专利名称：产2s-甲基丙二酰辅酶a的假单胞工程菌的制作方法
技术领域：
本发明涉及基因工程领域，具体地说，涉及一种产2S-甲基丙二酰辅酶A的假单胞工程菌。
背景技术：
来源于放线菌的次级代谢产物是临床上药物的重要来源，约70%的抗菌药物属于此类。由于这些次级代谢产物结构的复杂性，采用化学方法合成这些化合物成本高、操作繁琐，不能满足大量的商品化生产的需要。而采用原始菌进行次级代谢物的生产，往往菌体生长速度慢、产量低、难培养，遗传背景不清晰，代谢产物不清晰，且很难进行遗传操作，这些因素制约着对有价值的次级代谢产物的开发应用。近年来，次级代谢产物生物合成基因簇的异源表达成为提高化合物产量或有针对性地改造化合物的有效手段。在异源表达宿主的选择中，由于假单胞菌与放线菌密码子的使用相近，有翻译后修饰，安全无毒(如模式菌株恶臭假单胞菌I3Seudomonas putida KTM40)，生长快速，次级代谢产物背景清晰等优点，成为首选的宿主菌之一。P. putida KT2440表达异源产物已有成功的例子，如粘细菌Stigmatella aurantiaca DW4/3-1的全基因组序列分析后发现至少有八个PKS型，NRPS型或H(S/NRPS 杂合型的生物合成基因蔟，但常规的发酵和产物的分离纯化只得到Myxothiazol —种化合物，对某“沉默基因蔟”敲除后所得变异株的分析发现，其HPLC图谱比原株少一个特征峰。 RulfMuller研究组将此“沉默基因蔟”克隆后，转化至P. putidaKT2440中，在苯甲酸诱导下，得到了 H(S/NRPS型化合物Myxochromide，发酵2天产量就达到了 40mg/mL，而原株发酵 7天的产量仅为8mg/mL。因此，可以通过基因工程方法大量地获得新的、有潜在应用价值的化合物，为进一步的药效学研究提供充足的原料来源。但恶臭假单胞菌不能全面地提供复杂的次级代谢产物生物合成所需的小分子前体。如很多次级代谢产物需要以2S-甲基丙二酸辅酶A(2S-Methylmalonyl-CoA，2S-mmCoA) 作为延伸单位，而在恶臭假单胞菌中不能检测到2S-甲基丙二酸辅酶A的存在。虽然已有报道可进行化学合成2S-甲基丙二酰辅酶A，但化学合成成本大，技术难度高，而且很难得到单一的光学异构体产物，并且由于其不稳定性很难直接供给微生物作为合成底物利用，而 2S-甲基丙二酰辅酶A在细胞内生成可直接用于次级代谢产物的合成，可大大降低发酵成本。因此在异源表达宿主菌中合成2S-甲基丙二酰辅酶A是最佳选择，构建能够产生2S-甲基丙二酸辅酶A的基因工程菌株，是异源表达需要以之作为前体物质的次级代谢产物的基础，有着广泛的应用价值。已知生物体内有两个2S-甲基丙二酸辅酶A的生物合成途径。一是MCM途径，即以三羧酸循环中的琥珀酰辅酶A为起始化合物，通过甲基丙二酰辅酶A变位酶(MCM)和甲基丙二酰辅酶A变位酶复合物保护蛋白(MeaB)的作用生成2R-甲基丙二酰辅酶A，再通过甲基丙二酰辅酶A异构酶(Epi)的作用而生成2S-甲基丙二酸辅酶A。另外一条是PCC途径，即首先从L-丙氨酸、L-异亮氨酸或L-甲硫氨酸生成(或以奇数位脂肪酸降解)而获得丙酰辅酶A，继而在ATP的参与下通过羧化酶的作用生成2S-甲基丙二酸辅酶A，参与该过程的基因包括丙酰-CoA羧化酶基因和羧化酶复合物A亚单位基因。为了异源表达需要以2S-甲基丙二酸辅酶A作为前体单元的myxothiazol，德国 Rolf MulIer研究组将粘细菌Sorangium cellulosumSoce56全基因组中成簇的mem、印i和 meaB三个基因通过同源重组整合至假单胞菌P. putida KT2440的基因组中，所得菌株发酵后，经气相色谱和质谱连用(GC/MQ检测表明可产生4. 68nmol/mL的2S-甲基丙二酸辅酶 A。然而，该菌株2S-甲基丙二酸辅酶A的产量较低，直接影响了最终次级代谢产物的产量。
发明内容
