专利名称：一种培育抗蚜虫转基因小麦的方法及专用载体的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种培育抗蚜虫转基因小麦的方法及专用载体。
背景技术：
小麦作为最重要的粮食作物之一，是人类蛋白质主要摄取来源；同时富含维生素 B、维生素 E、纤维及镁、磷等物质(Vasil I K, Anderson 0 D. Genetic engineering of wheat gluten. Trends in Plant Science, 1997,2(8) :292-297.)。据 1997 年召开的“世界食物和可持续发展农业”大会估计，世界小麦需求量将以每年1. 6%的速率增长，2020年将达到 7. 75 亿吨，比 1993 年的 5. 52 亿吨增长 40% (Rosengrant M W, Agcaoili-Sombilla M, Perez N D. Global food projections to 2020 amplications for investment. 1995, Washington, DC:IFPRI.)。届时我国小麦需求量约为1. 4 1. 5亿吨，比目前产量增加 4600 5600万吨，增长49 60% (甘吉生.2006-2020年《作物科技发展规划》研究报告.Il路明主编，2003中国作物学会学术年会文集.2003 :47-62.)。建国以来，我国已培育出小麦品种2000多个，实现品种更新换代6 8次，单产从43公斤/亩提高到285公斤/ 亩，为我国粮食的有效供给作出了巨大贡献(喻修道，徐兆师，陈明，李连城，马有志.2010. 小麦转基因技术研究及其应用.中国农业科学，43 (8) ,1539-1553.)。但近十多年来，小麦产量提高速度趋缓。鉴于目前耕地面积不断减少和人口的持续增长，病虫害及干旱等胁迫的日益严重，我国小麦生产依然面临很大挑战，转基因技术可能为新形势下的小麦有效供给提供保障。虫害一直是小麦生产的重要障碍之一，其防治好坏直接影响到小麦产量和品质。 据不完全统计，危害中国麦类作物的害虫超过110种，隶属于8目40科以上，主要包括麦蚜、吸浆虫、地下害虫、麦蜘蛛、黏虫、蓟马、麦叶蜂、麦茎蜂等10余类群(曹雅忠，李克斌，尹姣，张克诚.小麦主要害虫的发生动态及可持续控制的策略与实践.中国植保导刊，2006， 26(8) :11-14.)。其中以麦蚜为害最为严重，中国常年发生面积达1.5-2.0亿亩，造成小麦减产10%左右，大发生年份减产超过30% (武予清，李素娟，刘爱芝，李世功.小麦抗蚜育种研究进展.河南农业科学，2002( :19-20.)。近年来，由于全球C02浓度不断增加、耕作制度变化等使麦蚜的繁殖能力和适应性显著增强(Awmack C S,Harrington R. Elevated C02 affects the interactions between aphid pests and host plant flowering. Agricultural and Forest Entomology，2000，2 :57-61)，其危害面积和危害程度正在不断扩大并日趋严重。现有小麦种质资源中几乎找不到对麦蚜免疫的材料，高抗材料也很少，因此通过植物基因工程创造小麦抗蚜新种质是非常必要的。转基因技术与常规育种手段相结合进行品种选育，可以缩短育种周期，提高育种效率，是非常有效的育种新途径，中国农业科学院生物技术研究所郭三堆课题组开展的抗虫棉选育已充分证明了此途径的有效性(倪万潮， 张震林，郭三堆(1998).转基因抗虫棉的培育.中国农业科学，31,36-40.；郭三堆，崔洪志， 夏兰芹，武东亮，倪万潮，张震林，张保龙，徐英俊(1999).双价抗虫转基因棉花研究.中国农业科学，32 (3)，1-7.)。目前已有研究者将几个抗虫基因导入了小麦，如Vishnudasan等 (Vishnudasan D，Tripathi M N，Rao U，Khurana P.Assessment of nematode resistance in wheat transgenic plants expressing potato proteinase inhibitor (PIN2)gene. Transgenic Research，2005，14 (5) :665-675.)将马铃薯来源的丝氨酸蛋白酶抑制剂基因PIN2通过农杆菌介导法转入小麦，转基因小麦株系对禾谷孢囊线虫具有很高的抗性。Altpeter 等(Altpeter F，Diaz I，McAuslane H，Gaddour K，Carbonero P，Vasil I K. Increased insect resistance in transgenic wheat stably expressing trypsin inhibitor CMe. Molecular Breeding，1999，5 :53-63.)