发酵反应可为有利的。可用作还原剂的其它化合物包括硫代硫酸盐(S2O32O (例如Na2S2O3 5H20和Na2S2O3)、碱分解的糖(alkali-decomposed sugar)、抗坏血酸、半胱氨酸、二乙醇胺、三乙醇胺、二硫苏糖醇(DTT)和还原的谷胱甘肽。在本发明的实施方案中，目标化学品是乙醇。乙醇是可来源于纤维素生物质且可通过发酵生产的目标化学品。目标化学品也可以是丁醇或琥珀酸，它们也可来源于纤维素材料。目标化学品的其它实例是其它醇或酸、烷烃、烯烃、芳族化合物、醛、酮、生物聚合物、蛋白质、肽、氨基酸、维生素、抗生素和其它药品。此外，可通过发酵生物体进行经水解的材料的发酵，所述发酵生物体是指能够将糖类发酵成目标化学品的生物体。发酵生物体可为至少一种真核或原核微生物，例如细菌和/或酵母。能够将糖类发酵成其它化合物的细菌和酵母的实例是本领域技术人员 已知的。来自酵母属(Saccharomyces)、毕赤酵母属(Pichia)和假丝酵母属(Candida)的酵母可用作发酵生物体。例如，发酵生物体可以是野生型、突变型或重组型酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)。使用酿酒酵母(S. cerevisiae)通过发酵生产目标化学品是有利的，因为酿酒酵母(S. cerevisiae)在工业发酵中得到广泛使用并提供高的产品产率。在本发明第一方面的实施方案中，向其加入还原剂的材料具有至少5%(重量/重量)、例如至少10%(重量/重量)、例如至少12%(重量/重量)的悬浮固体物含量。已经发现，可将还原剂添加至具有相对高固体物含量的纤维素材料，例如，经历SSF或CBP的纤维素材料。这使得能够对经预处理的纤维素材料浆料进行解毒或调整而无需任何固体物分离步骤。这样的原位解毒或调整提供了目标化学品的高产品产率以及成本有效的收取，例如，通过蒸馏。在本发明第一方面的实施方案中，向其加入还原剂的材料具有至少45g/l、例如至少65g/l、例如至少85g/l的糖浓度。因此，可将还原剂加入到具有高的糖浓度的纤维素材料中，例如，在SHF工艺中的发酵之前或期间加入到经水解的纤维素材料中。在本公开内容的上下文中，“糖”是指能够发酵的糖类，例如，可发酵的单糖和二糖。在本发明的实施方案中，根据本发明第一方面的方法进一步包括测量经水解的材料的发酵的发酵能力；并且如果所测得的发酵能力低于参比值，则向所述发酵中加入至少一种还原剂。在本公开内容的上下文中，发酵的“发酵能力”是与发酵工艺的结果成比例的任意参数。作为实例，发酵能力可以是糖消耗速率、所产生的目标化学品的量、关于所消耗的糖的所产生的目标化学品的产率和/或目标化学品的体积生产率。糖消耗速率可以作为每小时的糖浓度降低来度量，目标化学品的量可以作为每升的目标化学品克数来度量，关于所消耗的糖的所产生的目标化学品的产率可通过监测在发酵期间的糖类浓度的降低和目标化学品浓度的增加作为由所消耗的每个糖类分子产生的目标化学品分子的数目来度量，而且，目标化学品的体积生产率可以作为每升和每小时的目标化学品克数来度量。此外，发酵能力可通过测量总的糖浓度来度量。例如，如果发酵生物体在SSF工艺中变得效率较低，则可以测量总的糖浓度的提高。因此，发酵能力也可以是总的糖浓度的相反值。
