专利名称：一种长穗偃麦草e组染色体特异issr-scar标记的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种长穗偃麦草E组染色体特异ISSR-SCAR标记，尤其涉及一种检测小麦E组染色体的试剂盒及其应用。
背景技术：
偃麦草属是小麦的一个近缘种属，它具有普通小麦缺少的许多优良性状，如分蘖能力强，根系发达，抗寒、抗旱、耐瘠薄、耐盐碱力强，多花、大穗、多实，籽粒蛋白含量高以及优良的烘烤品质，抗多种病害能力强，对小麦条锈病、叶锈病、杆锈病、白粉病、黄矮病、条纹花叶病及腥黑穗病高抗至免疫，是小麦遗传育种的重要亲本之一。长穗偃麦草(Agropyron elongatum)是小麦的一个重要近缘种，具有蛋白质含量高、抗多种真菌和病毒病害、耐旱、 耐寒、大穗多花等优异性状，是在小麦品种改良中应用最广泛的野生种之一。在自然界，长穗偃麦草有二倍体、四倍体和十倍体3种倍性类型。其中二倍体长穗偃麦草(Thinopyrum elongatum) E组染色体是组成偃麦草属(Elytrigia)多倍体物种的基本染色体组，携带有对小麦遗传育种有益的基因，但对于四倍体和十倍体类型的染色体组构成，一直没有一致的结论。通过远缘杂交及染色体工程的方法从普通小麦野生近缘种属转移优良基因的方法已被实践证明是一条卓有成效的途径。目前，国外从长穗偃麦草中成功转移了 Sr24 (3DL)，Sr26 (6AL)，Sr25 (7DL, 7AL)，Lrl9, Lr24 等基因。国内从小麦与长穗偃麦草杂种后代中育成了小偃4号、5号、6号、小偃107等小麦品种。通过杂交和渐渗的方式是将外源染色体的优良性状和优异基因导入小麦的一种有效的方法，但是，在重组的小麦中，源于小麦-长穗偃麦草杂交后代的外源E组染色质或染色体的检测成为至关重要的问题，虽然通过农学上的重要特性以及生化分析已将有价值的基因绘图在长穗偃麦草染色体上，但这些实验的检测手段是不稳定的，而且不适合进行重要的农学性状的检测。有一些遗传学手段，如染色体分带、原位杂交等技术，已经将其用于小麦遗传背景下外源遗传物质的检测，但这些技术费时、费力，对技术的要求也很高，而且用这些实验手段进行大规模的后代快速筛选依然存在一定的局限。所以，迫切要求开发一种可以在小麦遗传背景下快速、准确、大规模的鉴定长穗偃麦草外源染色质或染色体的分子标记技术。随着分子生物学的发展，DNA分子标记已经广泛应用于小麦遗传育种的研究，限制片段长度多态性(RFLP)是首次被使用的分子标记，在植物遗传研究中获得很大的应用价值，但是，RFLP技术需要大量纯化的DNA，而且实验本身费时，对技术要求也很高，它不适合进行育种系统的大规模的筛选，因此，育种学家已经开始进行普通PCR的研究，期望在小麦育种系统中找到一种更简单的方式鉴定外源染色质，许多基于PCR的DNA分子标记技术已经被开发,如 RAPD，AFLP，EST, SSR 等。在这些标记中，ISSR(Inter-Simple Sequence Repeat)技术相对简单，它是利用重复序列加选择性碱基为引物，对基因组DNA进行扩增的分子标记体系。目前，ISSR已经广泛应用于分子指纹图谱、遗传多样性分析、外源遗传物质鉴定及系统演化等研究。但它的重复性和稳定性却很差，如果将其转化为SCAR标记，其特
3异性和稳定性将大幅度提高，可以更方便快捷地应用于异源染色体或染色质的检测。
发明内容
