专利名称：对hppd抑制剂型除草剂耐受的植物的制作方法
对HPPD抑制剂型除草剂耐受的植物导言本发明涉及编码从属于赭纤虫科(Blepharismidae)的原生生物获得的轻苯基丙酮酸双加氧酶(EC I. 13. 11. 27，本文中缩写为HPH))的核酸序列，以及由其编码的蛋白质，还涉及包含此类核酸序列的嵌合基因，还涉及此类核酸序列、蛋白质或嵌合基因用于获得对HPH)抑制剂型除草剂耐受的植物的用途。
背景技术：
HPPD是催化酪氨酸降解产物对羟苯基丙酮酸(本文中缩写为HPP)转化为尿黑酸(本文中缩写为HG)的反应的酶，尿黑酸是植物中生育酚和质体醌的前体(Crouch N. P.等人(1997)Tetrahedron,53,20,6993-7010, Fritze 等人,(2004), Plant Physiology 1 34 1388-1400)。生育酚作为膜连结的抗氧化剂发挥作用。质体醌首先作为PSII和细胞色素b6/f复合体之间的电子载体发挥作用，其次，其是八氢番茄红素不饱和酶(參与类胡萝卜素的生物合成)的氧化还原辅因子。迄今为止，NCBI数据库中存在的超过700条来自多种生物的核酸序列被注释为编码具有HPH)结构域的推定蛋白质，包括UniProtKB/TrEMBL数据库中给出的A8R3H6检录号下以及NCBI蛋白质数据库中给出的BAF91881检录号下公开的序列。但对那些中的大多数(包括对应于检录号A8R3H6/BAF91881的序列)而言，尚未在体外检验或植物内手段中证明所述蛋白质具有HPH)酶促活性，也没有证明此类HPH)蛋白在植物中表达时可赋予针对HPro抑制剂型除草剂的除草剂耐受性。在本领域范畴内已经描述了若干HPro蛋白及其ー级序列，特别是细菌(例如假单胞菌属(Ruetschi等人，Eur. J. Biochem. ,205,459-466,1992, WO 96/38567))、植物(例如拟南芥属(W0 96/38567，GenebankAF047834)、胡萝卜(W0 96/38567，Genebank 87257)、燕麦(Avena sativa) (TO 02/046387)、小麦(TO02/046387)、宽叶臂形草(Brachiaria platyphylla) (W0 02/046387)、蔡藜草(Cenchrusechinatus) (W002/046387)、硬直黒麦草(Lolium rigidum) (W0 02/046387)、苇叶羊茅(Festuca arundinacea) (W0 02/046387)、狗尾草(Setaria faberi) (W0 02/046387)、牛筋草(Eleusine indica) (W0 02/046387)、高梁属(Sorghum) (W0 02/046387)、球抱子菌属(Coccicoides) (Genebank C0ITRP)、日本黄连(Coptis japonica) (W0 06/132270)、莱茵衣藻(Chlamydomonas reinhardtii) (ES 2275365))或哺乳动物(例如小鼠或猪)的 HPPD 蛋白。指出的參考文献中公开的相应序列通过引用并入本文。大多数植物通过arrogenate 合成酪氨酸(Abou-Zeid 等人(1995), Applied EnvMicrob 41 :1298-1302 ;Bonner 等人，(1995)，Plant CellsPhysiol. 36,1013-1022 ；Byng等人，(1981), Phytochemistry 6 :1289-1292 ；Connely and Conn(1986), Z. Naturforsch41c :69-78 ；Gaines 等人，(1982)，Plants 156 :233-240)。在这些植物中，HPP 仅源于酪氨酸的降解。