将大麦胰蛋白酶抑制基因 BTI-CMe 转入小麦，该基因对储存害虫麦蛾有较强的抑制作用，但对小麦叶面害虫作用不大。就抗蚜转基因小麦而言，研究最成功的是转外源凝集素基因，如人工合成及来源于雪花莲的凝集素基因(gna)，半夏凝集素基因(Pta)。凝集素是一类具有特异糖结合活性的蛋白，对蚜虫等同翅目害虫有很强的抗杀作用。Moger等(Stoger E, Williams S，Christou P， Down R E，Gatehouse J A. Expression of the insecticidal lectin from snowdrop (Galanthus nivalis agglutinin ；GNA)in transgenic wheat plants :effects on predation by the grain aphid Sitobion avenae. Molecular Breeding，1999，5 :65-73.) 将韧皮部特异启动子调控下的gna导入小麦，发现转基因株系对小麦长管蚜有抗性，目的基因表达量高于0.04%的植株可以显著降低蚜虫繁殖率，但不影响蚜虫存活率。Yu等(Yu Y, Wei Z.Increased oriental armyworm and aphid resistance in transgenic wheat stably expressing Bacillus thuringiensis(Bt) endotoxin and Pinellia ternate agglutinin (PTA). Plant Cell, Tissue and Organ Culture, 2008,94 (1) :33-44.)构建了 cry Ia和pta双元表达载体，通过农杆菌介导法转入小麦，对2个转基因小麦株系进行抗虫鉴定，蚜虫的存活率分别为对照的和78%，粘虫的存活率分别为对照的65%和73%。 但根据 Birch 等(Birch A N Ε, Geoghegan I Ε,Majerus M E N,Mcnicol J W, Hackett C, Gatehouse AMR, Gatehouse J A.Tri—trophic interaction involving pest aphids, predatory 2~spot ladybirds and transgenic potatoes expressing snowdrop lectin for aphid resistance. Molecular Breeding, 1999,5 :75-83.)的报道，二星瓢虫取食转 gna马铃薯上的蚜虫后，其产卵力、卵的生存力和寿命明显降低，因而，转gna植物对生态环境的影响引起了人们的关注。挖掘利用新的更加安全有效的抗蚜基因将是小麦抗虫转基因育种的重要课题(喻修道，徐兆师，陈明，李连城，马有志O010).小麦转基因技术研究及其应用·中国农业科学，43 (8) ,1539-1553.)。
发明内容
本发明的一个目的是提供一种培育抗蚜虫转基因小麦的方法。本发明所提供的培育抗蚜虫转基因小麦的方法，包括如下步骤将如下1)或2)所示基因表达盒导入出发小麦中，得到抗蚜虫转基因小麦1)由如下元件依次连接而成启动子、增强子、kozak片段、SEQ ID NO :3所示蛋白的编码基因、终止子；2)由如下元件依次连接而成启动子、增强子、kozak片段、水稻Rubisco小亚基叶绿体导肽的编码序列、SEQ ID NO :3所示蛋白的编码基因、终止子。
上述方法中，所述1)所示基因表达盒为SEQ ID NO 1中自5 ‘末端起第1_3拟8位核苷酸所示基因表达盒；上述方法中，所述2)所示基因表达盒为SEQ ID NO :2中自5'末端起第1-3981位核苷酸所示基因表达盒。上述方法中，所述基因表达盒是通过如下I或II所述重组载体导入所述出发小麦中的；I、为如下I-I或1-2所示I-I JfSEQ ID N0:1中自5'末端起第1_3拟8位核苷酸所示基因表达盒插入载体PG4AB的多克隆位点，得到的重组载体；1-2、将SEQ ID NO :2中自5'末端起第1-3981位核苷酸所示基因表达盒插入载体PG4AB的多克隆位点，得到的重组载体；II、为如下II-I或II-2所示:11-1、将SEQ ID NO :1中自5'末端起第1_3拟8位核苷酸所示基因表达盒插入载体pG Π UB中，得到的重组载体；11-2、将SEQ ID NO :2中自5'末端起第1-3981位核苷酸所示基因表达盒插入载体pG Π UB中，得到的重组载体。