本发明的一个目的是提供一种检测植物E组染色体的试剂盒。本发明提供的试剂盒，包括如下引物对所述引物对中的一条引物为序列表中的序列3所示的核苷酸，所述引物对中的另一条引物为序列表中的序列4所示的核苷酸。所述植物为含有长穗偃麦草E组染色质或染色体的小麦属植物，所述含有长穗偃麦草E组染色质或染色体的小麦属植物具体为“中国春”-长穗偃麦草3E 二体附加系和“中国春”-杀配子染色体2C 二体附加系杂交获得的F1代和/或所述F1代自交得到的F2代。本发明另一个目的是提供一种检测植物E组染色体的PCR试剂。本发明提供的PCR试剂，由如下引物对、dNTP、氯化镁、DNA聚合酶和PCR缓冲液组成所述引物对中的一条引物为序列表中的序列3所示的核苷酸，所述引物对中的另一条引物为序列表中的序列4所示的核苷酸。所述引物对中各引物在所述PCR试剂中的浓度均为0. 5 μ M ；所述dNTP在所述的PCR试剂中的浓度为0. 18mM,所述DNA聚合酶在所述的PCR试剂中的浓度为0. 06υ/μ 1 ；所述氯化镁在所述的PCR试剂中的浓度为0. ISmM ；所述植物为含有长穗偃麦草E组染色质或染色体的小麦属植物。所述含有长穗偃麦草E组染色质或染色体的小麦属植物为“中国春”-长穗偃麦草 3Ε 二体附加系和“中国春”-杀配子染色体2C 二体附加系杂交获得的F1代和/或所述F1 代自交得到的F2代。所述的PCR试剂或所述的试剂盒在检测长穗偃麦草E组染色体中的应用，也是本发明保护的范围。PCR缓冲液购自宝生物工程(大连)有限公司，产品目录号R10T1。本发明的第三个目的是提供一种辅助检测待测植物中是否含有E组染色体的方法。本发明提供的方法，包括如下步骤用所述试剂盒中的引物对或中所述的PCR试剂对待测植物进行PCR扩增，得到PCR扩增产物；检测所述PCR扩增产物，若所述PCR扩增产物中含有大小为577bp的片段，则所述待测植物中候选含有E组染色体，若所述PCR扩增产物中不含有大小为577bp的片段，则所述待测植物中候选不含有E组染色体。所述PCR扩增中，以待测植物的基因组DNA为模板；所述PCR扩增的退火温度为58°C。所述PCR扩增产物的核苷酸序列为序列表序列2自5’末端第77_653位核苷酸。所述检测PCR扩增产物的方法为琼脂糖凝胶电泳或测序。本发明的实验证明，本发明开发的SCAR分子标记能够快速、准确地鉴定小麦遗传背景下的外源长穗偃麦草E组染色质或染色体奠定基础。小麦外源E组染色质的检测是鉴定小麦-长穗偃麦草重组系、渐渗系的关键，大量杂交后代的筛选和鉴定工作非常繁杂，本发明获得的E基因组特异ISSR-SCAR分子标记，即SCAR577，将为小麦-长穗偃麦草重组系E组染色质的快速检测和准确鉴定以及分子标记辅助育种提供新的途径和方法。
图1为ISSR引物UBC841在普通小麦“中国春”、“中国春”_2C 二体附加系、二倍体长穗偃麦草、四倍体长穗偃麦草中的扩增结果图2为ISSR-SCAR577引物在CS-1E-7E 二体附加系，CS-2C 二体附加系，二倍体长穗偃麦草，四倍体长穗偃麦草中的扩增结果图3为SCAIi577弓丨物在F1, F2代中的扩增结果
具体实施例方式下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。供试材料为“中国春”-杀配子染色体2C 二体附加系(Endo TR. Allocation of aGc chromosome of Aegilops cylindrica to wheat homoeologous group 2. Genes GenetSyst, 1996，71 :243-246,公众可从哈尔滨师范大学获得。)、二倍体长穗偃麦草(KnottD R. The inheritance of rust resistance.VI. The transfer of stem rustresistance from Agropyron elongatum to common wheat. Canadian Journal of PlantScience, 1961,41 :108-123，公众可从哈尔滨师范大学获得。)、“中国春”-长穗偃麦草二体附力口系(1E-7E) (Dvorak J, Knott DR. Disemic and diteleosomicadditions of diploid Agropyron elongatum chromosomes to Triticum aestivum[J]. Can J Genet Cytol，1974，16 :399-417,公众可从哈尔滨师范大学获得。)