另ー方面，在例如酿酒酵母的酵母或大肠杆菌的细菌等的生物中，HPP是酪氨酸前体，并且通过预苯酸脱氢酶(prephenate dehydrogenase,下文中称为F1DH)的作用(将预苯酸转化为 HPP)来合成(Lingens 等人，(1967)European J. Biochem 1:363-374;Sampathkumar and Morrisson (1982), Bioch Biophys Acta 701:204-211)。在这些生物中，HPP的生产因此直接与芳香族氨基酸生物合成途径(莽草酸途径)相关联，而不与酪氨酸降解途径相关联。对HPro的抑制导致光合作用的解偶联，缺乏辅助捕光色素(accessorylight-harvesting pigments),以及最重要地，由于缺少正常情况下由类胡萝卜素提供的光保护导致的UV照射和活性氧类别对叶绿体的破坏(褪色)(Norris等人(1995), PlantCell 7:2139-2149)。光合活性组织的褪色导致生长抑制和植物死亡。已证明，抑制HPro并且与该酶特异性结合以抑制HPP向尿黑酸的转化的ー些分子是非常有效的选择性除草剤。目前，大多数可商业获得的HPro抑制剂型除草剂属于这四个化学家族之一I)三酮类，例如，磺草酮[即2-[2-氯-4-(甲基磺酰基)苯甲酰基]-1，3-环己ニ酮]，甲基磺草酮[即2- [4-(甲基磺酰基)-2-硝基苯甲酰基]-I，3-环己ニ酮];环磺酮 (化1^0廿101^)[8卩2-[2-氯-4-(甲基磺酰基)-3-[(2，2，2，_三-氟こ氧基)甲基]苯甲酰基]-1, 3-环-己ニ酮];庄无忌(tefuryltrione)[即2-[2-氯-4_(甲基磺酰基)-3_[[(四氢-2-呋喃基)甲氧基]甲基]苯甲酰基]-1,3-环己ニ酮]];13；^5^10ロ5^0116[即4-轻基~3-[ [2-[ (2-甲氧基こ氧基)甲基]-6- ( ニ氟甲基)-3-卩比唳基]羰基]ニ环[3. 2. I]辛-3-烯-2-酮];双环磺草酮(Benzobicyclon)[即3- (2-氯-4-甲磺酰基苯甲酰基)-2-苯基硫代ニ环[3. 2. I]羊-2-烯-4-酮]2) ニ酮腈类，例如2-氰基-3-环丙基-1-(2-甲基磺酰基-4-三氟甲基苯基)-丙-1，3- ニ酮和2-氰基-I- [4-(甲基磺酰基)-2-三氟甲基苯基]-3-(1-甲基环丙基)丙-1，3_ ニ酮；3)异’恶唑类，例如异-愚氟草[即(5-环丙基-4-异’恶唑基)[2_(甲基磺酰基)-4-(三氟甲基)苯基]甲酮]。在植物中，异讓氟草被快速代谢为DKN (展示出HPH)抑制剂性质的ニ酮腈类化合物)；和4)pyrazolinate,例如苯批唑草丽(topramezone)[即[3_(4, 5_ 二氧 _3_ 异
唑基)-2-甲基-4-(甲基磺酰基)苯基](5-羟基-I-甲基-IH-吡唑-4-基)甲酮]和pyrasulfotole [ (5_轻基-I, 3_ ニ甲基卩比唑_4_基(2_甲横酸基-4-三氣甲基苯基(trifIuaromethylphenyl))甲酮]；pyrazofen[2_[4_(2,4_ ニ氯苯甲酸基)-I, 3_ ニ 甲基吡唑-5-基氧]苯こ酮]。这些抑制HPro的除草剂可在展现出代谢耐受性的作物植物(例如玉米(Zeamays),它们在其中被迅速降解)中使用以抵挡草(grass)和/或阔叶杂草(Schulz等人，(1993). FEBS letters,318,162-166 ;Mitchell 等人，(2001)Pest Management Science,Vol 57,120-128 ;Garcia 等人，(2000)Biochem.，39，7501-7507 ;Pallett 等人，(2001)PestManagement Science, Vol 57，133-142)。为拓展这些抑制HPH)的除草剂的范围，进行了若干努力，以向植物(特别是没有代谢耐受性或代谢耐受性运作欠佳的植物)赋予在农艺学田间条件下可接受的耐受性水平。