专利名称：一种凡纳滨对虾LvE165微卫星DNA标记的检测方法
技术领域：
本发明属于分子生物学DNA标记技术与应用领域，具体涉及海洋经济动物对虾属 凡纳滨对虾ilitopenaeus vannamei) LvE165微卫星DNA标记的检测方法。
背景技术：
凡纳滨对虾QJtopenaeus vannamei)是一种广盐、广温性虾类。该对虾原产于 西半球，主要分布于中南美洲从墨西哥西南沿海，经危地马拉、萨尔瓦多、洪都拉斯、尼加拉 瓜、哥斯达黎加、巴拿马、哥伦比亚、厄瓜多尔至秘鲁西部的太平洋沿岸。凡纳滨对虾是全球 主要养殖对虾品种之一，目前也是我国最主要的养殖对虾品种，其养殖区十分广泛，不仅包 括北自辽宁南至海南的大部分沿海地区，还包括广大内陆淡水养殖区，适宜养殖面积占全 国虾类养殖面积的95%以上。我国凡纳滨对虾的养殖产量超过100万吨(包括海水和淡水 养殖)，目前占到养殖对虾总产量的85%以上。随着对凡纳滨对虾在分子生物学领域的研究工作不断深入，对凡纳滨对虾分子标 记的需求也越来越多。遗传改良或品种培育是凡纳滨对虾养殖稳定发展的动力，许多研究 表明，遗传变异水平与生物的生长速度、抗病能力等生产性状密切相关，因此，开发凡纳滨 对虾的分子遗传标记，检测凡纳滨对虾遗传多样性、研究其遗传结构，进而实施分子标记辅 助选育，对于凡纳滨对虾的育种和增养殖都具有十分重要的意义。 EST是指通过从cDNA文库中随机挑取的克隆，进行大规模测序所获得的cDNA的 5’或3’端序列，长度一般为150-500 bp。近年来大量快速增长的EST数据已成为SSR的 重要来源，约有1%_ 5%的EST含有SSR。与gSSR (基因组微卫星)标记相比，从EST序列中 获得EST-SSR标记更经济，更有特点；由于EST是功能基因的表达片段，在其中发现的微卫 星标记会直接和功能基因相关，并有可能和一些生产性状相关联，这些特点对遗传图谱构 建以及标记辅助选育都有很高的应用价值；同时，由于不同物种间基因共显性和保守性，从 一种物种中开发的EST-SSR有可能同时用于近缘的其他物种研究，从而为比较基因组学、 同源基因克隆提供新的途径。因此，EST-SSR已被用于构建遗传图谱、分离与鉴定新基因、 基因表达差异研究、比较基因组研究和制备DNA芯片等方面。利用EST微卫星标记，可把凡 纳滨对虾重要经济性状与之关联起来，达到分子标记辅助育种的目的，并可进一步研究凡 纳滨对虾功能基因。目前关于凡纳滨对虾EST微卫星标记的研究还很少。
发明内容
本发明的目的是为了简便快速的鉴定凡纳滨对虾LvE165遗传标记基因座位的遗 传变异图谱，丰富现有的凡纳滨对虾微卫星标记，寻找更多的多态性好、稳定性高的微卫星 标记，提供了一种凡纳滨对虾LvE165微卫星DNA标记的检测方法。本发明是通过以下方案实现的一种凡纳滨对虾LvE165微卫星特异性DNA引物， 其特征在于其核苷酸序列分别如SEQ ID NO 1和SEQ ID NO :2所示。一种利用上述DNA引物的PCR反应体系，其特征在于所述的PCR体系为10XPCR缓冲液:2· O μ 1 ；IOmM 的 SEQ ID NO 1 和 SEQ ID NO 2 引物各:0· 2-0. 5 μ 1 ；IOmM dNTP 0. 4-5 μ 1 ；ddH20 :14· 6-15. 9 μ 1 ；5U/y 1 Taq 酶0· 2-0. 3 μ 1 ； IOng 凡纳滨对虾 DNA 1-1. 5 μ 1。一种凡纳 滨对虾LvE165微卫星DNA标记的检测方法，其特征在于包括以下步 骤先提取凡纳滨对虾基因组并稀释备用，再利用凡纳滨对虾LvE165微卫星DNA核心序列 (ATT)n，其中n=16-19，在其序列两端设计特异性引物，其核苷酸序列如SEQ ID N0:l_2所 示；然后使用该引物对凡纳滨对虾不同群体或者群体内个体的基因组DNA进行PCR扩增，对 PCR产物进行变性聚丙烯酰胺凝胶检测。