上述方法中，所述蚜虫为麦长管蚜(Sitobion avenae)；所述出发小麦为扬麦12 或科农199。本发明的另一个目的是提供一种基因表达盒。本发明所提供的基因表达盒，为如下1)或2)所示1)由如下元件依次连接而成启动子、增强子、kozak片段、SEQ ID NO :3所示蛋白的编码基因、终止子；2)由如下元件依次连接而成启动子、增强子、kozak片段、水稻Rubisco小亚基叶绿体导肽的编码基因、SEQ ID NO :3所示蛋白的编码基因、终止子。上述基因表达盒中，所述1)所示基因表达盒为SEQ ID NO :1中自5'末端起第 1-3828位核苷酸所示基因表达盒；上述基因表达盒中，所述2)所示基因表达盒为SEQ ID NO :2中自5'末端起第 1-3981位核苷酸所示基因表达盒。含有上述任一所述基因表达盒的重组载体也属于本发明的保护范围。含有上述任一所述基因表达盒的重组菌也属于本发明的保护范围。含有上述任一所述基因表达盒的重组细胞也属于本发明的保护范围。所述重组载体按照包括如下步骤的方法得到将上述任一所述基因表达盒插入载体pG4AB的多克隆位点，得到所述重组载体。所述重组载体还可按照包括如下步骤的方法得到将权利要求5或6所述基因表达盒插入载体PG Π UB中，得到所述重组载体。上述任一所述基因表达盒在培育抗蚜虫转基因小麦中的应用也属于本发明的保护范围。上述任一所述重组载体在培育抗蚜虫转基因小麦中的应用也属于本发明的保护范围。上述应用中，所述蚜虫为麦长管蚜(Sitobion avenae)；所述小麦为扬麦12或科农 199。本发明载体中含有表达盒rbcS-Ω序列-kozak-Mh β FS-poly (A)-Nos或表达盒 rbcS-Ω 序列-kozak-CTP-Mh β FS-poly(A)-Nos。其中，rbcS 为水稻核酮糖-1，5-二磷酸羧化酶小亚基基因(rbcS)启动子，CTP为水稻rbcS基因的叶绿体转导肽；为了能够有效的表达胞0 51和/或胞0 51+0 ，在目的基因前添加了 Ω和kozak序列，在目的基因后添加了 polyA。所述kozak序列是指包括Mh β FSl和/或Mh β FSl+CTP起始密码子在内的 ‘GCCATGG，，Ω序列在MhPFSl和/或Mh^FSl+CTP基因上游，中间间隔2bp。kozak序列和Ω序列能显著提高外源基因的表达量。实验证明，转入本发明载体的转基因小麦的抗虫性能明显高于野生型小麦，因此， 本发明载体在植物的遗传育种领域具有重要意义。
图1为基因枪法转基因小麦的表达载体构建流程。
图2为基因枪法转基因小麦的表达载体鉴定。
图3为农杆菌介导法转基因小麦表达载体的构建流程。
图4为农杆菌介导法转基因小麦表达载体的鉴定。
图5为转基因小麦的获得。
图6为转基因小麦植株的PCR检测。
图7为转基因小麦植株的Southern杂交。
图8为转基因小麦植株的蚜虫鉴定。
具体实施例方式下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。SEQ ID NO 1 所示(即 rbcS- Ω 序列-kozak-Mh β FS-poly (A) -Nos)，其中，自 SEQ ID NO :1的5'末端起，第1-1619位核苷酸为水稻Rubisco小亚基启动子rbcSPromotor, 第1621-1702位核苷酸为Ω序列，第1705-1711位核苷酸为kozak，第1708-3360位核苷酸为Mh β FS, H 3361-3575位核苷酸为poly (A)，第3576-38 位核苷酸为Nos。SEQ ID NO 2 所示(即 rbcS-Ω 序歹Ij -kozak-CTP-Mh β FS-poly (A)-Nos)，其中， 自SEQ ID N0:2的5'末端起，第1-1619位核苷酸为水稻Rubisco小亚基启动子rbcS Promotor，第1621-1702位核苷酸为Ω序列，第1705-1711位核苷酸为kozak，第1708-1854 位核苷酸为CTP，1856-1860位核苷酸为所加Spe I酶切位点，第1861-3513位核苷酸为 Mh^ FS，第3514-37 位核苷酸为poly (A)，第3729-3981位核苷酸为Nos。实施例1、Mh β FS基因的cDNA克隆制备亚洲薄荷(Mentha asiatica)购自北京汤河香草艺术庄园。平末端载体 pEASY-Blunt购自北京全式金生物技术有限公司，产品目录号为CBlOl。提取亚洲薄荷的总RNA，反转录成cDNA，以该cDNA为模板，用引物对Mh β FSFl/ Mh β FS Rl进行PCR扩增，得到的PCR产物即为Mh β FS基因。Mh^FS Fl :5，-ATGGCTACAAACGGCGTC-3，
