改进的微生物燃料电池的制作方法

专利名称：改进的微生物燃料电池的制作方法
技术领域：
本申请整体涉及基因修饰生物，特别是在微生物燃料电池中具有改进功能的基因修饰细菌，更特别地涉及具有改进的电力(电子)产生、改进的电子转移、改进的与阳极接触和/或改进的生物膜形成的基因修饰细菌。
背景技术：
一些细菌可通过在通常称为呼吸的过程中将电子从诸如葡萄糖的低电势底物转移到诸如分子氧(O2)的高电势电子受体而获得能量。在真核细胞中，线粒体通过氧化和磷酸化的过程(通常称为氧化磷酸化)获得ATP形式的能量。诸如铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)的革兰氏阴性细菌在产生能量方面类似于真核生物线粒体发挥作用。铜绿假单胞菌是具有单极生鞭毛的革兰氏阴性杆状细菌。作为人条件致病菌，铜绿假单胞菌同时也是植物的条件致病菌。铜绿假单胞菌能够在4°C至42°C的范围下生长。其可以柴油机燃料和喷气燃料为生，在这种情况下其是碳氢化合物利用微生物。其还可以代谢高含硝酸盐的有机材料。铜绿假单胞菌从无数碳源获得电子并且可在有氧、厌氧和厌氧发酵过程(例如，用精氨酸或丙酮酸)中获得电子。在厌氧生长中，铜绿假单胞菌细胞连续偶联氧化和磷酸化以获得能量。在微生物燃料电池形式中，微生物向阳极而不是诸如氧、硝酸盐或硫酸盐的天然受体分子提供电子。已证明包括细菌和真菌的各种类型微生物在代谢期间产生电能，但微生物燃料电池最常用的细菌诸如地杆菌属(Geobacter)或希瓦氏菌属(Shewanella)。地杆菌属细胞以一种干扰大表面积生物膜形成的方式响应于高微生物密度。在微生物燃料电池形式中，微生物的代谢过程产生电子形式的能量，尤其是在厌氧生物膜生长模式中。与利用能量相反，在微生物燃料电池中微生物将来自无数经代谢的底物的电子提供给阳极以通过电路进行转移。该电路输送电流通过负载，所述负载代表待通过电子流执行的工作。所述负载可为发光装置、机械、LCD、电气器具、电池充电器以及许多其他装置。一般而言，诸如细菌的微生物利用称为烟酰胺腺嘌呤二核苷酸或NAD+的辅酶来从原料或底物接受电子并因此使原料或底物氧化。NAD+从反应物底物切下两个氢原子。NAD+接受该氢原子中的一个从而变成NADH并在该过程中获得电子。氢负离子或阳离子被释放。公式如下所示，其中RH2被氧化，从而将NAD+还原成NADH。RH2可以代表诸如葡萄糖的有机底物或诸如有机废弃物的其他有机物质。公式I RH2+NAD+ — NADH+H++RNADH是一种强还原剂，细菌在还原另一底物时用其提供电子。NADH还原另一底物并且同时重新氧化成NAD+。在自然状态中，该另一物质可为氧或硫酸盐。在微生物燃料电池中，该另一物质可为介体或阳极。介体将电子转移到阳极。被阻止从阳极直接移动到阴极的电子，通过外部电路转移到阴极并通过负载执行有用工作。发明概述本申请提供用分离的核酸分子稳定转化的转基因微生物细胞，其中该微生物细胞呈现改变的所关注核苷酸序列(基因)表达和改变的产电功效。在这些微生物细胞的一些方面，分离的核酸分子包含表达盒，该表达盒含有与所关注异源核苷酸序列可操作地连接的启动子。所述细胞可呈现改变的所关注异源核苷酸序列表达，例如在细胞中表达新的或不同的多肽。相比于非转基因细胞(通常称为野生型)中所关注核苷酸序列的表达，转基因(突变)细胞中所关注异源核苷酸序列的表达可被增加。在一个方面，启动子选自包含诱导型启动子和组成型启动子的组。所述转基因微生物细胞还可包含第二表达盒。在本发明的一些方面，第一表达盒可包含第二所关注异源核苷酸序列。在一个实施方案中，分离的核酸分子使所关注内源核苷酸序列中断。在该实施方 案的一些方面，将分离的核酸分子的片段从细胞移除并且所述细胞稳定地保持中断的所关注内源核苷酸序列。在一个方面，微生物细胞呈现降低的所关注内源核苷酸序列表达。在一个实施方案中，微生物细胞选自包含细菌细胞和真菌细胞的组。细菌细胞可选自电子转移细菌的组，包括但不限于假单胞菌属(Pseudomonas)、地杆菌属(Geobacter)、希瓦氏菌属(Shewanella)和红育菌属(Rhodoferax),特别是铜绿假单胞菌和恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)。在一个实施方案中，选自电子转移细菌的组的转基因细菌细胞包含中断的所关注内源核苷酸序列。该中断的所关注内源核苷酸序列选自包含以下的组pilT(SEQ IDN0:l)、pilA(SEQ ID NO:2)、nirS(SEQ ID NO:3)、bdlA(SEQ ID NO:4)、IasI(SEQ ID NO:5)、IasR(SEQ ID NO:6)、ftsZ(SEQ ID NO:7)和 fliC(SEQ ID NO:8) 在一个方面，转基因细菌细胞包含至少两个选自包含PiIT (SEQ ID N0:l)、pilA(SEQ ID NO: 2)、nirS (SEQ ID NO: 3),bdlA(SEQ ID NO:4)、IasI(SEQ ID NO:5)、IasR(SEQ ID NO:6)、ftsZ(SEQ ID N0:7)和fliC(SEQ ID NO:8)的组的中断的所关注内源核苷酸序列。在多个方面，转基因细菌细胞包含至少三个、至少四个、至少五个、至少六个、至少七个或至少八个选自包含PilT (SEQ IDNO:I),piIA(SEQ ID NO:2)、nirS(SEQ ID NO:3)、bdlA(SEQ ID NO:4)、IasI(SEQ ID NO:5)、IasR(SEQ ID NO:6)、ftsZ(SEQ ID NO:7)和 fliC(SEQ ID NO:8)的组的中断的所关注内源核苷酸序列。在一个方面，相比于非转基因细胞，转基因细菌细胞具有降低的增殖能力。在一个方面，相比于非转基因细胞，转基因细菌细胞具有降低的毒性。降低的毒性可在哺乳动物或植物中。在一个方面，相比于非转基因细胞，转基因细菌细胞呈现降低的运动性。在一个方面，相比于非转基因细胞，转基因细菌细胞呈现改变的菌毛粘性。在一个方面，相比于非转基因细胞，转基因细菌细胞呈现改变的蹭行运动性。在一个方面，转基因细菌细胞具有改变的含铁细胞色素浓度，特别是在细胞的胞质膜处或附近的含铁细胞色素浓度。在一个方面，转基因细菌细胞具有改变的通道形成蛋白浓度，特别是细胞外膜的通道形成浓度。在一个方面，当细菌细胞是微生物燃料电池的组分时，转基因细菌细胞呈现增加的电流输出/细菌细胞。在一个方面，转基因细菌呈现增加的直接或间接向阳极的电子转移。在一个实施方案中，本申请提供包含转基因细菌细胞的基质，所述转基因细菌细胞选自电子转移细菌的组并呈现改变的产电功效。在一个方面，基质选自包含海绵、过滤器、小珠、粉末、纸巾、盒、药筒和胶囊的组。在一个实施方案中，本申请提供包含转基因细菌细胞的生物膜，所述转基因细菌细胞选自电子转移细菌的组并呈现改变的产电功效。生物膜厚度在I μ m至300 μ m、10 μ m至 200 μ m、10 μ m 至 30 μ m、和 30 μ m 至 100 μ m 的范围。提供包含转基因细菌细胞的过滤装置，所述转基因细菌细胞选自电子转移细菌的组并呈现改变的产电功效。过滤装置可包含含有转基因细菌细胞的生物膜。该过滤装置可进一步包含指示器。过滤装置可为液体材料过滤装置或气体材料过滤装置。在气体材料过滤器的方面，转基因细菌利用温室气体作为原料。温室气体可选自包含二氧化碳、no2、no3、
SO2、甲烧、N2O和SO3的组。一个实施方案提供包含转基因细菌细胞、阳极室和阴极室的微生物燃料电池，所 述转基因细菌细胞选自电子转移细菌的组并呈现改变的产电功效。在一个方面，转基因细菌细胞是铜绿假单胞菌或恶臭假单胞菌。在一个方面，阳极室是可拆卸的。在一个方面，微生物燃料电池包含含有转基因细菌细胞的生物膜，所述转基因细菌细胞选自电子转移细菌的组并且呈现改变的产电功效。在一个方面，生物膜附接到阳极或阴极。在一个方面，生物膜暴露于原料。原料可选自包含以下的组污水、肥料径流、工业废弃物(例如，乳制品、罐装食品、酿造厂、酿酒厂、果蔬汁)、炼油废弃物、公共场所废弃物(学校、医院、疗养院、监狱)、军用物、垃圾渗滤液和动物废弃物。在一个方面，原料为气体材料，可能包含温室气体。在一个方面，原料是循环的；在一个方面，原料是起泡的；在一个方面，原料是静态的。在一个实施方案中，原料可以更换。在一个实施方案中，在阳极室中在生物膜周围保持厌氧条件。在一个方面，可将阳极室用诸如多肽或小肽的生物膜抑制剂预处理。在一个实施方案中，微生物燃料电池还包含介体。介体可为外源介体或菌毛。介体可选自包含以下的组硫堇、甲基紫精、亚甲蓝、腐植酸、中性红、绿脓素、红脓素(pyorubrin)、黑脓素(pyomelanin)、I-轻基-吩嗪和尿黑酸。在一个方面,介体呈现杀菌或抑菌活性。本申请提供用于检测至少一种预定化合物的传感器，该传感器包含含有转基因细菌细胞和指示器的微生物燃料电池。指示器可为可视的或可听的。指示器可指示预定化合物的异常水平。传感器还可包含用于检测第二预定化合物的第二转基因细菌细胞。在一个实施方案中，微生物燃料电池还包含超级电容器。在一个方面，微生物燃料电池还包含水转移组件。在各个方面，水转移组件将由微生物燃料电池产生的水转移到集水装置或外部环境。在一个方面，微生物燃料电池还包含氢转移组件并且还可包含氢燃料电池。提供了包含微生物燃料电池的生物修复系统，该微生物燃料电池含有具有改变的产电功效的转基因细菌。生物修复系统的转基因细胞利用预定化合物作为原料。预定化合物可选自包含甲烷、温室气体和铀的组。在该系统的一个方面，转基因细菌细胞将预定化合物转化成第二化合物。本申请提供产电功效盒。该产电功效盒是含有表达盒的分离的核酸分子，所述表达盒包含与所关注第一核苷酸序列可操作地连接的启动子，其中所关注第一核苷酸序列编码改变产电功效的多肽。分离的核酸分子还可包含所关注第二核苷酸序列，其中所关注第二核苷酸序列也编码改变产 电功效的多肽。附图