本发明的目的是提供一种产2S-甲基丙二酰辅酶A的假单胞工程菌。为了实现本发明目的，本发明的一种产2S-甲基丙二酰辅酶A的假单胞工程菌， 其是将来源于天蓝色链霉菌(Sterptomyces coelicolor)的编码丙酰-CoA羧化酶的pccB 基因和编码羧化酶复合物A亚单位的accAl基因与筛选标记基因一起整合至恶臭假单胞菌 O^eudomonasputidEOKTM^的基因组中而获得。其中，所述筛选标记基因为卡那霉素抗性基因或庆大霉素抗性基因。优选地，前述的工程菌是将pccB基因和accAl基因与筛选标记基因一起整合至恶臭假单胞菌KTM40基因组中rpe基因和trpE基因之间的区域而获得。其中，rpe基因和 trpE基因分别编码磷酸核酮糖3-异构酶和邻氨基苯甲酸合酶，rpe基因和trpE基因之间为编码磷酸乙醇磷酸酶的gph基因。gph基因为非必须基因，即此基因的缺失不影响菌株的生理和生化功能。前述产2S-甲基丙二酰辅酶A的假单胞工程菌的培养方法为将所述工程菌接种于LB培养基中，在30°C下进行培养。本发明的目的还可以采用以下的技术措施来进一步实现。本发明提供一种产2S-甲基丙二酰辅酶A的恶臭假单胞菌O^seudomonas putida) Sino-PCC，保藏号CGMCC NO. 4517。其通过以下方法获得将来源于天蓝色链霉菌的编码基因丙酰-CoA羧化酶的pccB基因和编码羧化酶复合物A亚单位的accAl基因与卡那霉素抗性基因一起通过重组整合至恶臭假单胞菌KTM40的基因组中。卡那霉素抗性基因和pccB 基因及accAl基因连接在一起，作为基因整合菌株的筛选标记。对恶臭假单胞菌Sino-PCC进行发酵，经气相色谱和质谱连用(GC/MS)检测表明 Sino-PCC可产生高达6. 24nmol/mL的2S-甲基丙二酸辅酶A，该产量高于文献报道的产量。本发明通过基因工程的方法，将来源于天蓝色链霉菌(Sterptomyces coelicolor)的编码丙酰-CoA羧化酶的pccB基因和编码羧化酶复合物A亚单位的accAl 基因与筛选标记基因一起整合至恶臭假单胞菌O^seudomonas putida) KTM40的基因组中， 构建得到产2S-甲基丙二酰辅酶A的假单胞工程菌，为异源表达需要以2S-甲基丙二酸辅酶A作为前体单元的次级代谢产物的合成提供了基础，有着广泛的应用价值。
图1是PCC途径生物合成2S-甲基丙二酰辅酶A的相关基因整合至P. putida KT2440基因组中的示意图，其中oriT是结合转移片段，sacB是6-果糖基转移酶基因，bla是氨苄青霉素抗性基因，rpe是磷酸核酮糖3_异构酶基因，Km是卡那霉素抗性基因， accAl是编码丙酰基辅酶A羧化酶α亚单元的基因，pccB是编码丙酰基辅酶A羧化酶的基因，trpE是邻氨基苯甲酸合酶基因，gph是磷酸乙醇磷酸酶基因，pp_0414和pp_0418是 P. putida KT2440基因组中功能未明确的基因；ASU Li、L2、K2、AS2、RU R2和AS3为验证 P. putida Sino-PCC菌株基因型所设计的PCR引物。图2是P. putida Sino-PCC菌株基因型分析的琼脂糖凝胶电泳图，其中 1. DL500DNA Marker ；2. DL2000DNA Marker ；3. ASl 和 L2 引物扩增的 1. 2kb ；4. Ll 和 K2 引物扩增的2. Ikb ；5. AS2和R2引物扩增的2. 6kb ；6. Rl和AS3引物扩增的1. 5kb。图3是P. putida Sino-PCC产生2S_mmCoA的GC/MS分析结果图，其中A是 P. putida KTM40发酵液(空白对照)的GC/MS分析结果图；B是P. putida Sino-PCC发酵液的GC/MS结果图，MSlOl为丙二酸的分子离子峰，MS104为内标氘代丙二酸的分子离子峰。图4是P. putida Sino-PCC产生2S-甲基丙二酰辅酶A的时间-产量曲线图。
