专利名称：新型血管内皮生长因子人源化单克隆抗体的制作方法
技术领域：
本发明涉及抗体药物开发和生产技术领域。具体地，本发明涉及获得人血管内皮生长因子(hVEGF)不同表位的鼠单克隆抗体。同时，本发明还涉及单克隆抗体的人源化及其表达制备方法。
背景技术：
血管生成系统在许多疾病发展过程发挥着重要作用，如肿瘤、类风湿性关节炎、增生性视网膜病、牛皮癣(Klagsbrun 等人，Annu. Rev. Physiol. 53 :217-239,1991 ； Folkman J. J. Biol. Chem. 267 10931—10934，1992 ；禾口 Garner A, Vascular Disease In: Pathobiology of ocular disease. Adynamic approach. Garner A, Klintworth GK 编，2 版，Macel Dekker, NY, ppl625_1710，1994)。多数实体肿瘤生长是血管依赖性的，如果没有丰富血液供应氧气和营养物质，原发肿瘤不会超过2-3mm3(F0lkman J.N Engl J Med.，285 1182-1186，1971，Folkman J.N Engl J Med. ，333，1757-17631995)。血管内皮生长因子(VEGF)是血管生成重要调节因子，在胚胎发育及出生后的血管发程中均起着极为重要的调节作用，主要参与新生血管的形成VEGF有至少五种不同大小的剪切形式，包括121、145、165、189和206个氨基酸等，其中VEGF121、VEGF145和VEGF165是分泌蛋白。VEGF受体包括VEGFR1、VEGFR2和VEGFR3。VEGF与内皮细胞膜上内皮生长因子受体(VGFR)结合后，使VEGFR二聚体化，受体酪氨酸激酶活性被激活，由受体自身磷酸化后启动下游信号通路如PKC信号通路。VEGF在肿瘤细胞中表达水平显著升高。高表达的VEGF 除了能够使血管内皮细胞分化增殖和迁移，促进血管的构建及生长，还能够提高血管的通透性、增加血浆蛋白溶酶激活物(PA)及血浆纤溶酶原激活物抑制剂-I(PAI-I)的表达，促进肿瘤的侵袭、转移。使用抗体靶向肿瘤特异抗原可以用来治疗肿瘤。鼠移植动物模型鉴定肿瘤抗原分为两种一种是肿瘤特异移植抗原；一种是肿瘤相关移植抗原。肿瘤特异移植抗原是指肿瘤中突变基因编码的蛋白，经过I型MHC被展示到细胞表面。人基因组单个细胞的恶性转化诱因包括化学诱因、放射性诱因和病毒诱因等。在基因组水平，这体现为病毒癌基因、细胞原癌基因、抑癌基因等癌症相关基因的突变。癌症相关基因功能多与细胞复制调控和细胞死亡调控直接相关。诱导细胞复制的原癌基因有编码生长因子和生长因子受体的，例如 sis编码一种血小板来源生长因子，fms、erbB和neu编码生长因子受体；有编码信号传导通路和转录因子的，例如src编码酪氨酸激酶，ras编码GTP结合蛋白，myc、jun和fos等编码转录因子。抑癌基因能够抑制过度细胞复制，例如Rb基因突变导致retinoblastoma， P53蛋白编码一个核磷酸蛋白。大部分癌症诱导和发展过程是多步骤的。例如人直肠癌发展过程表现出稳定的不同时期特征和依次经历系列的遗传突变。不能有效免疫激活和 /或免疫耐受可能是肿瘤晚期无法控制的原因，临床表现为恶性肿瘤形成和原发肿瘤临近淋巴结的肿大。肿瘤相关移植抗原包括肿瘤发展必须蛋白、细胞有丝分裂特异蛋白、肿瘤细胞组织特异性蛋白。血管内皮生长因子(VEGF)是主要的血管内皮生长因子，是恶性肿瘤组织新血管生成所必须的(Folkman等人，新英格兰医学杂志(N. Engl. J. Med.)观5 1182-1186(1971))。原位杂交研究表明，许多肿瘤VEGF是过度表达的，包括肺癌、乳腺癌、肾癌、和子宫癌等(M. Volm 等人，Int. J. Cancer 74 :64-68,1997 ；H. Yoshiji, Cancer Res. 56 :2013-2016,1996 ；Μ.Tomisawa, Eur. J. Cancer 35 133-137，1999 ；H.