因此，进一步地，本发明人已经认识到，在由纤维素生物质生产目标化学品的工艺中，向具有低发酵能力的发酵工艺中加入至少一种还原剂可提高该工艺的发酵能力。因此，这提供了“挽救”在某些方面未正常运转的发酵工艺的可能性。作为实例，在发酵工艺中可以连续监测葡萄糖的消耗速率，而且，如果该速率低于令人满意的参比水平，则可以加入还原剂以提高葡萄糖的消耗速率。例如，可选择发酵能力的参比值以使得具有低于该参比值(例如低于一定的葡萄糖消耗速率)的发酵能力的发酵工艺导致目标化学品的不令人满意的量，而且，具有高于该参比值(例如高于一定的葡萄糖消耗速率)的发酵能力的发酵工艺导致目标化学品的合乎期望的量。根据本公开内容的教导，本领域技术人员知道如何选择发酵能力的参比值。下面参考图8的实施例表明，已长时间遭受抑制剂的发酵中的发酵能力可能未完全恢复，即使加入还原剂也是如此。不受限于任何科学理论，本发明人相信，这可归因于部分酵母的死亡。因此，在正在进行的发酵或SSF中的发酵能力不足的情况下，除还原剂外，还可加入额外的酵母。额外的酵母可以在还原剂之前或之后加入，或者可以与还原剂同时加入。例如,酵母和还原剂可在两小时之内(例如I小时或30分钟之内)加入。
在通过发酵生产目标化学品的工艺中，工艺用水的再循环通常导致工艺用水的抑制性的累积。但是，因为根据本发明的第一方面的还原剂的加入降低了发酵抑制，可进行工艺用水的再循环而没有抑制性的任何累积。因此，在第一方面的实施方案中，所述方法进一步包括将在目标化学品生产后得到的工艺用水再循环至目标化学品生产中的任意步骤。再循环工艺用水是指在生产目标化学品的工艺中在上游重新使用工艺用水。作为实例，部分或全部发酵液可被再循环。此外，如果通过蒸馏从发酵液中提取目标化学品，部分或全部釜馏物(例如釜馏物的滤液)可被再循环。例如，再循环的工艺用水可在纤维素材料的预处理中用作预处理流体、在纤维素材料的水解中用作水解液、或者在糖的发酵中用作发酵液。因此，在来自纤维素生物质的目标化学品的生产中，工艺用水的再循环减少了对引入新鲜水的需求。在本发明的第二方面中，提供了连二亚硫酸盐在降低正在经历同步酶法水解和发酵的材料、或者正在经历发酵的来源于酶法水解的水解产物的发酵抑制性中的用途。本发明的第二方面中所用的术语和定义如关于前述第一方面所定义的。此外，第一方面的实施方案加以必要的变更地应用于第二方面。已经发现，连二亚硫酸盐有利于降低在同步酶法水解和发酵工艺中(例如在SSF或CBP中)的材料的发酵抑制性。连二亚硫酸盐可在同步酶法水解和发酵工艺之前或期间使用。所述材料可以是纤维素材料，例如木质纤维素材料。
图I示出了在具有云杉水解产物的单独的水解和发酵的实验中的葡萄糖消耗。该图中的每个点作为两次发酵的平均值计算。误差条说明标准偏差。数据说明■:加入连二亚硫酸盐(5禮)、令加入连二亚硫酸盐(IOmM)、_ :加入亚硫酸盐(5mM)、A :加入亚硫酸盐(10. OmM), :未经处理的水解产物、X =NH4OH处理以及+ :参比发酵。图2示出了云杉水解产物经过14小时发酵(单独的水解和发酵实验)后的乙醇产量(g/L)。每个条作为两次发酵的平均值计算。误差条说明标准偏差。图3示出了在具有甘蔗渣水解产物的单独的水解和发酵的实验中的葡萄糖消耗。该图中的每个点作为两次发酵的平均值计算。误差条说明标准偏差。数据说明■:连二亚硫酸盐处理(5mM)、 :连二亚硫酸盐处理(10. OmM)、-:亚硫酸盐(5mM)、▲:亚硫酸盐处理(10. OmM), :未经处理的水解产物、X =NH4OH处理以及+ :参比发酵。图4示出了甘蔗渣水解产物经过6小时发酵(单独的水解和发酵)后的乙醇产量(g/L)。每个条作为两次发酵的平均值计算。误差条说明标准偏差。图5示出了在云杉浆料的同步糖化和发酵期间的乙醇产量。该图中的每个点作为两次发酵的平均值计算。误差条说明标准偏差。数据说明■:连二亚硫酸盐处理(7. 5mM)、 :连二亚硫酸盐处理(IOmM)、X :亚硫酸盐处理(7. 