简述图I示出来自利用直径2.5cm的阳极的实验的产电测试数据。小图示出在对应于包含不同微生物的微生物燃料电池的四个不同通道上测量的电压。在所有小图中，电压均以伏特为单位表示在y轴上。时间进展表示在X轴上；对微生物燃料电池监测3. 5天。小图A示出从希瓦氏菌属获得的电压；该电压在整个监测期间增加，达到近O. 2V。小图B(通道I)示出从转基因铜绿假单胞菌获得的电压；该电压在整个监测期间波动，早期峰值介于0.2V和0.22V之间。小图C(通道2)示出从第二转基因铜绿假单胞菌获得的电压；该电压在监测期间早期较高(0.3V)且迅速下降。小图D(通道3)示出从第三转基因铜绿假单胞菌获得的电压；该电压在0.005V和0.05V之间波动。小图E (通道4)示出从第四转基因铜绿假单胞菌(PilT突变体)获得的电压；该电压开始接近O. 5V，然后随着原料被消耗而降低。来自第四转基因铜绿假单胞菌的结果表明所产生的电压超过包含希瓦氏菌属的微生物燃料电池中产生的电压。图2示出根据至少一些实施方案的示例性微生物燃料电池。图3示出根据至少一些实施方案的示例性微生物燃料电池系统。图4示出从转基因铜绿假单胞菌(PilT突变体)获得的电压；该电压开始低于0.05V，然后上升至近0.45V。这些电量计测量结果来自单个13ml燃料电池。图5示出串联的三个示例性微生物燃料电池。该装置示出偶联到负载。图6示出从转基因铜绿假单胞菌(PilT突变体)获得的电压；该电压开始介于O. 3V和O. 4V之间，然后上升至近IV。这些电量计测量结果来自串联的三个13ml燃料电池。发明详述可由代谢物产生电流的微生物细胞包括但不限于细菌和真菌。可转移电流至外部元件的细菌细胞包括但不限于集胞藻属(Synechocystis sp)PCC 6803、短芽孢杆菌属(Brevibacillus sp. )PTH1、假单胞菌属、铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)、恶臭假单胞菌属、希瓦氏菌属、奥奈达希瓦氏菌(Shewanella oneidensis)MR_l、腐败希瓦氏菌(Shewanell putrefaciens) IR-1、奥奈达希瓦氏菌DSP10、地杆菌属、硫还原地杆菌(Geobacter sulfurreducens)、金属还原地杆菌(Geobacter metallireducens)、喜温地杆菌(Peletomaculum thermopropionicum)、热自养甲烧热杆菌(Methanothermobacterthermautotrophicus)、人苍白杆菌(Ochrobactrum anthropi)、丁酸梭菌(Clostridiumbutyricum)EG3、乙酸氧化脱硫单胞菌(Desulfuromonas acetoxidans)、铁还原红育菌(Rhodoferax ferrireducens)、嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila) A3、丙酸脱硫叶菌(Desulfobulbus propionicus)、Geopsychrobacter electrodiphilus、Geothrixfermentans、大肠杆菌(Escherichia coli)、沼泽红假单胞菌(Rhodopseudomonaspalustris)、人苍白杆菌YZ-1、脱硫脱硫弧菌(Desulfovibrio desulfuricans)、嗜酸菌属(Acidiphilium sp.) 3. 2Sup5、肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumonia) LI7。可由代谢物产生电流的真菌细胞包括但不限于异常毕赤酵母(Pichia anomala)。参见例如Prasad等(2OO7)Biosens. Bioelectron. 22:26O4-26IO ;Gorby 等(2。。6)Proc.Natl. Acad. Sci.USA 103:11358-11363 ;Pham 等(2008)Appl. Microbiol. Biotechnol. 77:1119-1129 ；和El-Naggar等(2008)Biophys J. 95:L10_L12 ;这些文献全文以引用方式并入本文。能够进行胞外电子转移的微生物细胞有时描述为“胞外产电菌”、“电化学活性微生物”、“产电微生物”、“阳极呼吸微生物”、“电化学活性细菌”和“阳极呼吸细菌”。所谓“产电功效”意指从阳极或阴极转移电子或转移电子至阳极或阴极的能力。这种转移可为直接或间接的(经由介体)。就微生物细胞的产电功效而言，细胞的许多组分或特性影响产电功效。影响产电功效的组分或特性是产电组分或产电特性。这些产电相关的特性包括但不限于生物膜相关的特性例如生物膜形成能力、生物膜密度、在生物膜中存在的耐受性、细胞装填特性、群体感应特性、细胞生长速率、细胞分裂速率、细胞运动性、底物附着、底物粘附、原料的酶加工、氧化、磷酸化、还原、电子转移、蹭行运动性、菌毛形成、细胞间粘附、纳米线形成、纳米线结构、从生物膜分散的能力以及介体相关的特性。产电功效可以使用本领域已知的电压或电流测量装置(万用表和基于计算机的测量技术)进行测量。微生物可通过代谢过程从原料或材料获得能量。在微生物燃料电池中，转基因微生物可以接近原料。在一个实施方案中，原料在阳极室中。在一个实施方案中，原料循环通过阳极。在一个方面，已经认识到，原料和/或转基因微生物可以更换、移除或重新添加。温室气体包括但不限于二氧化碳(CO2)、一氧化二氮(N2O)、甲烧、二氧化硫(SO2)、NO2> NO3和
SO3。铜绿假单胞菌代谢各种原料以产生能量。铜绿假单胞菌可以利用高硝酸盐有机材料，该材料包括但不限于污水、肥料径流、制浆厂流出物和动物废弃物；和诸如柴油机燃料和喷气燃料的碳氢化合物；温室气体，以及具有高硝酸盐浓度的溶液或气体材料。铜绿假单胞菌通过称为菌毛(也称为纳米线)的表面暴露的蛋白质附属物直接并牢固地附着到金属底物。附着的菌毛允许电子以类似于纳米线的方式从细菌转移到不溶性底物。参见Yu等(2007) J. Bionanoscience 1:73-83，该文献全文以引用方式并入本文。铜绿假单胞菌在包括有氧和厌氧条件的各种条件中形成生物膜；厌氧条件导致改善的生物膜形成(Yoon 等，2002. Pseudomonas aeruginosa anaerobic respiration inbiofilms:relationships 至 cystic fibrosis pathogenesis. Dev. Cell. 3:593-603)。在厌氧条件期间，电子被转移到阳极表面。质子(H+)然后可在阴极表面反应从而产生氢气作为副产物。在有氧条件中，铜绿假单胞菌在微生物燃料电池中在阴极处或在浮游(自由游动)生长期间产生水作为副产物。产电组分可包括与产电有关的任何多肽、肽或化合物，包括但不限于转运蛋白、离子转运蛋白、菌毛组分、膜组分、细胞色素、群体感应器、氧化还原活性蛋白、电子转移组分、绿脓素、红脓素、黑脓素、I-羟基-吩嗪或尿黑酸、解偶联剂蛋白(UCPs)、和酶、菌毛蛋白、pi IT (SEQ ID NO: I), bdlA(SEQ ID NO :4), IasI (SEQ ID NO :5), IasR (SEQ ID NO: 6)、nirS(SEQ ID NO:3)、ftsZ(SEQ ID NO:7)、piIA(SEQ ID NO:2)和 fliC(SEQ ID NO:8)。转基因微生物可呈现改变的产电功效。转基因微生物细胞为用分离的核酸分子稳定转化的并呈现改变的所关注核苷酸序列表达的微生物细胞。分离的核酸分子可使所关注内源核苷酸序列中断，从而导致中断的所关注内源核苷酸序列表达改变，或者分离的核酸可包含表达盒，该表达盒含有与所关注异源核苷酸序列可操作地连接的启动子，从而导致改变的所关注异源核苷酸序列表达。已经认识到，转基因微生物可包含多个使基因失活的基因改变或突变；这些可包括一、二、三、四、五、六、七、八、九、十、十一、十二、十三、十四、十五、十六、十七、十八、十九、二十或更多个稳定掺入的突变。这种稳定掺入的突变可引入所关注异源核苷酸序列或使内源核苷酸序列中断。所谓“稳定转化的”意指微生物的基因组已掺入至少一个拷贝的分离的核酸分子。当稳定转化的微生物分裂时，两个子细胞均包含分离的核酸分子的拷贝。设想到转基因微生物包括稳定转化的微生物的子代。本发明涵盖分离的或基本上纯化的核酸组合物。当由重组技术产生时，“分离的”或基本上“纯化的”核酸分子或其生物活性部分基本上不含其他细胞物质或培养基，或者当化学合成时，其基本上不含化学前体或其他化学物。分离的核酸分子可包含从宿主细胞纯化的载体或质粒以及从宿主细胞纯化的载体或质粒的片段。所谓“片段”意指分离的核酸分子的部分。分离的核酸分子的片段可在至少约25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、150、200、250、300、350、400、450、500、550、600、650、700、750、800、850、900、950、1000、1050、I100、I150、1200、1250、1300、1350、1400、1450、1500、1550、1600、1650、1700、1750、1800、1850、1900、1950、2000、2050、2100、2150、2200、2250、2300、2350、2400、2450、2500、2550、2600、2650、2700、2750、2800、2850、2900、2950、3000、3050、3100、3150、3200、3250、3300、3350、3400、3450、3500、3550、3600、3650、3700、3750、3800、3850、3900、3950、4000、4050、4100、4150、4200、4250、4300、4350、4400、4450、4500、4550、4600、4650、4700、4750、4800、4850、4900、4950、4500、4550、4600、4650、4700、4750、4800、4850、4900、4950、5000、5050、5100、5150、5200、5250、5300、5350、5400、5450、5500、5550、5600、5650、5700、或高达分离的核酸分子中所有完整数目的核苷酸的范围并且包括分离的核酸分子中所有完整数目的核苷酸。