；四倍体长穗偃麦草(Heneen W K, Runemark H. Cytology of Elym us (Agropyron)elongatacomplex. Hereditas,1972, 70(2) :155-164,公众可从哈尔滨师范大学获得。)；普通小麦“中国春”(Miller IE, Hutchinson J, Chapman V Investigation of apreferentially transmitted Aegilops sharonesis chromosome in wheat. Theor ApplGenet, 1982,61 :27-33. ^AnTZAfjB/Ki^W 范大学获得。)、“中国春”-长穗偃麦草3E 二体附加系(Dvorak J,Knott DR. Disomic and diteleosomic additions ofdiploid Agropyron elongatum chromosomes to Triticum aestivum[J]. Can J GenetCytol，1974，16 :399_417，公众可从哈尔滨师范大学获得。)与 “中国春”-杀配子染色体2C 二体附加系杂交获得的F1I2代来自于哈尔滨师范大学分子细胞遗传与遗传育种重点实验室。实施例1、长穗偃麦草E组染色体特异ISSR-SCAR标记UBC841的获得1、长穗偃麦草E组染色体特异ISSR-SCAR标记UBC841的筛选与克隆利用33条ISSR引物，对普通小麦“中国春”、“中国春” _杀配子染色体2C 二体附加系、二倍体长穗偃麦草、四倍体长穗偃麦草等材料进行扩增筛选，分离和克隆E基因组特异扩增片段。PCR扩增体系Template DNA50ngIOx buffer2. 5 μ 11. 5mM MgCl22. 5 μ 1
5
dNTP Mix (2. 5mM)1· 5 μ 1ISSR Primer (10 μ Μ)1 μ 1r Taq polymerase(5U/μ 1) 0.25 μ 1_Distilled sterile water up to 20 μ 1PCR反应程序94°C预变性4分钟，42个循环包括94°C变性1分钟，52°C退火1分钟，72 °C延伸2分钟，42个循环后72°C延伸7分钟。4°C保存。ISSR扩增产物均在含有lmg/ml EB的1. 2%琼脂糖上电泳检测，在紫外成像系统 (Gel Doc-2000, Bio-Rad, USA)下观察并照相记录结果。PCR扩增结果如图1所示，其中1.为普通小麦“中国春”CS ;2.为“中国春”-杀配子染色体2C 二体附加系(CS-2C) ；3.为二倍体长穗偃麦草；4.为四倍体长穗偃麦草;M.为 DL2000marker，从图中看出，引物 UBC8415’-GAGAGAGAGAGAGAGAGC-3’(序列 1)在二倍体长穗偃麦草、四倍体长穗偃麦草中能扩增出一条700bp左右的片段，此产物在普通小麦“中国春”中没有出现，在中国春”-杀配子染色体2C 二体附加系(CS-2C)中没有出现目的片段； 表明这个片段是长穗偃麦草E基因组所特有的。回收从二倍体长穗偃麦草中得到的特异片段，送去测序。经测序结果可知，该PCR 产物具有序列表中序列2的核苷酸序列，序列表的序列2由701个核苷酸组成，将PCR产物命名为 UBC8417tll。在GeneBank中将其进行Blast同源性搜索，结果显示它与小麦染色体3B-特异 BAC序列(genbank号FN564430. 1)具有一定程度的同源性，同源性达83%。也可人工合成序列2。2、长穗偃麦草E组染色体特异ISSR-SCAR标记的建立与定位根据序列表中序列2的序列，利用Primer Premier 5. 0软件，设计了 1对SCAR引物。