专利名称：耐受hppd抑制剂型除草剂的植物的制作方法
耐受HPPD抑制剂型除草剂的植物发明简介本发明涉及从属于红球菌属(Rhodococcus)的细菌获得的编码羟苯基丙酮酸双加氧酶(EC I. 13. 11. 27，本文缩写为HPro)的核酸序列及其所编码的蛋白质，并且涉及包含此类核酸序列的嵌合基因，以及此类核酸序列、蛋白质或嵌合基因用于获得对HPro除草剂耐受的植物的用途。
背景技术：
HPro是催化酪氨酸降解产物，对羟苯基丙酮酸(本文缩写为HPP)转化为植物中生育酚和质体醌的前体尿黑酸(本文缩写为HG)的反应的酶(Crouch N. P.等人(1997)Tetrahedron,53,20,6993-7010, Fritze 等人，(2004), Plant Physiology 134 1388-1400)。生育酚作为膜关联的抗氧化剂发挥作用。质体醌首先作为PSII和细胞色素b6/f复合物之间的电子载体发挥作用，其次是八氢番茄红素去饱和酶的氧化还原辅助因子，其参与类胡萝卜素的生物合成。到目前为止，NCBI数据库中有来自多种生物的多于700个核酸序列被注释为编码具有HPI3D结构域的推定蛋白质，所述序列分别包括在UniProtKB/TrEMBL数据库中给出的检索号Q0SC92和Q0SF39下的以及在NCBI蛋白质数据库中给出的检索号YP_703002和ΥΡ_702005下的公开的序列。但对于大部分序列，包括对应检索号Q0SC92/ΥΡ_703002和Q0SF39/YP_702005的序列，还没有证明蛋白质在体外测定或在植物体内(in planta)方法中具有HPTO酶促活性，也没有证明当在植物中表达时此类HPTO蛋白质能赋予对HPI3D抑制剂型除草剂的除草剂耐受性。现有技术描述了若干HPI3D蛋白质及其一级序列，特别地细菌(例如假单胞菌(Riletschi等人,Eur. J. Biochem. , 205,459-466,1992, WO 96/38567))、植物(例如拟南芥(W0 96/38567，Genebank AF047834)、胡萝卜(W0 96/38567， Genebank 87257)、燕麦(Avena sativa)(W0 02/046387)、小麦(W0 02/046387)，宽叶臂形草(Brachiaria platyphylla) (W002/046387)、蒺藜草(Cenchrus echinatus) (W0 02/046387)、硬直黑麦草(Lolium rigidum) (W0 02/046387)、高羊茅(Festuca arundinacea)(W002/046387)、大狗尾草(Setaria faberi)(W002/046387)、牛筋草(Eleusine indica) (W0 02/046387)、高粱(Sorghum) (TO 02/046387)、Coccicoides (Genebank C0ITRP)、日本黄连(Coptis japonica) (W0 06/132270)、莱茵衣藻(Chlamydomonas reinhardtii) (ES 2275365))或哺乳动物(例如小鼠或猪)的 HPPD 蛋白质。上述参考文献中公开的相应序列以引用的方式并入本文。大部分植物经由arrogenate 合成酪氨酸(Abou-Zeid 等人(1995), Applied EnvMicrob 41 :1298-1302 ;Bonner 等人，(1995)，Plant Cells Physiol. 36,1013-1022 ；Byng等人，(1981), Phytochemistry 6 :1289-1292 ；Connely 和 Conn(1986), Z. Naturforsch41c :69-78 ；Gaines 等人，(1982)，Plants 156 :233-240)。在这些植物中，HPP 只源自酪氨酸的降解。另一方面，在例如酵母酿酒酵母或细菌大肠杆菌等生物中，HPP是酪氨酸前体，并且其是通过预苯酸脱氢酶(本文此后简称为TOH)的作用合成的，所述预苯酸脱氢酶将预苯酸转变为 HPP (Lingens 等人，(1967) European J. Biochem I :363-374 ;Sampathkumar 和Morrisson (1982) ,Bioch Biophys Acta 701:204-211)。