专利名称：一种简便快速鉴别甘蓝型油菜小孢子再生的单倍体的方法
技术领域：
本发明属于植物细胞学应用技术领域，具体涉及一种早期、简便、快速大批量鉴别甘蓝型油菜小孢子再生的单倍体植株的方法。
背景技术：
自从上世纪八十年代末甘蓝型油菜小孢子离体培养和植株再生技术成功建立以来，甘蓝型油菜小孢子再生的双单倍体(DH)被广泛地应用于快速培育油菜新品种、构建遗传研究群体和进行遗传转化以及离体诱变等领域。实践证明，甘蓝型油菜DH技术体系是油菜遗传育种和分子生物学等研究领域的重要工具。但是，通过小孢子离体培养和双单倍体诱导后，不同的基因型或不同批次的培养材料再生的植株群体中，双单倍体株率在30%到 90%以上。即小孢子通过人工染色体加倍后，不是所有基因型的再生植株都是双单倍体，而是还有约10 70%的植株是不能结种子的单倍体(Hansen et al, In vitro chromosome doubling potential of colchicine,oryzalin,trifluralin and APM in Brassica napus microspore culture. Euphytica, 1996,88 :159-164)。通过目测，这些无用的单倍体在开花前不能与双单倍体区分，尤其是在试管苗阶段。研究人员只能将小孢子再生的各种倍性植株同时栽到温室或者田间，到现蕾或初花期阶段，将单倍体植株砍掉不要。或者用秋水仙碱涂抹单倍体植株的顶芽和腋芽进行染色体加倍。或者把该植株从土中挖出来，洗净根部的泥土，用秋水仙碱溶液浸泡根后，再栽到土中，使之染色体加倍。此时识别和处理单倍体植株必然提高了人工、试剂等费用，而且染色体加倍太晚，推迟了成熟期。另外，在我国长江流域，甘蓝型油菜小孢子离体培养后于每年6月份形成完整植株。而此时已不是油菜种植季节，小孢子再生的植株不能移栽到田间。而且国内一般均没有控温控湿的自动化温室，这些植株只能于试管继代培养到10月中旬以后才能移栽到田间。对大量未能识别的单倍体植株进行多次继代，需要大量试剂和人力，移栽到田间需要一定量的土地和肥料等费用(见表2)。在蕾期或初花期，把单倍体植株从土中挖出，经秋水仙碱处理后，再栽到田间。一般重栽的植株在10天后才能恢复生长，延迟成熟期约2周。这不但使DH技术的应用成本提高，而且效率降低。因此，急需一种于甘蓝型油菜小孢子植株发育早期能简便、快速准确鉴别单倍体的方法。在油菜小孢子植株发育的早期，其倍性鉴别可采用染色体计数和流式细胞仪测定核DNA含量的方法。但是要制出全套染色体分散好、不丢失、清晰能记数目的片子，需要具有娴熟的染色体制片技巧，而且制片很花费时间，不可能快速用于大量植株的倍性鉴别。流式细胞仪能准确地测定植株的倍性，但操作程序繁琐，需要花费时间制备核DNA悬浮液和进行核DNA染色。而且，该染色剂很贵，且仪器昂贵，需要专门人员操作分析，费用很高，也不可能用于大批量植株的倍性检测。据前人的研究，植物叶片表皮气孔的长度和气孔保卫细胞的叶绿体数与染色体倍性呈正相关。一般二倍体On)植株的叶片气孔比单倍体(η)叶片气孔大，叶绿体数比单倍体大约多一倍。根据两者的显著差异可以迅速地判别植株的倍性。刘威洪等(刘威洪等，用气孔保卫细胞周长鉴定甘蓝型油菜植株倍性水平.上海农业学报，2002，18(3) :35-38.)测量了甘蓝型油菜品种Qn)和单倍体(η)植株叶片的气孔保卫细胞纵横直径长度，采用公式L=1.57x[1.5x(A+B)-VZ^计算了保卫细胞的周长。他们提出保卫细胞的周长值可以作为鉴定甘蓝型油菜染色体倍性水平的一个指标。但是周长的测量和计算方法很繁琐，用于大量植株的倍性鉴定必定很花时间，不可能用于大量植株的检测。