5mM)、A :亚硫酸盐处理(IOmM)以及 :未经处理的浆料。图6示出了在加入了不同浓度的连二亚硫酸盐的云杉浆料的同步糖化和发酵期 间的乙醇产量。数据代表■，实线连二亚硫酸盐处理(2. 5mM) ; ，实线连二亚硫酸盐处理(5mM) ;▲，虚线连二亚硫酸盐处理(7. 5mM) ; ，实线连二亚硫酸盐处理(IOmM) ;□，实线连二亚硫酸盐处理(15mM) ; ，实线连二亚硫酸盐处理(20mM) ;A，实线连二亚硫酸盐处理(30mM)。图7示出了在加入了不同浓度的亚硫酸盐的云杉浆料的同步糖化和发酵期间的乙醇产量。数据代表■，实线亚硫酸盐处理(2. 5mM) ; ，实线亚硫酸盐处理(5mM)；▲，虚线亚硫酸盐处理(7. 5mM) ; ，实线亚硫酸盐处理(IOmM) ;□，实线亚硫酸盐处理(15mM) ; ,实线亚硫酸盐处理(20mM) ;A,虚线亚硫酸盐处理(30mM)。图8示出了云杉浆料在同步糖化和发酵24小时(黑色条)、48小时(灰色条)和72小时(白色条)后的乙醇产量(g/L)。数据说明(A)接种(inoculum)前10分钟加入IOmM连二亚硫酸盐、⑶接种前10分钟加入IOmM亚硫酸盐、(C)接种时加入IOmM连二亚硫酸盐、⑶接种时加入IOmM亚硫酸盐、(E)接种后45分钟加入IOmM连二亚硫酸盐、(F)接种后45分钟加入IOmM亚硫酸盐、(G)接种后105分钟加入IOmM连二亚硫酸盐、⑶接种后105分钟加入IOmM亚硫酸盐、⑴接种后240分钟加入IOmM连_■亚硫酸盐、(J)接种后240分钟加入IOmM亚硫酸盐、(K)接种后480分钟加入IOmM连_■亚硫酸盐、(L)接种后480分钟加入IOmM亚硫酸盐、以及(M)未加入还原剂的云杉浆料。示出的是基于两次测量结果的平均值。误差条说明标准偏差。图9示出了甘蔗渣浆料在同步糖化和发酵13小时(白色条)和45小时(黑色条)后的乙醇产量(g/L)。数据说明(A)加入IOmM连二亚硫酸盐、(B)加入7. 5mM连二亚硫酸盐、(C)加入IOmM亚硫酸盐、⑶加入7. 5mM亚硫酸盐、(E)未加入还原剂的甘蔗渣浆料。每个条代表两次平行的SSF实验的平均值。误差条说明标准偏差。
实施例下面的非限制性实施例将进一步说明本发明。实施例I.在单独的水解和发酵(SHF)工艺中的水解产物的解毒材料和方法通过热化学预处理以及后续的酶法水解，由云杉木和甘蔗渣制造木质纤维素水解产物。对于采用甘蔗渣的SHF实验，用500g稀硫酸(4%)浸溃Ikg (干重，DW)经过干燥的甘蔗渣，并保持在塑料袋中20小时。然后，将该经过浸溃的甘蔗渣装入30升的反应器中。在195° C的温度和14. I巴的压力下，用蒸汽处理该材料15分钟。将该经预处理的材料(在下文中称为甘蔗渣浆料)冷却并在4° C下储存直至进一步使用。用于SSF实验的甘蔗渣预处理是在瑞典的纤维素乙醇中试设备(通过瑞典0rnsk6ldsvik的SEKAB E-Technology运行)中进行的。在30升的反应器中，在198-199° C的温度下以连续模式处理甘蔗渣，且停留时间为13-14分钟。进料速度为24kg(干重)/小时，且甘蔗渣用二氧化硫(0.5kg/小时)浸溃。预处理后的pH为2. 7。干物质含量为19%。将该经预处理的材料冷却并在4° C下储存直至进一步使用。云杉的预处理也是在瑞典的纤维素乙醇中试设备中根据SEKAB E-Technology进行。在30升的反应器中，在203° C的温度下使用二氧化硫以连续模式处理未剥皮的木屑，且停留时间为5分钟。每40kg木屑使用Ikg 二氧化硫。