具体实施例方式以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。以下实施例中使用的术语，除非有另外说明，一般具有本领域普通技术人员通常理解的含义。以下实施例中，未详细描述的各种过程和方法是本领域中公知的常规方法，所用试剂的来源、商品名以及有必要列出其组成成分的，均在首次出现时标明，其后所用相同试剂如无特殊说明，均与首次标明的内容相同。以下实施例中使用的菌株和质粒，均为已公开的菌株和质粒1. Escherichia coli DHlOB 基因型 F—mcrA(mrr-hsdRMS—mcrBC)80dlacZ M151acX74deoR recAlaraD139 (ara，leu) 7697galU galK rpsL endAlnupG。 文献 LifeTechnologies, Inc. Focus (1990) 12，19。购自美国 Invitrogen 公司。2.Ε.coli HB101/pRK2073 文 ^ =Marx CJ, Lidstrom ME. evelopment of improved versatile broad-host-range vectors for use inmethylotrophs and other Gram-negative bacteria, icrobiology. 2001,147 (Pt 8) :2065_75。由美国华盛顿大学 Mary Lidstrom 教授提供。3. P. putida KT2440 文献Nelson KE, Weinel C, Paulsen IT 等，Complete genome sequence and comparative analysis of themetabo1icalIy versatile Pseudomonas putida KT2440. Environ Microbiol2002，4 :799_808。___ The Institute for Genomic Research 的 KarenNelson 博士提供。4. S. coelicolor A3 (2)文献Bentley SD, Chater KF, Cerdeno-Tarraga AM 等，Complete genome sequence of the modelactinomycete Streptomyces coelicolor A3 (2). Nature. 2002,417 :141-147。由英国 John Innes 研究所 Keith Chater 博士提供。5. pBluescript II KS(-) ^；^ :Alting-Mees MA, Short JM. pBluescript II: gene mapping vectors. Nucleic Acids Res, 1989,17 :9494。购自美国 Novagen 公司。6. pACYC177 文献Chang AC, Cohen SN. Construction andcharacterization of amplifiable multicopy DNA cloning vehicles derivedfrom the P15A crypticminiplasmid. 1978，J Bacteriol，134，1141-1156。购自美国 NEB 公司。7. pEXlOOTlink 文献Quenee L, Lamotte D, Polack B. CombinedsacB-based negative selection and cre-lox antibiotic marker recycling forefficient gene deletion in pseudomonas aeruginosa. Biotechniques. 2005, 38 (1) :63_7。由法国 Centre Hospitaller Universitaire 的 Benoit Polack 教授提供。8.恶臭假单胞菌KTM40基因组序列的Genbank接收号(Accession No.)为 NC_002947o实施例1构建含以PCC途径生物合成2S-甲基丙二酰辅酶A的相关基因的质粒1.感受态大肠杆菌DHlOB的制备和DNA转化自平板上接种新鲜划线培养的单菌落至aiil LB液体培养基中37°C振荡过夜，以 1/50体积转至50ml LB中，振荡培养至菌体0D600约为0. 6。将菌液倒入预冷的离心管中， 冰浴10分钟，4°C，5000rpm离心5分钟，弃上清。以10%的甘油洗涤沉淀两次，最后悬浮于 200 μ 1的10%甘油中，每管分装50 μ 1。将DNA连接产物加至50 μ 1冰上融化的DH10B的电转化感受态细胞中，轻弹混勻。