在这些生物中，HPP 的生产因而与芳香族氨基酸生物合成途径(莽草酸途径)而不与酪氨酸降解途径直接连结。HPPD的抑制导致光合作用的解偶联、辅助光收获色素的缺乏以及最重要地，由于缺乏正常情况下由类胡萝卜素提供的光保护而导致的叶绿素II被UV辐射和活性氧类破坏(褪色)(Norris等人(1995) ,Plant Cell 7:2139-2149)。光合作用活性的组织的褪色导致生长抑制和植物死亡。抑制HPro、以及特异性地与该酶结合以抑制HPP转化为尿黑酸的一些分子被证明是非常有效的选择性除草剂。
目前大部分可商购的HPro抑制剂型除草剂属于以下四个化学物家族之一I)三酮类，例如磺草酮(sulcotrione)[即2_[2_氯_4_(甲磺酰基)苯甲酰]-I，3-环己二酮]、甲基磺草酮(mesotrione)[即2- [4-(甲磺酰基)_2_硝基苯甲酰]-I，3-环己二酮]、环磺酮(tembotrione)[即2_[2_氯_4_(甲磺酰基)_3_[ (2，2，2，-三-氟乙氧基)甲基]苯甲酰]-1，3-环-己二酮]、庄无忌(tefuryltrione)[即2-[2-氯_4_(甲磺酰基)-3_[[(四氢-2-呋喃基)甲氧基]甲基]苯甲酰]-1，3-环-己二酮]]、双环吡喃酮(bicyclopyrone)[即4_轻基_3_[ [2_[ (2_甲氧乙氧基)甲基]_6_(三氟甲基)_3_卩比唳基]羰基]二环[3. 2. I]辛-3-烯-2-酮]、苯并双环酮(Benzobicyclon)[即3-(2-氯-4-甲磺酰基苯甲酰)-2-苯硫基双环[3. 2. I]辛-2-烯-4-酮]。2) 二酮腈类，例如2-氰基-3-环丙基-I- (2-甲磺酰基-4-三氟甲基苯基)-丙烷-1，3-二酮和2-氰基-1-[4-(甲磺酰基)_2三氟甲基苯基]-3-(1-甲基环丙基)丙烷-1，3-二酮；3)异藥唑类，例如异·氟草(isoxafIutole)[即(5-环丙基-4-异1 唑基)[2-(甲磺酰基)-4-(三氟甲基)苯基]甲酮]。在植物中，异碟氟草被迅速代谢为DKN，DKN是二酮腈化合物，表现出HPH)抑制剂性质；和4)卩比唑特类，例如苯卩比唑草酮(topramezone)[即[3_(4，5_ 二轻基_3_异^唑基)-2-甲基4-(甲磺酰基)苯基](5-羟基-I-甲基-IH-吡唑-4-基)甲酮]，以及口5^^8111;1^01016[(5-轻基-1,3-二甲基卩比唑-4-基(2_甲磺酰基_4_三氟甲基苯基)甲酮]、节草唑(pyrazofen) [2-[4-(2,4-二氯苯甲酰)-I, 3-二甲基卩比唑-5-基氧]乙酰苯]。这些HPro抑制性除草剂可在表现代谢耐受的农作物植物(例如玉米(Zea mays))中用于对抗草和/或宽叶杂草，在这些农作物植物中它们被迅速降解(Schulz等人，(1993). FEBS letters, 318,162-166 ;Mitchell 等人，(2001) Pest Management Science,第57 卷，120-128 ；Garcia 等人，(2000)Biochem.，39，7501-7507 ；Pallett 等人，(2001)PestManagement Science，第57卷，133-142)。为扩展这些HPH)抑制性除草剂的范围，进行了许多努力以赋予植物，特别地没有代谢耐受或具有表现不佳的代谢耐受的植物在农艺田间条件下可接受的耐受水平。除了绕过HPro介导的尿黑酸生产的尝试外(美国专利6，812，010)，进行了对敏感酶的过表达以此在植物中生产相对于除草剂足够的大量靶酶(W096/38567)。HPTO的过表达导致对异5恶氟草(IFT)的二酮腈衍生物(DKN)的更好的出苗前耐受，但耐受不足以耐受出苗后处理(Matringe 等人,(2005), Pest Management Science 61 :269-276)。第三种策略是使HPro突变以获得靶酶，该靶酶在保留其催化HPP转化为尿黑酸的性质的同时，相比突变前的天然HPro对HPro抑制剂敏感性较低。这一策略已成功应用于生产对属于二酮腈类家族的两种HPro抑制性除草剂(W099/24585)，2-氰基-3-环丙基-I- (2-甲磺酰基_4_三氟甲基苯基)-丙烷-I，3- 二酮和