Mh β FS Rl :5，-TCAAAAGACTATGGCATCAACA-3，。扩增体系如下ddH2031. 5 μ 1, 5 X PrimeSTAR Buffer (Mg2+plus) 10. 0μ 1, dNTPMixture (2. 5mM each) 4. O μ l,Mh^FS Fl(IOyM)L 5 μ l,Mh^FS Rl(IOyM)L 5 μ 1，反转录产物 1. O μ 1, PrimeSTAR HS DNA Polymerase (2. 5U/μ 1)0. 5 μ 1, Total50. Ομ 1。I^rimeSTAR高保真酶扩增得到的是平末端片段，因此回收的PCR产物可与平末端载体pEASY-Blunt连接，得到重组载体pEASY-Blunt/Mh β FS。将重组载体转入大肠杆菌Dffia感受态细胞，Amp抗性筛选培养，挑取阳性单克隆，将阳性单克隆进行液体培养， 提取质粒，进行测序，测得在载体pEASY-Blunt中插入了 SEQ ID NO :1的自5'末端起第 1708-3360位核苷酸所示基因，即为Mh β FS基因。证明构建的载体pEASY-Blunt/Mh β FS正确。实施例2、基因枪法转基因小麦一、基因枪法转基因小麦的表达载体构建载体Mh β FS l-pG4AB和载体Mh β FS l+CTP_pG4AB的构建流程如图1所示。( 一 )载体 Mh β FS l-pG4AB 的制备水稻品种为日本晴，购自中国农业科学院作物科学研究所国家农作物种质保存中心。A. 7jC稻 Rubisco 小亚基启动子(rbcS Promoter)制备提取水稻叶片DNA，用引物对rbcSP Fl/rbcSP Rl进行PCR扩增，得到Rubisco小亚基启云力子(rbcS Promoter) οrbcSP Fl :5’ -TCGGGTCGAGGTGAACTTTA-3，；rbcSP Rl :5’ -AGATGCACTGCTCTGCACAC-3，；将rbcS Promoter与T-easy载体连接，将重组载体进行测序验证，结果得到正确的重组载体，记作T-easy/rbcSP，该载体中含有SEQ ID NO 1的自5'末端起第1-1619位核苷酸所示基因，即为Rubisco小亚基基因启动子(rbcS Promoter)。Rubisco小亚基基因启动子(rbcS Promoter)的电泳图如图2A所示。B. R-pG4AB载体构建用水稻rbcS Promoter置换pG4AB上的!35S CaMV启动子。pG4AB为表达载体提供Ω序列、kozak序列、poly (A)和Nos序列。pG4AB在文献 “毛立群，郭三堆.1996. Ω序列和3’poly(A)序列长度与基因表达效率的关系.植物学报， 1998,40(7) 1-3"中公开过，公众可从中国农业科学院作物科学研究所获得。具体步骤如下1) pG4AB载体用BamH I酶切，酶切后纯化；2)用Klenow Fragment填平末端，具体步骤反应体系如下Reaction Buffer 5μ 1dNTP (2. 5mM)2 μ 1Klenow Fragment 1 μ 1BamH I酶切后的质粒 42 μ 137°C孵育 20min，70°C孵育 IOmin 使酶失活。3)以重组载体T-easy/rbcSP为模板，用引物对rbcSP F2/rbcSP R2进行PCR扩增；
rbcSP F2 5' -GGGaagcttTCGGGTCGAGGTGAACTTTA-3' (5，端加酶切位点 Hind III)rbcSP R2 :5’ -AGATGCACTGCTCTGCACAC-3，。4)将用BamH I酶切后填平末端的pG4AB载体用Hind III半酶切(半酶切条件 370C IOmin)，回收载体大片段；将步骤3)的PCR扩增产物用Hind III酶切，回收酶切后基因片段；将回收的载体大片段与酶切后基因片段连接，得到重组载体，记作R-PG4AB ；将重组载体进行测序验证，结果在载体PG4AB的Hind III和BamH I之间插入了 SEQ ID NO=I 的自5'末端起第1-1620位核苷酸所示基因，证明该重组载体正确，记作R-pG4AB载体。用水稻rbcS置换了 pG4AB上的35S CaMV启动子。酶切验证将重组载体R-pG4AB用Hind III酶进行酶切验证，以pG4AB为对照 (CK)；结果如图2C所示，重组载体R-pG4AB得到3. 1Kb和3. 8Kb的片段，对照组得到3. 1Kb 和2. 7Kb的片段。