专利名称：：双控双调节原核表达载体系统及其构建方法和用途的制作方法
技术领域：
：本发明属于分子生物学基因工程领域，具体涉及一种双控双调节原核表达载体系统及其构建方法和用途。
背景技术：
：原核细胞中基因表达(蛋白质合成)载体一股都是单载体，即一个感受态细胞中转入一种质粒，完成目的基因的表达，实现目的蛋白质的合成。这种形式的表达载体在把表达载体往感受态细胞中转化时操作程序简单，转化效率高。但是，该种表达载体在基因表达(蛋白质合成)过程中，载体上的控制调节系统对基因表达的控制不严格，经常有漏表达，造成一些表达产物对大肠杆菌宿主细胞有毒性的一些基因难已表达，从而限制了现有的一些表达载体的广泛应用。该种形式的表达载体可参考以下文献Yanisch-Perron,C.,Vieira,J.andjamesW.Warren,JenniferR.Walker,JohnR.Roth,etal.ConstructionandCharacterizationofaHighlyRegulableExpressionVector,pLACll,andItsMultipurposeDerivatives,pLAC22andpLAC33.Plasmid(2000)44,138-151；Studier,F.W.(1991).Useofbacteriophage-T71ysozymetoimproveaninducibleT7expressionsystem.J.Mol.Biol.219，37-44；Studier,F.W.，andMoffatt，B.A.(1986).UseofbacteriophageT7RNApolymerasetodirectselectivehigh-levelexpressionofclonedgenes.J.Mol.Biol.189，113—130；Studier，F.W.，Rosenberg，A.H.，Dunn，J.J.，andDubendorff，J.W.(1990).UseofT7RNA-polymerasetodirectexpressionofclonedgenes.In"MethodsinEnzymology"(D.V.Goeddel,Ed.),AcademicPress，SanDiego.Vol.185，pp.60-89；Vieira，J.，andMessing，J.(1982).ThepUCplasmids,anM13mp7_derivedsystemforinsertionmutagenesisandsequencingwithsyntheticuniversalprimers.Gene19，259-268；Glass，R.E.(1982)."GeneFunctionE.coliandItsHeritableElements."Univ.CaliforniaPress，BerkeleyandLosAngeles；Godson，G.N.(1991).Anover-expressionplasmidforEscherichiacoliprimase.Gene100,59-64；Mu”Iler-Hill,B.(1975).Lacrepressorandlacoperator.Prog.Biophys.Mol.Biol.30，227-252;Mu..ller-Hill，B.(1996).“ThelacOperon:AShortHistoryofaGeneticParadigm.，，deGruyter,Berlin；Bolivar,F.，Rodriguez,R.L.，Greene，P.J.，Betlach，M.C.，Heyneker,H.L.，Boyer,H.W.，Crosa，J.H.，andFalkow，S.(1977).ConstructionandcharacterizationofnewcloningvehiclesII.Amultipurposecloningsystem.Gene2,95-113；Brosius，J.(1988).Expressionvectorsemployinglambda-,trp_，lac-,andlpp-derivedpromoters.Biotechnology10,205-225；Brosius,J.,andHoly,A.(1984).Regulationofribosomal150WARRENETALRNApromoterswithasyntheticlacoperator.Proc.Natl.Acad.Sci.USA81，6929-6933；Amann,Ε.，andBrosius，J.(1985).ATGvectorsforregulatedhigh-levelexpressionofclonedgenesinEscherichiacoli.Gene40，183—190；Amann,Ε.，Ochs，B.,andAbel,K-J.(1988).TightlyregulatedtacvectorsusefulfortheexpressionofunfusedandfusedproteinsinEscherichiacoli.Gene69,301-315；Balbars，P·，andBolivar,F.(1990).DesignandconstructionofexpressionplasmidvectorsinEscherichiacoli.In“MethodsinEnzymology，，(D.V.Goeddel,Ed.)，AcademicPress，SanDiego.Vol.185，pp.14-37；Balba's，P.，Sobero'n，X.，Merino，E.，Zurita，M.，Hilda,M.，Valle,F.，Flores,N.，andBolivar,F.(1986).PlasmidvectorpBR322anditsspecial-purposederivatives-Areview.Gene50,3-40.Beckwith,J.R.,andZipser,D.(Eds.)