预处理后的pH为2. 0-2. 3。干物 质含量为25-27%。将该经预处理的材料冷却并在4° C下储存直至进一步使用。用5M氢氧化钠溶液将甘蔗渣浆料的PH调节至5. 3。然后，过滤该浆料，并除去液体部分的一部分以使该浆料的干物质含量为10%。在四个2升摇瓶中装入750g浆料。用5M氢氧化钠溶液将云杉浆料的PH调节至5. 3。在六个750毫升摇瓶中装入350g浆料。干物质含量为16%。将市售的纤维素酶和纤维二糖酶制剂加入到所述浆料中。来自里氏木霉(Trichoderma reesei)ATCC 26921的纤维素酶制剂具有700内切葡聚糖酶单位(E⑶)/g的宣称活度(stated activity) (Sigma-Aldrich, Steinheim, Germany),且载荷为 319EGU/g固体物(DW)。纤维二糖酶制剂Novozyme 188具有250纤维二糖酶单位(CBU)/g的宣称活度(Sigma-Aldrich)，且载荷为23CBU/g固体物(DW)。酶的剂量基于一组小规模实验的结果。在加入酶后，在50° C和70rpm下，在振荡下对所述浆料进行48小时培养(InforsEcotron, Infors AG, Bottmingen, Switzerland)。在水解后，过滤所述浆料，并通过高效液相色谱法(HPLC)测量所述浆料中的所释放的葡萄糖和甘露糖的量。将液体部分(在下文中称为甘蔗渣和云杉水解产物)的PH用12M盐酸溶液调节至2. 0,以防止在储存期间的微生物生长。通过蒸发(Rotavapor Buchi001, Biichi Labortechnik AG, Flawil, Switzerland)将甘鹿禮:水解产物浓缩，以得到与云杉水解产物中相似的葡萄糖浓度。将水解产物储存在4° C下直至进一步使用。用5M氢氧化钠溶液将甘蔗渣和云杉水解产物的pH调节至5. 5。在八个装有磁力搅拌棒的100毫升玻璃容器中进行每种水解产物的调整。向所有容器中加入26毫升水解产物，并将所述容器放在磁力搅拌板(IKA-Werke, Staufen, Germany)上。将连二亚硫酸钠(化学级；>87%, Merck, Darmstadt, Germany)以5mM和IOmM的浓度加入到水解产物中。此夕卜，还进行亚硫酸钠至5mM和IOmM的加入。在室温(23° C)下进行所述加入，并将样品在搅拌下保持10分钟。进行一式两份实验。将还原剂的加入的有效性与碱性解毒进行比较。因此，在前述条件下，用氢氧化铵处理水解产物样品(Alriksson等人(2006), Appl. Biochem.Biotechnol. 129-132，599-611)。将pH调节至9，并在搅拌下使水解产物在55° C下保持3小时。
通过使用高效液相色谱法(HPLC)进行单糖和呋喃醛[糠醛和2-羟甲基糠醛(HMF)]的分析。为了分析葡萄糖、甘露糖、半乳糖、HMF和糠醛，在装有YL9170系列折射率(RI)检测器的 YoungLin YL9100 系列系统(YoungLin, Anyang, Korea)中使用 ShodexSH-1011 柱(6 微米，8 X 300 毫米)(Showa Denko, Kawasaki, Japan)。用 0. OlM H2SOjjC溶液的等度流(isocratic flow)进行洗脱。流速为I. 0毫升/分钟，并将柱温设置为50° C。为了分析木糖和阿拉伯糖，将Shodex SP-0810柱(7微米，8 X 300毫米)与相同的HPLC系统一起使用。使用Milli-Q水以1.0毫升/分钟的流速进行洗脱，并将柱温设置为80° C。将 YLClarity 软件(YoungLin, Anyang, Korea)用于数据分析。根据前述方法(Nilvebrant等人(2001), AppI. Biochem.Biotechnol. 91-93，35-49)使用 HPLC (MoRe Research, Omskokisvik, Sweden)进行酹类化合物的总量测定。通过使用酶试剂盒(enzymatickit)(乙醇 UV 法，Boehringer Mannheim