C. Mh β FSl-pG4AB 构建以重组载体pEASY-Blunt/MhβFS为模板，用引物对MhβFS F6/Mh β FS R6进行 PCR扩增，得到PCR扩增产物，将PCR扩增产物用Nsi I和Ml I双酶切，回收酶切后的PCR 产物；将R-PG4AB载体用I^st I和B10 I双酶切，回收载体大片段；将回收酶切后的PCR产物与回收的载体大片段连接，得到重组载体，记作Mh β FSl-pG4AB ；将重组载体用引物对Mh β FS F6/Mh β FS R6进行PCR验证，扩增结果如图2Ε所示。MhPFS F6 :5，-CCAatgcatATGGCTACAAACGGCGTC-3，(加酶切位点 Nsi I)Mh^FS R6 :5，-GCGCgtcgacTCAAAAGACTATGGCATCAACA-3，(加酶切位点 Sal I)。将Mh β FSl-pG4AB进行测序验证，结果在载体pG4AB的两个Hind III酶切位点之间的基因片段如 SEQ ID N0:1(即 rbcS-Ω 序列-kozak-Mh β FS-poly (A)-Nos)所示，SEQ ID NO :1中，第1-1619位核苷酸为rbcS Promotor，第1621-1702位核苷酸为Ω序列，第 1705-1711位核苷酸为kozak，第1708-3360位核苷酸为Mhi3 FS，第3361-3575位核苷酸为 poly (A)，第；3576-3拟8位核苷酸为Nos。( 二 )载体 Mh β FS l+CTP-pG4AB 的制备1、提取水稻叶片DNA，用引物对rbcSC Fl/rbcSC Rl进行PCR扩增，得到水稻 Rubisco小亚基叶绿体转导肽(CTP)的编码基因。rbcSC Fl :5，-ATGGCCCCCTCCGTGATGG-3，rbcSC Rl :5’ -CTGCATGCACCTGATCCTGC-3’将水稻Rubisco小亚基叶绿体转导肽(CTP)的编码基因与pEASY-Blunt载体连接，将重组载体进行测序验证，结果得到正确的重组载体，记作pEASY-Blimt/CTP，该载体中含有SEQ ID NO 2中第1708-18M位核苷酸所示，即为水稻Rubisco小亚基叶绿体转导肽 (CTP)的序列。CTP的凝胶电泳图如图2B所示。2、Mh β FSl+CTP 表达盒扩增1)以 pEASY-Blunt/CTP 为模板，用引物对rbcSC F2/rbcSC R2 进行 PCR扩增，用高保真酶扩增，得到CTPl ；rbcSC F2 :5’ -ATGGCCCCCTCCGTGATGG-3，rbcSC R2 :5，-AGactagtCTGCATGCACCTGATCCTGC-3'(加上 Spe I 酶切位点)2)以重组载体pEASY-Blunt/MhβFS为模板，用引物对MhβFS F5/Mh β FS R5进行
9PCR扩增，用高保真酶扩增，得到Mh β FSl ；MhP FS F5 :5，-CAactagtATGGCTACAAACGGCGTC-3，(加上 Spe I 酶切位点)Mh^FS R5 :5，-TCAAAAGACTATGGCATCAACA-3，3)将CTPl用Spe I酶切，回收酶切后的CTPl ；将Mh β FSl用Spe I酶切，回收酶切后的Mh β FSl ；将酶切后的CTPl和酶切后的Mh β FSl连接，得到Mh β FSl和CTPl的连接产物；4)以Mh β FSl和CTPl的连接产物为模板，用引物对Mh β FS+CTPFl/Mh β FS+CTPR1 进行扩增Mh β FS+CTP，得到的PCR扩增产物即为Mh β FSl+CTP融合片段。Mh β FS+CTP Fl :5-CCCatgcatATGGCCCCCTCCGTGATGG_3 (加酶切位点 Nsi I)Mh β FS+CTP Rl :5-GCGCgtcgacTCAAAAGACTATGGCATCAACAAAGAG_3 (力口酶切位点 Sail)。CTP-Mh β FS 1的凝胶电泳图如图2D所示。3、Mh β FS l+CTP_pG4AB 构建将Mhi3FSl+CTP融合片段用Nsi I和Ml I双酶切，回收酶切后的PCR产物；将 R-PG4AB载体用I^st I和B10 I双酶切，回收载体大片段；将回收酶切后的PCR产物与回收的载体大片段连接，得到重组载体，记作Mh β FS l+CTP-pG4AB ；将重组载体用引物对Mh β FS+CTP Fl/Mh β FS+CTP Rl进行PCR验证，扩增结果如图2E所示。Mh^FS l+CTP-pG4AB进行测序验证，结果在载体pG4AB的Hind III和Hind III之间的基因片段如SEQ ID NO 2所示(即rbcS-Ω序歹 Ij-kozak-CTP_Mh0FS-poly(A)-Nos)，其中，自 SEQ ID N0:2 的 5'末端起，第 1-1619 位核苷酸为rbcS，第1621-1702位核苷酸为Ω序列，第1705-1711位核苷酸为kozak，第 1708-1854位核苷酸为CTP，1855-1860位核苷酸为所加Spe I酶切位点，第1861-3513位核苷酸为Mhi3 FS，第3514-37 位核苷酸为poly (A)，第3729-3981位核苷酸为Nos。