利用产物出现的条带银染显色后进行分析，确定每 个个体的基因型，从而获得凡纳滨对虾在LvE165遗传标记基因座位的多态性遗传变异图 谱(如图1所示)。LvE165微卫星DNA序列的特异性引物核苷酸序列分别为正链SEQ ID NO 1 5，-GCTGGTTGTGGACTCTAA-3，，负链 SEQ ID NO 2 :5，-CCTTGCATTGATCTGTCA_3，，退火温度为 50 "C。其PCR反应加样参数正反向引物各为0. 2 uM, 0.2 mM dNTP, IXPCR Buffer, 1.5-2.5 mM Mg2+，0. 6 U Taq酶，50-100 ng DNA模板，用双蒸水补足到20ul ；使用该引物 的时设置PCR程序参数为94°C预变性2分钟；然后94°C变性30-40秒，根据不同的退火温 度退火30秒，72°C延伸30秒-1分钟，重复此反应35个循环。PCR产物的检测基因组DNA模板进行PCR扩增，其产物在聚丙烯酰胺凝胶上电 泳，利用长度差异为50 bp的DNA ladder及PBR322 Marker (上海生工)作为分子量标记， 扩增产物用6%-8%变性聚丙烯酰胺凝胶电泳-银染系统进行检测，电压是8V/cm PCR产 物中加上变性Buffer之后95°C变性5分钟，之后立刻置于冰上降温，使用微量进样器上样 5ul，85 W恒功率电泳至溴酚兰带至胶板的底端，约120分钟，用终浓度0.5 μ g/ml的EB即 溴化乙锭染色30分钟，干燥放在UTA-2100XL型号扫描仪中扫描保存图片，分析多态性，确 定各个个体的基因型，并进一步得到LvE165遗传标记基因座位的多态性图谱。本发明适用于凡纳滨对虾种质资源和遗传多样性分析，家系鉴定，分子群体遗传 学，遗传图谱的构建，重要经济性状的定位，功能基因的研究，进一步用于辅助凡纳滨对虾 分子遗传育种和养殖。现有的凡纳滨对虾微卫星标记还不够丰富，建立凡纳滨对虾遗传连锁图谱，物理 图谱，以及QTL定位需要更多的多态性好、稳定性高的微卫星标记。与现有技术相比，本发 明具有以下优点
(1)本发明可以简便快速的鉴定凡纳滨对虾LvE165微卫星遗传标记基因座位的遗传 变异图谱，方法简便，所得结果可直观的检测出凡纳滨对虾每个个体的基因型。(2)本发明的核心是LvE165微卫星DNA标记的特异性引物，其核苷酸序列为正 链 5，-GCTGGTTGTGGACTCTAA-3，，负链 5，-CCTTGCATTGATCTGTCA-3，，退火温度为 50°C，可在 凡纳滨对虾种群检测中呈现高度遗传变异的多态性。(3)本发明主要应用于凡纳滨对虾种质资源和遗传多样性分析，家系鉴定，分子群 体遗传学，遗传图谱的构建，重要经济性状的定位，功能基因的研究。
图1本发明的LvE165微卫星DNA标记在，24尾凡纳滨对虾个体中的基因型图谱。
具体实施例方式实施例1
1.提取凡纳滨对虾的DNA
本实验所取的凡纳滨对虾材料是随机提取24个DNA样品，从冷冻的肌肉组织中提取 DNA。剪取IOOmg肌肉组织，剪碎后置于0.7 ml的抽提缓冲液(6 M Urea (尿素)，10 mM Tris-HCI. 125 mM NaCI (氯化钠)，1% SDS (十二烷基肌硫酸钠)，10 mM EDTA (乙二胺四 乙酸)，pH=7.5)中，加入终浓度为0.1 mg/ml的蛋白酶K (20 mg/ml)，37°C消化一夜。用 苯酚氯仿(1:1)抽提反应物三次，提取上清液用等体积的氯仿抽提一次。取上清液用异 丙醇进行沉淀，然后溶解于 500 ΙμΙΧΤΕ (10 mM Tris. HCI, 1 mM EDTA，pH =8.0)中。用 RNase (20 μ g/ml) 37°C处理DNA样品1小时，然后用苯酚/氯仿提取液进行DNA纯化 用苯酚/氯仿抽提一次、氯仿抽提一次。然后提取上清液加入两倍体积的无水乙醇和十分 之一倍体积的3M NaAc (醋酸钠)，摇勻之后12000rpm离心收集DNA，再用70%乙醇洗涤 两次，待乙醇完全蒸发之后，加入50μ 1 IXTE于一 20°C保存待用。2. PCR 扩增