而且Ho等(Ho.et al,The Use of Stomatal Chloroplast Number for Rapid Determination of Ploidy Level in Maize. Plant Breeding, 1990,105 :203-210)也报道，不同倍性植株之间的叶片气孔长度差异比它们之间的叶绿体数差异小，判定倍性的准确率比叶绿体计数方法低° Ewald 等(Ewald. et al, Induction of tetraploid poplar and black locust plants using colchicine :chloroplast number as an early marker for selecting polyploids in vitro. Plant Cell Tiss Organ Cult. 2009，99 :353-357.)统计了离体培养的杨树和洋槐叶片表皮气孔保卫细胞的叶绿体数。在已测的所有植株中，四倍体Gn)的叶绿体数几乎是二倍体On)的2倍。他们提出，保卫细胞的叶绿体数可作为离体诱导的杨树、洋槐多倍体的早期选择标记。从以上所述可知，在某些植物，使用叶片气孔保卫细胞的叶绿体数已可以快速区分其植株的倍性。但是至今未见使用叶片气孔保卫细胞的叶绿体数鉴别甘蓝型油菜小孢子再生的单倍体(n，HP)试管苗的报道。为能在小孢子植株的幼苗阶段快速、准确地识别单倍体，我们采用甘蓝型油菜小孢子试管无菌苗，研究了不同倍性植株的叶片气孔保卫细胞的叶绿体数与染色体倍数的相关性和不同倍性植株之间保卫细胞叶绿体数的差异显著性，找到了叶绿体数与单倍体相关的实用参数，建立了使用气孔保卫细胞叶绿体数快速鉴别大批量甘蓝型油菜小孢子单倍体试管苗的技术，使小孢子再生的单倍体植株能于成苗初期被识别和剔除，或者尽可能早地进行染色体加倍，使其尽早形成双单倍体，解决了盲目地长时间于培养基继代和在田间栽种单倍体植株的问题，节约了试剂、人工和土地等费用，提高了甘蓝型油菜双单倍体(DH)技术体系在油菜遗传育种等领域的应用效率。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的缺陷，根据叶片气孔保卫细胞中的叶绿体数与植株倍性的相关性，运用气孔保卫细胞中叶绿体计数技术建立简便、快速、大批量地鉴别甘蓝型油菜小孢子再生植株倍性的有效方法。实现本发明的技术方案和步骤如下1、切取无菌的小孢子再生植株叶片从甘蓝型油菜品种植株的花蕾分离小孢子， 采用石淑稳的方法诱导胚状体(参照石淑稳等报道的方法，石淑稳，甘蓝型油菜及其种间和属间杂种小孢子胚状体的诱导，华中农业大学学报，1993，12 =544-550)。产生的胚状体接禾中在含有 B5 培养基(Gamborg et al, Nutrient requirements of suspension cultures of soybean root cells. Experimental Cell Research，1968，50 :151-158)的三角瓶中培育成植株。在超净工作台上，将灭菌的医用剪刀伸进瓶中，剪下小植株基部往上数的第5片平展叶，并放入小塑料袋中，写上与该三角瓶相同的株号，随后，将三角瓶用原纸帽封住，置于培养室。2、叶片下表皮组织制片在细胞学实验室，用刀片切取步骤(1)所述的叶片中间组织，置于载玻片上，然后用镊子将其上表皮和叶肉细胞轻轻夹碎去掉，仅留下表皮组织。加一滴碘-碘化钾染色液在下表皮组织，盖上盖玻片，染色约2分钟。3、气孔保卫细胞中的叶绿体计数把步骤( 所述的制片放在光学显微镜的载物台上，用16倍目镜和40倍物镜头观察气孔保卫细胞中的叶绿体，每株观察一片叶，每片叶统计10个气孔的叶绿体数(即，每张制片记录10个气孔)。4 用叶绿体参数判定试管苗植株倍性根据步骤3所得叶绿体参数鉴定试管苗植株群体中的单倍体、双单倍体和四倍体。即在显微镜下记录每个气孔的叶绿体数，每张制片 (即每片叶)有7个以上(包括7个，下同)气孔具有6-8个叶绿体，判定为单倍体(HP)， 具有10-13个叶绿体的判定为双单倍体(DH)，具有15-M个叶绿体的判定为四倍体(TP)。 详见表3和图1-3。本发明染色液的组分及其配制方法如下将碘0. 5g倒入小烧杯中，加40ml蒸馏水，进行溶解；溶解后，再加入碘化钾1. Og, 用蒸馏水定容到50ml，倒入棕色试剂瓶中保存，备用。本发明的实施效果1、提高了 DH技术的应用效率和降低了应用成本当小孢子再生的胚状体于试管刚发育成完整植株时，使用本发明建立的叶片气孔保卫细胞中的叶绿体计数法准确地把不能结籽的单倍体鉴别出来，尽早丢弃，不再使用大量药品于试管进行多次继代培养，每一万株苗节约费用16513元。