一株在高盐环境中除去黄曲霉毒素B₁的嗜盐四联球菌的使用的制作方法

专利名称：一株在高盐环境中除去黄曲霉毒素B₁的嗜盐四联球菌的使用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一株在高盐环境中除去AFB1的嗜盐四联球菌，已经于2010年4月 29日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)保藏，保藏编号为CGMCC No. 3792，属于微生物领域。
背景技术：
黄曲霉毒素是由黄曲霉(Aspergillus flavus)和寄生曲霉(Aspergillus parasiticus)等产生的次级代谢产物，黄曲霉毒素尤其是黄曲霉毒素B1 (AFB1)具有较强的致癌作用，因此，各国在农产品、各种食品等原料与产品中的含量均有严格的限制。自1960年发现黄曲霉毒素以来，世界各国科学家们均试图寻求预防和除去黄曲霉毒素的有效途径。目前除去黄曲霉毒素的方法主要有五类①碱处理方法。Mukendi报道了使用亚硫酸钠、硫酸氢钠、氢氧化钠、氨等化学试剂对黄曲霉毒素去毒的研究，并分析了影响这些化合物去毒效果的各种因素。该类方法适合应用于含水量较高的青绿、青贮饲料以及液态粮油，去毒效率高但不适合籽实、饼粕等固体饲料原料，而且处理后原料残留有大量氨。由于该方法的设备投资大，成本高，已逐渐被淘汰。②氧化处理法。常用的氧化剂有次氯酸钠、臭氧、过氧化氢、氯气等。该方法具有较好的去毒效果，但是该方法的缺点在于处理效果不稳定，饲料中维生素等营养成分损失严重，处理成本较高。③吸附剂吸附毒素。常用的吸附剂包括酵母细胞壁、硅铝酸盐、活性炭等。但吸附剂不能解除黄曲霉毒素的毒性， 它还可能同时吸附食品中的营养成分而降低营养物质的利用率，而且被吸附的毒素有可能在动物胃肠道中重新释放。④抗氧化剂处理。这类抗氧化剂包括2-叔丁基对甲酚(BHA)、 2，6-二叔丁基对甲酚(BHT)、异硫氰酸苄酯、2，2，4-三甲基-6-乙氧喹啉等。其机理是抗氧化剂能促进大鼠体内α-谷胱甘肽转移酶-YC2亚基的表达，有效地抑制了 AFB1与机体 DNA的结合。但是抗氧化剂的去毒作用有限，不能完全消除黄曲霉毒素中毒症，而且BHT等抗氧化剂浓度均超过常规使用量的30倍以上才显示较好的去毒效果，这样对动物具有一定毒害作用。⑤高温处理法。破坏AFB1需要以上的温度，该方法能耗高且对食品中的营养成分破坏大，实际应用很少。朱新贵等在几种食品微生物除去黄曲霉毒素作用的研究(食品科学.2001,22 65 68)文中报道了乳酸菌、醋酸菌、面包酵母、酿酒酵母、米曲霉、枯草杆菌等对AFB1具有除去作用。在30°C，添加AFB1使其初始含量是10 μ g/ml，接种乳酸菌、醋酸菌和枯草芽孢杆菌的菌悬液，培养4 后，除去AFB1的作用明显。乳酸菌和枯草杆菌的除去作用分别达到 82 %和86 %，培养60h后，其除去率分别达到88 %和89 %。但面包酵母和酿酒酵母的除去作用则不明显。本发明的目的就是采用一株能在高盐环境中生长繁殖，且具有除去AFB1能力的嗜盐四联球菌达到去除酱油、豆酱和豆瓣酱等生产过程中污染的AFB1的目的。本发明使用的嗜盐四联球菌(/feira^^ococctts A^oMiAz1S,保藏编号CGMCC No. 3792)，属于益生菌类，安全可靠，含盐浓度在6% -20%范围生长繁殖良好，能有效除去被污染的酱油、豆酱等发酵醪中的AFB11
发明内容
为了减少AFB1对人和动物的危害，减少真菌毒素对食品的污染，保证食品安全，本文通过对该菌株生物修复AFB1,应用于生产实际中，AFB1的去除率达到41. 76%。本发明嗜盐四联球菌的形态学特征为在固体培养基上菌落表面光滑，湿润，边缘整齐，中央隆起，直径约为1mm，乳白色。液体培养无菌膜，菌液浑浊且有少量沉淀，革兰氏染色阴性，细胞呈球形，二个平面分裂形成四联状。本发明所要解决的技术问题是提供一株除去AFB1效果较好的嗜盐四联球菌及其在AFB1污染样品上的应用。本发明要求嗜盐四联球菌(7 halophilus)的菌龄处于为对数初期，菌体浓度在使用对象中的初始浓度为5. OX IO6 1. 5X IO7 cfu/g(ml)，以湿基计。本发明去除AFB1的具体方法为待处理的酱油醪、豆酱醅或豆瓣酱醅中接种菌龄是对数初期的嗜盐四联球菌(7 A^oMiAz1S)悬液，初始菌体浓度为5. OX IO6 1. 5X IO7 cfu/g(ml)，以湿基计，混勻后置于25°C 35°C，发酵10 30天。本发明具有如下优点