将混合液转移至冰上预冷的Imm电转杯中，电击转化。电转化条件1mm电转杯，200 Ω， 1800V, Bio-Rad公司Gene PulserIIR电转化仪。加Iml LB液体培养基至电转杯，吹打混勻，将溶液转移至一个无菌的1. 5ml印pendorf管中，37°C或30°C振荡培养60分钟后，转化液涂布在相应抗生素的抗性平板上，37°C或30°C培养。挑取单菌落，在含相应抗生素的液体培养基中培养，提取质粒，酶切和测序鉴定。LB培养基的组成(g/ml，% ):蛋白胨1，酵母提取物0. 5，氯化钠1，固体培养时加 1. 5%的琼脂，115°C灭菌 20min。2. Sterptomyces coelicolor A3 (2)基因组 DNA 的提取将在_70°C冻存的S. coelicolor A3 (2)划线于ISPII固体平板上，30°C培养2天以上；从固体平板上挑取一块菌块到20mL ISPII液体培养基培养，30°C 220rpm/min摇床培养约30小时；取1. Oml菌体到1. 5mL离心管，13200rpm离心，30秒，收集菌体；将菌体重悬于467L TE缓冲液，混勻，加入30mL 10 % SDS (十二烷基磺酸钠)，加入3mL20mg/mL的蛋白酶K溶液，混勻，37°C保温1小时；加入等体积苯酚氯仿抽提，混勻，13200rpm离心IOmin ； 取上清，重复上述步骤；取上清，加入等体积氯仿抽提，混勻，13200rpm离心IOmin ；取上清， 加入1/10倍体积的5M醋酸钠，0. 6倍体积的异丙醇，混勻至有白色絮状沉淀产生；用玻璃棒挑取絮状沉淀，用70%乙醇洗涤；将絮状沉淀溶于适量的TE缓冲液，50°C 30min ；置于 37 °C待DNA完全溶解。ISPII培养基的组成(g/ml，％)酵母提取物0. 3，麦芽提取物1，葡萄糖1，pH7. 3， 固体培养时加1. 5 %的琼脂，115 °C灭菌20min。TE缓冲液的组成10mM三羟甲基氨基甲烷盐酸盐，ImM 二胺四乙酸二钠，pH 8.0。3.构建含PCC途径生物合成2S-甲基丙二酰辅酶A的相关基因的质粒设计引物Ll 5' -GGGGAGCTCGGGAGCCCTGTTTGCCTTTGCC-3‘L2 5' -GGGGGATCCGCATGCCGATCTCGCGGATGTTGTTGAC-3‘分别在5'端引入Mcl位点，在3'端引入BamHI和SphI位点(以下划线表示)。以P. putida KT2440基因组DNA为模板，Ll和L2为引物扩增出1. Okb的rpe基因区域，以 SacI和BamHI酶切后，克隆至pBluescript IIKS (-)的&icl和BamHI位点，获得重组质粒 pSino-100。设计引物Kl 5' -GGGGAGCTCGCA-3‘K2 5' -GGGGGATCCTTAGAAAAACTCATCGAGCATC-3‘分别在5'端引入Mcl和SphI位点，在3'端引入BamHI位点(以下划线表示)。 以pACYC177为模板，Kl和K2为引物扩增出1. Okb的Km基因，以SacI和BamHI酶切后，克隆至 pBluescript II KS (-)的 &icl 和 BamHI 位点，获得重组质粒 pSino_101。设计引物 ACl 5' -GGGTCTAGAAGATCTGTGCGCAAGGTGCTCATCGCC-3‘AC2 5' -GGGCTGCAGTCAGTCCTTGATCTCGCAGATG-3‘分别在5'端引入^CbaI和BglII位点，在3'端引入I^stI位点(以下划线表示)。以S. coelicolor基因组DNA为模板，ACl和AC2为引物扩增出1. 8kb的accAl基因， XbaI和I3StI酶切后，克隆至pBluescript II KS (-)的XbaI和I^stI位点，获得重组质粒 pSino_102o设计引物PBl 5' -GGGCTGCAGATGTCCGAGCCGGAAGAGCAG-3‘PB2 5' -GGGCTCGAGTTACAGGGGGATGTTGCCGTG-3‘分别在5'端引入I3StI位点，在3'端引入BioI位点(以下划线表示)，以 S. coelicolor基因组DNA为模板，PBl和PB2为引物扩增出1. 