除了分流HPro介导的尿黑酸生产(US 6,812,010)的尝试之外，还已过表达敏感型(sensitive)酶，以在植物中以相对除草剂来说足够的量生产靶标酶(W096/38567)。HPH)的过表达导致对异ず恶氟草(IFT)的ニ酮腈类衍生物(DKN)的更好的出苗前(pre-emergence)耐受性，但是就针对出苗后处理的耐受性而言，耐受性是不足的(Matringe 等人，(2005)，Pest Management Science 61 :269-276)。第三种策略是突变HPro，以获得下述靶标酶，其保留有其催化HPP转化为尿黑酸的性质，同时对HPro抑制剂不如突变前的天然HPro敏感。该策略已成功应用于生产对2-氰基-3-环丙基-1-(2-甲基磺酰基-4-三氟甲基苯基)-丙-1，3- ニ酮和2-氰基-I- [4-(甲基磺酰基)-2-三氟甲基苯基]-3-(1-甲基环丙基)丙-1，3_ ニ酮(属于ニ酮腈类家族的两种抑制HPH)的除草剂(W0 99/24585))耐受的植物(EP496630)。Pro215Leu、Gly336Glu、Gly336Ile 和更特别地 Gly336Trp (突变的氨基酸的位置是參照假单胞菌属HPH)示出的)被鉴定为负责于针对用这些ニ酮腈类除草剂进行的出苗前处理的増加的耐受性的突变，并且它们不造成酶活性的变化。更近来地，将假单胞菌属HPro基因引入烟草和大豆的质体基因组已显示出比核转化更为有效，其甚至赋予了针对异P恶氟草的出苗后应用的耐受性(Dufourmantel等人，2007, Plant Biotechnol J. 5(I) :118-33)。 在WO 04/024928中，发明人已寻求通过增加HPP前体进入这些植物的细胞的通量来增加异戍ニ烯基醌(prenylquinone)在植物细胞中的生物合成(例如质体醌、生物酹的合成)。这已经通过PDH酶的过表达将所述前体的合成与“莽草酸”途径关联来进行了。他们还提到，用编码I3DH酶的基因转化植物使得增加所述植物对HPH)抑制剂的耐受性成为可倉^:。在专利申请WO 2009/144079中，公开了编码在荧光假单胞菌的HPH)蛋白的第336位突变的羟苯基丙酮酸双加氧酶(HPPD)的核酸序列及其用于获得对HPH)抑制剂型除草剂耐受的植物的用途。在WO 2002/046387中，已经鉴定来自植物的HPH)蛋白的若干结构域与赋予对多种HPro抑制剂型除草剂的耐受性相关，但是既没有显示植物内数据也没有显示生物化学数据来验证所描述的结构域功能的影响。在WO 2008/150473中，示例了两种不同的耐受性机制——经修饰的编码突变体HPH)酶的燕麦基因和CYP450玉蜀黍单加氧酶(nsfl基因)的组合，以获得改进的针对HPTO抑制剂型除草剂的耐受性，但是没有公开证实基于两种蛋白质的组合的协同效果的数据。尽管开发显示出针对上文所述的若干HPro抑制剂型除草剂耐受的植物获得了成功，但仍需要开发和/或改进植物对较新的或对若干不同的HPro抑制剂的耐受性，特别是对属于三酮类(例如磺草酮、甲基磺草酮、环磺酮、双环磺草酮和bicyclopyrone)和pyrazolinate (例如,苯卩比唑草酮和Dyrasulfotole)的类别的HPF1D抑制剂的耐受性。发明描述本发明因此涉及转基因植物的生产，所述转基因植物含有编码可从或从属于赭纤虫科的生物获得的HPro蛋白质的基因及其变体或突变体，更尤其涉及来自属于赭纤虫属(Bkpharisma)的生物的编码展示出能催化对羟苯基丙酮酸到尿黑酸的转化的性质的HPPD酶的基因，其变体或突变体，并且所述植物较之不含任何此类HPH)编码转基因的植物而言对HPro抑制剂更不敏感。