用于检测人乳头瘤病毒的基因型的dna芯片、含有该芯片的试剂盒及检测hpv的基因型的方法

专利名称：用于检测人乳头瘤病毒的基因型的dna芯片、含有该芯片的试剂盒及检测hpv的基因型的方法
技术领域：
本公开涉及一种用于检测人乳头瘤病毒(HPV)的基因型的DNA芯片、含有该芯片的试剂盒及HPV基因分型的方法。更具体而言，本公开涉及一种DNA芯片(或DNA微阵列)、含有该DNA芯片的基因分型试剂盒及使用该DNA芯片的基因分型方法，在所述DNA芯片上点有44种HPV (其是子宫颈癌的主要成因和性传播疾病的最常见原因)的核酸互补结合的探针。
背景技术：
人乳头瘤病毒(HPV)是一种通过性接触传播到人的病毒并且在两个方面非常重要。第一，HPV感染是人类最常见的性传播感染，具有最高现患率(prevalencerate)。在美国，26.8%的年龄在14至59之间的女性有HPV感染并且认为80%的女性被感染至少一次。这种感染尤其发生在性活跃的育龄女性身上，而且据估计患病率正在增力口。因此，定期的HPV测试对成年女性是必需的，并且性传播感染的测试中包括HPV测试(U.S.DEPARTMENT OF HEALTH AND HUMAN SERVICES, Centers for Disease Control andPrevention, National Center for HIV/AIDS, Viral Hepatitis, STD, and TB,PreventionDivision of STD Prevention.Sexually Transmitted Disease SurveiIlance2008.Division of STD Prevention.2009:November;Tchernev G.Sexually transmittedpapillomavirus infections:epidemiology pathogenesis，clinic，morphology，important differential diagnostic aspects，current diagnostic and treatmentoptions.An Bras Dermatol.2 009;84(4):377-89)0第二，HPV已被明确证实在人类中引起肿瘤和癌症。HPV，特别是高危型HPV，是几乎所有子宫颈癌病例的原因。HPV浸润到人皮肤或粘膜上皮中，由此引起炎症和过度增殖。在大多数情况下，过度增殖是简单的皮肤肉赘、生殖器或肛门肉赘、或良性肿瘤(如尖锐湿疣)。然而，HPV能够引起癌症，实际上，几乎所有子宫颈癌、大多数口腔癌、咽癌和喉癌及许多肛门癌均由HPV引起。HPV的重要性在于，其因可以引起癌症而是致命的。通过HPV测试可以早期诊断子宫颈、肛门等的癌症和癌前期病变。实际上，已显示，HPV测试，与作为子宫颈癌诊断用的标准筛查方法的帕帕尼科拉乌试验或巴氏涂片相比，具有非常优异的子宫颈癌预测灵敏性。因此，在包括US的许多国家推行子宫颈癌筛查测试(Howley PM.Virology.Vol2,1996, 2045-2109;Murinoz N et al., NEngl J Med,2003, 348:518-27;Parkin M, F.Bray F, J.Ferlay J and P.Pisani P.Global cancer statistics, 2002.C..A.Cancer J.Clin.2005;National Network of STD/HIV Prevention Training Center.Genital humanpapillomavirus infection.Feb2008)。出于这些原因，HPV市场庞大，而且HPV测试具有重大经济价值。子宫颈癌是继乳腺癌之后全世界女性中的第二最常见癌症。在发展中国家，它还是女性癌症相关死亡的主要原因之一。据报道，全世界每年出现约440，000新病例和270，000例死亡。特别是，它是在发展中国家中引起女性死亡的主要原因。在韩国女性中，子宫颈癌的发病率(10.6%)位列第二，在胃癌(15.8%)和乳腺癌(15.1%)之后。近年来，人乳头瘤病毒感染在20岁和30岁年轻女性中显著增加，占所有性传播疾病患者的32%，且已经成为严重的健康关注对象。根据韩国中心癌登记处(Korea Central Cancer Registry)2002年度报告，与发达国家相比，韩国显示出较高的发病率，在2002年有3，979例。在所有的女性中出现的恶性肿瘤中，子宫颈癌在乳腺癌、胃癌、结肠直肠癌和甲状腺癌之后位列第五，患病率为9.1%，在40岁女性中患病率最高，为29.3%。根据来自韩国中心癌登记处的数据，当包括子宫颈原位癌(其是一种初癌阶段)时，子宫颈癌位列第二，而当排除原位癌时，其位列第五。然而，如果还包括在癌症统计中没有登记的宫颈非典型增生，其仍然是女性中最重要的癌症。以前，子宫癌的大约90%的癌症都是子宫颈癌。但是，近来，子宫体癌的发病率日益增加，而子宫颈癌的发病率正在减少。目前，子宫颈癌与子宫体癌白勺 t匕 列大约为 5:1 (http://www.ncc.re.kr:9000/nciapps/user/basicinfo/each_inf0.j sp grpcode=lH00)。关于子宫颈癌的原因的流行病学研究显示，具有低水平教育或经济或糟糕卫生条件的女性、在青少年期开始性交的女性、具有多次分娩经历的女性、具有杂乱性伙伴的女性以及在人乳头瘤病毒测试中被诊断为阳性的女性中患子宫颈癌的风险较高。这说明，子宫颈癌与性传播感染密切相关，并且已被普遍认可的是，人乳头瘤病毒是子宫颈癌的主要原因(Jae Won Kim, Ju Won Roh, Moon Hong Kim, Noh Hyun Park, Polymorphisms in E7Geneof Human Papillomavirus Type 16 Found in Cervical Tissues from Korean Women, JKorean Cancer Assoc.2000;32(5)875-883)。目前，基于亚型或基因型已知大约120种HPV。其中，83种的碱基序列和结构是已知的。大约40种HPV是感染肛门生殖器部位(即，阴道皮肤和粘膜、子宫颈、尿道和阴茎)的所谓的肛门生殖器型或生殖器HPV。在大多数人中大部分HPV感染不会引起症状，但是一些类型可以引起肉赘。其他的可以导致癌前期病变，如高等级鳞状上皮内损伤(HSIL)或子宫颈上皮瘤，而且他们中的一些可以发展成癌症。能够导致癌前期病变和癌症的HPV类型被称为高危型HPV，其他的被 称为低危型HPV。一些研究者将HPV分成高危群、中危群和低危群。高危型 HPV 包括 HPV16 型、HPV18 型、HPV31 型、HPV33 型、HPV35 型、HPV39 型、HPV45型、HPV51 型、HPV52 型、HPV56 型、HPV58 型、HPV59 型、HPV68 型和 HPV82 型。以及，低危型HPV 包括 HPV6 型、HPVll 型、HPV34 型、HPV40 型、HPV42 型、HPV43 型、HPV44 型、HPV54 型、HPV55型、HPV61型、HPV62型、HPV72型和HPV81型。被怀疑为高危但尚未被识别的可能的高危型 HPV 包括 HPV26 型、HPV53 型、HPV HPV66 型、HPV67 型、HPV69 型、HPV70 型 and HPV73型。