二、小麦基因枪介导的遗传转化扬麦12在文献“刘永伟，徐兆师，杜丽璞，徐惠君，李连城，马有志，陈明.病毒复制酶基因NibS和ERF转录因子W17基因枪法共转化小麦.作物学报，2007，33(9) 1548-1552. ”中公开过，公众可从中国农业科学院作物科学研究所获得。pAHC20在文献“徐惠君，庞俊兰，叶兴国，杜丽璞，李连城，辛志勇，马有志，陈剑平， 陈炯，程顺和，吴宏亚.基因枪介导法向小麦导入黄花叶病毒复制酶基因的研究.作物学报，2001，27(6) :688-693”中公开过，公众可从中国农业科学院作物科学研究所获得。(一)方法A.外植体和靶材料取授粉后14天左右的扬麦12幼胚为外植体，接种于诱导培养基(MS+lmg/L VB^lSOmg/L ASP+2mg/L 2，4_D)，22_25°C条件下暗培养3-7天，得到幼胚愈伤组织。B.基因枪法共转化及转化体筛选采用BIO-RAD 公司的 PDS-1000/He 基因枪进行轰击(PsillOO，27. 5cm Hg 柱)，金粉、质粒(Mh β FSl+CTP-R-pG4AB和pAHC20)浓度分别为45 μ g/枪和1 μ g/枪，轰击后的愈伤组织转移到新的诱导培养基上培养2-3周，培养条件为22-25°C、黑暗。
再生、筛选和壮苗等方法除培养基中不含150mg/lTimentin外，其余均与下面农杆菌转化中所述相同。(二)鉴定1、Tc^T1代转基因小麦的PCR检测鉴定引物为MhiiFS-J Fl/Mh β FS-J Rl0预期产物长度为817bp。Mh β FS-J F1 5，-GCTCTTCGTTTCCGTTTGCTC-3，Mh β FS-J Rl 5，-GCTCCTCATTAAATGCCCTTGC-3，2、T2代转基因小麦PCR检测检测采用的是巢式PCR，先用Mh β FS-J Fl/Mh β FS-J Rl扩增，将PCR产物稀释100 倍，取Ιμ 为模板，用MhiiFS-J F2/Mhi3FS-J R2进行第二轮扩增，第二轮PCR扩增的预期产物长度为329bp ；Mh β FS-J F2 5，-CGAGTCGTGGAGGCTTATGT-3，Mh β FS-J R2 5，-GCCCTTGCCAGTTGTTTCA-3，3、T0代转基因小麦的Southern杂交提取Ttl代转基因小麦株系的DNA，纯化后用B10 I酶切，转膜、标记探针和杂交。以载体Mh^FS 1164々8为模板，利用引物胞0 5-了 F2和Mh β FS-J R2扩增，PCR 产物即为探针；探针标记使用TaKaRa Random primer DNA Labeling Kit。本实验基因枪法共获得547棵再生植株，为了检测目标基因MhiiFSl或Mhi3FSl+CTP是否转入到小麦基因组中，根据 MhiiFSl基因序列设计引物，以 ；、T1再生植株叶片的基因组DNA为模板进行PCR检测 (图6A为Ttl代检测结果；图6B为T1代检测结果)，阳性植株中扩增出了一特异性片段，在 SOObp左右，符合预期大小(预期产物长度为817bp)，而对照植株(小麦受体品种，CK)中没有扩增出相应片段；Ttl植株共检测到12个阳性株系，11、44、50、215、249、274、538等7个株系为Mh β FSl基因枪法获得的转基因小麦株系；C321、C322、C360、C428、C491等5个为 Mhi3FSl+CTP基因枪法获得的转基因小麦株系；将部分T1转基因植株种于温室加代，获得T2 转基因植株，T2转基因植株检测采用的是巢式PCR扩增，两轮PCR之后扩增出330bp左右的特异性片段，阴性对照植株(小麦受体品种)中没有扩增出相应片段(图6C)，随后获得转基因小麦T3种子。Southern杂交显示目的基因已经整合到小麦基因组中。实施例2、农杆菌法转基因小麦载体Mh β FSl-pG Π UB和载体Mh β FSl+CTP-pG Π UB的构建流程如图3所示。载体pG Π UB 在文献"Hellens RP, Edwards EA, Leyland NR, Bean S, Mul 1 ineauxPM. 2000. pGreen -.a versatile and flexible binary Ti vector for Agrobacterium-mediated plant transformation. Plant Molecular Biology 42, 819-832”中公开过，公众可从中国农业科学院作物科学研究所获得。