分离的核酸分子可包含可调控的表达盒。表达盒将包含含有与所关注异源核苷酸序列可操作地连接的启动子核苷酸序列的转录起始区，所述所关注异源核苷酸序列的表达将受启动子的控制。这种表达盒设置有至少一个限制性位点，该限制性位点用于插入将处于调控区的转录调控下的核苷酸序列。该表达盒可另外包含选择标记基因。表达盒将在5’到3’转录方向上包含转录和翻译起始区以及所关注异源核苷酸序列。除了包含用于转录起始和控制的位点，表达盒还可以包含转录终止所需的序列以及在转录区的用于翻译的核糖体结合位点。其他表达调控元件包括起始和终止密码子以及聚腺苷酸化信号。本领域的普通技术人员应该知道许多可用于表达载体的调控序列。这些调控序列描述于例如 Sambrook 等(1989)Molecular Cloning:A Laboratory Manual 第二版，Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N. Y.。包含与异源核苷酸序列可操作地连接的启动子序列的表达盒还可包含至少一个将共转化到生物体中的另外的基因核苷酸序列。或者，另外的序列可提供在另一表达盒上。本文所述的多核苷酸可以与之可操作地连接的调控序列包括用于指导mRNA转录的启动子。这些包括但不限于来自λ噬菌体的左向启动子、来自大肠杆菌的lac、TRP和TAC启动子、来自SV40的早期和晚期启动子、CMV即刻早期启动子、腺病毒早期和晚期启动子以及逆转录病毒长末端重复。除了启动转录的控制区，表达载体还可包含调节转录的区域，例如阻遏物结合物位点和增强子。例子包括SV40增强子、巨细胞病毒即刻早期增强子、多瘤病毒增强子、腺病毒增强子和逆转录病毒LTR增强子。在适当的情况下，其表达将处于本发明的启动子序列的控制之下的异源核苷酸序列以及任何其他核苷酸序列可以进行优化以增加在转化的微生物中的表达。也就是说，这些核苷酸序列可以使用用于提高表达的物种偏好密码子来合成。用于合成物种偏好核苷酸序列的方法是本领域可获得的。参见例如Wada等(1992)Nucleic Acids Res.20(增刊),2111-2118 ;Butkus 等(1998)Clin Exp Pharmacol Physiol Suppl. 25:S28-33 ;和 Sambrook 等(1989)Molecular Cloning:A Laboratory Manual 第二版，Cold SpringHarbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N. Y.,这些文献以引用方式并入本文。已知其他序列改造可用于增强在细胞宿主中的基因表达。可将异源核苷酸序列的G-C含量调整到如通过参考宿主细胞中表达的已知基因而计算的给定细胞宿主的平均水平。如果可能，对序列进行改造以避免预测的发夹二级mRNA结构。表达盒还可包含表达盒构建体中的5’前导序列。这种前导序列可以发挥增强翻译的作用。翻译前导区是本领域已知的并且包括小核糖核酸病毒前导区，例如 EMCV 前导区(脑心肌炎 5’ 非编码区)(Elroy-Stein 等(1989)Proc. Nat. Acad. Sci. USA86:6126-6130);马铃薯Y病毒属前导区，例如TEV前导区(烟草蚀纹病毒)(Allison等(1986)) ;MDMV前导区(玉米矮花叶病毒)(Virology 154:9-20);和人免疫球蛋白重链结合蛋白(BiP) (Macejak等(1991)Nature 353:90-94)。还可以利用其他已知用于增强翻译和/或mRNA稳定性的方法，例如内含子等。在制备表达盒的过程中，可以操作各种DNA片段以便提供正确方向和在适当情况下正确阅读框的DNA序列。为此目的，可以采用衔接子或接头来连接DNA片段，或者可以包括其他操作以提供方便的限制性位点、移除多余DNA、移除限制性位点等等。为此，可以包括体外诱变；引物修补；限制；退火；替换例如转换和颠换；或其任何组合。表达盒中可以包含报告基因或选择标记基因。本领域已知的合适报告基因的例子可见于例如 Ausubel 等(2002) Current Protocols in Molecular Biology. John Wiley &Sons, New York, New York,其以引用方式并入本文。用于选择转化的细胞或组织的选择标记基因可包括赋予抗生素抗性的基因。合适选择标记基因的例子包括但不限于编码抗如下物质的基因庆大霉素Schweizer, H.P. 1993. Small broad-host-range gentamicin resistance gene cassettes forsite-specific insertion and deletion mutagenesis Biotechniques 15:831-833.,羧节青霉素 Parvatiyar 等，2005. Global analysis of cellular factors andresponses involved in Pseudomonas aeruginosa resistance to arsenite.JBacteriol187:4853-64.,氯霉素(Herrera Estrella 等(1983)EMB0 J. 2:987-992)；氨甲蝶呤(Herrera Estrella 等(1983)Nature 303:209-213 ;Meijer 等(1991)PlantMol.Biol. 16:807-820)；潮霉素(Waldron 等(1985)Plant Mol. Biol. 5:103-108 ；Zhijian 等(1995)Plant Science 108:219-227);链霉素(Jones 等(1987)Mol. Gen.Genet. 210:86-91);壮观霉素(Bretagne-Sagnard 等(1996) Transgenic Res. 5:131-137)；博来霉素(Hille 等(1990)Plant Mol. Biol. 7:171-176);磺酰胺(Guerineau 等(1990)Plant Mol. Biol. 15:127-136);嘌呤霉素(Abbate 等(2001)Biotechniques 31:336-40 ；阿糖胞苷(Eliopoulos 等(2002)Gene Ther. 9:452-462) ;6_ 硫鸟嘌呤(Tucker 等(1997)Nucleic Acid Research 25:3745-46)。可在转基因事件重获中发挥作用但在最终产物中可能不需要的其他基因将包括但不限于诸如以下的例子果聚糖鹿糖酶(sacB)、⑶S(f|-葡糖醒酸酶；Jefferson(1987)Plant Mol. Biol. Rep. 5:387) ；GFP(绿色突光蛋白；ffang 等(2001)Anim Biotechnol12:101-110 ;Chalfie 等(1994)Science 263:802)、BFP(蓝色荧光蛋白；Yang 等(1998)J. Biol. Chem. 273:8212-6)、CAT ;和荧光素酶(Riggs 等(1987)NucleicAcidRes. 15(19):8115 ；Luchrsen 等(1992)Methods EnzymoI. 216:397-414)。许多启动子可用于实施本发明。可给予所需结果来选择启动子。多种诱导型启动子系统已描述于文献中并且可用于本发明。这些包括但不限于四环素可调控系统(W0 94/29442、WO 96/40892、W096/01313、美国申请 No. 10/613，728);激素反应系统、干扰素诱导系统、金属诱导系统、和热诱导系统，(W0 93/20218);蜕皮激素诱导系统、和araC_Pbad。这些系统中的一些(包括蜕皮激素诱导系统和四环素诱导系统)可分别商购自Invitrogen (Carlsbad, Calif.)和 Clontech (Palo Alto, Calif)。参见Qiu 等,(2008) App. &Environ Microbiology74:7422-7426 和 Guzman 等，(1995) J. Bacteriol. 177:4121-4130，这些文献全文以引用方式并入本文。 所谓“诱导”意指化学刺激物改变可操作地连接的所关注核苷酸序列的表达至少1%、5%，优选 10%、20%，更优选 30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、99% 或更多。差别可为表达水平的上升或下降。用于检测表达水平的方法在本文其他地方有描述。可以施用或撤除化学刺激物。各种化学刺激物是本领域已知的。使用最广泛的一种诱导系统是基于四环素的二元系统，该系统已用于细胞和动物中以通过添加或移除四环素或其类似物来可逆地诱导表达(参见Bujard(1999). J. GeneMed. 1:372-374 ；Furth 等(1994) · Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:9302-9306 ;和 Mansuy &Bujard(2000). Curr. Opin. Neurobiol. 10:593-596，这些文献全文以引用方式并入本文)。另一个这种二元系统的例子是噬菌体Pl的cre/loxP重组酶系统。