除此之外，尚未清楚识别的其他类型有HPV7型、HPVlO型、HPV27型、HPV30型、HPV32型、HPV57型、HPV83型、HPV84型和HPV91型。据报道，全世界有49.9%的子宫颈癌患者是被HPV16型感染的，13.7%是被HPV18型感染的，7.2%是被HPV31型、HPV33型和HPV35型感染的，以及8.4%是被HPV45型感染的。根据Merck的报告，HPV16型和HPV18型尤为重要。这两种类型的HPV被报道引起约60-70%的子宫颈癌、子宫颈上皮瘤(CIN)和HSIL，而且已知的是，HPV6型和HPVll型引起约90%的生殖器赘生物。然而，不同人种和国家中的HPV类型的流行病学有所不同。实际上，如下文将阐述的，来自韩国的数据与来自其他国家的数据略有不同。来自韩国的其他报告将HPV16型和HPV18型归类为引起子宫颈癌的高危HPV，将HPV31型、HPV33型、HPV35型、HPV45型和HPV52型归类为中危HPV，以及将HPV6型和HPVll归类为低危HPV，并且声称通过对HPV进行基因分型使子宫颈癌的早期筛查或诊断成为可能(Jae WonKimj Ju Won Rohj Moon Hong Kimj Noh Hyun Park, Polymorphisms in E7Gene of HumanPapillomavirus Type 16 Found in Cervical Tissuesfrom Korean Women, J KoreanCancer Assoc2000;32(5)875-883;(http://www cmcbaoro or.kr/guide/guide02 02.1sp dtno=209&dcno=41I;Munoz N，Bosch FX，de Sanjose S，Herrero R，CastellsagueX，Shah KV，Snijders PJ，Meijer CJ and International Agency for Research on CancerMulticenter Cervical Cancer Study Group.Epidemiologic classification of humanpapillomavirus types associated with cervical cancer.New England Journal of Medicine.2003;348:518-527;Koutsky LA et al., N Engl J Med,2002, 347:1645-51;http://www.bosa.c0.kr/news board/view.asp news pk=82896) 0HPV基因组的大小约为8-10kb，并且由封装在类似高尔夫球的病毒壳体中的双螺旋DNA组成。HPV的基因组结构可以大体分为早期转录区E (早期基因区)、晚期转录区L(晚期基因区)和不表达区LCR(长控制区)。HPV的基因组结构极大地影响疾病的暴发类型、危险度和预后。特别是，E6基因和E7基因被整合到受感染细胞的基因组中，并且在它们在此保留并被表达的同时对诱发癌症起到重要作用。如HPV16型和HPV18型的高危型HPV的E6基因和E7基因与作为人类中最重要的肿瘤抑制基因的p53、E6AP、Rb(视网膜母细胞瘤，P105RB)、P107、P130等反应，并且使它们失活。结果，受感染细胞因细胞周期调节和凋亡控制机制的紊乱而被转化为癌细胞。超过99%的子宫颈癌是由高危型HPV引起的，而且在癌细胞的基因组中几乎总是发现E6/E7的HPV基因片段。相反，因为低危型HPV与如p53或Rb的肿瘤抑制基因反应并使其失活的能力低，所以它们通常不引起子宫颈癌。HPV的最大基因是LI。LI存在于大多数HPV类型中，具有同样保守的碱基序列。HPV的壳体蛋白主要由LI组成，而且LI具有最高抗原性。一旦子宫颈细胞被 HPV恶性转化，其会经由癌前期病变、发育异常、CIN或鳞状上皮内损伤(SIL)发展成所谓的原位癌。如果原位癌侵入子宫颈上皮下方的基底层，其会变成癌或浸润性癌。在90%的被HPV感染的女性中，免疫系统自然地从机体内清除病毒。然而，HPV保留在10%的被高危型HPV感染的女性中并且诱发癌前期病变(Wallin KL, WinklundF,Angstrim T, et al:Type-specific persistence of human papillomavirus DNA beforethe development of invasive cancer.N Engl J Med 1999;341:1633;Bosch FX, LorinczA, Munoz N, Meijer CJ, Shah KV.The causal relation between human papillomavirusand cervical cancer.JClin Pathol2002; 55:244-65)。大约 8% 的癌前期病变发展成原位癌，以及大约20%的原位癌发展成癌症。也就是说，高危型HPV感染维持10-20年或更长，它发展成子宫颈癌，且频率估计为约0.16%。既然子宫颈癌的暴发需要如此长时间并且其是逐渐发展，那么可以通过早期诊断癌前期病变来治疗或预防子宫颈癌。就是说，可以经由保守外科手术消除子宫颈的癌前期病变来预防癌症。HPV感染几乎不能由培养、染色、组织学检查或免疫检查来检测，并且只能通过遗传测试来准确地诊断。有三种HPV遗传测试。第一种是仅仅调查HPV的存在。典型实例是通过PCR扩增HPV基因的共有序列(即，不变核苷酸序列)接着通过例如电泳识别。第二种是所谓的基因分型分析，不仅鉴定HPV的存在而且鉴定其类型。金标准测试是进行PCR并且通过产物的自动核苷酸序列测定来分析基因型。然而，由于这种方法需要许多成本、时间和劳动，因此其正在被HPV DNA微阵列替代。将多种特异性针对HPV类型的探针点在固体载体上并且将样品DNA的PCR产物放在其上并杂交。然后，使用扫描仪分析结果。第三种是两种测试方法的中间物。杂交捕获测定法(Digene公司，Gaithersburg, MD, USA)是一个实例。虽然它能够鉴定HPV是否存在以及HPV是高危型还是低危型，但是准确的基因分型是不可能的。另外，只有13种高危型HPV和7种低危型HPV可被识别，而其他的20种以上的 HPV 类型不能被识别(Kim KH, Yoon MS, Na YT.Park CS, Oh MR, Moon ffC.Developmentand evaluation of a highly sensitive human papillomavirus genotyping DNA chip.Gynecol Oncol.2006;100(I):38~43;Selva L, Gonzalez-Bos quet E, Rodriguez-PlataMT, Esteva C,Sunol M and Munoz-Almagro C.Detection of human papillomavirusinfection in women attending a colposcopy clinic.Diagnostic Microbiology andInfectious Disease.2009;64:416-421)。关于HPV的另一个重要的事实是可以使用最近开发的HPV疫苗通过接种疫苗预防病毒感染和癌症。