也不再盲目地移栽到田间，浪费土地，花费人力进行管理，节约成本 2570元(表幻。如果需要把鉴定出的单倍体人工加倍成双单倍体，此时可以在试管中用秋水仙碱或在移栽前进行染色体加倍，以免在移栽后加倍延迟开花结果，影响DH植株的使用。2、能快速地鉴别大批量的植株倍性采用本发明建立的叶绿体计数方法，用约5分钟时间可以完成一株试管苗的倍性鉴定，可以快速鉴定大批量的植株倍性。用流式细胞仪 (Flow Cytometry)分析法鉴定倍性，其操作流程复杂，必须用柠檬酸和土温20等试剂处理叶片组织，用染色剂DAPI染色DNA，并通过过滤制备核DNA悬浮液，才能用于倍性分析，花费时间较长。而且分析费用非常高，一般分析一株需要50元人民币，一万株就要五十万元 (表1)，不可能用于大量植株倍性的鉴定。3、程序简便、易操作、费用低本发明建立的叶绿体计数测定植株倍性的技术，流程简便，易于操作，没有系统学过细胞学的工人也能胜任本工作，而且染色剂相当便宜，鉴定一万株苗的费用为8227元。而采用染色体计数法，则需要相当熟练的制片技术，没有一定细胞学知识的一般工作人员难以完成该试验。其需要经费19888元(表1)。
图1.单倍体叶片气孔保卫细胞的叶绿体及数量。
图2.双单倍体叶片气孔保卫细胞的叶绿体及数量。
图3.四倍体叶片气孔保卫细胞的叶绿体及数量。
图4.用流式细胞仪检测的四倍体的DNA含量峰值。
图5.单倍体结角特征。
图6.双单倍体结角特征。
图7.四倍体结角特征。
具体实施例方式实施例11、切取甘蓝型油菜小孢子离体再生的无菌苗叶片采用石淑稳等报道的方法(石淑稳等，甘蓝型油菜及其种间和属间杂种小孢子胚状体的诱导，华中农业大学学报，1993，12 =544-550)将甘蓝型油菜品种华双4号、华双2 号、华油8号、华双1号和华黄一号(上述品种来自华中农业大学油菜研究室培育的品种， 已在中国广泛推广和应用)的小孢子离体培养获得胚状体，将所述的再生的胚状体分别接种在pH为6. 0的B5培养基上(B5培养基来源Gamborg等，Nutrient requirements of suspension cultures of soybean root cells.Experimental Cell Research,1968,50 151-158)的150ml三角瓶中，培养至有根和茎叶的完整小植株(培养温度为M-26°C，光照每天12h，光强为ISOOlux)。在含有小植株的瓶子上分别编写其株号，然后在超净工作台上上，用灭菌的医用剪刀剪下培养瓶内小植株的第5片(从其基部向上数)平展叶片，将剪切的叶片置于小塑料袋中，写上与该三角瓶相同的株号。随后，将三角瓶用原纸帽封住，放回到培养室。2、叶片下表皮组织制片和气孔保卫细胞的叶绿体计数在细胞学实验室，取出上述步骤1的塑料袋中华双4号、华双2号、华油8号、华双 1号和华黄一号等5个品种的叶片(来自82株试管苗)，用薄刀片切下叶片中间的一块组织，放在载玻片上。然后用镊子轻轻夹碎其上表皮和叶肉细胞，仅留下表皮组织。用滴管滴一滴配制好的染色液在该下表皮组织上，盖上盖玻片。染色约2分钟后将载玻片放在光学显微镜(购自Olympus公司)的载物台上，用16倍目镜和40倍的物镜头观察叶绿体。每张制片(来自同一片叶)随机统计10个气孔(每个气孔有一对保卫细胞)的叶绿体数，重复操作前述步骤一次，每片叶片共观察统计20个气孔的保卫细胞的叶绿体数，采用最小显著差数法(LSD法)进行各倍性之间的差异显著性分析。染色液配制方法用干分之一的天平称取碘0. 5g，倒入小烧杯中，加入大约40ml蒸馏水进行溶解。 溶解后，再加入碘化钾l.og，然后转入量筒中，并加蒸馏水定容到50ml，在棕色试剂瓶避光下保存，备用。3、小孢子再生的试管苗植株的倍性判定将步骤2记录过的华双4号、华双2号、华油8号、华双1号和华黄1号的叶绿体数的共82株试管苗移栽到田间。在开花初期观察这些植株花器特征和结角结籽状况。在上述5个群体中，单倍体(HP)每一叶片有70%以上(包括70%，下同)的气孔(两次重复， 下同)分别具有6-8个叶绿体。