GmbH, Mannheim, Germany)进行乙醇测量。进行发酵实验以评价所述加入和处理的有效性。为了对比，在所述发酵实验中包括未经处理的水解产物，以及基于糖的培养基的参比发酵，所述基于糖的培养基所具有的能够发酵的糖(即葡萄糖和甘露糖)的量对应于水解产物样品中的能够发酵的糖的量。使用面包酵母(Saccharomyces cerevisiae) ( JastboiagetAB, Rotebro, Sweden)进行发酵。酵母接种体是在具有300毫升YETO培养基(2%酵母提取物，1%蛋白胨，2%D_葡萄糖)的750毫升棉塞摇瓶(cotton-plugged shake flask)中制备的。在30° C下，在搅拌下对所述瓶进行接种(inoculate)和培养约12小时。在后期指数生长阶段(late exponential growth phase)通过以 1500g离心分离(Hermla Z206A, HermleLabortechnik GmbH, Wehingen, Germany) 5分钟收集细胞(cell)。将细胞再悬浮在适量的无菌水中，以在所有发酵容器中实现由2. Og/L(细胞干重)构成的接种体。发酵在装有搅拌用磁体并用橡胶塞密封的14个25毫升玻璃瓶中进行，其中，以插管刺穿所述橡胶塞用于排放二氧化碳。将水解产物样品(23. 75毫升)或者用于参比发酵的糖溶液与0.5毫升营养液(150g/L 酵母提取物，75g/L (NH4)2HPO4, 3. 75g/L MgSO4 7H20，238. 2g/LNaH2P04 H2O)和0. 75毫升酵母接种体一起加入到发酵瓶中。在30° C下，在具有磁力搅拌(IKA-Werke)的水浴中，对所述瓶进行培养。在发酵期间取出用于测量糖和乙醇的样品。通过使用葡萄糖仪(glucometer) (Glucometer Elite XL, Bayer AG,Leverkusen, Germany)评估发酵期间的葡萄糖水平。结果用于SHF实验的云杉和甘蔗渣水解产物的制备导致具有超过80g/L葡萄糖和大于100g/L单糖的水解产物(表I和2)。在这两种水解产物中，葡萄糖均为主要的能够发酵的糖，但是，正如所预料的，云杉水解产物含有大量甘露糖(表I)。如通过HPLC所评估的，酚类化合物的总浓度相对类似。这两种水解产物都含有约4g/L的呋喃醛以及糠醛的约3倍的HMF。云杉水解产物中的脂族酸含量稍高于甘蔗渣水解产物中的脂族酸含量。在这两种情况中，醋酸均为最普遍的脂族酸。单糖的浓度不受连二亚硫酸盐或亚硫酸盐的加入的影响(表I和2)。但是，与加入连二亚硫酸盐或亚硫酸盐相比，碱性解毒(即加入NH4OH)导致更低的糖浓度。例如，碱性解毒后的云杉水解产物的葡萄糖浓度仅为约70g/L，然而，连二亚硫酸盐或亚硫酸盐的加入导致超过80g/L的葡萄糖浓度。与使用连二亚硫酸盐或亚硫酸盐时相比，碱性解毒还导致云杉水解产物中的较少量的木糖、半乳糖和甘露糖。此外，与加入连二亚硫酸盐或亚硫酸盐时相比，碱性解毒导致甘蔗渣水解产物中的较少量的木糖和半乳糖(表I和2)。因此，与碱性解毒相比，连二亚硫酸盐和亚硫酸盐的加入导致更高的糖浓度。表I.用于具有单独的水解和发酵的实验的云杉水解产物中的单糖和抑制剂的浓度(g/U。所用的缩写=Galact=半乳糖；Arabin=阿拉伯糖；Phen=酹类化合物；HMF=2_轻甲基糠醒；Untreat. hydro=未经处理的水解产物；NH40H_detox.=氢氧化铵解毒。