关于cre/loxP重组酶系统的描述，参见例如Lakso等(1992) PNAS89:6232-6236。在Cre/LoxP重组酶系统中，激活蛋白转基因编码重组酶。如果使用cre/loxP重组酶系统来调节转基因表达，则需要包含编码Cre重组酶和选定靶蛋白两者的转基因的微生物。另一个重组酶系统的例子是酿酒酵母(S. cerevisiae)的 FLP 重组酶系统(O，Gorman 等(1991) Science 251:1351-1355)。单个转基因微生物可包含多个诱导型启动子。测定表达水平的方法是本领域已知的并且包括但不限于定性蛋白质印迹分析、免疫沉淀、放射学检测、多肽纯化、分光光度分析、丙烯酰胺凝胶的考马斯染色、ELISAs、RT-PCR、双向凝胶电泳、微阵列分析、原位杂交、化学发光法、银染、酶法检测、丽春红S染色、多重RT-PCR、免疫组织化学检测、放射免疫检测、比色检测、免疫放射检测、正电子发射断层显像、RNA印迹法、荧光检测和SAGE。参见例如Ausubel等编辑(2002)CurrentProtocols in Molecular Biology, ffiley-Interscience, New York, New York ；Coligan等(2002)Current Protocols in Protein Science, ffiley-Interscience, New York, NewYork;和Sun等(2001) Gene Ther. 8:1572-1579，这些文献以引用方式并入本文。已经认识至IJ，可在RNA、多肽或肽水平对所关注核苷酸序列的表达进行评估、分析或估计。所谓改变的表达意指完整的所关注核苷酸序列的表达水平相比于未转化、未修饰、非转基因或野生型微生物的改变。表达水平可上升大约1%、2%、3%、4%、5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、100%、200%、300%、400%、500% 或更多。表达水平可下降大约 1%、2%、3%、4%、5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90% 或 100%。已经认识到，改变的表达还包括所关注核苷酸序列的片段而不是全长所关注核苷酸序列的表达。转基因细胞可呈现改变的细胞特性，例如但不限于改变的产电功效。这种改变可为所关注特性的增加或降低。已经认识到，一种细胞特性的改变可改变第二细胞特性；进一步认识到，一种特性的增加可降低第二特性，一种特性的增加可增加第二特性，一种特性的降低可降低第二特性，并且一种特性的降低可增加第二特性。改变的细胞特性可相比于非转基因微生物细胞中的该细胞特性被改变1%、2%、3%、4%、5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、100%、200%、300%、400%、500%或更多。分析细胞特性的方法是本领域已知的。使所关注内源核苷酸序列中断的分离的核酸分子可替换所关注内源核苷酸序列、可打断所述内源核苷酸序列、可替换所关注内源核苷酸序列的部分，可替换控制所关注内源核苷酸序列表达的调节区，可打断控制所述内源核苷酸序列表达的调节区，可删除所关注内源核苷酸序列、可删除内源核苷酸序列的部分、可删除调节区、或可删除调节区的部分。所关注内源核苷酸序列包括但不限于pilT(SEQ ID N0:1)、bdlA(SEQ ID NO:4),IasI (SEQ ID NO: 5)、IasR (SEQ ID N0:6)、nirS (SEQ ID NO: 3)、ftsZ (SEQ ID NO: 7),piIA(SEQ ID NO:2)和 fliC(SEQ ID NO:8) pilT基因编码涉及调节细菌表面上的菌毛数目的多肽；该蛋白质，一种导电多肽，也称为蹭行运动性蛋白。蹭行运动是细菌通过延伸菌毛、将菌毛附着到无生命或有生命的表面并缩回菌毛的运动。某些PilT突变体，例如PilT中断体，呈现降低的蹭行运动性和增加的菌毛形成或超菌毛形成。这些PilT突变体呈现改善的附着、细胞间粘附和生物膜形成。某些PilT突变体呈现降低的毒性和降低的从表面分离的能力。虽然不受机制的限制，但降低的蹭行运动性似乎增加附着和细胞间附着，从而改善生物膜形成且增加生物膜厚度。参见Chaing& Burrows (2003) J. Bacterio. 2374-2387，其全文以引用方式并入本文。bdlA或生物膜分散基因座A涉及从生物膜的细菌分散。由于其是将生物膜保持在阳极表面上所需要的，所以改变细菌细胞执行趋化的能力可改善生物膜形成和保持。趋化是细菌朝向或远离多种刺激物或拒斥剂运动的过程。打断或删除bdlA降低细菌细胞从表面分离的能力，从而改善生物膜形成和保持并增加向阳极的电子转移。参见Morgan等(2006) J. Bacteriol. 7335-7343，其全文以引用方式并入本文。fIiC基因编码涉及泳动和趋化的多肽。FliC中断突变体不具有鞭毛；因而其运动性降低。FliC中断突变体呈现降低的趋化性和改善的生物膜形成。虽然不受理论的限制，但是FliC中断突变体可向阳极转移更多的电子。LasI编码多肽N_(3_氧代十二酰基)_L_高丝氨酸内酯合成酶，虽然不受机制的限制，但其可能涉及称为群体感应的细胞间信号传导的过程。某些N-(3-氧代十二酰基)-L-高丝氨酸内酯合成酶突变体具有改变的生物膜特性。这些改变的生物膜形成特性包括但不限于更薄、更紧实的生物膜、增加的细胞密度、改变的表面附着特性、改变的多糖产生、降低的多糖产生以及改变的绿脓素产生。绿脓素是氧化还原活性的，呈现抗生素活性并可用作电子转移的介体。删除IasI也改变细菌细胞在动物和人细胞中的毒性。这种改变的毒性可为在人或动物细胞中降低的毒性。参见Davies等(1998) Science，其全文以引用方式并入本文。删除IasR改变细菌细胞在动物和人细胞中的毒性。这种改变的毒性可为在人或动物细胞中降低的毒性。所谓毒性意指病原菌克服靶的防御的相对能力。微生物细胞可感染任何其他活生物体；特定类型的微生物细胞可具有有限范围的靶。铜绿假单胞菌能够感染广泛范围的祀，包括植物、昆虫、哺乳动物。示例性哺乳动物包括但不限于人、牛科动物、类人猿、绵羊、山羊、猪科动物、兔科动物(Iapines)、鼠科动物和骆驼科动物(camellids)。毒性的方面包括但不限于合适靶的范围、感染性、多重感染、从一个靶到另一个靶的转移速度、靶细胞结合能力、抗生素敏感性、致病性以及抗原产生。已经认识到，降低毒性的一个方面可不影响毒性的另一方面或可增加毒性的另一方面。 NirS编码呼吸型硝酸还原酶(NIR)前体。失活的nirS突变体呈现改变的使在生物膜中的厌氧培养物存活的能力(Yoon等(2002)DevCelI 3:593，其全文以引用方式并入本文)。虽然不受机制的限制，但NIR可为在厌氧呼吸期间硝酸盐还原成氮气的全过程中的第二酶促步骤。呼吸型NIR的产物是一氧化氮(NO)，一种在微摩尔浓度下固有地对细菌具有毒性的化合物。NIR可催化NOf到NO的一电子还原并且可催化O2到2H20的四电子还原。nirS的失活可减少与厌氧生物膜中的NO相关的问题，增加通过菌毛的电子流并减少一氧化二氮(N2O)的产生。nirS突变体的表面暴露的III型分泌器产生比野生型细菌低的毒素浓度；nirS突变体呈现改善的毒性特性。参见Van Alst,N. E.等，2009.Nitrite reductase NirS is required for type HI secretion system expression andvirulence in the human monocyte cell line THP-Iby Pseudomonas aeruginosa InfectImmun 77:4446-4454，其全文以引用方式并入本文。所谓“生物膜”意指包含通常陷在或嵌在多糖/蛋白质基质内的多个细胞的复合表面附着生长。生物膜存在多种厚度；这种厚度可随时间推移而改变并且可在生物膜的不同区域中不同。优选的生物膜厚度在介于I μ m和300 μ m之间，特别地介于10 μ m和200 μ m之间并且更特别地介于30 μ m和IOOym之间的范围内。生物膜可由多种细胞类型、单种细胞类型或克隆群体的细胞组成。多种细胞类型可指不同种的细胞、相同种的不同菌株的细胞以及具有不同转基因改变的细胞。若干生物膜相关的特性影响产电功效。影响产电功效的生物膜相关特性包括但不限于生物膜中的细菌数目、生物膜中的细菌密度和附着到阳极的菌毛数目。在一个实施方案中，生物膜可附着到、生长在、粘附至、包被、接触、覆盖或临近阳极表面或阳极室。生物膜可改善包含生物膜的细胞在不利条件中的存活，所述不利条件包括但不限于非偏好温度、PH范围、重金属浓度等。对原料的调节可以调节生物膜稳健性。可将各种物质添加到供给生物膜的原料。这些物质可包括与转基因微生物相容的其他生物体、介体化合物、抗菌化合物、用于调节或调整诱导型启动子的添加剂以及生物膜优化剂(biofilm optimizer)。生物膜优化剂是调整存在于生物膜中的细胞的至少之一的代谢特性的化合物，这种代谢特性可影响可用底物的代谢或生物膜或微生物燃料电池内的微生物之间的生理协作。可添加到原料中的抗生素选自转基因微生物耐受的抗生素的组。尽管需要改善的生物膜形成和保持，但已经认识到，细菌细胞生物膜基质的过度产生可对微生物燃料系统不利。例如，细菌细胞的过度产生可阻塞微生物燃料电池、改变微生物燃料电池的环境、阻塞阳极室和阴极室之间的过滤器、增加细菌细胞死亡的可能性或得到具有非最佳厚度的生物膜。此外，细胞分裂需要可转移到阳极的能量。因此，在一个实施方案中，可进行细胞分裂(或细胞增殖)的外源调节。这种调节可涉及使用诱导型启动子。