8kb的pccB基因，PstI和XhoI 酶切后，克隆至pBluescript II KS (-)的I3StI和XhoI位点，获得重组质粒pSino-103。设计引物Rl 5' -GGGCTCGAGCTGCGCCTGGCCGCTG-3‘R2 5' -GGGTCTAGAGTGCTCGGCAATTTCCTTGTCGTC-3'分别在5'端引入BioI位点，在3'端引入^CbaI位点(以下划线表示)。以 P. putida KT2440基因组DNA为模板，Rl和R2为引物扩增出1. Okb的trpE基因区域，以 XhoI和XbaI酶切酶切后，克隆至pBluescript II KS (-)的BioI和)(bal酶切位点，获得重组质粒 pSino-104。以上质粒的克隆宿主菌均为DH10B，所有均经酶切和测序验证其所克隆得序列的正确性。SacI 禾Π SphI 酶切 pSino-100 得到 1. Okb 的 rpe 基因片段，SphI 和 BamH 酶切 pSino-101得到l.Okb的Km基因片段，两片段连接后克隆至pBluescript II KS㈠的^icI 和BamHI位点，得到重组质粒pSino_105。PstI 和 XhoI 酶切 pSino-103 得到 1. 6kb 的 pccB 基因片段，XhoI-XbaI 酶切 pSino-104得到l.Okb的trpE基因片段，两片段连接后克隆至pBluescript II KS㈠的 PstI和XbaI位点，得到重组质粒pSino-106。SacI和BamHI酶切pSino-105得到2. Okb的插入片段，BglII和PstI酶切 pSino-102得到1. 8kb的accAl基因片段，PstI和XbaI酶切pSino—106得到2. 6kb的插入片段，三个片段连接后克隆至pBluescript II KS(-)的McI和)(baI位点，得到重组质粒 pSino_107oSacI 和 XbaI 酶切 pSino-108 所得的 6. 4kb 片段克隆至 pEXlOOTlink 的 SacI 和 XbaI位点后，得到最终用于同源重组质粒得pSino-108。以上50 μ 1 PCR反应体系dd H2O38. 2 μ 110XPCR反应缓冲液5 μ 1IOmMdNTP1. 3μ 1上游引物(终浓度0. 75mM)1. 5 μ 1下游引物(终浓度0. 75mM)1. 5 μ 1模板(质粒约lOOng，基因组DNA约200ng) 2 μ 1pfu 聚合酶(5U/ μ 1)0· 5 μ 1PCR反应条件95°C变性5分钟，(95°C 45秒，60°C 1分钟，72°C Ikb每分钟)，共 34个循环，72°C延伸10分钟。PCR仪购自Bio-rad公司，型号为PTC-200。反应结束后，以加入20μ g/ml的溴化乙锭(EB)的1 %的琼脂糖凝胶电泳检测。实施例2将上述所得质粒通过三亲接合转移的方法转化至P.putidaKT2440，在10%蔗糖的负筛选作用下，PCC途径相关基因通过rpe基因和trpE基因得同源重组而整合至 P. putida KT2440的基因组，得到基因工程菌株Sino-PCC。1.三亲本杂交法转化P. putida KT2440从冻存管中分别划线P. putida KT2440于LB平板，30°C，培养过夜；划线E. coli HB101/pRK2073于含50μ g/mL链霉素的LB平板，37 °C，培养过夜；划线E. coli DH10B/ pSino-108于含30 μ g/mL卡那霉素的LB平板，37°C，培养过夜。挑P. putida KT2440单菌落接种于2mL LB液体培养基中，30°C，220rpm，振荡培养过夜；挑E. coliHB101/pRK2073单菌落接种于21^含5(^8/1^链霉素的1^液体培养基中，371，22011)111，振荡培养过夜；挑单菌落E. coli DH10B/pSino-108于含30 μ g/mL卡那霉素的LB液体培养基中，37°C，振荡培养过夜。分别取ImL 的 E. coli HB101/pRK2073、E. coli DH10B/pSino-108 和 1. 4mL P. putida KT2440的新鲜菌液，分别离心，弃去上清，用LB洗菌体两次以去除残留的抗生素，并分别用 ImL 的 LB 悬浮菌体。