双单倍体植株(DH)有70%以上的气孔均具有10-13个叶绿体，凡是长有特大蕾和大花瓣，花粉多，但结角少，且多是萝卜角，结少量大籽的植株，其 70%以上气孔分别具有15-M个叶绿体(见表幻。用流式细胞仪(FCM)分析这些大蕾大花瓣植株叶片的核DNA含量，证明是四倍体(TP)(见图4)。经过LSD测验证明，单倍体、双单倍体和四倍体之间的平均叶绿体数差异极显著(见表3)。以上采用花器特征和结角结籽特性以及流式细胞仪验证的结果证明，所观察的一片叶(来自一单株)下表皮的10个气孔(一次重复)中有7个以上(包括7个，下同)分别具有6-8个叶绿体，判定为单倍体，具有10-13个叶绿体的判定为双单倍体，具有15-M 个叶绿体的判定为四倍体(图1- 。该叶绿体数值可以直接用于判定甘蓝型油菜小孢子再生的试管苗植株的倍性，不必再用其它方法进行验证。实施例2 (应用实施例利用实施例1的方法识别和丢弃不结籽的小孢子单倍体植株)将油菜品种中油821(来自中国农业科学院油料作物研究所，中国大面积推广品种)、华双3号和华双5号(来自华中农业大学油菜研究室培育的品种，已在中国广泛推广和应用)的小孢子再生为胚状体(方法参照石淑稳等，甘蓝型油菜及其种间和属间杂种小孢子胚状体的诱导，华中农业大学学报，1993，12 :544-550)。将获得的胚状体接种于含B5 培养基(PH6.0)的三角瓶中，培育成小植株(培养温度为M_26°C，光照每天12h，光强为 ISOOlux)。按实施例1的方法切下第5片叶，进行下表皮组织制片。在光学显微镜(购自 Olympus公司)的目镜16倍和物镜40倍下观察和计数这些植株的气孔保卫细胞的叶绿体数。每张制片(来自一单株的一片叶)统计10个气孔的叶绿体数。在每张制片中凡是有7 个以上(包括7个，下同)均具有6-8个叶绿体，其植株判定为单倍体，均从三角瓶中丢掉， 不再继代培养保存。凡具有10-13个或更多的叶绿体的，其植株判定为双单倍体或四倍体， 均保留，进行继代培养(继代培养基为B5，pH6. 0)，作为下一步的遗传育种研究的材料。本发明的实施效果见表1-3.表1三种方法鉴定甘蓝型油菜小孢子植株倍性的费用的成本核算(人民币元/
万株)
权利要求
1. 一种早期快速鉴定甘蓝型油菜小孢子试管苗单倍体的方法，其特征在于，它包含下列步骤1)在无菌条件下取离体培养获得的甘蓝型油菜小孢子试管苗基部往上的第5片平展叶，用刀片切取叶片中间组织，置于载玻片上，然后用镊子将其上表皮和叶肉细胞轻轻夹碎去掉，仅留下表皮组织，向所述的下表皮组织加一滴染色液，盖上盖玻片，染色2min，每片叶制成一张玻片，得到鉴定用的玻片；2)将步骤1)的鉴定用的玻片置于光学显微镜的载物台上，用16倍目镜和40倍物镜头观察气孔保卫细胞中的叶绿体，每张鉴定用的玻片记录10个气孔的叶绿体数，即每株观察一片叶，每片叶统计10个气孔的叶绿体数；3)根据步骤2所得叶绿体参数鉴定试管苗植株群体中的单倍体，双单倍体和四倍体； 染色液的配制方法如下所示将0. 5g的碘倒入小烧杯中，加40ml蒸馏水进行溶解，溶解后再加入碘化钾1. Og ；用蒸馏水定容至50ml。
全文摘要
本发明属于植物细胞学技术领域，具体涉及一种使用叶绿体计数法，在早期简便快速、大批量鉴别甘蓝型油菜小孢子再生的单倍体的方法。特征是，将离体小孢子培养成的胚状体接种在B5培养基。在胚状体刚发育成完整植株时，无菌切取第5片平展叶。用碘-碘化钾染色该叶片中间部位的下表皮组织。用光学显微镜观察气孔保卫细胞的叶绿体。每张制片(即一片叶)记录10个气孔的叶绿体数。之中，有7个以上气孔均具有6-8个叶绿体，其植株为单倍体。本方法解决了单倍体长时间继代培养问题，一万株可节约试剂、土地和人工费用19083元。本发明程序简便，易操作，仅用5分钟时间鉴别一株苗，费用低，可用于鉴别大量的植株倍性，提高了双单倍体(DH)技术的应用效率。
文档编号C12Q1/68GK102304561SQ201110003029
公开日2012年1月4日 申请日期2011年1月6日 优先权日2011年1月6日
发明者吴江生, 孙秀丽, 汪频, 王晨, 石淑稳, 陈琳 申请人:华中农业大学