目前可用两种HPV疫苗。Gardasi! (Merck & C0.1nc., WhitehouseStation, NJ, USA)是针对即￥16型、即￥18型、即￥6型和即￥11型制备的四价疫苗。另一种是Cervarix. (GlaxoSmithKline Biologicals, Rixensart,比利时)，其是为预防 HPV16 型和HPV18型感染设计的二价疫苗。这些疫苗对性活动前的青春期少女最有效，并且在以前已被HPV16或HPV18感染的女性中效力降低。为此，对成年女性接种疫苗是有争论的，但是，其是可行的，除非HPV感染是16型或18型。因此，鉴定HPV感染并且识别准确的HPV类型变得越来越重要(Selva L, Gonzalez-Bosquet E, Rodriguez-Plata M T, Esteva C，Sunol M andMunoz-Almagro C.Detection of human papillomavirus infection in women attendinga colposcopy clinic Diagnostic Microbiologyand Infectious Disease2009;64:416-421;Reynales-Shigematsu LM.Rodrigues ER.Lazcano-Ponce E.Cost-effectivenessanalysis of a quadrivalent human papilloma virus vaccine in Mexic0.Arch MedRes.2009Aug ；40 (6):503-13)。检查子宫颈细胞的帕帕尼科拉乌试验(帕帕尼科拉乌涂片或巴氏涂片)已被用作子宫颈癌的主要筛查测试。但是，因为巴氏涂片是一种主观测试，所以经常发生假阳性结果，因此，需要对其进行补充的测试方法。事实上，基于巴氏涂片的细胞学测试对于作为子宫颈癌的最重要原因的HPV感染的诊断并不怎么有效，而且预测异常损伤是将会自然消失还是发展成癌症并不容易。实际上，通过显微镜下的细胞形态学检查不可能诊断无症状的感染或潜伏性感染，尤其是区分高危型HPV感染和低危型HPV感染。因此，为了减少子宫颈癌，需要能够监测HPV感染、其危险度及其基因型的诊断方法。如上所述，需要准确地、快速地、低成本、大规模地测试HPV的存在及其基因型。在这种意义上，DNA微阵列(芯片)技术是最适合的。
海外使用的HPV诊断产品包括Hybrid Capture II (Qiagen,德国；FDA批准)、Cervista HPV HR 测试(Hologic Women’ s Health C0.; 14 种高危型;FDA 批准)，RocheAMPLICOR HPV测试(Roche Molecular Systems, USA; CE标志(CE marking)), PapilloCheckHPV筛查测试试剂盒(Greiner Bio-One GmbH,德国；18种高危型和6种低危型；CE标志)和Digene HPV基因分型RH测试(Qiagen;高危型；CE标志)。然而，目前商品化的HPV基因分型DNA芯片具有以下缺点。第一，可被测试的HPV基因型的数目有限。第二，尽管HPV探针需要基于实际临床样品的HPV基因组的碱基序列信息来设计，但是大多数HPV DNA芯片的设计是基于从文献或美国基因库(US GenBank)中得到的标准碱基序列。因为HPV基因组的DNA碱基序列中有许多变化，如果引物或探针的设计没有考虑它们，那么PCR或杂交不会如所期望的进行，而且会出现错误。第三，因为没有使用内参基因(对照基因)，所以不容易知道阴性结果是真阴性还是假阴性。第四，没有考虑能够测试HPV全部基因型的存在的所谓通用探针。为此，对于全部HPV基因型均得到阴性结果时，不容易确定其意味着样品中没有HPV存在，还是其他基因型的HPV会存在。第五，PCR是在HPV DNA分析之前最重要的步骤，但是条件未被标准化。第六，为了使HPV DNA芯片和使用该芯片的HPV基因分型标准化，每种基因型的HPV需要用于基因克隆的标准材料。第七，虽然许多HPV DNA诊断试剂盒是可用的，但是大规模测试以及为研究与标准测试相比它们的准确度有多大以及它们用于筛查子宫颈癌和癌前期病变的帮助有多大而进行的比较是不够的。 本公开的发明人已经在几年内通过PCR后序列测定、DNA微阵列测试和HPV类型特异性PCR等研究了超过250，000个样品的肛门与生殖器HPV的存在及其类型和DNA碱基序列。基于这一结果和对商购的HPVDNA诊断试剂盒的特点的分析，他们注意到了现有技术中有待解决的问题并发明了一种新的HPV DNA微阵列。详细情况如下。1.生殖器和肛门HPV的类型和数目根据文献，可以侵入包括子宫颈的生殖器和肛门部位的HPV类型的数目估计为约40种，但并不确定。为了准确地诊断全部类型的生殖器HPV，先决条件是测试全部类型的生殖器HPV的多个样品。但是，这种数据是全世界稀少的。因此，本公开的发明人针对来自韩国女性的约16，000个子宫颈样品的HPV的LI基因、L2基因和E6/E7基因进行PCR并分析全部PCR产物的碱基序列。基于这些数据，并参考美国和其他国家的报告，他们已经确定了在该新的HPV DNA芯片中应当包含的HPV类型。类型的数目是43，因此，他们发明了一种能够分析全部43种生殖器HPV的DNA芯片。在实施例I中将对其进行详细描述。2.标准材料HPV基因分型的基本要求之一是应当针对各种基因型制备全部标准材料(参考材料)。这可以是HPV本身、HPV的整个基因组、HPV的重要基因或质粒克隆。文献中公开的和GenBank储存的生殖器HPV的标准材料的种类和数目非常有限。如前所述，本发明人已经针对来自韩国女性的约15，000个子宫颈样品的HPV的LI基因、L2基因和E6/E7基因进行PCR并分析了全部PCR产物的碱基序列。基于这一结果，通过完整或部分地克隆43种生殖器HPV的LI基因、L2基因和E6/E7基因，他们得到了质粒DNA克隆。他们决定通过以HPV LI基因的特异性区域为靶识别43种HPV的基因型，并确定了每种类型的HPV LI基因的克隆的质粒标准材料。它们用于DNA芯片的开发及其质量控制(QC)。在实施例2中将对其进行详细描述。3.PCR 扩增为了可以使用HPV DNA芯片进行准确、灵敏地分析，首先需要适当地进行PCR扩增。为此，应当使用于扩增将要在本公开的HPV DNA芯片上被杂交的HPV LI基因的PCR条件最优化，而且，最重要的是，应当适当地设计PCR引物。此外，优选的是，通过单个双重PCR，在相同条件下，在单管中完成HPV LI基因以及参考和对照基因的扩增。由于文献中报道的或商购HPV DNA芯片推荐的HPV PCR条件常常是嵌套式PCR，因此扩增过程不便，污染危险度高。此外，一些类型的HPV扩增良好，而另一些不好，并且当同时扩增参考基因时经常出现干扰。因此，通过重复实验，发明人新建了用于PCR的寡核苷酸引物的碱基序列以及基于43种HPV的LI基因和前述标准材料的碱基序列的扩增条件。结果，通过单个双重PCR可以完成HPV LI基因和参考基因的扩增。在实施例3中将对其进行详细描述。4.对照基因HPV DNA芯片分析的基本要求之一是不仅应当研究靶基因，而且应当研究为此的内参或对照基因。这对DNA芯片的信号的归一化分析以及假阴性结果与假阳性结果的区分都是必要的。