所谓“异源核苷酸序列”意指并非与启动子序列一起天然存在的序列。虽然这种核苷酸 序列对于启动子序列是异源的，但其对于宿主细胞可为同源的、或内在的、或异源的、或外来的。所关注异源核苷酸序列包括但不限于编码使氧化和磷酸化解偶联的物质的所关注核苷酸序列。解偶联、干扰或中断正常偶联的过程，即氧化和磷酸化，改变从周质空间到细胞质的质子梯度。例如，在用诸如二硝基酚的外源解偶联剂处理的细菌中，底物氧化速率增加且朝向阳极的电子流可增加。其他解偶联剂包括但不限于会在微生物细胞内表达的产热素、UCXP-U UCP-2和UCP-3。在一个实施方案中，将具有编码解偶联多肽(例如但不限于产热素、UCXP-I、UCP-2和UCP-3)的核苷酸序列的核酸分子与诱导型启动子可操作地连接。然后可用包含与所关注解偶联核苷酸序列可操作地连接的诱导型启动子的表达盒稳定转化细菌细胞。在某些实施方案中，厌氧条件可涵盖没有O2存在的严格厌氧条件以及温和厌氧条件，在温和厌氧条件中，O2浓度在O至15%、0. 001%至12. 5%、0· 001%至10%、0. 001%至7. 5%、
O.001% 至 5%、0· 01% 至 4%、0· 01% 至 3%、0· 01% 至 2%、0· 01% 至 1% 或 O. 01% 至 O. 05% 的范围内。因此，细菌在厌氧环境中代谢原料不同于在有氧条件中代谢原料。在某些实施方案中，需要有氧条件。在某些实施方案中，需要厌氧条件。铜绿假单胞菌迅速利用氧，因而可形成厌氧条件。可通过利用氧移除系统来建立厌氧条件。氧移除酶系统包括但不限于葡萄糖-葡萄糖氧化酶-过氧化氢酶酶促O2移除系统。葡萄糖氧化酶将葡萄糖转化成尿酸和h202。葡萄糖氧化酶是一种氧依赖酶。在每个循环中葡萄糖氧化酶和过氧化氢酶反应共同使氧浓度减半。所谓“保持”生物膜周围的厌氧条件意指建立厌氧条件并将所述厌氧条件维持包括但不限于以下的一段时间30秒、I分钟、2分钟、5分钟、10分钟、15分钟、20分钟、25分钟、30分钟、45分钟、60分钟、2小时、3小时、4小时、5小时、6小时、7小时、10小时、15小时、20小时、24小时、36小时、48小时、60小时、72小时、84小时、96小时、108小时、5天、6天、7天、2周、3周、4周、I个月、2个月、3个月、个4月、5个月、6个月和I年。已经认识至IJ，特别地对于保持或将原料引入到微生物燃料电池(例如但不限于当污水进入燃料电池时)可发生厌氧条件的间断期。给阳极室接种的方法包括但不限于将阳极浸入培养物中，将细菌添加到阳极室中以及添加包含即时施加的转基因细菌的基质。在一个实施方案中，将微生物燃料电池，特别是阳极隔室，与来自PilA肽C末端的17个氨基酸的多肽一起孵育。PilA蛋白的末端17个氨基酸介导到各种表面的附着并减少生物膜形成。在一个实施方案中，将阳极室用该17聚体预处理或涂布，但阴极不进行预处理或涂布。所谓阳极意指电子受体。阳极可具有平面形状、圆柱形状、分层螺旋圆柱形状、曲线形状、成角度形状或其他几何形状，例如但不限于片、多个片、金属丝网、多孔管和海绵状基质。已经认识到，希望阳极提供较大的表面积体积比。阳极可为可从微生物燃料电池移除的。微生物燃料电池的优化操作可包括清洁或更换阳极。阳极可由任何合适材料构造，包括但不限于金属(不锈钢)、碳、碳纳米管、碳纳米纤维、碳布、碳纸、钼、石墨、石墨棒、石墨租、石墨泡沫、石墨粒、97%孔隙率网状玻璃碳(RVC)、人造金刚石、金、铝或其他导电材料。多孔金属，例如烧结钢，可以给阳极提供较大的表面积体积比。例如，阳极可为平坦表面、彼此紧密靠近的多个薄板或轧制平坦表面或丝网。已经认识到，可因微生物燃料电池的不同功用而对阳极形状和阳极材料进行修改或优化。已经认识到，阳极可呈现高表面积、低电阻、高电导率、或其组合并且可允许高细菌生长密度。纳米材料厚度通常小于I微米。阳极可通过导线与阴极连接。用于导线的合适物质包括但不限于铜或金刚石。微生物燃料电池的阴极可为包括但不限于以下的导电材料金属(不锈钢)、碳、碳纳米管、碳纳米纤维、碳布、碳纸、钼、石墨、石墨棒、石墨毡、石墨泡沫、石墨粒、97%孔隙率网状玻璃碳(RVC)、人造金刚石、银、金、铝或其他导电材料。诸如Nafionj<^的屏障可将阳极室和阴极室隔开。该屏障减慢、减少或阻止电子从阳极直接移动到阴极；相反地，电子流动通过电路的导线。屏障可为离聚物膜，例如但不限于!\!3.「丨0丨丫1〈全氟磺酸(PFSA)膜(DuPont Fuel Cells, Inc)。生物膜在屏障上的过度沉积可损害微生物燃料电池的功能。因此，可取的是将屏障上的生物膜沉积保持在适度水平。调节生物膜沉积的方法包括但不限于调节细菌细胞分裂速率和用生物膜形成抑制剂预先涂布屏障。生物膜形成抑制剂是本领域已知的并且包括具有PilA蛋白的末端17个氨基酸 的氨基酸序列(也称为PilA17聚体)的多肽。或者，阳极和阴极可为可分开的组件，例如可从微生物燃料电池的阴极部分移除的阳极管。若干个微生物燃料电池可以串联或并联电连接以形成燃料电池的电池组。微生物燃料电池中的一个或多个可以拆卸并清洁。已经认识到，微生物燃料电池中的一个或多个组件可以清洁。这种清洁可涉及化学清洁、机械清洁、清除利用蛭弧菌属(Bdellovibrio)物种的生物膜、清除利用食肉生物体(例如但不限于真菌)的生物膜、或其组合。蛭弧菌属，一种食菌的细菌，以铜绿假单胞菌为食并且临时反转电极的极性以释放结合的菌毛。图2示出根据一些实施方案的示例性微生物燃料电池10。微生物燃料电池10可包括外壳(或封闭结构)12。外壳12可包含阳极室34、阴极室36和介于阳极室34和阴极室36之间的屏障22。阳极室34可包含一个或多个阳极14。阴极室36可包含一个或多个阴极16。在一些实施例中，微生物燃料电池10可包含原料18，阳极14和/或阴极16可放置于其中。在一些实施例中，阳极14可覆盖有由许多细菌形成的细菌膜或生物膜28，如在整个本发明中所述。在一些实施例中，阳极室34和阴极室36可通过屏障22(例如离聚物膜)隔开。屏障22可将外壳12分成隔室并且阻止外壳10内电子从阳极14向阴极16移动。电路可通过负载24连接阳极14和阴极16。电极26可将阳极14和阴极电偶联。用于电极26的合适物质可包括但不限于铜或金刚石。微生物燃料电池10的阴极16可为导电材料，包括但不限于金属(不锈钢)、碳、碳纳米管、碳纳米纤维、碳布、碳纸、钼、石墨、石墨棒、石墨毡、石墨泡沫、石墨粒、97%孔隙率网状玻璃碳(RVC)、人造金刚石、银、金、铝或其他导电材料诸如Nafion膜的屏障22可将阳极室34和阴极室36隔开。屏障22减慢、减少或阻止电子从阳极14直接移动到阴极16 ;相反地，电子流动通过电路的导线26。屏障22可为离聚物膜，例如但不限于Nafion全氟磺酸(PFSA)膜(DuPont Fuel Cells, Inc)。生物膜28在屏障22上的过度沉积可损害微生物燃料电池10的功能。因此，可取的是将屏障22上的生物膜28沉积保持在适度水平。调节生物膜28沉积的方法包括但不限于调节细菌细胞分裂速率和用生物膜形成抑制剂预先涂布屏障22。生物膜形成抑制剂是本领域已知的并且包括具有PilA蛋白的末端17个氨基酸的氨基酸序列(也称为PilA17聚体)的多肽。或者，阳极14和阴极16可为可分开的组件，例如可从微生物燃料电池10的阴极部分36移除的阳极管。若干个微生物燃料电池可以串联或并联电连接以形成燃料电池的电池组。串联燃料电池系统50的一个实施例示于图5中，该图示出串联连接的三个微生物燃料电池52、54和56。微生物燃料电池进一步偶联到负载58。负载58可包括例如电灯泡或其他负载。微生物燃料电池中的一个或多个可以拆卸并清洁。已经认识到，微生物燃料电池中的一个或多个组件可以清洁。这种清洁可涉及化学清洁、机械清洁、清除利用蛭弧菌属(Bdellovibrio)物种的生物膜、清除利用食肉生物体(例如但不限于真菌)的生物膜、或其组合。蛭弧菌属，一种食菌的细菌，以铜绿假单胞菌为食并且临时反转电极的极性以释放结合的菌毛。微生物燃料电池的使用者可制造或获得微生物燃料电池。微生物燃料电池的使用者然后可使用从阳极和阴极延伸出来的电极来将燃料电池连接到负载。因此，使用者完成从阳极穿过负载到达阴极的电路。使用者可例如通过接入开关使得由转基因微生物产生的电流流过负载。转基因微生物将电子从原料转移到阳极，电子继续流过电极和负载到达阴极。屏障阻止电子通过燃料电池的内部流动。微生物燃料电池可用于消费性电子产品，或许通过锂/离子电池充电器或作为锂/离子电池的替代物。微生物燃料电池可用于插电型 汽车或给插电型汽车充电。微生物燃料电池可通过接入从建筑物沿着向外的污水管道排出的有机废弃物而产生用于住宅和商业建筑物的电力。微生物燃料电池可用于大型废弃物处理、农场和公用设施。微生物燃料电池电力系统还可包含在成对系统中并联电连接的超级电容器。超级电容器具有根据需求迅速存储电力和以相对短脉冲传输电力的有利能力。根据本发明的一个实施方案将超级电容器与燃料电池配对使得当开始启动该系统时该成对系统的使用者可具有持续的电力流。图3示出根据本发明的一个实施方案的示例性微生物燃料电池系统40，其包含微生物燃料电池42、氢燃料电池44、超级电容器46和负载48。超级电容器46可与具有改造的细菌的微生物燃料电池42并联连接。当对于超过微生物燃料电池42可供应电力的电力的需求出现时，超级电容器46可放电相对较短的时间。当对于增加的电力的需求消退时，超级电容器46可利用微生物燃料电池42以进行充电。相对较短时间的对增加的电力的需求可例如在以下情况下发生在电动车辆的快速加速、与燃料电池连接的发动机的启动期间，或在微生物燃料电池系统40开始用于紧急备用系统之后紧接的时间期间。将微生物燃料电池42与超级电容器46配对可允许系统40的设计者利用较小的微生物燃料电池42，因为微生物燃料电池42可能不需要设定尺寸以用于峰值功率应用。超级电容器46还可用于使电能传输到输电网络、负载48或更常用的装置。如果来自燃料电池42的能量流变得波动，超级电容器46可使电力传输的峰和谷平滑。另外，多个微生物燃料电池42和/或多个超级电容器46可以配对以增加电力输出。在一些实施例中，超级电容器46可作为一个紧凑单元嵌在外壳12内。对于本领域的技术人员而言，可以进行其他应用和/或配置。此外，有利用途可由微生物燃料电池42的化学反应造成。例如，当微生物燃料电池42厌氧地运行时，阴极处的化学反应产物可包括游离氢气。这种氢气可通过氢捕获模块被捕获和/或收集并用来给氢燃料电池44提供动力。图3示出氢燃料电池44与微生物燃料电池42配对以形成燃料电池系统40。燃料电池系统40可包含每种类型(微生物和/或氢)的很多个燃料电池、每种类型一个燃料电池、或可省去一种燃料电池类型，如应用可决定的。在这些实施例中，微生物燃料电池42可排出极少的二氧化碳，因而能够成为一种环保能源。另外，微生物燃料电池42可设计成排出可变成其他装置的能源的可用糖类。微生物燃料电池42可有氧地运行以排出水作为副产物。水可转移到储水装置或转移到外部环境。所谓“基质”意指某物嵌在或封闭在其中的材料。适用于当前应用的基质包括但不限于海绵、过滤器、小珠、粉末、纸巾、颗粒、盒、药筒和胶囊。本申请的转基因微生物可用于清洁溶液和除味系统。