(1970)."TheLactoseOperon.”ColdSpringHarborLaboratoryPress,ColdSpringHarbor，NY；TimothyS.Ham,SungKukLee,JayD.Keasling,etal.ATightlyRegulatedInducibleExpressionSystemUtilizingthefimInversionRecombinationSwitch.BiotechnologyandBioengineering，2006，Vol.94,No.1，pl_4；IanΤ.D.Petty.AplasmidvectorforcloningdirectIyatthetranscriptioninitiationsiteofabacteriophageT7promoter.NucleicAcidsResearch.1988，Volume16Number17，p8738；ChristineCagnon,VlvianeValverdeandJean-MichelMassonlAnewfamilyofsugar—inducibleexpressionvectorsforEscherichiacoli.ProteinEngineering.1991，vol.4no.7pp.843-847.W.TomStumpandKathleenB.Hall.SP6RNApolymeraseefficientlysynthesizesRNAfromshortdouble-strandedDNAtemplates.NucleicAcidsResearch,1993,21(23)5480-5484.EllenD.Jorgensen$,RussellK.Durbin,StevenS.Risman,etal.SpecificContactsbetweentheBacteriophageT3，T7，andSP6RNAPolymerasesandTheirPromoters,THEJOURNOAFLBIOLOGICACLHEMISTRY.Val.1991,266(1),645-651.HirokazuKotani，YukuoIshizaki，NobutsuguHiraoka，etal.NucleicAcidsResearch.1987，15(6)2653-2664.现有的大肠杆菌表达载体经常有目的基因不表达的情况发生，原因是在单控单调节的情况下由启动子、操纵子、调节基因组成的控制调节系统不严格，即目的基因表达(转录和翻译)控制调节不严格，在非诱导表达时也能够(漏表达)进行少量的目的基因表达，合成出蛋白质。有些目的基因的表达产物还会对宿主细胞有毒性作用，造成宿主细胞的死亡，不能获得要表达的目的蛋白。
发明内容为了解决现有技术中存在的问题，本发明提供一种双控双调节原核表达载体系统，用双载体控制调节目的基因的表达，即SP6启动子(promoter)+乳糖(Iac)调节基因表达系统和araB启动子(promoter)+araC调节基因表达系统，分别由乳糖类似物IPTG和阿拉伯糖(L-arabinose)诱导目的基因的表达。在该双控双调节原核表达载体系统中，由两个表达载体共同完成目的基因的表达。其中一个为主表达载体，即目的基因克隆到此表达载体上，另一个为辅助表达载体，该辅助表达载体控制调节主表达载体的启动子(SP6)。若实现主表达载体表达目的基因，必须经过辅助表达载体的控制调节系统和自身载体上的控制调节系统双调控实现目的基因的表达。双控双调节原核表达载体系统实现双控双调节基因表达的原理如图1所示。为了实现上述的发明目的，本发明提供如下技术方案一种双控双调节原核表达载体系统，由两个表达载体共同完成目的基因的表达；其中一个表达载体为主表达载体，目的基因克隆到此表达载体上，另一个表达载体为辅助表达载体，该辅助表达载体控制调节主表达载体启动子的开关；主表达载体含有SP6启动子和乳糖调节基因，辅助表达载体含有araB启动子、araC调节基因和SP6RNA聚合酶基因；主表达载体和辅助表达载体的表达目的基因受诱导物控制和/或调节。主表达载体的诱导物是乳糖类似物IPTG，辅助表达载体的诱导物是阿拉伯糖。上述双控双调节原核表达载体系统的构建方法，包括以下步骤1)WSEQIDNO:1和2所示序列为引物，以质粒pETlla为模板，进行PCR扩增，用BglII酶切PCR产物，回收目的片段后直接进行连接反应，构建pESP-Ι载体；将目的基因片段插入PESP-I载体中，构建含有目的基因的主表达载体；2)将质粒pARA13用I3StI和HindIII双酶切，回收目的片段，与SP6RNA聚合酶基因连接，构建质粒PARA-SP6作为辅助表达载体；3)将主表达载体和辅助表达载体同时转化大肠杆菌，同时使用主表达载体诱导物和辅助表达载体诱导物控制和/或调节目的基因表达。本发明还提供了上述双控双调节原核表达载体系统用于表达目的基因的用途。本发明具有以下技术效果1)本发明提供的基因表达载体系统，在目的基因表达过程中，表达控制高度严格而且可调。2、本发明提供的表达载体系统解决了目的基因表达过程中的漏表达问题，从而能表达一些难以表达的基因，即载体表达目的基因(蛋白质合成)的广谱性增强。幻本发明的基因表达载体系统广谱性强。图1双控双调节原核表达载体系统表达原理示意2:pESP-l载体结构示意图SP6启动子在质粒pESP-Ι中432-448的位置，Lac操纵基因(operator)在405-429的位置，LacI编码序列在835-1914的位置。pESP-Ι载体克隆表达区域(cloning/expressionregion)为权利要求1.一种双控双调节原核表达载体系统，其特征在于由两个表达载体共同完成目的基因的表达；其中一个表达载体为主表达载体，目的基因克隆到此表达载体上，另一个表达载体为辅助表达载体，该辅助表达载体控制调节主表达载体启动子的开关；主表达载体含有SP6启动子和乳糖调节基因，辅助表达载体含有araB启动子、araC调节基因和SP6RNA聚合酶基因；主表达载体和辅助表达载体的表达目的基因受诱导物控制和/或调节。2.如权利要求1所述的载体系统，其特征在于所述的诱导物是乳糖类似物IPT6，辅助表达载体的诱导物是阿拉伯糖。3.如权利要求1或2所述双控双调节原核表达载体系统的构建方法，其特征在于包括以下步骤1)以SEQIDNO:1和2所示序列为引物，以质粒pETlla为模板，进行PCR扩增，用BglII酶切PCR产物，回收目的片段后直接进行连接反应，构建pESP-Ι载体；将目的基因片段插入pESP-Ι载体中，构建含有目的基因的主表达载体；2)将质粒pARA13用I^stI和HindIII双酶切，回收目的片段，与SP6RNA聚合酶基因连接，构建质粒PARA-SP6作为辅助表达载体；3)将主表达载体和辅助表达载体同时转化大肠杆菌，同时使用主表达载体诱导物和辅助表达载体诱导物控制和/或调节目的基因表达。4.如权利要求1或2所述双控双调节原核表达载体系统的用途。全文摘要本发明属于分子生物学基因工程领域，具体涉及一种双控双调节原核表达载体系统及其构建方法和用途。该载体系统由两个表达载体共同完成目的基因的表达，其中一个表达载体为主表达载体，目的基因克隆到此表达载体上，另一个表达载体为辅助表达载体，该辅助表达载体控制调节主表达载体启动子的开关，主表达载体含有SP6启动子和乳糖调节基因，辅助表达载体含有arab启动子、araC调节基因和SP6RNA聚合酶基因，主表达载体和辅助表达载体的表达目的基因受诱导物控制和/或调节。文档编号C12N15/70GK102174554SQ20111002503公开日2011年9月7日申请日期2011年1月24日优先权日2011年1月24日发明者李国瑞,翟景波,陈永胜申请人:内蒙古民族大学