但是，许多DNA芯片测试的进行没有对照基因。本公开的发明人已使用人β_球蛋白基因作为对照基因。此外，他们发现，持家基因肌动蛋白也可用作另一对照基因，并且最近将其加入HPV DNA芯片中。在实施例4-6中将对其进行详细描述。5.探针结构 在HPV基因分型DNA微阵列测试中最重要的事是对于各种基因型的HPV适当地进行杂交以使其能够被准确地识别。在这方面，探针极其重要。如上所述，本公开的发明人已对于来自韩国女性的超过15，000个子宫颈样品针对HPV的LI基因进行PCR并分析了全部PCR产品的碱基序列。基因这一结果，他们建立了 43种生殖器HPV的质粒DNA克隆标准材料，并且确定了 HPV DNA芯片的基本的寡核苷酸结构。寡核苷酸的长度为18至30个碱基对(bp)。在实施例5中将对其进行详细描述。6.探针的最终设计和制备通常，寡核苷酸探针的长度为20_30bp并且具有连到其上的C6接头。然而，本公开的发明人凭经验发现，在那种情况下，由于空间不稳定性会导致在载玻片上点样的过程中可能出现问题，。因此，本公开的发明人设计了一种具有较长C20接头的寡核苷酸探针。在实施例5中将对其进行详细描述。另外，他们通过引入茎部设计了d形探针。在实施例6中将对其进行详细描述。7.DNA微阵列(芯片)的构建根据探针对载网(grid)进行设计，并且将混在适合缓冲液中的探针点在显微镜用载玻片上。在实施例7中将对其进行详细描述。8.在DNA微阵列(芯片)上的反应
使用从各种类型的HPV的一个、两个或三个克隆的多种组合中得到的100个人造标准样品作为用于HPV LI基因和β-肌动蛋白基因的PCR扩增的模板。将PCR产物放在所述芯片上，并且进行杂交至少三次。然后，通过使用荧光扫描仪进行分析来确立最佳条件。在实施例8中将对其进行详细描述。9.DNA微阵列(芯片)的准确性的评估将本公开所构建的新HPV DNA芯片与标准序列测定及HPV-类型特异性PCR的HPVDNA芯片进行比较以调查准确性、灵敏性和特异性。此外，研究HPV DNA芯片是否能够用于测试临床样品(如子宫颈细胞)中HPV的存在及其基因型。在实施例9中将对其进行详细描述。现有HPV DNA芯片缺乏这种数据。10.子宫颈癌早期诊断的准确性的评估将根据本公开构建的新HPV DNA芯片的子宫颈癌和癌前期病变的诊断的准确性、灵敏性和特异性与现有的杂交捕获测定法2 (HCA-2)的子宫颈癌和癌前期病变的诊断的准确性、灵敏性和特异性进行比较。另外，调查本公开的HPV DNA芯片是否能够用于从临床样品(如子宫颈细胞)中预测子宫颈癌或癌前期病变。在实施例10中将对其进行详细描述。现有HPV DNA芯片缺乏这种数据。本公开的HPV DNA芯片已被证实可用于临床应用。

发明内容
技术问题本公开旨在提供一种用于诊断HPV的DNA芯片，其能够同时地准确、快速地诊断由44种生殖器HPV引起的感染。本公开还旨在提供一种寡核苷酸`探针和一种PCR引物，能够准确地检测44种生殖器HPV，具有高度特异性和灵敏性。本公开还旨在提供一种用于检测44种生殖器HPV的基因型的试剂盒，在所述试剂盒中，“多合一地”提供所述HPV DNA芯片、所述PCR引物、标记物等。技术方案在一个总的方面，本公开提供一种用于检测来自样品中的人乳头瘤病毒(HPV)的基因型的DNA芯片，包含:具有选自SEQ ID N06-SEQ ID Ν0109的碱基序列的线性寡核苷酸探针。在另一个总的方面，本公开提供一种用于检测来自样品中的HPV的基因型的DNA芯片，包含:具有选自SEQ ID NOl 10-SEQ ID Ν0213的碱基序列的d形寡核苷酸探针。本公开的DNA芯片能够同时检测44种HPV的基因型，所述44种HPV包括:作为高危型 HPV 的 HPV-16、HPV-18、HPV-31、HPV-33、HPV-35、HPV-39、HPV-45、HPV-51、HPV-52、HPV-56、HPV-58、HPV-59、HPV-68a、HPV-68b 和 HPV-82 ;作为中危型 HPV 的 HPV-26、HPV-53、HPV-66、HPV-67、HPV-69、HPV-70 和 HPV-73 ;作为低危型 HPV 的 HPV-6、HPV-1U HPV-34、HPV-40、HPV-42、HPV-43、HPV-44、HPV-54、HPV-55、HPV-61、HPV-62、HPV-72 和 HPV-81 ;以及作为其他 HPV 的 HPV-90、HPV-10, HPV-27、HPV-30、HPV-32、HPV-57、HPV-83、HPV-84 和HPV-91。在本公开的一个示例性实施方式中，具有选自SEQ ID N06-SEQ ID N097或SEQ IDNOl 10-SEQ ID N0201的碱基序列的寡核苷酸探针可与各个类型HPV所特有的LI基因区互补结合。在本公开的一个示例性实施方式中，具有选自SEQ ID N098-SEQ ID N0105或SEQID N0202-SEQ ID N0209的碱基序列的寡核苷酸探针可为与存在于全部类型的HPV中的LI基因区互补结合的通用探针。在本公开的一个示例性实施方式中，具有选自SEQ ID N0106-SEQ ID N0109或SEQID N0210-SEQ ID N0213的碱基序列的寡核苷酸探针可以与作为阳性对照的β-肌动蛋白
基因互补结合。在本公开的一个示例性实施方式中，所述DNA芯片可以具有8-24个分隔孔，所述探针可以被点在所述分隔孔上。在本公开的一个示例性实施方式中，所述寡核苷酸探针的浓度可为至少38pmol。在本公开的一个示例性实施方式中，可以将C6胺修饰的双脱氧胸腺嘧啶核苷连接到所述寡核苷酸探针 上作为接头从而将所述寡核苷酸探针点在SuperAldehyde涂敷载体上。在本公开的一个示例性实施方式中，所述载体可以选自载玻片、纸、硝酸纤维素膜、微量培养板孔、塑料、硅、DVD和小珠。在本公开的一个示例性实施方式中，所述样品可以选自子宫颈拭子、阴道拭子、子宫颈组织、阴茎组织、尿、肛门组织、直肠组织、咽组织、口腔组织和头颈组织。在本公开的一个示例性实施方式中，所述样品可以选自阴茎癌细胞、尿道癌细胞、肛门癌细胞、头颈癌细胞及其癌前细胞。在本公开的一个示例性实施方式中，所述DNA芯片可以用于决定是否将施用HPV疫苗。在另一个总的方面中，本公开提供一种用于检测HPV的基因型的试剂盒，包括:所述DNA芯片，用于通过PCR扩增靶基因的引物，和用于检测扩增的DNA的标记物。在本公开的一个示例性实施方式中，所述引物可为具有选自SEQ ID NOl-SEQ IDNO 2的碱基序列的用于扩增人β-肌动蛋白基因的引物或者具有选自SEQ ID N03-SEQ IDNO 5的碱基序列的用于扩增HPV LI基因的引物。在本公开的一个示例性实施方式中，所述标记物可为选自Cy3、Cy5, Cy5.5、BODIPY, Alexa488、Alexa532、Alexa546、Alexa568、Alexa594、Alexa660、若丹明、TAMRA,FAM、FITC、Fluor X、R0X、Texas Red、0range Green488X、Orange Green514X、HEX、TET、JOE、0yster556、0yster645、B0DIPY630/650、B0DIPY650/665、Calfluor 0range546、CalfluorRed610、Quasar670、生物素、Au、Ag和聚苯乙烯中的一种或多种。