pG Π UB提供表达载体由W^iqutin启动子调控的Bar盒子。pENTR/D-TOPO 载体购自 hvitrogen 公司，产品目录号为 K2420-20。一、农杆菌法转基因小麦表达载体的构建本载体构建过程中，在正向引物的5’端加上CACC，扩增得到整个表达盒片段，这样片段的5’端与入门载体pENTR/D-TOPO的突出末端GTGG序列互补，在拓扑异构酶I的作用下使基因以正确的方向插入到pENTR/D-TOPO载体的两个attL重组位点之间，形成带有两个attL重组位点的入门克隆；提取构建正确的入门克隆质粒，BspH I酶切后，按比例与目的载体PG Π UB混合，在LR Clonase Π Enzyme Mix的作用下，入门克隆载体的两个 attL重组位点与pG Π UB的两个attR位点进行LR位点特异性重组反应，得到目的重组载体。(一)Mh3FSl-pGTI UB 构建1、入门克隆载体构建以重组质粒Mh β FS l-pG4AB为模板，用引物对V_G F/V-G R进行PCR扩增。扩增片段的凝胶电泳如图4中A泳道1所示。V-G F:5-CACCTCGGGTCGAGGTGAACTTTA-3V-G R:5-GATCTAGTAACATAGATGACACCGC-3。pENTR/D-TOPO 载体 1 μ 1，Salt Solution 1 μ 1，PCR 扩增产物 X μ 1，ddH20 补充至 Ij 6 μ 10将PCR扩增产物与pENTR/D-TOPO载体按照摩尔比1 1比例混合，室温下连接 5min，将连接产物热激转化大肠杆菌DH5ci后涂布在含有Kan (100mg/L)的平板上筛选，挑取单菌落进行PCR鉴定，提取质粒并测序，将测序正确的重组载体即为入门克隆载体，记作 Mh β FSl-pENTRTM/D-T0P0。2、Mh β FS 1-pG Π UB 载体构建由于入门克隆载体Mh β FSl-pENTRTM/D-TOP和pG Π UB载体均为Kan抗性，故在重组反应前先将入门克隆载体用BspH I酶切，反应体系如下10XNEB Buffer 4 10μ 1, BspH I 3μ l，Mh3FSl-pENTRTM/D-T0P0 入门克隆载体 50μ l，ddH20 37 μ 1, Total 100 μ L·37°C酶切过夜，用1 %琼脂糖凝胶电泳检测酶切情况，结果如图4中B泳道2所示， 并切胶回收目的片断。参照 Invitrogen 公司 Gateway LR Clonase Π Enzyme Mix 说明书，在 0. 5ml EP 管中依次加入如下组分进行LR重组反应酶切后的入门克隆载体2 μ 1，pG Π UB 2 μ 1，TE buffer(ρΗ 8. 0)4 μ 1, LR Clonase Π Enzyme Mix 2 μ 1。短暂混勻后25°C孵育过夜，待反应完全后加入1 μ 1蛋白酶K于37°C IOmin终止反应。取2 μ 1反应液热激转化大肠杆菌DH5 α，菌液涂布在含有Kan (100mg/l)的平板上筛选，挑取单菌落进行PCR鉴定，提取质粒并测序。测序结果表明，将SEQ IDNO 1中第1_3拟8 所示 DNA 片段(rbcS- Ω 序列-kozak-Mh β FS-poly (A) -Nos 片段)插在了 pG Π UB 的 attRl 和attR2之间，表明得到的重组载体正确，记作Mh β FSl-pG Π UB0Mh β FSl-pG Π UB的菌液PCR鉴定结果如图4中C所示。(泳道1_4为载体pG Π UB 引物扩增结果，泳道5-8为Mh β FSl鉴定结果)。鉴定载体引物为pG Π UB F/pG Π UB R0 鉴定 Mh β FSl 引物为 Mh β FS F3/Mh β FS R3。pG Π UB F 5 ‘ - G A T T C C T T T C C C A C C G C T C C T - 3 ‘ ； pG Π UB R 5’ -GGCGTTGCGTGCCTTCCAG-3’。Mh β FS F3 5-ATGGCTACAAACGGCGTC-3Mh β FS R3 5-TCAAAAGACTATGGCATCAACA-3。
