专利名称：鼠李糖乳杆菌pcr检测、鉴定特异引物对的制作方法
技术领域：
本发明涉及生物技术领域。具体而言，提供了利用PCR技术快速检测、鉴定鼠李糖 乳杆菌的引物对，适合于微生物肥料质检机构、菌种鉴定机构应用。
背景技术：
鼠李糖乳杆菌(LactcAacillus rhamnosus)是从健康人肠道分离出的一株乳杆 菌，是目前最受全球关注的益生菌之一，在食品、保健、医疗等领域应用广泛。研究人员将其 应用于微生物肥料领域，发现其在腐解有机物料、净化水体、促生及抑制病原菌等方面均具 有良好的使用效果。鉴于鼠李糖乳杆菌的多功能性，已有很多企业将其用于微生物肥料生产，鼠李糖 乳杆菌作为有效菌的微生物肥料产品日益增多；另一方面，在产品质量检测过程中发现，乳 杆菌种类多，表型相似，很难快速准确区分，而传统的检测方法主要是以形态特征和各项生 理生化方法为主，存在着检验周期长，操作繁琐，费用高，准确性差等缺点。因此，迫切需要 研究建立快速、准确、灵敏的检测新方法，以满足以鼠李糖乳杆菌为有效菌的微生物肥料产 品检测的准确性和时效性。PCR方法有着快速、准确和灵敏的特点，使用种特异引物对菌株进行特异PCR扩 增用于微生物快速鉴定技术已经广泛用于食品安全、临床医学等领域如对各种病毒和病 源体-乙肝病毒、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌等病源菌已建立了 PCR检测方法；在微生物 肥料领域也得到了应用，关大伟等人曾建立了的特异PCR法用于沼泽红假单胞菌的鉴定和 检测，曹凤明等人建立了一种鉴定微生物肥料中侧孢短芽孢杆菌的特异PCR方法，都取得 了良好的应用效果。这都表明了随着技术的发展，分子生物学技术将在微生物检测领域发 挥着越来越重要的作用。为将PCR技术更广泛应用于微生物肥料检测和菌种鉴定领域，本 发明人利用NCBI中I^rimer-BLAST(引物设计和特异性检验工具)，以Genbank数据库中 某个鼠李糖乳杆菌的gyrB基因(促旋酶基因)为目标模板序列设计出一对鼠李糖乳杆菌 (Lactobacillus rhamnosus)种特异性引物。并通过反复摸索实践建立了基于PCR技术的、 能够快速、准确、灵敏地检测微生物肥料中鼠李糖乳杆菌的方法。该方法适用于鼠李糖乳杆 菌的检测和鉴定。
发明内容
本发明内容的关键是提供用于检测、鉴定鼠李糖乳杆菌的特异引物对。另一内容 是提供利用这对引物对待测菌株进行特异PCR扩增鉴定鼠李糖乳杆菌的方法。具体而言，本发明利用已公布的鼠李糖乳杆菌gyrB核酸序列为目标模板序列， 利用NCBI中ft~imer-BLAST(引物设计和特异性检验工具)设计出-对鼠李糖乳杆菌 (Lactobacillusrhamnosus)种特异性引物。通过优化PCR反应中的镁离子浓度和退火温度 等条件来提高PCR方法的特异性，并根据优化结果建立了鼠李糖乳杆菌的特异PCR鉴定方 法，用于微生物肥料中鼠李糖乳杆菌的检测和鉴定。
本发明用于检测、鉴定鼠李糖乳杆菌的引物对序列为上游引物(F)5' -GACGCAGCCGGTTGACCCAA-3‘；下游引物(R)5' -GGCGGCAGTTGCCCCAGAAT-3‘。本发明用于鉴定鼠李糖乳杆菌的PCR方法为PCR反应体系10X buffer2. 0μ L
Mg2+(25mmol/L)1. 6μ L
dNTPS(10mmol/L)1. 6μ L
上游引物(20μπιΟ1/7L)0. 5μ L
下游引物OOymol/7L)0. 5μ L
Taq E (2. 5U/ μ L)0. 2μ L
模板DNALOyL
补足ddH20至20 μ L
PCR扩增参数-MV 3min94 "C60s
67 "C45 s L 30个循环72 0C60 s -J
72 0C IOmin。
图1为应用鼠李糖乳杆菌特异引物对鼠李糖乳杆菌标准菌株及乳杆菌属其它菌 株进行PCR的实验结果。其中，各泳道的具体说明如下
鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus ACCC10534T) 鼠李糖乳杆菌(L. rhamnosus CGMCC 1. 104) ^糖乳杆菌(L. rhamnosus CGMCC 1. 552) 鼠李糖乳杆菌(L. rhamnosus CGMCC 1. 26) 直物乳杆菌(L. ρlantarum CGMCC 1. 2437τ) 耆酸乳杆菌(L. acidophilus CGMCC 1. 1878τ)泳道1 :Ι
泳道2:1
泳道3:丨
泳道4 I
泳道5 I
泳道
泳道7 :P
泳道8 1. 1480)
泳道9 -J
泳道101. 2624τ)
泳道11
泳道12
泳道13
泳道14
泳道15
泳道16
德氏乳杆菌德氏亚种(L. deIbrueckii
1. 13)
；tis CGMCC 1. 2625τ) subsp.delbruekii CGMCC
1. 2435)
2626τ) 1. 2623)
1. 6)
泳道17 发酵乳杆菌(L. fermentium CGMCC 1. 1880τ)泳道18 玉米乳杆菌(L. zeae CICC20290)泳道19 戊糖乳杆菌(L. pentosus CICC20301)泳道20 高加索酸奶乳杆菌(L. kefiri CICC6080)泳道21 类植物乳杆菌(L. paraplantarum CICC 22192)图2为应用鼠李糖乳杆菌特异引物对鼠李糖乳杆菌标准菌株及微生物肥料常见 非乳杆菌属菌株进行PCR的实验结果。其中，各泳道的具体说明如下泳道1
泳道2
泳道3
泳道4
泳道5
泳道6
泳道7
泳道8
泳道9
泳道10
泳道1具体实施例方式下面结合附图对本发明具体实施方案进一步说明。实施例用鼠李糖乳杆菌特异性引物对标准菌株进行PCR检测。(1)材料测试菌下面表1所列标准菌株为测试菌。表 权利要求
1. 一种用于检测、鉴定鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)的特异性扩增引物 对，其特征在于，其序列为上游引物(F) 5' -GACGCAGCCGGTTGACCCAA-3‘； 下游引物(R) 5' -GGCGGCAGTTGCCCCAGAAT-3‘。
全文摘要
本发明公开了一对鼠李糖乳杆菌的特异引物，这对引物可以快速、准确地检测出鼠李糖乳杆菌。同时建立了鼠李糖乳杆菌的PCR鉴定方法，可根据扩增产物是否产生特异的鼠李糖乳杆菌条带(大小为376bp)，对微生物肥料中的鼠李糖乳杆菌进行检测和鉴定。
文档编号C12Q1/68GK102146458SQ20111002767
公开日2011年8月10日 申请日期2011年1月26日 优先权日2011年1月26日
发明者关大伟, 冯瑞华, 姜昕, 曹凤明, 李俊, 李力, 杨小红, 沈德龙, 葛一凡, 邴晓会, 陈慧君 申请人:中国农业科学院农业资源与农业区划研究所