实施例实施例I.在原料中的简单玻璃表面上形成静态生物膜
将圆形玻璃盖玻片贴附到35 X IOmm聚苯乙烯组织培养皿(Falcon)的底部，该组织培养皿在底部具有小孔。将该培养板暴露于UV照射过夜。(UV照射对培养板灭菌)。将细菌细胞在Luria Bertani培养基(LB)中培养过夜。将有氧LB、有氧LBN(LB+1%KN03)或厌氧LBN(3ml)放置在各个组织培养板中。给培养基接种IO7Cfu的细菌细胞。将培养板在37°C下孵育24小时。移除培养基并用盐水缓冲液洗漆培养板。将 LIVE/DEAD BacLight (Molecular Probes, Inc)细菌活力染料(O. 5ml)添加到各培养板中。在附接到具有63 X 14NA油浸物镜的Axiovert显微镜的Zeiss LSM510激光扫描共聚焦单元上获得图像。对于两种彩色图像，在488nm和546nm下连续扫描样品。Syto 9(绿色荧光)通过505-530nm带通滤波器检测，而碘化丙啶(红色荧光)通过560nm长通滤波器检测，并呈现在两个512 X 512像素、8比特图像的通道中。实施例2.培养基LB培养基10g/L胰蛋白胨，5g/L酵母提取物和5g/L NaCl。LBN培养基10g/L胰蛋白胨，5g/L酵母提取物，5g/L NaCl和10g/L KNO30实施例3.在流通的原料中形成牛物膜将细菌在37°C下于LB中有氧培养直至静止生长期。将细菌按1:50稀释到1%胰酪胨大豆肉汤中。给流动细胞接种O. 2ml经稀释的细菌。将流动细胞和细菌孵育I小时。在I小时之后，以O. 17ml/min的速率开始流动。将细胞在室温下孵育3天。将细胞用由SYTO9和碘化丙唳(Molecular Probes, Inc.)组成的活/死活力染料进行染色。使用LSM 510共聚焦显微镜(Carl Zeiss，Inc.)获得生物膜图像。绿色荧光的激发波长和发射波长分别为488nm和500nm,而红色突光的激发波长和发射波长分别为490nm和635nm。所有生物膜实验均重复至少3次。使用3D for LSM(V. I. 4. 2)软件(Carl Zeiss)计算生物膜的活/死t匕。使用C0MSTAT软件评估总体生物膜结构，例如厚度、水通道、细菌密度(底物覆盖率)、粗糙度系数和以m3/m2计的总生物量。C0MSTAT分析使用扫描共聚焦激光显微镜(SCLM)获得的图像叠加以量化生物膜结构的3维性质。参见Heydorn等(2000)Microbiologyl46 (Pt10) :2395，其全文以引用方式并入本文。实施例4.构建铜绿假单胞菌删除突变体将铜绿假单胞菌菌株PAOl用作构建删除突变体的起始菌株。使用经典等位基因置换技术来产生突变菌株。参见Hoang等(1998) Gene212 (I) : 77-86。对每个所关注基因均形成插入突变盒，该插入突变盒包含庆大霉素抗性(GmK)核苷酸序列、绿色荧光蛋白(GFP)核苷酸序列以及位于庆大霉素抗性序列和GFP序列两侧的FLP重组酶靶(FRT)位点。在接合转移或电穿孔之后，选择质粒整合体。将细胞在含6%蔗糖的培养基中培养。蔗糖启动所关注靶序列的删除。突变体通过PCR或DNA印迹法进行确认。突变细胞经历用含有诸如PFLP2的FLP-重组酶表达质粒的细胞进行的接合转移。pFLP2包含sacB序列；在含蔗糖培养基上的生长使细菌细胞消除含sacB质粒。FLP重组酶的表达使得切除FRT盒。在消除质粒之后，铜绿假单胞菌删除突变菌株是庆大霉素敏感的。通过相似方 法构建诸如双突变体和三突变体的多突变体。实施例5.高通暈微生物燃料电池原型开发了一种小型高通量微生物燃料电池(菌毛电池)原型。使用通常用于在I英寸硝酸纤维素滤膜上收集细胞的类型的Millipore过滤装置来构建菌毛电池原型。当用于在滤膜上收集细胞以在闪烁计数器中进行放射性测量时，将滤膜放置在每个孔的烧结塑料表面上。所述装置的顶部紧紧旋拧在底部上。所述装置的顶“杯”部分具有橡胶密封件以防止从每个孔的渗漏。底部包括真空口。该Millipore过滤装置具有12个孔。该过滤装置已改良成用于筛选和监测多达12种不同基因工程细菌的电力产生的高通量装置。已将铜线焊接至十二个2. 54cm X O. 2mm圆形不锈钢晶片的基部。将轧制钢用丙酮处理，然后用甲醇处理以移除残余油。将钢晶片用钢丝刷擦刷以增加可供细菌结合的钢表面积。与晶片连接的铜线代表阳极。将来自每个晶片的铜线拉引穿过之前是该装置的真空口的部分。将铜线连接到电压/电流测量装置。每个孔可容纳至多15ml的培养基；在这些实验中，使用7ml的培养基。在十二个与所述孔紧密配合的6级橡胶塞中的每一个中钻两个洞。将一根8英寸的铜线放置在橡胶塞的主洞中，所述铜线有O. 25英寸延伸进阳极的培养基中。该铜线代表阴极。该高通量装置允许一次评估多达12个样品。一旦装配好，各个孔具有成为独立微生物燃料电池的能力。实施例6.高通量微牛物燃料电池电压/电流评价使用上述高通量微生物燃料电池原型来评价来自野生型铜绿假单胞菌(POA)、奥奈达希瓦氏菌和突变菌株(pilT、bdlA、nirS、IasI或fliC pi 1A)的电压和电流产生。将整个高通量微生物燃料电池原型装配好并通过装置顶部上的螺栓固定。实验中使用的每个孔通过用乙醇处理来灭菌。移除乙醇并将装置在无菌层流罩中干燥。将LB+1%KN03培养基(7ml)放置在实验中使用的每个孔中。将每个细菌样品(野生型铜绿假单胞菌属、希瓦氏菌属和突变菌株)的静止期生长的有氧培养物(70 μ 1，1:100稀释液)添加到孔中的培养基中。还准备一个仅有培养基的对照孔并进行监测。在将橡胶塞固定在孔中之前，将橡胶塞和阴极铜线用乙醇处理。在厌氧条件下将该装置在37°C下孵育24小时。如本文中其他地方所述记录测量结果。移除橡胶塞并吸走培养基。向每个孔轻轻施加盐水(0.9%)。通过抽吸移除盐水溶液。进行三次盐水洗涤。在每个孔的塑料区域上涂抹乙醇。向每个孔添加LB+1%KN03培养基(7ml)。重复记录过程。来自一个这种实验的结果示于图I中。实施例7.微牛物燃料电池原型的电压和电流监测使用用于数据采集系统的Lab Jack U12，8通道12比特USB A/D获得测量结果。使用四个通道来监测微生物燃料电池电压。将3cm铜阳极连接到四个LT1012高输入阻抗缓冲放大器。这些放大器的输出然后连接到Labjack A/D的通道AI0-AI3输入。通过连接穿过IK电流检测电阻器的LTllOl仪表放大器来进行电流测量。通过测量穿过电阻器的电压降并利用欧姆定律(I=E/R)，可以计算流经电池电路的电流。所使用的测量系统允许通过因特网远程进行电压和电流测量。该系统利用八个不同图形监测系统，这些系统可被构造成监测由实验设计所决定的电压和电流的各种组合。实施例8.形成具有增加的阳极表面积的微生物燃料电池构造了 23-板的不锈钢314阳极系统。前21块板具有以下尺寸0. 05 X 9. 851X7. 554英寸。这涉及197. 56英寸的总表面积。其他两块板为O. 05X 9. 851X 7. 884英寸。这两块较大的板用作面向Nafion膜中或面朝Nafion膜并增加了另外的96. 2英寸表面积的“腿”。因此估计的总表面积为大约294英寸。该两块较大的板给21块板组件提供支撑。从阳极室到阴极室的电极为不锈钢并且配有插入嵌在阴极内的相似配件的Swagelok配件。单块O. 125 X 9. 6 X 4. 65英寸的热等均压的石墨板(GraphiteStore.com)用于 阴极。在装配阳极之后，将阳极用1%漂白剂、然后95%乙醇，并且然后70%乙醇进行处理。较小的Ix Ix O. 05英寸不锈钢晶片用来监测生物膜形成。在37°C下，将阳极在Coy厌氧室中接种有细菌的I升LB+1%KN03中孵育24小时。使用野生型细菌或使用各种突变体进行实验。比较野生型和突变细菌的总体效率。将附着有成熟生物膜的完整阳极组件浸没在厌氧O. 9%NaCl溶液中，然后从该溶液中移除。浸没和移除可以重复。(未附着的细菌通过该过程移除。)将具有附着的成熟生物膜的阳极放置在大型微生物燃料电池组件中。将两个塑料盒(一个包含阳极，另一个包含阴极)用LB+1%KN03填充。将阳极室和阴极室用葡糖氧化酶进行处理。葡糖氧化酶将葡萄糖转化成尿酸和H202。将H2O2用过氧化氢酶处理。葡糖氧化酶和过氧化氢酶反应降低氧浓度。阳极在大约250-400mV(vs Ag/AgCI)下平衡。将Clark型或World PrecisionInstrument O2电极与阳极和阴极部分连接。使用流速O. 05ml/min的螺动泵实现新鲜厌氧培养基流动通过阳极室。使用野生型、单重、双重、三重、四重、五重和多重突变菌株进行类似实验。使用本文上述的LabJack系统或与电子数据库连接的Agilent 34970-A数据采集系统监测电流和电压输出。这种系统允许监测微安培范围的电流和微伏特至毫伏特范围的电压。实施例9.铜绿假单胞菌突变菌株使用PAOl菌株制备突变菌株。构建pilT、bdlA、nirS和IasI单中断突变体。