将 500 μ 1 Ε. coli HB101/pRK2073 和 500 μ 1 Ε. coli DH10B/pSino-108的悬浮菌液混合，37°C温育30min，与ImL已悬浮的P. putida KT2440菌液混合，离心，100 μ 1 LB悬浮混合的菌体，并小面积涂布于LB平板上，置于30°C约15h。用ImL无菌水刮取LB平板上的菌苔，取20 μ 1菌悬液稀释涂布于含50 μ g/mL氯霉素和30 μ g/mL卡那霉素的PMM的平板上，30°C培养约20h，挑取单菌落在ImL含50 μ g/mL 氯霉素和30 μ g/mL卡那霉素的LB液体培养基中过夜培养，取50 μ 1稀释涂布于含50 μ g/ mL氯霉素和30 μ g/mL卡那霉素及10 %蔗糖的PMM平板上。PCC途径生物合成2S-甲基丙二酰辅酶A的相关基因整合至P. putida KT2440基因组的示意图如图1所示。PMM培养基的组成(g/ml，% )磷酸氢二钾0. 7，磷酸二氢钾0. 3，柠檬酸钠0. 05，七水硫酸镁0. 1，硫酸铵0. 1，葡萄糖0.4，琼脂1.5，pH7.3，115°C灭菌20min。2.基因工程菌株Sino-PCC的获得pSino-108中的sacB基因编码6_果糖基转移酶，该酶催化蔗糖为对假单胞菌有毒害作用的果聚糖，因此含有pSino-108的菌株不能在含有蔗糖的培养基上生长。在卡那霉素抗性的筛选之下，pSino-108上的rpe基因和trpE基因及P. putida KT2440的同源片段发生同源重组，Km-accAl-pccB基因整合至P. putida KT2440基因组，基因组上rpe基因和 trpE基因之间gph基因被去除。将所得单菌落接种于含30 μ g/mL卡那霉素的LB液体培养基中培养过夜，提取基因组，进行PCR验证。引物设计如下AS1 :5' -ATCTCGCCCATGGTGGTGCCG-3 ‘，为针对pp 0414基因序列设计的引物；L2为扩增rpe基因的下游引物；Ll为扩增rpe基因的上游引物； K2 为扩增 km 基因的下游引物；AS2 5 ‘ -GTGCTCGGCAATTTCCTTGTCGTC-3 ‘，为扩增 accAl 基因的下游引物；R2为扩增trpE基因的下游引物；Rl为扩增trpE基因的上游引物；AS3 5' -CTGCGCCTGGCCGCTGCCGGC-3‘，为针对pp_0418基因中间序列设计的引物。共获得四株基因型正确的转基因工程菌，任取一株命名为P. putida Sino-PCC，现已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址北京市朝阳区大屯路中科院微生物研究所，保藏编号CGMCC NO. 4517，保藏日期2010年12月观日。P. putida Sino-PCC菌株基因型分析的琼脂糖凝胶电泳图如图2所示。实施例3发酵培养P. putida Sino-PCC，通过GC/MS测定不同发酵时间细胞内mmCoA的含量。1.转化子的发酵培养将双交换的转化子单克隆挑取到2mL含30 μ g/mL卡那霉素的LB液体培养基中， 30°C，180rpm，振荡培养过夜；以1 1000的比例稀释到IOOmL含30 μ g/mL卡那霉素的LB 液体培养基中，30°C，180rpm，振荡培养，分别在10h、20h、40h、60h、80h、IOOh取样，同时以 P. putidaKT2440原株培养作为对照。取样后测定OD6tltl,剩余菌液7000rpm离心5min收集菌体。2.胞内2S-甲基丙二酰辅酶A的提取向菌体中加入3mL pH7. 050mM磷酸盐缓冲液，混勻；将菌体超声破碎，至菌液变清；加入50mL甲醇，ISOrpm振荡摇勻1小时；将甲醇溶液用漏斗过滤；将过滤得到的液体在旋转蒸发仪上45°C蒸干，蒸干后加入Iml甲醇溶解，得到提取物。3. 2S-甲基丙二酰辅酶A和内标物的衍生化处理取300 μ 1提取物，加入内标物IOnmol甲基氘代丙二酸，混勻，真空抽干；加入 400 μ 1环己烷，100 μ 1酸性正丁醇，混勻；在样品瓶内80°C，反应2h，冷却至室温；加入 500 μ 1 6%的Na2CO3溶液，混勻，离心，两相分离；取上层有机相。4. P. putida Sino-PCC 产 2S_mmCoA 的 GC/MS 分析甲基丙二酸盐及2S-甲基丙二酰辅酶A在酸性条件下与正丁醇反应后生成可用于GC/MS分析的甲基丙二酸的二丁基酯。选用氘代甲基丙二酸作为内标物，在质谱图上， 2S-甲基丙二酰辅酶A衍生化的分子离子峰为MS101，内标物氘代甲基丙二酸衍生化的分子离子峰为MS104，二者之间无干扰，且在这个质量范围内无其它碎片干扰。