Μ. Sowter, Lab. Invest 77 :607-614,1997)。Genentech 公司生产的 VEGF 人源抗体 Bevacizumab 对非小细胞肺癌、直肠癌和乳腺癌均有疗效，其药理是体内注射VEGF抗体特异阻断VEGF的促新血管生成功能，从而抑制恶性肿瘤生长速度。VEGF抗体药物升级需要获得和研究针对VEGF不同表位的⑶R。不同⑶R免疫原性是不同的，这会造成抗体被耐受的速度和毒性的差异，直接影响药效。针对不同表位的CDR 与抗原结合的亲和力也会差别，高亲和力⑶R的抗体药物每针剂用量预期可以下调。鉴于 VEGF和其受体的多样性，针对VEGF不同抗原表位或者识别相同表位而亲和力不同的VEGF 抗体对肿瘤生长抑制的效果可能是不同的。抗体的疗效还受抗体血浆半衰期和血管穿透能力等因素的影响。因此研究识别VEGF不同抗原表位的抗体人源化改造将有助于获得疗效更好的治疗性抗体。人抗体分子包括IgGl、IgG2、IgG3、IgG4、IgM、IgAl、IgA2、IgE 和 IgD 等。就 IgGl 而言，其序列去除CDR部分亦存在个体间差异。因此在抗体人源化过程中，需要考察不同人种IgG序列的个体间差异。
发明内容
本发明提供一种新的具有治疗前景的人源化VEGF抗体，能够在体外抑制VEGF诱导的内皮细胞增殖，在体内抑制肿瘤的生长。本发明提供了一种针对血管内皮生长因子(VEGF)的人源化抗体，采用与鼠VEGF 抗体具有最高同源序列的人亚类共有序列的架构，即八K亚组II(V^II) 亚组I(VH I)，将鼠抗-VEGF抗体的CDR移植其上构建成人源化抗体。对该初始的人源化抗体序列上的关键框架残基进行改变，以减少免疫原性。本发明提供了一种人源化VEGF抗体，其中重链可变区VH的高变区具有如下氨基酸序列CDRHl (SEQ ID NO 1 :GYTFTDYNVA)，CDRH2 (SEQ ID NO 2 :DIDPNNGNTIYNQKFK)， CDRH3(SEQ ID NO 3 :YCARGAHW)。本发明还提供了优选的VEGF抗体轻链可变区，其中高变区具有下列氨基酸序列 CDRLl(SEQ ID NO 4 :KSSQSLLDSDGKTYLN)，CDRL2(SEQ ID NO 5 :LVSKLDS),CDRL3(SEQ ID NO 6 =WQGTHFPffT)。本发明提供了一种VEGF抗体，其重链可变区具有SEQ ID NO 7所示氨基酸序列和序列表1所示核苷酸序列，轻链可变区具有SEQ ID NO 8所示序列和序列表2所示核苷酸序列，人源化抗体重链可变区具有SEQ ID NO 9所示序列，轻链可变区具有SEQ ID NO 10 所示序列。本发明还包括各种形式的该人源化抗体，例如，可以是全长的抗体，也可以是抗体片段(如Fab，Fab’或者F(ab’)2)，以及抗体与药物、毒素、细胞因子、放射性核素或酶等偶联，组成免疫偶联物。本发明还提供了序列表3所示的最短人泛素S27A启动子，该序列长度为沈9，能与CMV增强子序列共同作用提高外源基因在真核细胞中的表达量。本发明还提供了编码人源化VEGF抗体的DNA分子；表达载体，它含有该核酸序列及与该序列操作性相连的表达调控序列；制备该抗体的方法，包括在宿主细胞中表达抗体， 以及从宿主细胞培养物中分离纯化抗体。本发明还包括VEGF抗体的诊断和治疗用途。
图1和2显示了鼠单克隆抗体18-5的重链可变区(SEQ. ID NO 7)和轻链可变区(SEQ. IDNO 8)，人源化单克隆抗体hl8-5的重链可变区(SEQ. ID NO 9)和轻链可变区 (SEQ. ID NO 10)，人重链亚组 I human I (SEQ. ID NO :11)和轻链 κ 亚组 II (SEQ. ID NO :12) 的可变区序列。下划线标出了互补决定区(CDR)。图3是人源化抗VEGF的单克隆抗体hl8_5对裸鼠肿瘤生长的抑制作用。与对照组相比，hl8-5，阳性对照抗体Bevacizumab均可显著抑制肿瘤的生长(ρ < 0. 