构建 pilT bdlA、bdlA nirS、bdlA lasl> nirS pilT、nirS IasI 和 IasI pilT 双中断突变菌株。构建 PilT bdlA nirS、bdlA IasI pilT、nirSlasI bdlA 三中断突变菌株。构建 pilTbdlA nirS IasI四中断突变菌株。构建稳定包含araBAD-ftsZ的PAOl菌株。使用PAOlaraBAD-ftsZ菌株来制备突变菌株。在PAOI araBAD-ftsZ背景下构建pilT、bdlA、nirS和IasI单中断突变体。在PAOlaraBAD-ftsZ 背景下构建 pi IT bdlA、bdlA nirS、bdlA lasI、nirS pilT、nirS IasI 和 IasIpilT 双中断突变体。在 PAOl araBAD-ftsZ 背景下构建 pi IT bdlA nirS、bdlAlasI pilT 和nirS IasI bdlA 三中断突变体。在 PAOl araBAD-ftsZ 背景下构建 pi IT bdlA nirS IasI四中断突变菌株。构建稳定包含araBAD-ftsZ 和 siRNA 构造(PA0730)的 PAOl 菌株。PAOlaraBAD-ftsZ PA0730菌株用来制备突变菌株。在PAOI araBAD-ftsZ PA0730背景下构建pilT、bdlA、nirS 和 IasI 单中断突变体。在 PAOl araBAD-ftsZ PA0730 背景下构建 pilTbdlA、bdlA nirS、bdlA Iasi、nirS pilT、nirS IasI 和 IasI pilT 双中断突变体。在PAOI araBAD-ftsZ PA0730 背景下构建 pilT bdlA nirS、bdlA IasI pilT 和 nirSlasI bdlA三中断突变体。在PAOl araBAD-ftsZ PA0730背景下构建pilT bdlA nirS IasI四中断突 变菌株。说明书中提及的所有出版物、专利和专利申请均指示本发明所属领域的技术人员的水平。所有出版物、专利和专利申请均以引用方式并入本文，如同各个单独出版物或专利申请特别地且单独地以引用方式并入一样。
权利要求
1.一种用分离的核酸分子稳定转化的转基因铜绿假单胞菌细胞，所述分离的核酸分子使选自包含 PilT (SEQ ID NO: I)、pi IA (SEQ ID NO: 2)、nirS (SEQ ID NO: 3)、bdlA (SEQ IDN0:4)、IasI(SEQ IDNO:5)、IasR(SEQ ID NO:6)、ftsZ(SEQ ID NO:7)和fIiC(SEQ ID NO:8)的组的所关注内源核苷酸序列中断，其中所述微生物细胞呈现降低的所述所关注内源核苷酸序列表达并且所述细胞呈现改变的产电功效。
2.根据权利要求I所述的转基因细胞，其中至少2个所关注内源核苷酸序列被中断并且其中所述中断的内源核苷酸序列选自包含以下的组pilT(SEQ ID NO: I)、pi IA (SEQ IDNO:2),nirS(SEQ IDN0:3)、bdlA(SEQ ID NO:4)、IasI (SEQ ID NO:5)、IasR(SEQ ID NO:6)、ftsZ(SEQ ID NO:7)和 fliC(SEQ ED NO:8)。
3.根据权利要求2所述的转基因细胞，其中所述至少两个中断的内源核苷酸序列选自包含以下的所关注双核苷酸序列的组PilT (SEQ ID NO: DbdlA(SEQ ID NO:4) ；bdlA(SEQID N0:4)nirS(SEQ ID NO: 3) ；bdlA(SEQ ID NO: 4) IasI (SEQ ID NO:5) ；nirS(SEQ ID NO:3)pi IT(SEQ ID NO:I) ；nirS(SEQ ID NO:3)IasI(SEQ ID NO :5) ； IasI (SEQ ID NO:5)pilT(SEQID NO:I) ；ftsZ(SEQ ID NO:7)pi IT(SEQ IDNO:1) ；ftsZ(SEQ ID N0:7)bdlA(SEQ ID NO :4)；ftsZ (SEQ ID N0:7)nirS(SEQ ID NO:3) jPftsZ(SEQ ID NO: 7) IasI (SEQ ID NO: 5)。
4.根据权利要求2所述的转基因细胞，其中至少三个所关注内源核苷酸序列被中断并且所述至少三个中断的内源核苷酸序列选自包含以下的所关注三核苷酸序列的组pi IT (SEQ ID NO: DbdlA (SEQ ID NO: 4) ft sZ (SEQ ID NO :7) ；bdlA(SEQ ID NO: 4) nirS (SEQID NO:3) ftsZ(SEQ ID NO:7) ；bdlA(SEQ ID NO:4)IasI(SEQ ID NO:5) ftsZ(SEQ ID NO:7)；nirS(SEQ ID NO:3)pi IT(SEQ ID NO:I)ftsZ(SEQ IDNO:7) ；nirS(SEQ ID NO:3)IasI(SEQID NO:5) ftsZ(SEQ ID NO:7) ；lasI(SEQ ID NO:5)pilT(SEQ ID NO:I)ftsZ(SEQ ID NO:7)；pilT(SEQID NO: DbdlA (SEQ ID NO: 4) nirS (SEQ ID NO:3) ；pilT(SEQ ID NO: l)bdlA (SEQ IDN0:4)IasI(SEQ ID NO:5) jPbdlA(SEQ ID NO:4)IasI(SEQ ID NO:5)nirS(SEQ ID NO:3)。
5.根据权利要求2所述的转基因细胞，其中至少四个所关注内源核苷酸序列被中断并且所述至少四个中断的内源核苷酸序列选自包含以下的所关注四核苷酸序列的组pi IT (SEQ ID NO: DbdlA (SEQ ID NO: 4) nirS (SEQ ID NO: 3) ft sZ (SEQ ID NO :7) ；pilT(SEQID NO: DbdlA (SEQ ID NO: 4) IasI (SEQ ID NO: 5) ft sZ (SEQ ID NO :7) ；bdlA(SEQ ID NO :4)IasI (SEQ ID NO:5)nirS(SEQ ID NO:3)ftsZ(SEQ IDNO: 7)和pi IT (SEQ ID NO:I)bdlA(SEQID N0:4)IasI(SEQ ID NO:5)nirS(SEQ ID NO:3)。
6.根据权利要求2所述的转基因细胞，其中至少五个所关注内源核苷酸序列被中断并且所述至少五个中断的内源核苷酸序列选自包含以下的所关注五核苷酸序列的组pilT(SEQ ID NO: DbdlA (SEQ ID NO :4) IasI (SEQ ID N0:5)nirS(SEQ ID NO: 3) ft sZ (SEQ IDNO :7)。
7.根据权利要求I所述的转基因细胞，其中所述细胞相比于非转基因细胞具有降低的增殖能力。
8.根据权利要求I所述的转基因细胞，其中所述细胞相比于非转基因细胞具有降低的毒性。
9.根据权利要求8所述的转基因细胞，其中所述降低的毒性是在哺乳动物或植物中。
10.根据权利要求I所述的转基因细胞，其中所述细胞相比于非转基因细胞呈现降低的运动性。
11.根据权利要求I所述的转基因细胞，其中所述细胞相比于非转基因细胞呈现改变的菌毛粘性。
12.根据权利要求I所述的转基因细胞，其中所述细胞相比于非转基因细胞呈现改变的蹭行运动性。
13.根据权利要求I所述的转基因细菌细胞，其中当所述细菌细胞是微生物燃料电池的组分时所述细胞呈现增加的电流输出/细菌细胞。
14.根据权利要求I所述的转基因细胞，其中所述细胞呈现增加的向阳极的电子转移。
15.根据权利要求14所述的转基因细胞，其中所述电子转移是直接或间接的。
16.一种基质，包含根据权利要求I所述的转基因细胞。
17.根据权利要求16所述的基质，其中所述基质选自包含以下的组海绵、过滤器、小珠、粉末、纸巾、盒、药筒和胶囊。
18.—种生物膜，包含根据权利要求I所述的转基因细菌细胞，其中所述生物膜的厚度介于I μ m和300 μ m之间。
19.一种过滤装置，包含根据权利要求I所述的转基因细菌细胞。
20.一种包含生物膜的过滤装置，所述生物膜包含根据权利要求I所述的转基因细菌细胞。
21.根据权利要求20所述的过滤装置，其中所述装置包含指示器。
22.根据权利要求20所述的过滤装置，其中所述过滤装置选自包含以下的组液体材料过滤装置和气体材料过滤装置。
23.根据权利要求22所述的气体材料过滤装置，其中所述转基因细菌细胞利用选自包含二氧化碳、NO2, NO3> SO2,甲烷、N2O和SO3的组的温室气体作为原料。
24.一种微生物燃料电池，包含根据权利要求I所述的转基因细菌细胞、阳极室和阴极室。
25.一种微生物燃料电池，包含含有根据权利要求I所述的转基因细胞的生物膜、阳极室和阴极室。
26.根据权利要求25所述的微生物燃料电池，其中所述阳极室为可拆卸的。
27.根据权利要求25所述的微生物燃料电池，其中所述生物膜附着到所述阳极。
28.根据权利要求25所述的微生物燃料电池，其中所述生物膜暴露于选自包含污水、肥料径流、废水、动物废弃物、气体材料和温室气体的组的原料。
29.根据权利要求25所述的微生物燃料电池，其中在所述生物膜周围保持厌氧条件。
30.根据权利要求25所述的微生物染料电池，其中所述阳极室用生物膜抑制剂预处理。
31.根据权利要求25所述的微生物燃料电池，还包含介体。
32.一种用于检测预定化合物的传感器，包含根据权利要求25所述的微生物燃料电池和指示器，其中所述指示器指示所述化合物的异常水平。
33.根据权利要求32所述的传感器，还包含用于检测第二预定化合物的第二转基因细菌细胞。
34.根据权利要求25所述的微生物燃料电池，还包含超级电容器。