来自赭纤虫科的编码HPro蛋白质的基因被选为优秀的HPro抑制剂耐受的候选者，这是因为它们较之敏感的拟南芥属HPro蛋白质(被用作为对HPro抑制剂型除草剂敏感的參照分子)而言在与HPro抑制剂耐受性相关的位置上的氨基酸组成上具有高分岐性，这是在HPro蛋白质中以实验和结构方式測定的。更具体地，本发明因此涉及对下述转基因植物的生产，所述转基因植物含有可从或从属于赭纤虫科的生物(尤其是赭纤虫属，更尤其是从日本赭纤虫(Bkpharismajaponicum)种获得的)获得的、编码展示出能催化对羟苯基丙酮酸到尿黑酸的转化的性质的HPH)酶的基因，其变体或突变体，并且所述植物较之不含任何此类HPH)转基因的植物而言对HPro抑制剂更不敏感。在一种实施方式中，本发明涉及本文中命名为“本发明的HPro蛋白质”或“赭纤虫属HPro蛋白质”的HPro蛋白质，其是与SEQ ID No. 4在2至382位氨基酸上的氨基酸序列(特别是与SEQ ID No. 4、5、6或7中任一的氨基酸序列，优选SEQ ID No. 6)具有至少 75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少97%、至少98%或至少99%的氨基酸序列同一性的HPI3D蛋白质。在另ー实施方式中，本发明涉及本文中命名为“本发明的HPro蛋白质”或“赭纤虫属HPro蛋白质”的HPro蛋白质，其是与SEQ ID No. 4在2至382位氨基酸上的氨基酸序列(特别是与SEQ ID Nos. 4、5、6或7中任一的氨基酸序列，优选SEQ ID No. 6)具有至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少97%、至少98%或至少99%的氨基酸序列同一性的HPH)蛋白质，并且其中SEQ ID No. 4的第185位至第382位的任何氨基酸可改为任何天然存在的氨基酸，优选地，其可以是任何保守取代。在另ー实施方式中，本发明涉及本文中命名为“本发明的HPro蛋白质”或“赭纤虫属HPro蛋白质”的HPro蛋白质，其是与SEQ ID No. 4在2至382位氨基酸上的氨基酸序列(特别是与SEQ ID Nos. 4、5、6或7中任一的氨基酸序列，优选SEQ ID No. 6)具有至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少97%、至少98%或至少99%的氨基酸序列同一性的HPH)蛋白质，并且其在括号给出的其编号(相对于SEQID No. 4的编号)所定义的位置上具有下述氨基酸中的ー个或多个，即，His (183)、Ser (226)、Asn (241)、Gln (265)、His (266)、Tyr (295)、Gln (334)、Phe (347)、Glu (349)、Gly (360)和 Asn (363)。在另ー实施方式中，本发明涉及本文中命名为“本发明的HPro蛋白质”或“KordiaHPro蛋白质”的HPro蛋白质，其是与SEQ ID No. 4在2至382位氨基酸上的氨基酸序列(特别是与SEQ ID Nos. 4、5、6或7中任一的氨基酸序列，优选SEQ ID No. 6)具有至少75%、至少80 %、至少85 %、至少90 %、至少95 %、至少97 %、至少98 %或至少99 %的氨基酸序列同一性的HPH)蛋白质，并且在表(i)的第二列给出的各位置上，原来出现的氨基酸可被表
(i)第三列中列出的氨基酸中的任何取代。表⑴
权利要求
1.包含与可在植物中表达的启动子有效连接的编码序列的嵌合基因，其特征在于，所述编码序列包含编码赭纤虫属羟苯基丙酮酸双加氧酶(HPPD)蛋白质或与赭纤虫属HPro蛋白质具有至少75 %序列同一性的蛋白质的核酸序列。
2.根据权利要求I的嵌合基因，其特征在于，HPro蛋白质是日本赭纤虫HPro蛋白质或与日本赭纤虫HPro蛋白质具有至少75%序列同一性的蛋白质。