在另一个总的方面中，本公开提供一种用于检测HPV的基因型的方法，包括:(a)使用具有选自SEQ ID NOl-SEQ ID N05的碱基序列的引物通过单一、双重或嵌套式PCR扩增样品的靶基因；(b)对DNA芯片的寡核苷酸探针进行标记；(c)使经标记的探针与经扩增的PCR产物杂交；和(d)检测杂交的产物。在本公开的一个示例性实施方式中，(b)中所述标记可通过以下方式进行:用选自 Cy3、Cy5、Cy5.5、B0DIPY、Alexa488、Alexa532、Alexa546、Alexa568、Alexa594、Alexa660、若丹明、TAMRA、FAM、FITC、Fluor X、ROX、Texas Red,Orange Green488X、Orange Green514X、HEX、TET、JOE、Oyster556、Oyster645、B0DIPY630/650、B0DIPY650/665、CalfluorOrange546、Calfluor Red610、Quasar670和生物素中的标记物对所述寡核苷酸探针进行标记。在本公开的一个示例性实施方式中，(b)中所述标记可通过以下方式进行:首先用Au纳米颗粒然后用银染色标记靶探针以及将所述靶探针与所述DNA芯片的寡核苷酸探针互补地结合。在本公开的一个示例性实施方式中，(b)中所述标记可通过以下方式进行:首先用Au纳米颗标记靶探针而后形成银壳以及将所述靶探针与所述DNA芯片的寡核苷酸探针互补地结合。在本公开的一个示例性实施方式中，所述靶探针可以具有选自SEQ ID N0214-SEQID N0215的碱基序列，并且在3’ -末端依次连接C18接头、AlO和巯基。在本公开的一个示例性实施方式中，所述基因分型方法可以进一步包括使用质粒载体进行分析，在所述质粒载体中插入表I中描述的65种HPV的LI基因作为阳性对照克隆。在本公开的一个示例性实施方式中，所述样品可以选自子宫颈拭子、阴道拭子、子宫颈组织、阴茎组织、尿、肛门组织、直肠组织、咽组织、口腔组织和头颈组织。在本公开的一个示例性实施方式中，所述样品可以选自阴茎癌细胞、尿道癌细胞、肛门癌细胞、头颈癌细胞及其癌前细胞。根据本公开的用于检测HPV的基因型的寡核苷酸探针、含有所述寡核苷酸探针的DNA芯片和诊断试剂盒以及用于检测HPV的基因型的方法按照如下九步完成。1.标准样品和对照样品的制备本公开的发明人对于来自韩国女性的约16，000个子宫颈样品，针对HPV的L1、L2和E6/E7基因进行PCR，并且分析全部PCR产物的碱基序列。基于这些数据，并且参考美国和其他国家的报告，他们确定了应当被包含在新型HPV DNA芯片中的HPV类型。所述类型的数目为43，因此，他们发明了一种能够分析全部43种生殖器HPV的DNA芯片。2.DNA 的分离使用适当确立的方法从步骤I中得到的样品中分离DNA。3.双重 PCR设计用于扩增HPV LI基因和人β-肌动蛋白基因的寡核苷酸引物，并且确立适当的PCR条件。以双重方式进行PCR并且在不同的引物浓度下针对各种基因确立条件。使用在步骤2中分离的DNA作为模板，针对HPV LI基因和人β -肌动蛋白基因进行PCR。4.序列测定和克隆PCR后，通过序列测定分析HPV LI基因的碱基序列，并且基于结果建立数据库。将HPV类型已被识别的PCR产物克隆到质粒载体中。随后，在确立用于本公开的DNA芯片的反应条件的过程中，将所述克隆用作标准样品和对照样品。HPV基因型已被识别的临床DNA样品被贮藏并且用于本公开的DNA芯片的准确分析。5.探针设 计基于通过检测来自韩国人的子宫颈细胞和癌组织的HPV的基因型而在步骤4中建立的序列数据库以及外国的HPV相关数据库，设计与全部43种可以感染人子宫颈的HPV的LI基因和人β -肌动蛋白基因互补且能够通过在所述DNA芯片上杂交检测它们的寡核苷酸探针。此外，设计具有茎部的d形寡核苷酸探针。6.DNA芯片的构建设计载网，在步骤5中设计的探针将被点在所述载网上，并且将与适当的缓冲液混合的探针点(或排列)在显微镜用载玻片上。对所得到的DNA芯片进行稳定化和质量控制。7.在DNA芯片上的反应和分析条件的确立对于在步骤4中得到的各个类型HPV，使用一个、两个或三个克隆的多种组合作为模板，通过双重PCR扩增HPV LI基因和β-肌动蛋白基因。将PCR产物置于所述DNA芯片上，并且几次进行杂交。然后，通过使用荧光扫描仪进行分析来确立最佳条件。8.在DNA芯片上进行临床样品的分析将在步骤3和4中通过PCR和序列测定已经确认HPV的存在和类型的临床样品的DNA再次进行双重PCR。将PCR产物置于在步骤6中构建的DNA芯片上并且使其在步骤7中确立的条件下进行杂交。清洗后，使用荧光扫描仪分析结果。由此，分析本公开的DNA芯片的灵敏性、特异性和再现性，并且再次确立使用本公开的DNA芯片诊断HPV基因型的最佳条件。9.在于DNA芯片上分析临床样品之后分析与临床数据的相关性将在步骤8中PCR后DNA芯片分析的结果与临床数据(如巴氏涂片的数据)进行比较，并且研究它们的相关性。分 析本公开的DNA芯片是否对预测子宫颈癌或癌前期病变有用。结果，可以确认的是，本公开的DNA芯片不仅可以用于HPV的基因分型，还可以用于子宫颈癌的筛查。使用本公开的DNA芯片的诊断试剂盒提供了:1)用于从样品(如子宫颈拭子、石蜡切片等)中提取DNA的试剂；2)用于通过PCR扩增HPV LI基因和β-肌动蛋白基因的试剂；3)在HPV基因扩增过程中用作阳性对照的质粒DNA克隆；4)用于HPV基因分型的寡DNA芯片；和5) “多合一地”使用DNA芯片的杂交用反应溶液和清洗溶液。有益效果根据本公开，可以检测侵入外生殖器的全部44种HPV，而且可以准确诊断由超过一种类型的HPV引起的同时感染。HPV基因分型的灵敏性和特异性接近于100%，并且可以快速测试许多个样品。本公开对预测子宫颈癌和癌前期病变是非常有用的。特别是，根据本公开的用于检测HPV的基因型的DNA芯片和使用该DNA芯片的试剂盒对通过HPV及其基因分型大规模自动化诊断样品(如子宫颈拭子、阴道拭子、尿、肛门组织、口腔组织、咽组织等)感染非常有用。此外，它们可以与巴氏涂片一起使用或者单独使用以筛查子宫颈癌及其癌前期病变，减少测试成本、工作和时间。此外，因为可以准确地分析HPV的基因型，所以它们可以用于定制接种疫苗。因此，本公开将通过减少HPV相关癌症和由此引起的死亡而非常有助于卫生健康的改善，并且对医药产业非常有价值。


图1显示根据本公开的用于检测HPV的基因型的DNA微阵列(芯片)的载网。在一个DNA芯片上形成八个孔，并且将特异性针对各个类型的HPV LI基因的探针、对全部类型的HPVLl基因共用的通用探针和针对对照或参考基因的探针点在每个孔上。图1中，红色斑点对应于引起癌症的 14 种高危型 HPV:HPV16、HPV18、HPV31、HPV33、HPV35、HPV39、HPV45、HPV51、HPV52、HPV56、HPV58、HPV59、HPV68和HPV82。粉红色斑点对应于7种可能的高危型HPV(尽管未明确证实但其可能引起癌症):HPV26、HPV53、HPV66、HPV67、HPV69、HPV70和 HPV73。天蓝色斑点对应于 14 种低危型 HPV:HPV_6、HPV-11、HPV-34、HPV-40、HPV-42、HPV-43、HPV-44、HPV-54、HPV-55、HPV-61、HPV-62、HPV-72、HPV-81 和 HPV-90。黄色斑点对应于8种其他的HPV类型(癌症风险尚不明确):HPV10、HPV27、HPV30、HPV32、HPV57、HPV83、HPV84和HPV91。紫色斑点，对应于通用探针，当样品中存在HPV时，给出阳性结果。绿色斑点对应于对照基因探针，对照基因探针用作角标记(corner marker)并表明已成功地从样品中提取DNA。本公开中，使用所谓的持家基因之一的人β_肌动蛋白(ACTB)基因作为对照基因。