2-氰基-I-[4-(甲磺酰基)-2-三氟甲基苯基]-3-(I-甲基环丙基)丙烷-I，3-二酮耐受的植物(EP496630)。Pro215Leu、Gly336Glu、Gly336Ile 以及更特别地 Gly336Trp (突变的氨基酸的位置是参考假单胞菌HPH)说明的)被鉴定为对出苗前用这些二酮腈类除草剂处理的耐受增加而不引起酶活性变动的原因。最近，将假单胞菌HPro基因导入烟草和大豆质体基因组显示比核转化更高效，甚至赋予对异flT恶氟草出苗后应用异遞氟草的耐受(Dufourmantel等人，2007, PlantBiotechnol J. 5(1) :118-33)。 在WO 04/024928中，发明人寻求通过增加HPP前体进入这些植物细胞中的流量，增加植物细胞中异戊二烯醌的生物合成(例如质体醌、生育酚的合成)。这是通过过表达PDH酶，通过连接所述前体的合成与“莽草酸”途径完成的。他们也注意到，用编码PDH酶的基因转化植物使得可能增加所述植物对HPH)抑制剂的耐受性。在专利申请WO 2009/144079中，公开了下文所述核酸序列及其用于获得对HPH)抑制剂型除草剂耐受的植物的用途，所述核酸序列编码在荧光假单胞菌(Pseudomonasfluorescens)HPPD蛋白质的第336位置突变的羟苯基丙酮酸双加氧酶(HPPD)。在WO 2002/046387中，鉴定了可能与赋予对多种HPH)抑制剂型除草剂耐受相关的、源自植物的HPro蛋白质的若干个结构域，但没有已显示的植物体内或生物化学的数据来验证所述结构域功能的影响。在WO 2008/150473中，例示了两种截然不同的耐受机制——编码突变体HPTO酶的经修饰的燕麦基因和CYP450玉米单加氧酶(nsf I基因)的组合，以获得对HPTO抑制剂型除草剂改善的耐受，但没有公开证明基于两种蛋白质组合的协同作用的数据。尽管对表现对多种HPro抑制剂型除草剂耐受的植物的开发获得了一些成功，开发和/或改善植物对较新的或若干不同HPro抑制剂的耐受，特别地属于三酮类(例如磺草酮、甲基磺草酮、环磺酮、苯并双环酮和双环吡喃酮)和吡唑特类(例如苯吡唑草酮和pyrasulfotole)的HPF1D抑制剂的耐受依然是必要的。发明描述本发明因而涉及生成含有可获得自或获得自属于红球菌属的生物的编码HPH)蛋白质的基因及其变体或突变体的转基因植物，更特别地涉及来自属于红球菌属某种(Rhodococcus sp.)的生物的基因及其变体或突变体，更特别地涉及来自属于红球菌属RHAl种的菌株的生物的基因及其变体或突变体，所述基因编码具有催化对羟苯基丙酮酸转化为尿黑酸的性质的HPH)酶，并且所述植物比不含有任何此类编码HPH)的转基因的植物对HPro抑制剂较不敏感。更特别地，本发明因而涉及生成含有可获得自或获得自属于红球菌属的生物的编码HPro蛋白质的基因及其变体或突变体的转基因植物，更特别地涉及来自属于红球菌属某种(Rhodococcus sp.)的生物的基因及其变体或突变体，更特别地涉及来自属于红球菌属RHAl种的菌株的生物的基因及其变体或突变体，最特别地涉及来自属于分离群ro03041或ι·ο02040的生物的基因及其变体或突变体，所述基因编码具有催化对羟苯基丙酮酸转化为尿黑酸的性质的HPro酶，并且所述植物比不含有任何此类HPro转基因的植物对HPro抑制剂较不敏感。将来自红球菌属RHAl种，更特别地来自属于分离群ro03041或ι·Ο02040、编码HPro蛋白质的基因选作优秀的HPro抑制剂耐受候选基因，这是由于根据在HPro蛋白中实验和结构所确定的，与已经作为HPro抑制剂型除草剂敏感的参考分子的敏感的拟南芥HPPD蛋白质相比，所述基因在与HPro抑制剂耐受相关的位置处的氨基酸组成高度趋异。在一个实施方式中，本发明涉及本文命名为“本发明的HPro蛋白质”或“红球菌HPro蛋白质”的HPro蛋白质，所述HPro蛋白质是与SEQ ID NO. 4从第2位至第皿位氨基酸的氨基酸序列，特别地与SEQ ID NO. 4、5、6或7中的任一个、优选地SEQ ID NO. 6的氨基酸序列，和/或与SEQ ID NO. 18从第2位至第_位氨基酸的氨基酸序列，特别地与SEQID NO. 18、19、20或21中的任一个、优选地SEQ ID NO. 20的氨基酸序列具有至少80%、至少85 %、至少90 %、至少95 %、至少97 %、至少98 %或至少99 %氨基酸序列同一性的HPTO蛋白质。