05)，*表示显著性差别。实施方式具体实施例1小鼠单克隆抗体的制备和筛选(1)抗原的制备将人血管内皮生长因子 VEGR65(Human Vascular endothelial growth factor, hVEGF165)基因通过PCR从人基因转录组中扩增获得，上游引物为5’ -CGCGGATCCGCACCCAT GGCAGAAGGAGG-3，；下游引物为5，-CTCCTCGAGTCACCGCCTCGGCTTGTCACATC-3，。利用 BamH I和B10 I双酶切，将基因片段连入原核表达载体pET3h(+)，PCR和双酶切鉴定阳性克隆后测序，序列测定正确后，提取质粒。原核表达载体pET3h-VEGF165转化Rosetta菌株，在 IOOmlLB培养基中，OD6tltl达到约0.5时，ImM IPTG诱导表达4h，VEGF165蛋白形成包涵体。超声破菌后，用IXSDS上样缓冲液溶解包涵体，测定靶蛋白的表达量。将制备好的VEGF165蛋白进行SDS-PAGE电泳，割胶纯化蛋白。(2)小鼠的免疫将纯化后的VEGF165蛋白溶解在1 XPBS，取适量的蛋白溶液与弗氏完全佐剂 (Sigma)混勻乳化，取8周龄的BALB/c雌鼠，皮下多点注射抗原。2周后，取适量的蛋白溶液与弗氏不完全佐剂(Sigma)混勻乳化，在小鼠的皮下，进行第二次免疫。以后每隔3周， 进行第三、四次免疫。第四次免疫后3天，取脾脏进行细胞融合。(3)细胞融合和阳性克隆的筛选引颈处死小鼠，用70%酒精消毒其体表。无菌条件下取出脾脏，在灭菌不锈钢网中，用注射器向脾脏内注入3ml无血清培养液，反复抽吸数次获得细胞悬液，将细胞悬液注入50ml离心管中，加入20ml无血清培养液，轻轻吹打数次，1000rpm/min离心。用无血清培养液将细胞重悬，与小鼠骨髓瘤细胞SP2/0以适当比例轻轻混勻，在37°C水浴锅中加入 PEG1400，水浴1. 5min。加入无血清培养液35ml，离心。沉淀用含有20% FCS的RPM1-1640 重悬，每孔200 μ 1均分到96孔细胞培养板，放入37°C 5% CO2培养箱中培养。24h后，加入选择培养液HAT，每3天换一次新鲜培养液。14天后，取细胞培养上清，ELISA鉴定出阳性克隆。多次进行亚克隆鉴定阳性克隆细胞成系，继续体外培养6个月。选出5株高效表达细胞株，分别命名为18-1，18-2，18-3， 18-4，18-5。(4)单克隆抗体的鉴定血清1 1000-1 50000 稀释，IOOngVEGF165 蛋白上样，进行 Western Blot 分析抗体的特异性。将VEGF165基因通过TOPO克隆方法连入表达载体pLenti7. 3/V5-T0P0,真核表达载体 pLenti7. 3/V5_VEGF165 利用 Lipofectamine 2000 (Invitrogen)介导瞬时转染
细胞，血清1 100稀释，进行免疫荧光鉴定抗体。测定可知，18-5细胞株的抗体特异性最好，且能识别细胞内源表达的抗原。(4)单克隆抗体可变区序列的获得利用1Trizol (Invitrogen)法提取杂交瘤细胞株18-5的总RNA，然后用oligo-dT 弓I物禾口 superscript II Reverse Transcriptase (Invitrogen)反转录成 cDNA。根据小鼠抗体重链和轻链的FRl区氨基酸序列，合成兼并的寡核苷酸引物，用作正向引物。反向引物根据小鼠抗体的恒定区设计，可将全部的可变区扩增得到。PCR反应完成后，分别将抗体重链和轻链的DNA片段连于TA克隆载体，挑取克隆进行测序。具体实施例2鼠单克隆抗体的人源化和表达纯化(1)鼠单克隆抗体的人源化将小鼠的抗体氨基酸序列与人抗体氨基酸序列进行比对，获得最高同源序列的人亚类共有序列的架构，即人轻链Vd亚组II(VdII)和重链Vh亚组I(VH I)，作为人源化构架。