图2是显示确定用于通过双重PCR扩增HPV LI基因(作为靶基因)和人β -肌动蛋白基因(作为对照基因)的HPV LI引物和ACTB引物的最佳浓度比的实验结果的电泳图像。使用Myll、GP6-l和GP6+作为HPV LI引物，并且使用ACTBF和ACTBR作为β -肌动蛋白引物。泳道Μ:1OObp大小标记；泳道1-5 =IOpmol HPV LI引物，IOpmolACTB引物；泳道6-10:IOpmol HPV LI 引物，5pmol ACTB 引物；泳道 11-15:10pmol HPV LI 引物，lpmol ACTB引物。样品1:HPV56型阳性的人子宫颈拭子样品；样品2:HPV16型阳性的人子宫颈拭子样品；样品3-4:未被HPV感染的子宫颈拭子样品；样品5:作为阳性标准材料的含有HPV18型的基因的海拉(HeLa)子宫颈癌细胞样品。已证实，就双重PCR而言，泳道6_10的条件是最好的条件。图3显示在将图2中泳道6-10的样品放在本公开的HPV DNA芯片上之后进行杂交及使用荧光扫描仪在635nm波长下进行扫描的结果。图4显示按照现有方法分别进行HPV LI基因和β -球蛋白基因的单一 PCR与使用对HPV和非特异的低信号表现出阴性结果的样品进行双重PCR的实验结果。样品1-2是作为未被HPV感染的阴性对照的HEK细胞的gDNA样品，以及样品3是被HPV35、HPV39、HPV-53、HPV58、HPV72和HPV-66同时感染的子宫颈拭子样品。图5显示从韩国女性的子宫颈拭子样品和阴道拭子样品中提取DNA、按照本公开进行双重PCR、在本公开的HPV DNA芯片上进行HPV LI扩增产物和β-肌动蛋白扩增产物的杂交以及在清洗后用荧光扫描仪扫描的示例性结果。样品表现出对于特异性针对HPV-6L1基因的探针、通用探针和β_肌动蛋白探针的阳性结果，于是被诊断为被HPV6型感染。因为对于通用探针和β_肌动蛋白探针样品给出阳性结果，所以可以确定为真阳性，而非假阳性。这一结果也通过序列测定而被证实。图6显示从韩国女性的子宫颈拭子样品和阴道拭子样品中提取DNA、按照本公开进行双重PCR、在本公开的HPVDNA芯片上进行HPV LI扩增产物和β-肌动蛋白扩增产物的杂交以及在清洗后用荧光扫描仪扫描的示例性结果。样品表现出对于特异性针对HPV39L1基因的探针、通用探针和β_肌动蛋白探针的阳性结果，于是被诊断为被HPV39型感染。这一结果也通过序列测定而被证实。
图7显示从韩国女性的子宫颈拭子样品和阴道拭子样品中提取DNA、按照本公开进行双重PCR、在本公开的HPVDNA芯片上进行HPV LI扩增产物和β-肌动蛋白扩增产物的杂交以及在清洗后用荧光扫描仪扫描的示例性结果。样品表现出对于特异性针对HPV11L1基因的探针、通用探针和β_肌动蛋白探针的阳性结果，于是被诊断为被HPVll型感染。这一结果也通过序列测定而被证实。图8显示从韩国女性的子宫颈拭子样品和阴道拭子样品中提取DNA、按照本公开进行双重PCR、在本公开的HPVDNA芯片上进行HPV LI扩增产物和β-肌动蛋白扩增产物的杂交以及在清洗后用荧光扫描仪扫描的示例性结果。样品表现出对于特异性针对HPV-6L1基因的探针、特异性针对HPV43L1基因的探针、通用探针和肌动蛋白探针的阳性结果，于是被诊断为被HPV-6和HPV-43同时感染(混合感染)。这一结果也通过序列测定而被证实。图9显示从韩国女性的子宫颈拭子样品和阴道拭子样品中提取DNA、按照本公开进行双重PCR、在本公开的HPV DNA芯片上进行HPV LI扩增产物和β-肌动蛋白扩增产物的杂交以及在清洗后用荧光扫描仪扫描的示例性结果。样品表现出对于特异性针对HPV-6L1基因的探针、特异性针对HPV11L1基因的探针、通用探针和肌动蛋白探针的阳性结果，于是被诊断为被HPV-6和HPV-1l同时感染。这一结果也通过序列测定而被证实。图10显示从韩国女性的子宫颈拭子样品和阴道拭子样品中提取DNA、按照本公开进行双重PCR、在本公开的HPV DNA芯片上进行HPV LI扩增产物和β -肌动蛋白扩增产物的杂交以及在清洗后用荧光扫描仪扫描的示例性结果。样品表现出对于特异性针对HPV52L1基因的探针、通用探针和β_肌动蛋白探针的阳性结果，于是被诊断为被HPV52型感染。这一结果也通过序列测定而被证实。图11显示从韩国女性的子宫颈拭子样品和阴道拭子样品中提取DNA、按照本公开进行双重PCR、在本公开的HP VDNA芯片上进行HPV LI扩增产物和β-肌动蛋白扩增产物的杂交以及在清洗后用荧光扫描仪扫描的示例性结果。样品表现出对于特异性针对HPV33L1基因的探针、通用探针和β_肌动蛋白探针的阳性结果，于是被诊断为被HPV33型感染。这一结果也通过序列测定而被证实。图12显示从韩国女性的子宫颈拭子样品和阴道拭子样品中提取DNA、按照本公开进行双重PCR、在本公开的HPVDNA芯片上进行HPV LI扩增产物和β-肌动蛋白扩增产物的杂交以及在清洗后用荧光扫描仪扫描的示例性结果。样品表现出对于特异性针对HPV-6L1基因的探针、特异性针对HPV56L1基因的探针、通用探针和肌动蛋白探针的阳性结果，于是被诊断为被HPV-6和HPV-56同时感染。这一结果也通过序列测定而被证实。图13显示从韩国女性的子宫颈拭子样品和阴道拭子样品中提取DNA、按照本公开进行双重PCR、在本公开的HPVDNA芯片上进行HPV LI扩增产物和β-肌动蛋白扩增产物的杂交以及在清洗后用荧光扫描仪扫描的示例性结果。样品表现出对于特异性针对HPV-6L1基因的探针、特异性针对HPV30L1基因的探针、通用探针和肌动蛋白探针的阳性结果，于是被诊断为被HPV-6和HPV-30同时感染。这一结果也通过序列测定而被证实。图14显示从其子宫颈中经组织学鉴定为具有高级别的鳞状上皮内损伤的韩国女性的子宫颈拭子样品中提取DNA、按照本公开进行双重PCR、在本公开的HPV DNA芯片上进行HPV LI扩增产物和β_肌动蛋白扩增产物的杂交以及在清洗后用荧光扫描仪扫描的示例性结果。样品表现出对于特异性针对HPV16L1基因的探针、特异性针对HPV81L1基因的探针、通用探针和肌动蛋白探针的阳性结果，于是被诊断为被HPV-16和HPV-81同时感染。这一结果也通过序列测定而被证实。图15示意性显示在使被点在芯片上的探针与PCR产物杂交之后，先用金纳米颗粒(AuNP)而后用银进行标记的过程。图16显示HPV-6-AuNP-Ag增强芯片的扫描图像。左侧图像显示扫描全部8个孔的结果，以及右侧图像显示点在每个孔中的斑点。图17显示HPV-6-AuNP-Ag核壳芯片的扫描图像。左侧图像显示扫描全部8个孔的结果，以及右侧图像显示点在每个孔中的斑点。不同于图16的银(Ag)染色图像，斑点被清楚地显示。图18显示利用扫描电子显微镜术(SEM)分析HPV-6-AuNP-Ag染色芯片的斑点和背景(BG)的结果。已证实，在每个斑点中金纳米颗粒以高密度存在。图19显示利用SEM分析HPV-6-AuNP-Ag核壳芯片的斑点和背景(BG)的结果。已证实，在每个斑点中金纳米颗粒以高密度存在。图20显示HPV-6-AuNP-Ag增强斑点和HPV-6-AuNP-Ag核壳-标记斑点的SEM图像。可以看出，与Ag染色相比，Ag核壳标记赋予稳定得多的结果。在Ag染色的情况下，染色是非特异的。图21显示使用装备有ro的扫描仪在不同的模板浓度下扫描其中用AuNP (HPV-6-AuNP)标记针对HPV-6的PCR模板和靶探针(LTP)的芯片、其中用AuNP标记针对HPV-6的PCR模板和靶探针(LTP)而后用银(HPV-6-AuAg染色)增强的芯片以及先用Au然后用Ag核壳(HPV-6-AuAg核壳)标记针对HPV-6的PCR模板和靶探针(LTP)的芯片以及使用SBR比较每个斑点的反射率的结果。图22示意性显示用于DNA芯片的d形探针的示例性结构。