PCR的反应条件是50ng凡纳滨对虾基因组DNA，引物SEQ ID NO 1和SEQ ID NO 2 各 1 μ M、0. 2mMdNTP、lXPCR buffer、1. 5mM 的Mg2 +、0. 6 UTaq酶。PCR 的反应程序是94°C 变性10分钟之后进入循环，94°C变性30秒，Tm 50°C退火30秒，72°C延伸1分钟，反应进行 35个循环。4°C保存PCR产物。3.电泳检测
PCR扩增产物用8%的聚丙烯酰胺凝胶电泳，电压是8V/cm，电泳完毕之后用EB (终浓 度是0. 5 μ g/ml)染色30分钟，在凝胶成像系统下观察记录成像结果(如图1所示)。试验结果说明本标记可以用于群体之间的检测，并且显示多态性，是有价值的微 卫星标记。实施例2
微卫星位点的筛选及其多态标记的确定 1.微卫星位点 的来源和微卫星序列的筛选
从NCBI (http://www. ncbi. nlm. nih. gov)数据库搜集并下载(以FASTA格式)已有的 EST序列，利用SSRhunter软件逐一查找分析所得的5736个序列，对2 — 6个碱基重复单 元、重复次数大于5的微卫星DNA序列进行分离。采用软件DNAstar中的SeqMan对含有微 卫星的ESTs进行聚类分析，选取聚类在不同contig中的ESTs设计引物。2.微卫星标记引物的设计
在微卫星重复的侧翼序列利用引物设计软件Primer Premier 5. 0和DNAstar中的 Primerselect设计引物；引物要求满足以下条件(1)引物长度为17 — 25bp ;(2)GC含量 要求大于40%; (3)退火温度大于40°C; (4)预期的PCR产物长度为100 — 300bp。设计的 引物为正链 5，-GCTGGTTGTGGACTCTAA-3，，负链 5’ -CCTTGCATTGATCTGTCA-3，。3.引物的优化扩增反应分别用MJ-IOO和BioRad-200 PCR仪，PCR程序为94°C变性2分钟之后进入 循环，94°C变性30或者40秒，45°C退火30秒，72°C延伸30秒到1分钟不等，反应进行35个 循环。反应体系为20 μ 1 其中含有正反向引物0.2 μ M、0.2mMdNTP (四种脱氧核苷酸的混 合物)、1 XPCR buffer,2. OmM的Mg2 +、Taq酶，模板量分别是lOOng。模板是随机的5个凡 纳滨对虾样本。扩增得到的产物用8%的聚丙烯酰胺凝胶电泳一检测，选取无或杂带少、特 异性产物较高的PCR对应的温度作为最佳的退火温度，对应的Mg2 +作为最佳Mg2 +的浓度。10XPCR buffer 含有 100 mM Tris-HCL (三羟基甲基氨基甲烷一盐酸 ρΗ9· 0)，500 mM KCL (氯化钾 ρΗ9· 0)，1% Triton X-100 (曲拉通 X-100)
4.微卫星位点的确定
根据上面筛选出来的Tm值45°C和Mg2+选取20个个体检测这些微卫星标记的多态性。 PCR的反应程序是94°C变性10分钟之后进入循环，94°C变性30秒，45°C退火30秒，72°C延 伸30秒，反应进行35个循环。反应体系为20 μ 1 其中含有正反向引物0.2 μ M、0.2mM、 IXPCR buffer、1. 2mM的Mg2 +、Taq酶，模板量分别是50ng。PCR扩增产物用8%的聚丙烯 酰胺电泳，电压是1 一 8V/cm，电泳完毕之后用EB (溴化乙锭，终浓度0. 5 μ g/ml)染色30 分钟，然后在凝胶成像系统下观察记录成像结果，分析确定多态性，最后筛选出1个位点作 为凡纳滨对虾微卫星标记，标记的具体信息如表一。表一.开发1 条凡纳滨对虾(Apostichopus japonicus)的 EST-SSR 标记