在其他实施方式中，本发明涉及从ro03041分离的，本文命名为“本发明的HPH)蛋白质ro03041”或“红球菌ro03041HPro蛋白质”的HPH)蛋白质，所述HPH)蛋白质是与SEQID NO. 4从第2位至第401位的氨基酸序列，特别地与SEQ ID NO. 4、5、6、7中的任一个、优选地SEQ ID NO. 6的氨基酸序列具有至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少97%、至少98%或至少99%氨基酸序列同一性的HPH)蛋白质，并且其中来自SEQ IDNO. 4的第207位至第401位氨基酸的任何氨基酸可以被天然存在的氨基酸修改，优选地可以是任何保守替换。在其他实施方式中，本发明涉及从ro02040分离的，本文命名为“本发明的HPTO蛋白质ro02040”或“红球菌ro02040HPro蛋白质”的HPH)蛋白质，所述HPH)蛋白质是与SEQID NO. 18从第2位至第402位氨基酸的氨基酸序列，特别地与SEQ ID NO. 18、19、20、21中的任一个、优选地SEQ ID NO. 20的氨基酸序列具有至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少97%、至少98%或至少99%氨基酸序列同一性的HPH)蛋白质，并且其中来自SEQ ID NO. 18的第208位至第402位氨基酸的任何氨基酸可以被任何天然存在的氨基酸修改，优选地可以是任何保守替换。在其他的实施方式中，本发明涉及本文命名为“本发明的HPro蛋白质”或“来自分离群ro03041的红球菌HPro蛋白质”的HPTO蛋白质，所述HPTO蛋白质是与SEQ ID NO. 4从第2位至第401位氨基酸的氨基酸序列，特别地与SEQ ID NO. 4、5、6、7中的任一个，优选地SEQ ID NO. 6的氨基酸序列具有至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少97%、至少98%或至少99%的氨基酸序列同一性的HPH)蛋白质，并且所述HPTO蛋白质在由括号中给出的编号确定的位置处(涉及SEQ ID No. 4的编号)具有一个或多个以下氨基酸，即 His (205)、Ser (248)、Asn (263)、Gln (287)、His (288)、Tyr (317)、Gln (354)、Phe (367)、Glu (369)、Gly (380)和 Asn (383)。在其他实施方式中，本发明涉及本文命名为“本发明的HPro蛋白质”或“来自分离群ro03041的红球菌HPro蛋白质”的HPTO蛋白质，所述HPTO蛋白质是与SEQ ID NO. 4从第2位至第401位氨基酸的氨基酸序列，特别地与SEQ ID NO. 4、5、6、7中的任一个，优选地SEQ ID NO. 6的氨基酸序列具有至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少97%、至少98%或至少99%的氨基酸序列同一性的HPH)蛋白质，并且在表(i)第2列给出的各自的位置的原有氨基酸可以被表(i)第3列列出的任何氨基酸替换。表I在SEQ ID 在 SEQ IDNo. 4 中的 No. 4 中
权利要求
1.包含与可在植物中表达的启动子有效连接的编码序列的嵌合基因，其特征在于编码序列包含编码红球菌属(Rhodococcus)羟苯基丙酮酸双加氧酶(HPPD)蛋白质，或与红球菌属HPro蛋白质具有至少80%的序列同一性的蛋白质的核酸序列。
2.根据权利要求ι的嵌合基因，其特征在于HPro蛋白质是红球菌属某种HPro蛋白质或与红球菌属某种HPro蛋白质具有至少80%序列同一性的蛋白质。
3.权利要求I或2的嵌合基因，其中可以通过使用与SEQID No. I或SEQ ID No. 15的DNA杂交的至少20个核苷酸的引物或探针从红球菌属DNA获得编码所述蛋白质的DNA。