SCAR577 上游引物5，-CGGAGAGGCACCAATAAGGAT-3，(序列 3)SCAR577 下游引物5，-CCGACCCCAGATACGCTC-3，(序列 4)PCR扩增体系Template DNA30ngIOx PCR buffer2. 5 μ 11. 5mM MgCl2 (终浓度为 0. 18mM)2. 5 μ 1dNTP Mix (2. 5mM,终浓度为 0. 18mM)1· 5 μ 1SCAR577 上游引物(10 μ Μ,终浓度为 0. 5 μ Μ)1 μ 1SCAR577 下游引物(10 μ Μ,终浓度为 0· 5 μ Μ)1 μ 1
r Taq polymerase (5U/ μ 1，终浓度为 0. 06U/ μ 1)0. 25 μ 1_Distilled sterile waterup to 20 μ 1IOx PCR buffer购自宝生物工程(大连)有限公司，产品目录号RlOTl。PCR反应程序94°C预变性5分钟，35个循环包括94°C变性30秒，58°C退火30秒， 72°C延伸1分钟，35循环后72°C延伸10分钟。4°C保存。
分别以二倍体长穗偃麦草、四倍体长穗偃麦草、普通小麦“中国春”和“中国春”-杀配子染色体2C 二体附加系的基因组DNA为模板，进行PCR扩增。结果如图2所示，其中，1-7分别为“中国春”-长穗偃麦草二体附加系(1E-7E) 1.为CS-IE 二体附加系；2.为CS-2E 二体附加系；3.为CS-3E 二体附加系；4.为CS-4E 二体附加系；5.为CS-5E 二体附加系；6.为CS-6E 二体附加系；7.为CS-7E 二体附加系；8.为普通小麦“中国春”(⑶)；9.为二倍体长穗偃麦草；10.为四倍体长穗偃麦草；11.为“中国春”-杀配子染色体2C 二体附加系(CS-2C) ；M.为DL2000marker。从图中看出，在“中国春”-长穗偃麦草二体附加系(1E-7E)、二倍体长穗偃麦草、四倍体长穗偃麦草中都能扩增出 577bp的片段，而在“中国春”、“中国春”-杀配子染色体2C 二体附加系中没有此片段。测序577bp的片段，结果为该片段具有序列表序列2自5’末端第77-653位核苷酸，表明该片段为长穗偃麦草E基因组所特有。同时还利用一套“中国春”-长穗偃麦草二体附加系(1E-7E)将该对SCAR引物进行初步定位分析，结果显示，SCAR577标记分布于长穗偃麦草E基因组所有染色体上。实施例2、长穗偃麦草E组染色体特异ISSR-SCAR标记的应用用SCAIi577上游引物和SCAIi577下游引物对“中国春”-长穗偃麦草3E 二体附加系与 “中国春”-杀配子染色体2C 二体附加系杂交后代F1和自交F2代进行了鉴定。以普通小麦 “中国春”、“中国春”-杀配子染色体2C 二体附加系、二倍体长穗偃麦草、四倍体长穗偃麦草为对照。结果如图3所示，其中1-9.为“中国春”-长穗偃麦草二体附加系和“中国春”-杀配子染色体2C 二体附加系杂交获得的F1代；10-19.为&代自交获得的&代；20.为普通小麦“中国春”;21.为“中国春”-杀配子染色体2C 二体附加系；22.为二倍体长穗偃麦草； 23.为四倍体长穗偃麦草；M.为DL2000marker ；从图中看出，SCAR577标记在F1代均表现为阳性结果(得到577bp的片段)，为了在后代中进行易位系的初步筛选和鉴定，选取了 152株 2n = 42的F2代进行上述PCR鉴定，结果为阴性、阳性结果同时存在，有8株后代在SCAR577 标记中出现了阳性结果(得到577bp的片段)，所以可以初步判断这些植株为易位系，易位的几率约为5. %。(杀配子染色体2C是一种可以诱导染色体产生畸变的特殊染色体，它可以使不含有它的配子产生致死或半致死的效应，半致死的效应就包括如染色体的易位、 缺失等染色体畸变，达到要创制易位系或缺失系的目的，这是一种诱导染色体产生畸变的一种方式，但2C产生的这些畸变行为完全是随机的。目前有实验证明证明了此种诱导染色体产生畸变的频率一般在5% 10%左右，因此本发明的易位的几率在理论值范围内。)利用SCAR577分子标记能够快速、准确地鉴定小麦遗传背景下的外源长穗偃麦草E 组染色质或染色体，这样可以大大提高育种速度，缩短育种周期，实现了利用分子标记辅助选择育种的目的。