权利要求
1.用于降低在从经预处理的纤维素材料生产目标化学品的工艺中的发酵抑制的方法，所述工艺包括该经预处理的纤维素材料的酶法水解和经水解的材料的发酵，其中，通过向所述经预处理的材料或经水解的材料中加入至少一种还原剂来降低经历发酵的材料的发酵抑制性。
2.权利要求I的方法，其中，所述酶法水解和发酵以两个单独的步骤进行，并且该发酵步骤是在发酵罐中进行的，并将所述至少一种还原剂加入到所述发酵罐中。
3.权利要求I的方法，其中，所述酶法水解和发酵在发酵罐中同时进行。
4.权利要求3的方法，其中，将所述至少一种还原剂加入到所述发酵罐中。
5.前述权利要求中任一项的方法，其中，在20-80°C、例如28-38° C的温度下加入所述至少一种还原剂。
6.前述权利要求中任一项的方法，其中，在3-8、例如4-6的pH下加入所述至少一种还原剂。
7.前述权利要求中任一项的方法，其中，将该还原剂加入至l_75mM、例如5-60mM、如10-50mM的发酵期间最终浓度。
8.前述权利要求中任一项的方法，其中，至少一种还原剂含有硫。
9.权利要求8的方法，其中，至少一种还原剂选自连二亚硫酸盐和亚硫酸盐。
10.权利要求9的方法，其中，所述还原剂是连二亚硫酸盐，并且所述连二亚硫酸盐的加入量使得连二亚硫酸盐在发酵期间的浓度为1-30禮，例如5-25mM、如7. 5_20mM。
11.权利要求9的方法，其中，所述还原剂是亚硫酸盐，并且所述亚硫酸盐的加入量使得亚硫酸盐在发酵期间的浓度为10-75mM，例如15-75mM、如20_75mM。
12.前述权利要求中任一项的方法，其中，所述目标化学品为乙醇。
13.前述权利要求中任一项的方法，其中，向其中加入所述还原剂的材料的悬浮固体物含量为至少5%(重量/重量)，例如至少10%(重量/重量)、如至少12%(重量/重量)。
14.前述权利要求中任一项的方法，其中，向其中加入所述还原剂的材料的糖浓度为至少45g/l,例如至少65g/l、如至少85g/l。
15.前述权利要求中任一项的方法，进一步包括测量经水解的材料的所述发酵的发酵能力；并且如果所述测量的发酵能力低于参比值，则向所述发酵中加入所述至少一种还原剂。
16.前述权利要求中任一项的方法，进一步包括将在所述目标化学品的所述生产后得到的工艺用水再循环至所述目标化学品生产中的任意步骤。
17.连二亚硫酸盐在降低正在经历同步酶法水解和发酵的材料、或者正在经历发酵的来源于酶法水解的水解产物的发酵抑制性中的用途。
全文摘要
本发明提供了用于降低在从经预处理的纤维素材料生产目标化学品的工艺中的发酵抑制的方法，所述工艺包括该经预处理的纤维素材料的酶法水解和经水解的材料的发酵，其中，通过向该经预处理的材料或经水解的材料中加入至少一种还原剂来降低经历发酵的材料的发酵抑制性。此外，本发明还提供了连二亚硫酸盐在降低正在经历同步酶法水解和发酵的材料的发酵抑制性中的用途。
文档编号C12N1/38GK102770547SQ201080064339
公开日2012年11月7日 申请日期2010年12月17日 优先权日2009年12月21日
发明者A.卡夫卡, B.阿尔里克森, L.琼森 申请人:瑞典乙醇化工技术有限公司