权利要求
1.一种凡纳滨对虾LVE165微卫星特异性DNA引物，其特征在于其核苷酸序列分别如 SEQ ID NO 1 和 SEQ ID NO 2 所示。
2.一种利用如权利要求1所述DNA弓丨物的PCR反应体系，其特征在于所述的PCR体系 为10 X PCR 缓冲液2. 0μ 1 ； IOmM 的 SEQ ID NO 1 和 SEQ ID NO 2 引物各0. 2-0. 5 μ 1 ； IOmM dNTP 0. 4-5 μ 1 ；ddH20 :14. 6-15. 9 μ 1 ；5U/y 1 Taq酶0. 2-0. 3 μ 1 ； IOng凡纳滨对虫下 DNA :1-1. 5 μ 1。
3.一种凡纳滨对虾LvE165微卫星DNA标记的检测方法，其特征在于包括以下步骤先 提取凡纳滨对虾基因组并稀释备用，再利用凡纳滨对虾LvE165微卫星DNA核心序列(AAT) η,其中ri=16-19，在其序列两端设计特异性引物，其核苷酸序列如SEQ ID N0:l_2所示；然 后使用该引物对凡纳滨对虾不同群体或者群体内个体的基因组DNA进行PCR扩增，对PCR 产物进行变性聚丙烯酰胺凝胶检测。
4.如权利要求3所述的检测方法，其特征在于其PCR反应加样参数为正反向引物SEQ ID NO 1 和 SEQ ID NO 2 各为 0. 2 uM, 0. 2 mM dNTP, 1*PCR 缓冲液，1. 5-2. 5 mM Mg2+， 0.6 U Taq酶，50-100 ng DNA模板，用双蒸水补足到20ul ；使用该引物的时设置PCR程序 参数为94°C预变性2分钟；然后94°C变性30-40秒，45_60°C退火30秒，72°C延伸30秒-1 分钟，重复此反应35个讯环。
5.如权利要求3所述的检测方法，其特征在于对PCR产物的检测基因组DNA模板进行 PCR扩增，其产物在69Γ8%的聚丙烯酰胺凝胶上电泳，干燥后在扫描保存图片，分析多态性， 得到各个个体的基因型，并进一步确定LvE165遗传标记基因座位的多态性遗传变异图谱。
6.如权利要求5所述的检测方法，其特征在于在PCR产物的检测中利用长度差异为50 bp的DNA梯型及PBR322标记作为电泳的分子量标记；电泳的电压为1 一 8V/cm。
7.如权利要求5所述的检测方法，其特征在于PCR扩增产物用变性聚丙烯酰胺凝胶电 泳-银染系统进行检测PCR产物中加上变性缓冲液之后95°C变性5分钟，之后立刻置于 冰上降温，使用微量进样器上样5ul，85 W恒功率电泳至溴酚兰带至胶板的底端，120分钟 后，用终浓度0. 5μ g/ml的溴化乙锭染色30分钟，然后在凝胶成像系统下观察记录成像结
全文摘要
本发明属于分子生物学DNA标记技术与应用领域，具体涉及凡纳滨对虾LvE165微卫星DNA标记的检测方法。本发明提供了一种凡纳滨对虾LvE165微卫星特异性DNA引物，一种利用上述引物的PCR反应体系以及一种凡纳滨对虾LvE165微卫星DNA标记的检测方法，包括先提取凡纳滨对虾基因组并稀释备用，再利用凡纳滨对虾LvE165微卫星DNA核心序列，在其序列两端设计特异性引物，然后使用该引物对凡纳滨对虾不同群体或者群体内个体的基因组DNA进行PCR扩增，并对产物进行分析，确定每个个体的基因型，从而获得多态性遗传变异图谱。本发明主要应用于凡纳滨对虾种质资源和遗传多样性分析，分子群体遗传学，遗传图谱的构建等。
文档编号C12Q1/68GK102146460SQ20111002832
公开日2011年8月10日 申请日期2011年1月26日 优先权日2011年1月26日
发明者夏建军, 张吕平, 王艳红, 胡超群 申请人:中国科学院南海海洋研究所