35.根据权利要求25所述的微生物燃料电池，还包含水转移组件，其中所述水转移组件将由所述微生物燃料电池产生的水转移到集水装置或转移到外部环境。
36.根据权利要求25所述的微生物燃料电池，还包含氢转移组件。
37.根据权利要求36所述的微生物燃料电池，还包含氢燃料电池。
38.一种生物修复系统，包含根据权利要求25所述的微生物燃料电池，其中所述转基因细菌细胞利用预定化合物作为原料并且所述细胞将所述预定化合物转化成第二化合物。
39.一种微生物燃料电池，包含 至少一个阴极； 至少一个与所述至少一个阴极电连通的阳极，所述至少一个阳极包含导电材料； 包含多个细菌细胞的生物膜，所述生物膜可操作地偶联到所述至少一个阳极，其中所述生物膜有利于从所述生物膜转移多个电子至所述至少一个阳极。
40.根据权利要求39所述的微生物燃料电池， 其中所述至少一个阴极容纳在阴极室中，并且其中所述至少一个阳极容纳在阳极室中。
41.根据权利要求40所述的微生物燃料电池，还包含 介于所述阳极室和所述阴极室之间的屏障，所述屏障适于限制所述至少一个阳极和所述至少一个阴极之间的电子直接转移。
42.根据权利要求39所述的微生物燃料电池，其中所述生物膜暴露于能够被所述生物膜代谢的原料。
43.根据权利要求39所述的微生物燃料电池，其中所述生物膜暴露于包含污水、肥料径流、废水、动物废弃物、气体材料和/或温室气体中的一者或多者的原料。
44.根据权利要求39所述的微生物燃料电池，其中所述至少一个阳极可拆卸地偶联到所述至少一个阴极。
45.根据权利要求39所述的微生物燃料电池，其中所述导电材料包括多孔材料。
46.根据权利要求45所述的微生物燃料电池，其中所述多孔材料包含金属、不锈钢、碳、碳纳米管、碳纳米纤维、碳布、碳纸、钼、石墨、石墨棒、石墨毡、石墨泡沫、石墨粒、97%孔隙率网状玻璃碳(RVC)、人造金刚石、金和/或铝中的至少一种。
47.根据权利要求39所述的微生物燃料电池，其中所述导电材料包括纳米材料。
48.根据权利要求39所述的微生物燃料电池，其中所述至少一个阳极包括可操作地偶联到一起的多个阳极。
49.根据权利要求39所述的微生物燃料电池，其中所述至少一个阳极包括平面形状、圆柱形状、分层螺旋圆柱形状、曲线形状、成角度形状和几何形状中的至少一种。
50.根据权利要求39所述的微生物燃料电池，其中所述至少一个阳极包括片、多个片、金属丝网结构、多孔管和/或基体结构。
51.根据权利要求39所述的微生物燃料电池，还包含 可操作地偶联到所述至少一个阳极的第一电极，所述第一电极进一步可操作地偶联到负载； 可操作地偶联到所述负载的第二电极，所述第二电极进一步可操作地偶联到所述至少一个阴极。
52.根据权利要求13所述的微生物燃料电池，其中所述负载包含发光装置、机械、显示器、电气器具和/或电池充电器中的至少一种。
53.根据权利要求39所述的微生物燃料电池，还包含可操作地偶联到所述至少一个阳极的超级电容器，所述超级电容器适于储存所述多个电子的至少一部分。
54.根据权利要求39所述的微生物燃料电池，其中所述至少一个阳极包括大致平行于其他多个导电片中的每个取向的多个导电片。
55.一种微生物燃料电池，包含 阴极； 与所述阴极电连通的阳极，所述阳极具有至少部分地偶联到其上的细菌生物膜，所述细菌生物膜适于代谢原料以产生至少电子和氢； 用于产生至少电子和氢的原料； 用于捕获由所述细菌生物膜代谢所述原料而产生的所述氢的氢捕获模块；以及 用于捕获由所述细菌生物膜代谢所述原料而产生的所述电子的电子捕获模块。
56.根据权利要求55所述的微生物燃料电池，其中所述阳极包含金属、不锈钢、碳、碳纳米管、碳纳米纤维、碳布、碳纸、钼、石墨、石墨棒、石墨毡、石墨泡沫、石墨粒、97%孔隙率网状玻璃碳(RVC)、人造金刚石、金和/或铝中的至少一种。
57.根据权利要求55所述的微生物燃料电池，其中所述阳极包括片、多个片、金属丝网结构、多孔管和/或基体结构。
58.一种微生物燃料电池，包含 阳极室，所述阳极室包含 多个包含导电材料的阳极； 包含多个细菌细胞的生物膜，所述细菌细胞适于帮助将多个电子转移到所述多个阳极，所述生物膜覆盖所述多个阳极的至少一部分； 至少部分地接触所述生物膜的原料；和 与所述多个阳极中的至少一个可操作地偶联的阳极电极，所述阳极电极进一步可操作地偶联到位于所述阳极室外部的负载； 阴极室，所述阴极室包含 至少一个阴极；和 与所述至少一个阴极可操作地偶联的阴极电极，所述阴极电极进一步可操作地偶联到所述负载；以及 将所述阳极室和所述阴极室分隔的离聚物屏障。
59.根据权利要求39所述的微生物燃料电池，其中所述生物膜包含用分离的核酸分子稳定转化的转基因铜绿假单胞菌细胞，所述分离的核酸分子使选自包含pilT(SEQ IDNO:l)、pilA(SEQ ID NO:2)、nirS(SEQ ID N0:3)、bdlA(SEQ ID NO:4)、IasI(SEQ ID NO:5),IasR(SEQ ID NO:6)、ftsZ(SEQ ID NO:7)和 fliC(SEQ ID NO:8)的组的所关注内源核苷酸序列中断，其中所述微生物细胞呈现降低的所述所关注内源核苷酸序列表达并且所述细胞呈现改变的产电功效。
60.根据权利要求59所述的微生物燃料电池，其中至少2个所关注内源核苷酸序列被中断并且其中所述中断的内源核苷酸序列选自包含以下的组pilT(SEQ ID NO: I),piIA(SEQ ID NO:2)、nirS(SEQID NO:3)、bdlA(SEQ ID NO:4)、IasI(SEQ ID NO:5)、IasR(SEQIDN0:6)、ftsZ(SEQ ID NO:7)和 fliC(SEQ ED NO:8)。
61.根据权利要求59所述的微生物燃料电池，其中所述至少两个中断的内源核苷酸序列选自包含以下的所关注双核苷酸序列的组PilT (SEQ ID NO: DbdlA(SEQ ID NO:4)；bdlA(SEQ ID NO: 4) nirS (SEQ ID NO: 3) ；bdlA(SEQ ID NO: 4) IasI (SEQ ID NO: 5) ；nirS(SEQIDN0:3)pilT(SEQ ID NO:I) ；nirS(SEQ ID NO:3)IasI(SEQ ID NO:5) ；IasI(SEQ ID NO:5)pilT(SEQ ID NO:I) ；ftsZ(SEQ ID NO:7)pilT(SEQID NO:I) ；ftsZ(SEQ ID NO:7)bdlA(SEQID NO:4) ；ftsZ(SEQ ID NO: 7) nirS (SEQ ID NO:3) jPftsZ(SEQ ID NO: 7) IasI (SEQ IDNO :5)。
62.根据权利要求59所述的微生物燃料电池，其中至少三个所关注内源核苷酸序列被中断并且所述至少三个中断的内源核苷酸序列选自包含以下的所关注三核苷酸序列的组pi IT (SEQ ID NO: DbdlA (SEQ ID NO: 4) ft sZ (SEQ ID NO :7) ；bdlA(SEQ ID NO: 4) nirS (SEQID NO:3) ftsZ(SEQ ID NO:7) ；bdlA(SEQ ID NO:4)IasI(SEQ IDNO:5)ftsZ(SEQ ID NO:7)；nirS(SEQ ID NO:3)pi IT(SEQ ID NO:I)ftsZ(SEQ ID NO :7) ；nirS(SEQ ID NO:3)IasI(SEQID NO :5)ftsZ(SEQID NO :7) ；lasI(SEQ ID NO:5)pi IT(SEQ ID NO:l)ftsZ(SEQ ID NO :7)；pi IT (SEQ ID NO: DbdlA (SEQ ID NO: 4) nirS (SEQ ID NO :3) ；pilT(SEQ ID NO: I) bdlA (SEQID N0:4)IasI(SEQ ID NO:5)；和 bdlA(SEQ ID NO:4)IasI(SEQ ID NO:5)nirS(SEQ IDNO :3)。
63.根据权利要求59所述的微生物燃料电池，其中至少四个所关注内源核苷酸序列被中断并且所述至少四个中断的内源核苷酸序列选自包含以下的所关注四核苷酸序列的组pi IT (SEQ ID NO: DbdlA (SEQ ID NO: 4) nirS (SEQ ID NO: 3) ft sZ (SEQ ID NO :7) ；pilT(SEQID NO: DbdlA (SEQ ID NO: 4) IasI (SEQ ID NO: 5) ft sZ (SEQ ID NO :7) ；bdlA(SEQ ID NO :4)IasI(SEQ ID NO:5) nirS(SEQ ID NO:3) ftsZ(SEQ ID NO: 7)和pilT(SEQ ID NO:l)bdlA(SEQID N0:4)IasI(SEQ ID NO:5)nirS(SEQ ID NO:3)。
64.根据权利要求59所述的微生物燃料电池，其中至少五个所关注内源核苷酸序列被中断并且所述至少五个中断的内源核苷酸序列选自包含以下的所关注五核苷酸序列的组pilT (SEQ ID NO: DbdlA (SEQ ID NO: 4) IasI (SEQ ID NO: 5)nirS (SEQ ID NO: 3) ftsZ (SEQIDNO :7)。
65.根据权利要求59所述的微生物燃料电池，其中所述细胞相比于非转基因细胞具有降低的增殖能力。
全文摘要
本发明提供具有改变的产电功效的转基因微生物，包含这种微生物的生物膜以及包含这种微生物的微生物燃料电池(产电生物反应器)。所述微生物燃料电池可作为检测器、过滤装置和传感器操作。
文档编号C12N15/52GK102906246SQ201080066383
公开日2013年1月30日 申请日期2010年11月4日 优先权日2010年2月23日
发明者R·T·欧文, J·E·巴克鲁, D·J·哈西特 申请人:贝克蒂瑞罗博蒂克斯有限责任公司, 辛辛那提大学