具体实施例方式在下文中，将通过实施例更加详细地描述本公开。但是，本公开并不被下列实施例限制。实施例1:对照样品的制备和DNA的提取制备将要用作标准材料的样品以及从其中提取DNA。作为第一样品，被HPV感染且其类型已被识别并且已被广泛用于HPV基因分型研究的人子宫颈癌细胞购自ATCC(马纳萨斯，VA20108，USA)和韩国细胞系库(KCLB;SeoulNational University Cancer Research Institute,韩国)，并且在单层培养后使用。从其中分离基因组DNA。第二样品从已被诊断为子宫颈癌或原位癌的100个韩国女性的CIN子宫颈组织得至|J。将福尔马林固定的石蜡包埋的组织切成5-10片(10-μπι厚)，并且放在显微镜用载玻片上。然后，只对癌细胞进行显微解剖。在100例子宫颈癌损伤中，98例有子宫颈上皮瘤(CIN)。作为第三样品 ，子宫颈样品从在2005年至2007年期间就诊Hamchun诊断中心(韩国首尔)或韩国妇科癌症基金会(Korea Gynecologic Cancer Foundation)(韩国首尔)并且接受子宫颈拭子和巴氏涂片测试的15，708个女性得到。她们的年龄在16至80岁之间，且平均年龄是47岁。如下从样品中分离DNA。为了从细胞、子宫颈拭子样品和石蜡切片样品中提取DNA，使用Labo Pass 组织迷你试剂盒(CME0112，CosmoGenetech,韩国)浓缩和纯化DNA。详情如下:A.从细胞中分离基因组DNA分离单层培养的细胞并将其加入到50-mL离心管中。在于3500rpm下离心30分钟后，弃去上清液并将沉淀在500 μ L PBS中重悬浮，然后转移到1.5-mL离心管中。再次于12，OOOrpm下离心2分钟后，通过清洗除去残留培养基，于是得到基因组DNA。B.从子宫颈拭子样品中分离基因组DNAI)将1.5mL样品溶液转移到1.5-mL离心管中。通过在13，500xg下离心2分钟使细胞沉降。2)移除上清液并加入500 μ LPBS。3)利用涡旋使细胞与溶液充分混合。4)在13，500xg下离心2分钟后，移除上清液。5)加入 200 μ L TL 缓冲液。6)加入20 μ L蛋白酶K后，利用涡旋使混合物充分混合。
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7)在56° C恒温水浴中进行反应30分钟。8)反应完成后，在6，OOOxg以上的条件下进行离心约10秒。9)加入400 μ L TB缓冲液后，使混合物充分混合。然后，在6，OOOxg以上的条件下进行离心约10秒。10)将反应溶液加入到安装在收集管处的离心柱(spin column)中。11)在6，OOOxg下进行离心I分钟。12)弃去已经通过离心柱的滤液并且安装新的收集管。13)加入700 μ L Bff缓冲液后，在6，OOOxg进行离心I分钟。14)弃去已经通过离心柱的滤液并且安装新的收集管。15)加入500 μ L NW缓冲液后，在13，500xg下进行离心3分钟。16)弃去已经通过离心柱的滤液并且安装新的1.5-mL的管。17)加入200 μ L AE缓冲液或净化水后，使离心柱在室温下静置2分钟。18)在6，OOOxg下进行离心I分钟。19)提取的基因组DNA可以直接用于PCR，或者可以贮存在-20° C备用。20)提取的基因组DNA可以在0.8%琼脂糖凝胶上进行电泳并且用UV检测。C.从石蜡包埋的样品中分离基因组DNAI)使用切片机或外科手术刀将石蜡包埋的样品切成20 μ m厚的片。2)将样品转移到1.5-mL管中。3)加入1.2mL 二甲苯后，利用涡旋剧烈混合该混合物2分钟。4)在13，500xg下离心5分钟后，移除上清液。5)加入1.2mL乙醇后，利用涡旋剧烈混合该混合物2分钟。6)在13，500xg下离心5分钟后，移除上清液。
7)重复步骤3)-5)以彻底除去石蜡。8)使容纳样品的管在37° C静置15分钟以使乙醇可被蒸发。9)将200 μ LTL缓冲液加入到管中的样品中。10)加入20 μ L蛋白酶K后，利用涡旋充分混合该混合物。11)在56° C恒温水浴中进行反应30分钟。12)加入400 μ L TB缓冲液后充分混合该混合物。在6，OOOxg以上的条件下进行离心约10秒。13)将反应溶液加入到安装在收集管处的离心柱中。14)在6，OOOxg下进行离心I分钟。15)弃去已经通过离心柱的滤液并且安装新的收集管。16)加入700 μ L Bff缓冲液后，在6，OOOxg下进行离心I分钟。17)弃去已经通过离心柱的滤液并且安装新的收集管。18)加入500 μ L NW缓冲液后，在13，500xg下进行离心3分钟。19)弃去已经通过离心柱的滤液并且安装新的1.5-mL管。20)加入200 μ L AE缓冲液或净化水后，使离心柱在室温下静置2分钟。21)在6，OOOxg下进行离心I分钟。22)提取的基因组DNA可以直接用于PCR，或者可以贮存在-20° C备用。23)提取的基因组DNA可以在0.8%琼脂糖凝胶上进行电泳并且用UV检测。实施例2 准样品和对照样品的制备制备将要在下列基因分型和分析中用作标准材料的HPV LI基因的质粒DNA克隆。首先，从人子宫颈癌细胞中提取DNA并且获得HPV LI基因的PCR产物。其次，从韩国食品和医药管理局(Korea Food & Drug Administration (KFDA))获得42种类型的HPV的LI基因的PCR产物。再次，从100个韩国女性的子宫颈癌组织和15，708个女性的子宫颈拭子样品中得到HPV的PCR产物。在通过PCR后序列测定对HPV LI基因进行基因分型之后，将PCR产物克隆到pGEM-T Easy载体上以获得每种HPV基因型的LI克隆。在本公开的DNA芯片的反应条件的确立的过程中，使用这些克隆作为标准样品和对照样品。如下进行克隆:I)在琼脂糖凝胶上使用凝胶回收试剂盒(Zymo Research, USA)分离扩增的LI基因的PCR产物，并且使用分光光度计或在琼脂糖凝胶上测量浓度。2)使已贮存在-20° C 的 pGEM-T Easy 载体(Promega, A1360, USA)和 2x 快速连接缓冲液熔化并且通过用手指轻微地摇动而轻微地混合。在低速离心之后，接着以下列比例混合将要被克隆的插入DNA，将混合物加入到用于连接反应的0.5-mL管中。
权利要求
1.一种用于检测来自样品中的人乳头瘤病毒(HPV)的基因型的DNA芯片，包含:具有选自SEQ ID N06-SEQ ID NO 109的碱基序列的线性寡核苷酸探针。