4.根据权利要求I至3任一项的嵌合基因，其特征在于所述嵌合基因编码包含SEQIDNo. 4从第2位氨基酸至第401位氨基酸或SEQ ID No. 18从第2位氨基酸至第402位氨基酸的氨基酸序列的HPH)蛋白质，或者与SEQ ID No. 4从第2位氨基酸至第401位氨基酸、SEQ ID No. 18从第2位氨基酸至第402位氨基酸的氨基酸序列具有至少80%序列同一性的蛋白质。
5.根据权利要求I至4任一项的嵌合基因，其特征在于所述嵌合基因编码HPro蛋白质序列并且包含SEQ ID No. 3从第400位核苷酸至第1602位核苷酸的核苷酸序列，或SEQ IDNo. 17从第400位核苷酸至第1605位核苷酸的核苷酸序列，或者在严格杂交条件下与此类序列杂交的DNA。
6.根据权利要求I至5的嵌合基因，其特征在于所述嵌合基因在HPH)编码序列下游包含编码在植物中有活性的转运肽的核酸序列，使得转运肽/HPro融合蛋白质被所述嵌合基因编码。
7.包含根据权利要求I至6任一项的至少一个嵌合基因的载体。
8.植物细胞、植物部分、植物或种子，其特征在于其包含根据权利要求I至7任一项的嵌合基因。
9.权利要求8所述的植物细胞、植物部分、植物或种子，其也包含编码PDH酶的嵌合基因。
10.权利要求8或9所述的植物细胞、植物部分、植物或种子，还包含赋予对生长调节物，优选地对2，4-D或麦草畏(dicamba)，和/或抑制乙酰乳酸合酶(ALS)、EPSP合酶(EPSPS)和/或谷氨酰胺合酶(GS)的除草剂耐受的一种或多种嵌合基因。
11.获得对HPH)抑制剂型除草剂耐受的植物的方法，其特征在于将根据权利要求I至6之一的嵌合基因引入所述植物。
12.在含有或待种植根据权利要求8、9或10的植物或种子的区域或田地中控制杂草的方法，所述方法包括向所述区域或田地使用对所述杂草是毒性的剂量的HPH)抑制剂型除草剂，而不显著地影响根据权利要求8、9或10的种子或植物。
13.根据权利要求12的控制杂草的方法，其特征在于HPH)抑制剂选自异$恶氟草(isoxafIutole)、环横酮(tembotrione)、甲基横草酮(mesotrione)、横草酮(sulcotrione)、pyrasulfotole、苯卩比唑草酮(topramezone)、2_ 氰基-3-环丙基 _1_ (2_S02CH3_4_CF3 苯基)丙烧 _1，3_ _■丽和 2_ 氛基 _3_ 环丙基-I- (2_S02CH3_4_2，3C12苯基)丙烧_1，3_ 二酮、双环卩比喃酮(bicyclopyrone)、苯并双环酮(benzobicyclon)、庄无忌(tefuryltrione)、二酮臆(diketonitrile)和节草唑(pyrazoxyfen)。
14.获得油或膳食的方法，包括种植根据权利要求8、9或10的植物，任选地用HPH)抑制剂型除草剂处理此类植物，收获种粒并碾磨种粒以制造膳食并任选地提取油。
15.红球菌属HPro或与红球菌属HPro具有至少75%序列同一性的HPro使植物对HPro抑制剂型除草剂耐受的用途。
16.权利要求15的用途，其中HPro抑制剂型除草剂选自异’恶氟草、环磺酮、甲基磺草酮、磺草酮、pyrasulfotole、苯批唑草酮、2-氰基_3_环丙基-I-(2-S02CH3-4_CF3苯基)丙烧_1，3_ 二丽和2_氛基_3_环丙基-I-(2-S02CH3-4_2, 3C12苯基)丙烧_1，3- 二丽、双环吡喃酮、苯并双环酮、庄无忌、二酮腈和苄草唑。
全文摘要
本发明涉及从属于红球菌属(Rhodococcus)的细菌获得的编码羟苯基丙酮酸双加氧酶(EC 1.13.11.27，本文简称为HPPD)的核酸序列及其所编码的蛋白质，包含所述核酸序列的嵌合基因，以及所述核酸序列、蛋白质或嵌合基因在获得对HPPD除草剂耐受的植物中的用途。
文档编号C12N9/02GK102869769SQ201080064547
公开日2013年1月9日 申请日期2010年12月22日 优先权日2009年12月23日
发明者F·波雷, B·拉博尔, N·克尼特尔-奥特勒本, G·朗格, A·舒尔茨, R·海因 申请人:拜尔知识产权有限公司