按照 kabat 等人的定义将 L 链的 CDRl :M_34，CDR2 :50_56，CDR3 :89-97 ；H 链的 CDRl 26-35, CDR2 :50-65, CDR3 :95-102 (sequences of proteins of immunological Interest, (5th) ,Public Health Service,National Instistutes ofHe￡ilth，Bethesd￡i，MD(1991)。禾Ij 用计算机构建鼠单克隆抗体VL-VH区的立体图模型(Carter等，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89 :4285-4289(1992)和 Eigenbrot 等，J. Mol. Biol.) 229 :969-995 (199 )，确定将那些鼠抗体构架区残基引入人源化抗体。其中重链除⑶RH1，⑶RH2，⑶RH3外，在H73位点人源化构架改用鼠抗体氨基酸，轻链CDRLl，CDRL2，CDRL3使用鼠抗体氨基酸序列。(2)人泛素S27A强启动子表达载体的构建在含人抗体恒定区CH和CL的载体AbVec-hlgGl，AbVec-hlgKappa上，利用NdeI和 fegl个酶切位点连入CMV增强子序列。苯酚抽提法从细胞中提取人基因组DNA。通过比对人泛素S27A与仓鼠泛素S27a启动子的序列，同时考虑序列的长度，设计PCR上游引物 (5' -3' catcggccgTTGATTGTACGGGAAAAGCCT)和下游引物(5，_3，ccggaattcGCAGATGGCGGATC GAAA)。以人基因组DNA作为模板，进行PCR。产物获得以后，电泳回收目的片段。启动子片段被克隆入含有CMV增强子序列的AbVec-hlgGl，AbVec-hlgKappa，命名为AbVecl-hlgGl， AbVecl-higKappa。(3)人源化抗体IgG的构建和表达纯化人源化抗体重链和轻链可变区核苷酸序列全基因合成后，分别克隆入载体AbVecl-hlgGl，AbVecl-hlgKappa。转化DH5 α，提取阳性克隆质粒。利用转染试剂Lipofectamine2000 (Invitrogen)，将构建好的质粒共转染人细胞。培养Mh 后，DMEM培养基被换成基本培养基，并在5天之内每天收获上清。上清合并以后用 ProteinA-Sepharose CL-4B (Amersham)纯化抗体，并用 SDS-PAGE 电泳鉴定。经过亲和层析的鉴定产物再次通过分子筛层析，获得高纯度的单抗，然后利用EZQ Protein Quantitation Kit(Invitrogen)对抗体定量，以进行下一步的实验。具体实施例3人源化单克隆抗体的理化性质及生物活性分析(I)VEGF亲和力分析katchard法测定单克隆抗体18-5，hl8_5，Bevacizumab的亲和力。表1显示了测定的结果，说明两株单克隆抗体与VEGF有较强的结合亲和力。
18-5hi 8-5BevacizumabKd (M)4.12xl0"y1.59x10·"1.78x10"8(2)体外抑制内皮细胞增殖分析在内皮细胞基本培养基(EGM-2，Lonza)中，加入2 %胎牛血清和生长因子 (BulletKit，L0nza)，配制成内皮细胞生长培养基。当人脐静脉内皮细胞(HUVECs) (Lonza， ffalkersville, MD)生长到致密单层时，以4X IO3细胞/孔的密度接种于96孔板中，此时的分析培养液EGM-2不加入生长因子。阳性对照抗体为Bevaci zumab (Genetech)，人源化VEGF抗体按一定稀释梯度加入，孵育Ih后，加入人VEGF165使其终浓度为15ng/ml。 37°C,5% CO2培养箱培养4天后，每孔中加入10 μ 1 AlamarBlue(Invitrogen)继续培养 24h0 在激发波长 530nm 和发射波长 590nm 时，利用 Wallac Victor V multilabel HTS counter (PerkinElmer)测定细胞的增殖情况。