GC/MS分析条件如下采用美国安捷伦公司的7000A型气质分析仪。色谱条件 色谱柱:DB5MS(30ymX250ymX0. 25 μ m)；进样方式脉冲不分流，脉冲压力14psi，脉冲时间0. 5min ；载气氦气；柱流量lmL/min ；进样口温度300°C。升温程序起始温度 700C (5°C ) ；5°C /min 升至 170°C;30°C /min 升至 300°C，保持 5min ；30°C /min 冷却至 70°C。 质谱条件溶剂延迟:3min ；EM电压1094V ；质量范围50-550 ；离子源温度230°C ；四极杆温度150 0C ；进样量1.0 μ 1。根据MSlOl和MS104积分面积的比值，即可计算出2S-甲基丙二酰辅酶A的含量。 实验发现P. PUtida Sino-PCC发酵样品检出MSlOl离子峰，其碎片峰型与预期一致，而原株未检出MSlOl离子峰，说明基因工程菌株发酵产生了 2S-mmCoA。P. putida Sino-PCC产生 2S-甲基丙二酰辅酶的GC/MS分析结果如图3所示。由此可见，P. putida Sino-PCC发酵产生了 2S-甲基丙二酰辅酶A，而原株P. putida KT2440未能检测出2S-甲基丙二酰辅酶A。P. putida Sino-PCC产生2S-甲基丙二酰辅酶A的时间-产量曲线图如图4所示， 图4表明在40个小时胞内2S-甲基丙二酰辅酶A的含量最高，达6. 2^mol/mL。虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
权利要求
1.产2S-甲基丙二酰辅酶A的假单胞工程菌，其特征在于，其是将来源于天蓝色链霉菌(Sterptomyces coelicolor)的编码丙酰-CoA羧化酶的pccB基因和编码羧化酶复合物 A亚单位的accAl基因与筛选标记基因一起整合至恶臭假单胞菌O^seudomonas putida) KT2440的基因组中而获得。
2.根据权利要求1所述的工程菌，其特征在于，所述筛选标记基因为卡那霉素抗性基因或庆大霉素抗性基因。
3.根据权利要求1或2所述的工程菌，其特征在于，其是将pccB基因和accAl基因与筛选标记基因一起整合至恶臭假单胞菌KTM40基因组中rpe基因和trpE基因之间的区域而获得。
4.权利要求3所述工程菌的培养方法，其特征在于，将所述工程菌接种于LB培养基中， 在30°C下进行培养。
5.根据权利要求3所述的工程菌，其特征在于，其是将pccB基因和accAl基因与卡那霉素抗性基因一起整合至恶臭假单胞菌KTM40基因组中rpe基因和trpE基因之间的区域而获得。
6.根据权利要求5所述的工程菌，其特征在于，其为恶臭假单胞菌O^eudomonas putida)Sino-PCC，保藏号 CGMCC NO. 4517。
全文摘要
本发明提供了一种产2S-甲基丙二酰辅酶A的假单胞工程菌，其是将来源于天蓝色链霉菌(Sterptomyces coelicolor)的编码丙酰-CoA羧化酶的pccB基因和编码羧化酶复合物A亚单位的accA1基因与筛选标记基因一起整合至恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)KT2440的基因组中构建得到的。为异源表达需要以2S-甲基丙二酸辅酶A作为前体单元的次级代谢产物的合成提供了基础，有着广泛的应用价值。
文档编号C12P19/40GK102154191SQ20111000685
公开日2011年8月17日 申请日期2011年1月13日 优先权日2011年1月13日
发明者廖志勇, 杨小芳 申请人:北京赛诺百奥生物技术有限公司