(二)Mh β FSl+CTP-pG Π UB 构建1、入门克隆载体构建参照 Invitrogen 公司 Gateway pENTR Directional TOPO Cloning Kits 说明书对引物的要求，设计了引物对V-G F/V-G R0以重组质粒Mhi3FS l+CTP_pG4AB为模板，用引物对V-G F/V-G R进行PCR扩增。扩增片段的凝胶电泳如图4中A泳道2所示。V-G F:5-CACCTCGGGTCGAGGTGAACTTTA-3V-G R:5-GATCTAGTAACATAGATGACACCGC-3。将PCR扩增产物与pENTR/D-TOPO载体按照摩尔比1 1比例混合，室温下连接 5min，将连接产物热激转化大肠杆菌DH5ci后涂布在含有Kan (100mg/L)的平板上筛选，挑取单菌落进行PCR鉴定，提取质粒并测序，将测序正确的重组载体即为入门克隆载体，记作 Mh β FSl+CTP-pENTRTM/D-T0P0。2、Mh β FSl+CTP-pG Π UB 载体构建由于入门克隆载体Mh β FSl+CTP-pENTRTM/D-TOP和pG Π UB载体均为Kan抗性，故在重组反应前先将入门克隆载体用BspH I酶切，反应体系如下10XNEB Buffer 410 μ 1， BspH I 3 μ 1，Mh β FS1 +CTP-pENTRTM/D-T0P0 入门克隆载体 50 μ 1，ddH20 37 μ 1, Total 100 μ 1。37°C酶切过夜，用1 %琼脂糖凝胶电泳检测酶切情况，结果如图4中B泳道2所示， 并切胶回收目的片断。参照 Invitrogen 公司 Gateway LR Clonase Π Enzyme Mix 说明书，在 0. 5ml EP 管中依次加入如下组分进行LR重组反应酶切后的入门克隆载体2 μ 1，pG Π UB 2 μ 1，TE buffer(ρΗ 8. 0)4 μ 1, LR Clonase Π Enzyme Mix 2 μ 1。短暂混勻后25°C孵育过夜，待反应完全后加入1 μ 1蛋白酶K于37°C IOmin终止反应。取2 μ 1反应液热激转化大肠杆菌DH5 α，菌液涂布在含有Kan (100mg/l)的平板上筛选，挑取单菌落进行PCR鉴定，提取质粒并测序。测序结果表明，将SEQ IDNO 2中第1-3981 所示 DNA 片段(rbcS- Ω 序列-kozak-CTP-Mh β FSl-poly (A) -Nos 片段)插在了 pG Π UB 的 attRl和attR2之间，表明得到的重组载体正确，记作Mh β FSl+CTP-pG Π UB0MhβFSl+CTP-pGIIUB的菌液PCR鉴定结果如图4中D所示。(泳道1_4为pGTIUB 载体引物扩增结果，泳道5-8为CTP-Mh β FSl鉴定结果)。鉴定载体引物为pGTIUB F/pG Π UB R0 鉴定 CTP-Mh β FSl 引物为 Mh β FS+CTP F2/Mh β FS+CTP R2。pG Π UB F 5 ‘ - G A T T C C T T T C C C A C C G C T C C T - 3 ‘ ； pG Π UB R 5’ -GGCGTTGCGTGCCTTCCAG-3’。Mh β FS+CTP F2 5-ATGGCCCCCTCCGTGATGG-3Mh β FS+CTP R2 5-TCAAAAGACTATGGCATCAACA-3。二、农杆菌转化科农199在文献“李俊明，张相岐，张爱民，王志国，安调过，纪军，王静.高产广适小麦新品种-科农199.麦类作物学报，2007，39 O) :368_368”中公开过，公众可从国家种质资源库获得，也可中国农业科学院作物科学研究所获得。根癌农杆菌菌株AGLl 在文献“Lazo GR, Stein PA, Ludwig RA. 1991. A DNAtransformation-competent Arabidopsis genomic library in Agrobacterium. Biotechnology9,963-967.，，中公开过，公众可从中国农业科学院作物科学研究所获得。载体pAL154 和载体 pGreen-UB-UG 在文献“Hellens RP, Edwards EA, Leyland NR, Bean S, Mullineaux PM. Pgreen :A versatile and flexible binary Ti vector for Agrobacterium-mediated plant transformation. Plant Mol Biol 2000，42 :819_832。”巾公开过，公众可从中国农业科学院作物科学研究所获得。pAL154和pGreen-UB-UG，是由JIC基于pSoup/pGreen双元载体系统发展而来。 pALIM作为辅助质粒，除具有促进pGreen复制和扩增功能外，还含有额外的15-1Λ的 Komari片段，大大增强和提高了菌株侵染和转移Ti质粒的效率。(一)方法该转化方法及所用的培养基等与中国专利(申请号200810116723. 2，
发明者喻修道, 夏兰琴, 张保明, 马有志 申请人:中国农业科学院作物科学研究所