3.权利要求I或2的嵌合基因，其中编码所述蛋白质的DNA可通过使用至少20个核苷酸的引物或探针从赭纤虫属DNA获得，所述引物或探针与SEQ ID No. I的DNA杂交。
4.根据权利要求I至3中任意一项所述的嵌合基因，其特征在于，其编码包含SEQIDNo. 4从第2位氨基酸至第382位氨基酸的氨基酸序列的HPH)蛋白质，或者与SEQ ID No. 4从第2位氨基酸至第382位氨基酸的氨基酸序列具有至少75%序列同一性的蛋白质。
5.根据权利要求I至4中任意一项所述的嵌合基因，其特征在于，其编码HPH)蛋白质序列，并且包含SEQ ID No. 3从第400位核苷酸至第1542位核苷酸的核苷酸序列，或者是在严格杂交条件下与此类序列杂交的DNA。
6.根据权利要求I至5中任意一项所述的嵌合基因，其特征在于，其在HPH)编码序列的下游包含编码在植物中具有活性的转运肽的核酸序列，使得转运肽/HPro融合蛋白被所述嵌合基因编码。
7.包含根据权利要求I至6中任意一项所述的至少一种嵌合基因的载体。
8.植物细胞、植物部分、植物或种子，其特征在于其包含根据权利要求I至7中任意一项所述的嵌合基因。
9.权利要求8的植物细胞、植物部分、植物或种子，其还包含编码PDH酶的嵌合基因。
10.权利要求8或9的植物细胞、植物部分、植物或种子，其还包含赋予对生长调控因子，优选对2，4-D或麦草畏，和/或对抑制乙酰乳酸合酶(ALS)、EPSP合酶(EPSPS)和/或谷氨酰胺合酶(GS)的除草剂的耐受性的一种或多种嵌合基因。
11.获得对HPH)抑制剂型除草剂耐受的植物的方法，其特征在于，将根据权利要求I至6之一的嵌合基因引入所述植物。
12.用于在区域或田间控制杂草的方法，所述区域或田间含有根据权利要求8、9或10的植物或种子，或者待栽种权利要求8、9或10的植物或种子，所述方法包括向所述区域或田间应用对所述杂草来说是毒性的剂量的HPH)抑制剂型除草剂，并且不显著影响根据权利要求8、9或10的种子或植物。
13.根据权利要求12的用于控制杂草的方法，其特征在于，所述HPH)抑制剂选自异^氟草、环磺酮、甲基磺草酮、磺草酮、pyrasulfotole、苯吡唑草酮、2-氰基-3-环丙基 _1_ (2_S02CH3_4_CF3 苯基)丙 _1，3_ _■丽和 2_ 氛基 _3_ 环丙基-I- (2_S02CH3_4_2，3 Cl2苯基)丙-I，3- 二酮、bicyclopyrone、双环磺草酮、庄无忌、二酮腈和节草唑。
14.用于获得油或膳食的方法，所述方法包括种植根据权利要求8、9或10的植物，任选地，用HPH)抑制剂型除草剂处理此类植物，收获种粒，以及碾磨种粒，以制造膳食，以及任选地，提取油。
15.赭纤虫属HPro或者与赭纤虫属HPro具有至少75%序列同一性的HPro用于使得植物对HPro抑制剂型除草剂耐受的用途。
16.权利要求15的用途，其中所述HPro抑制剂型除草剂选自异1*1氟草、环磺酮、甲基横草丽、横草丽、pyrasulfotole、苯卩比唑草丽、2_氛基-3-环丙基-I-(2-S02CH3-4_CF3苯基)丙-1，3- 二丽和 2_ 氛基-3-环丙基-I-(2-S02CH3-4_2，3 Cl2 苯基)丙-1，3- 二丽、 bicyclopyrone、双环磺草酮、庄无忌、二酮腈和节草唑。
全文摘要
本发明涉及编码从属于赭纤虫科的原生生物获得的羟苯基丙酮酸双加氧酶(EC 1.13.11.27，本文中缩写为HPPD)的核酸序列以及由其编码的蛋白，还涉及包含此类核酸序列的嵌合基因，还涉及此类核酸序列、蛋白或嵌合基因用于获得对HPPD抑制剂型除草剂耐受的植物的用途。
文档编号C12N9/02GK102770531SQ201080064559
公开日2012年11月7日 申请日期2010年12月22日 优先权日2009年12月23日
发明者A·舒尔茨, B·拉博尔, F·波雷, G·朗格, N·克尼特尔-奥特勒本, R·海因 申请人:拜尔知识产权有限公司