权利要求
1.一种检测植物E组染色体的试剂盒，包括如下引物对所述引物对中的一条引物为序列表中的序列3所示的核苷酸，所述引物对中的另一条引物为序列表中的序列4所示的核苷酸。
2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于所述植物为含有长穗偃麦草E组染色质或染色体的小麦属植物，所述含有长穗偃麦草 E组染色质或染色体的小麦属植物具体为“中国春”-长穗偃麦草3E 二体附加系和“中国春”-杀配子染色体2C 二体附加系杂交获得的F1代和/或所述F1代自交得到的F2代。
3.一种检测植物E组染色体的PCR试剂，由如下引物对、dNTP、氯化镁、DNA聚合酶和 PCR缓冲液组成所述引物对中的一条引物为序列表中的序列3所示的核苷酸，所述引物对中的另一条引物为序列表中的序列4所示的核苷酸。
4.根据权利要求3所述的PCR试剂，其特征在于所述引物对中各引物在所述PCR试剂中的浓度均为0. 5μΜ ；所述dNTP在所述的PCR试剂中的浓度为0. 18mM,所述DNA聚合酶在所述的PCR试剂中的浓度为0. 06U/y 1 ；所述氯化镁在所述的PCR试剂中的浓度为0. ISmM ；所述植物为含有长穗偃麦草E组染色质或染色体的小麦属植物。
5.根据权利要求3或4所述的PCR试剂，其特征在于所述含有长穗偃麦草E组染色质或染色体的小麦属植物为“中国春”-长穗偃麦草3Ε 二体附加系和“中国春”-杀配子染色体2C 二体附加系杂交获得的F1代和/或所述F1代自交得到的F2代。
6.权利要求1或2所述试剂盒或权利要求3-5中任一所述的PCR试剂在检测长穗偃麦草E组染色体中的应用。
7.一种辅助检测待测植物中是否含有E组染色体的方法，包括如下步骤用权利要求1 或2所述试剂盒中的引物对或权利要求3或4中所述的PCR试剂对待测植物进行PCR扩增， 得到PCR扩增产物；检测所述PCR扩增产物，若所述PCR扩增产物中含有大小为577bp的片段，则所述待测植物中候选含有E组染色体，若所述PCR扩增产物中不含有大小为577bp的片段，则所述待测植物中候选不含有E组染色体。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于所述PCR扩增中，以待测植物的基因组DNA为模板；所述PCR扩增的退火温度为58°C。
9.根据权利要求7或8所述的方法，其特征在于所述PCR扩增产物的核苷酸序列为序列表序列2自5’末端第77-653位核苷酸。
10.根据权利要求7-9中任一所述的方法，其特征在于所述检测PCR扩增产物的方法为琼脂糖凝胶电泳或测序。
全文摘要
本发明公开了一种长穗偃麦草E组染色体特异ISSR-SCAR标记。本发明提供了一种检测长穗偃麦草E组染色体的试剂盒，包括如下引物对所述引物对中的一条引物为序列表中的序列3所示的核苷酸，所述引物对中的另一条引物为序列表中的序列4所示的核苷酸。二倍体长穗偃麦草E组染色体是组成偃麦草属多倍体物种的基本染色体组，携带有对小麦遗传育种有益的基因，小麦中外源E染色质的检测是鉴定小麦-长穗偃麦草重组系、渐渗系的关键，大量杂交后代的筛选和鉴定工作非常繁杂，本发明的实验证明，本发明开发的ISSR-SCAR分子标记能够为快速、准确地鉴定小麦遗传背景下的外源长穗偃麦草E组染色质或染色体奠定基础。
文档编号C12Q1/68GK102154459SQ20111000267
公开日2011年8月17日 申请日期2011年1月7日 优先权日2011年1月7日
发明者司亮, 徐国辉, 束永俊, 王晓萍, 郭长虹 申请人:哈尔滨师范大学