每个处理设3次重复，每个重复测定两次。结果显示，在VEGF有效浓度下，抗体对人脐静脉内皮细胞的增殖有较好的抑制作用，阳性对照抗体和抗体的IC50值分别为0. 051,0. 012。(3)体内抑制肿瘤生长研究在含有链霉素、青霉素和10%胎牛血清的高糖DMEM培养基(G1BC0)中，培养人 A673成横纹肌细胞瘤细胞。在6-8周龄的雌性BALB/c裸鼠的背部区域皮下，注射IXlO7 个活肿瘤细胞。当肿瘤体积达到约100mm3(50 200mm3)时，裸鼠被随机分组，每组10只， 抗体在腹膜内注入。人源化VEGF抗体和阳性对照抗体Bevacizum(Genetech)的施用剂量是0.5和5mg/kg;无菌生理盐水作为对照。肿瘤细胞接种后1天开始，每周在裸鼠腹膜内施用2次单克隆抗体，每2 3天测定肿瘤大小。肿瘤细胞接种4周后，裸鼠被安乐死亡， 然后肿瘤被取出称重。试验结果说明，在两种剂量(0. 5和5mg/kg)，人源化VEGF抗体能显著抑制肿瘤的生长。与对照组相比，人源化VEGF抗体在两种剂量下肿瘤重量分别下降94%和95%，而使用Bevacizum的对照组动物肿瘤重量各下降89%和91%。
权利要求
1.一种人源化抗VEGF单克隆抗体，它具有重链可变区，该重链可变区含有如下氨基酸序列的三个高变区CDRH1(SEQ ID NO 1 :GYTFTDYNVA)，CDRH2 (SEQ ID NO 2 :DIDPNNGN TIYNQKFK)，CDRH3(SEQ ID NO 3 :YCARGAHW)。
2.如权利要求1所述的抗体，其特征在于，它包含轻链可变区，所述轻链可变区包括三个高变区，分别含有所示的氨基酸序列CDRL1(SEQ ID NO 4 :KSSQSLLDSDGKTYLN), CDRL2 (SEQ ID NO :5 :LVSKLDS)，CDRL3 (SEQ ID NO :6 =WQGTHFPffT)。
3 如权利要求1所述的抗体，它具有的重链可变区具有SEQID NO :9所示的氨基酸序列，轻链可变区具有SEQ ID NO: 10所示的氨基酸序列。
4.一种分离的核酸分子，其特征在于，该分子含有SEQ ID NO: 13所示的编码所述单克隆抗体重链可变区的核苷酸序列，以及SEQ ID NO :14所示的编码所述单克隆抗体轻链可变区的核苷酸序列。
5.根据权利要求4所述的核酸分子，其特征在于，它编码权利要求1所述的单克隆抗体。
6.一种表达调控的启动子元件，其特征在于，它含有SEQ ID NO :15所示的核苷酸序列。
7.—种药物组合物，它含有权利要求1所述的人源化抗VEGF抗体和药学上可接受的载体。
8.—种表达载体，它含有权利要求5所述的核酸序列及与该序列操作性相连的表达调控序列。
9.一种宿主细胞，其特征在于，它被权利要求8所述的表达载体转化。
10.产生权利要求1所述人源化抗VEGF抗体的方法，它包括培养权利要求9所述的宿主细胞，从而表达权利要求5所述的核酸分子。
11.如权利要求10所述的方法，其特征在于，还包括从权利要求9所述宿主细胞培养物中分离纯化人源化的VEGF抗体。
12.—种治疗哺乳动物VEGF诱导型血管生成相关病症方法，它包括将治疗有效量的权利要求1所述的人源化VEGF抗体施用于哺乳动物。
13.如权利要求12所述的方法，其特征在于，该哺乳动物有肿瘤。
14.如权利要求12所述的方法，其中所述治疗包括将第二制剂与所述抗体同时或顺序给药的方式。
15.如权利要求14所述的方法，第二制剂包括化疗剂，细胞毒剂，抗血管生成剂和抗肿瘤组合物。
全文摘要
本发明公开了新型抗人血管内皮生长因子(VEGF)的单克隆抗体。该单克隆抗体对VEGF有很高的亲和力，很低的免疫原性，并且其生物活性有显著提高。本发明还包含了所述单克隆抗体在研究及诊断治疗方面的应用。
文档编号C12N15/63GK102276722SQ20111000735
公开日2011年12月14日 申请日期2011年1月14日 优先权日2011年1月14日
发明者冯杰, 邵长君, 高静 申请人:中国科学院北京基因组研究所