2.一种用于检测来自样品中的人乳头瘤病毒(HPV)的基因型的DNA芯片，包含:具有选自SEQ ID NOl 10-SEQ ID N0213的碱基序列的d形寡核苷酸探针。
3.根据权利要求1或2所述的DNA芯片，其中，所述DNA芯片用于同时检测44种HPV的基因型，所述 44 种 HPV 包括:作为高危型 HPV 的 HPV-16、HPV-18、HPV-31、HPV-33、HPV-35、HPV-39、HPV-45、HPV-51、HPV-52、HPV-56、HPV-58、HPV-59、HPV-68a、HPV-68b 和 HPV-82 ;作为中危型 HPV 的 HPV-26、HPV-53、HPV-66、HPV-67、HPV-69、HPV-70 和 HPV-73 ;作为低危型HPV 的 HPV-6、HPV-11、HPV-34、HPV-40、HPV-42、HPV-43、HPV-44、HPV-54、HPV-55、HPV-61、HPV-62、HPV-72 和 HPV-81 ;以及作为其他 HPV 的 HPV-90、HPV-10、HPV-27、HPV-30、HPV_32、HPV-57、HPV-83、HPV-84 和 HPV-91。
4.根据权利要求3所述的DNA芯片，其中，具有选自SEQID N06-SEQ ID N097或SEQID NOl 10-SEQ ID N0201的碱基序列的寡核苷酸探针与各个类型HPV所特有的LI基因区域互补结合。
5.根据权利要求3所述的DNA芯片，其中，具有选自SEQID N098-SEQ ID N0105或SEQID N0202-SEQ ID N0209的碱基序列的寡核苷酸探针是与存在于全部类型的HPV中的LI基因区域互补结合的通用探针。
6.根据权利要求3所述的DNA芯片，其中，具有选自SEQID N0106-SEQ ID N0109或SEQ ID N0210-SEQ ID N0213的碱基序列的寡核苷酸探针与作为阳性对照的β-肌动蛋白基因互补结合。
7.根据权利要求1或2所述的DNA芯片，其中，所述DNA芯片具有8_24个分隔孔，所述探针能够被点在所述分隔孔上。
8.根据权利要求1或2所述的DNA芯片，其中，所述寡核苷酸探针的浓度为至少38pmolο
9.根据权利要求1或2所述的DNA芯片，其中，将C6胺修饰的双脱氧胸腺嘧啶核苷连接到所述寡核苷酸探针上作为接头从而将所述寡核苷酸探针点在SuperAldehyde涂敷载体上。
10.根据权利要求9所述的DNA芯片，其中，所述载体选自载玻片、纸、硝酸纤维素膜、微量培养板孔、塑料、硅、DVD和小珠。
11.根据权利要求1或2所述的DNA芯片，其中，所述样品选自子宫颈拭子、阴道拭子、子宫颈组织、阴茎组织、尿、肛门组织、直肠组织、咽组织、口腔组织和头颈组织。
12.根据权利要求1或2所述的DNA芯片，其中，所述样品选自阴茎癌细胞、尿道癌细胞、肛门癌细胞、头颈癌细胞及它们的癌前细胞。
13.根据权利要求1或2所述的DNA芯片，其中，所述DNA芯片用于确定是否将施用HPV疫苗。
14.一种用于检测人乳头瘤病毒(HPV)基因型的试剂盒，包括:根据权利要求1或2所述的DNA芯片，用于通过PCR扩增靶基因的引物，和用于检测所述经扩增DNA的标记物。
15.根据权利要求14所述的试剂盒，其中，所述引物是具有选自SEQID NOl-SEQ IDN02的碱基序列的用于扩增人β-肌动蛋白基因的引物或者具有选自SEQ ID N03-SEQ IDN05的碱基序列的用于扩增HPV LI基因的引物。
16.根据权利要求14所述的试剂盒，其中，所述标记物是选自Cy3、Cy5、Cy5.5、B0DIPY、Alexa488、Alexa532、Alexa546、Alexa568、Alexa594、Alexa660、若丹明、TAMRA, FAM、FITC、Fluor X>ROX>Texas RecUOrange Green488X、Orange Green514X、HEX、TET、J0E、0yster556、0yster645、B0DIPY630/650、B0DIPY650/665、Calfluor 0range546、Calfluor Red610、Quasar670、生物素、Au、Ag和聚苯乙烯的一种或多种。
17.一种用于检测人乳头瘤病毒(HPV)基因型的方法，包括: (a)使用具有选自SEQID NOl-SEQ ID N05的碱基序列的引物通过单一、双重或嵌套式PCR扩增样品的靶基因； (b)对根据权利要求1或2所述的DNA芯片的寡核苷酸探针进行标记； (c)使经标记的探针与经扩增的PCR产物杂交；和 (d)检测杂交的产物。
18.根据权利要求17所述的方法，其中，所述对所述寡核苷酸探针进行标记包括用选自 Cy3、Cy5、Cy5.5、BODIPY, Alexa488、Alexa532、Alexa546、Alexa568、Alexa594、Alexa66。、若丹明、TAMRA、FAM、FITC、Fluor X、R0X、Texas RecUOrange Green488X> OrangeGreen514X、HEX、TET、JOE、0yster556、0yster645、B0DIPY630/650、B0DIPY650/665、Calfluor 0range546、Calfluor Red610、Quasar670和生物素中的标记物对所述寡核苷酸探针进行标记。
19.根据权利要求17所述的方法，其中，所述(b)对所述寡核苷酸探针进行标记包括首先用Au纳米颗粒然后用银染色 标记靶探针以及将所述靶探针与所述DNA芯片的寡核苷酸探针互补地结合。
20.根据权利要求17所述的方法，其中，所述(b)对所述寡核苷酸探针进行标记包括首先用Au纳米颗标记靶探针而后形成银壳以及将所述靶探针与所述DNA芯片的寡核苷酸探针互补地结合。
21.根据权利要求19所述的方法，其中，所述靶探针具有选自SEQID N0214-SEQ IDN0215的碱基序列，并且在3’ -末端依次连接C18接头、AlO和巯基。
22.根据权利要求20所述的方法，其中，所述靶探针具有选自SEQID N0214-SEQ IDN0215的碱基序列，并且在3’ -末端依次连接C18接头、AlO和巯基。
23.根据权利要求17所述的方法，所述方法进一步包括使用质粒载体进行分析，在所述质粒载体中插入表I中描述的65种HPV的LI基因作为阳性对照克隆。
24.根据权利要求17所述的方法，其中，所述样品选自子宫颈拭子、阴道拭子、子宫颈组织、阴茎组织、尿、肛门组织、直肠组织、咽组织、口腔组织和头颈组织。
25.根据权利要求17所述的方法，其中，所述样品选自阴茎癌细胞、尿道癌细胞、肛门癌细胞、头颈癌细胞及它们的癌前细胞。
全文摘要
本申请公开一种DNA芯片(或DNA微阵列)、含有该DNA芯片的基因分型试剂盒及使用该DNA芯片的基因分型方法，在所述DNA芯片上点有与作为子宫颈癌的主要成因和性传播疾病的最常见原因的44种HPV的核酸互补结合的探针。根据本公开，可以检测侵入外生殖器的全部44种HPV，而且可以准确地诊断由超过一种类型的HPV引起的同时感染。HPV基因分型的灵敏性和特异性接近于100%，并且可以快速测试许多个样品。本公开对预测子宫颈癌和癌前期病变是非常有用的。
文档编号C12N15/37GK103210091SQ201080068613
公开日2013年7月17日 申请日期2010年6月25日 优先权日2010年6月17日
发明者文宇哲, 吴明烈 申请人:Goodgene有限公司