本发明方法能够在高盐环境中有效除去AFB1，去除率达到41. 76% ；本发明使用嗜盐四联球菌系源于酱油醪，是东方传统酿造调味品常用的微生物菌种，并经Ames实验等方法验证是安全的；本发明方法是采用适合高盐发酵调味品生产的耐盐微生物菌株，去除生产过程中AFB1的污染，为其安全生产提供了一种可行、合理的方法。
具体实施例方式下面结合具体实施范例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。实施例1在高盐液态物料体系中除去AFB1
在含NaCl 6% 8%的MRS液体培养基中添加AFB1，使其浓度到达10ng/ml，接入处于对数初期的嗜盐四联球菌(7 halophilus)悬液，初始菌体浓度5. O XlO6CfuAil，未接种的样品作对照，置于30 士 2°C的培养箱中培养72hr，取样分析，本发明嗜盐四联球菌除去了样品中 58. 05% 的 AFB115实施例2在高盐半固态物料体系中除去AFB1
以产黄曲霉毒素的菌株4408 (中国科学院普通微生物研究所订购)为出发菌株， 以蚕豆瓣为原料生产瓣曲，采用豆瓣酱生产工艺加入盐水使其盐分为13.5%，水分含量为 55. 0%。 将预先繁殖进入对数初期的嗜盐四联球菌(7 halophihus)悬液接入瓣醅，初始菌体浓度为5. O X 106cfu/g (ml)，置于30 士 2°C培养箱中保温培养30d，瓣醅中黄曲霉毒素B1 的除去率达35. 70%。实施例3采用本方法除去被污染样品中的AFB1
以一定量的已污染了 AFB1的豆瓣酱为研究对象。将预先繁殖至对数初期的嗜盐四联球菌(7 halophihus)悬液接入污染的豆瓣酱，初始菌体浓度为5. OX 106cfU/g(ml)，模拟工厂生产环境，25°C 35°C下培养30d，AFB1的除去率达到41. 76%。
权利要求
1. 一株耐盐性嗜盐四联球菌σ. A^oMiAzl5)应用于传统酿造调味品中黄曲霉毒素 B1 (AFB1)的去除，其内容包括首先将活化的本发明菌株培养至菌龄为对数初期，然后分别接种于高盐液态物料体系与半固体物料体系中，达到去除的AFB1目的，初始菌体浓度为 5. O X IO6 1.5Χ107 cfu/g (ml)，最后将本发明菌株应用于实际生产中，论证该菌株实际应用的可行性。
2.根据权利1要求本发明的液体培养基配方为嗜盐四联球菌液体培养基(MRS培养基)胰蛋白胨10. O g，牛肉膏10. O g，酵母提取物5. O g，葡萄糖20. O g，乙酸钠5.0 g，柠檬酸二铵 2. 0 g,吐温 80 1. 0 ml, K2HPO4 2. 0 g, MgSO4 · 7H20 0. 58 g, MnSO4 · H2O 0. 25 g, NaC160 80g,蒸馏水 1. 0 L, ρΗ6· 2 6. 4。
3.根据权利要求1所述方法获得的嗜盐四联球菌(7A^oMiA^)，保藏编号为 CGMCC No. 3792。
4.根据权利要求1的嗜盐四联球菌(7halophilus)的应用，本发明可适用于各类传统酿造产品中，如豆瓣、腐乳、豆豉等。
5.根据权利1要求，本发明所述的除去AFB1的方法，其特征在于用于除去AFB1的本发明菌株的菌龄为对数初期，接种到被AFB1污染的酱油醪、豆酱醅或豆瓣酱醅中的嗜盐四联球菌(7 A^oMiAz1S)，其初始菌体浓度分别为5. OX IO6 1.5Χ107 cfu/g (ml)，以湿基计，发酵培养温度为25°C 35°C，培养时间为IOd 30d。
全文摘要
本发明涉及一株嗜盐四联球菌(Tetragenococcushalophilus)，能够在高盐环境中有效除去黄曲霉毒素B1(AFB1)。首先将活化的本发明菌株于MRS液体培养基中培养至菌龄为对数初期，然后分别应用于已添加AFB1毒素纯品的高盐液态物料体系和已污染AFB1的高盐半固体物料体系中，达到去除AFB1的目的；最后将本发明菌株应用到已污染AFB1的某豆瓣酱中，模拟工厂生产环境，本发明菌株对AFB1的除去率达到41.76%。该发明可应用于传统酿造行业，尤其是应用到具有高盐环境的调味品行业，具有良好的经济效益和实际应用价值。
文档编号A23L1/015GK102239976SQ201110004940
公开日2011年11月16日 申请日期2011年1月12日 优先权日2011年1月12日
发明者刘超兰, 周荣清, 李从虎, 黄钧 申请人:四川大学