专利名称：细菌表面抗原Ag43表达系统的构建方法
技术领域：
本发明涉及一种可以和细菌表面抗原Ag43嵌合表达的原核表达系统的构建方法。
背景技术：
免疫耐受是一个自然现象，免疫系统对自身抗原分子(比如肿瘤抗原、过敏性疾病发病相关的自身分子治疗靶点)具有先天的免疫耐受能力，如何诱导免疫系统打破这种免疫耐受是当今科学研究的重大问题。研究表明，antigen 43 (Ag43)是大肠埃希氏菌(大肠杆菌)表达的一种表面抗原蛋白分子，在一个大肠埃希氏菌表面，可表达5万多个Ag43分子。和细菌表面表达的其它蛋白(如菌毛或鞭毛)不同，Ag43不需伴侣分子和/或引导分子，本身就可抵达细菌表面。 它由信号肽和α和β 二个结构域三个部分组成。信号肽引导α和β 二个结构域通过细菌内膜，然后β结构域在细菌外膜形成一个环形通道，保证α结构域到达细菌外膜表面 (图1)。目前，已有人将此蛋白开发成一个用于细菌表面展示的表达载体，还发现Ag43不但能在缺失了 Ag43基因(又称flu基因)的大肠埃希氏菌的表面表达，还可以表达于其它多种细菌表面，如绿脓杆菌、肺炎克雷白菌等。另外，Ag43和细菌菌毛表达载体不同，插入高达500个氨基酸的外源蛋白后也可表达于细菌表面(菌毛载体只能插入20 30个外源氨基酸)。目前研究证实Ag43具有十分强大的免疫原性，含有多种T和B淋巴细胞表位， 如果将外源抗原基因在Ag43a结构域的148个氨基酸处插入，构成Ag43的嵌合分子，能促使免疫系统产生对嵌合的外源基因蛋白的免疫反应，产生外源蛋白特异的抗体。此外，Ag43 只需要加热就可以从细菌体分离，纯化技术也不复杂，因此，Ag43是重组外源嵌合蛋白最理想的展示载体。在疫苗制备方面展现出了良好的应用前景。
发明内容
本发明的目的在于提供一种可以和细菌表面抗原Ag43嵌合表达的原核表达系统的构建方法。来源于大肠杆菌JM109的Ag43基因敲除细菌Tanl09和重组质粒pET_Ag43 作为一个有效的原核基因表达系统，可以将外源基因嵌合于Ag43的中进行共表达，并能将外源基因和Ag43嵌合表达(展示)于细菌表面，通过加热就可获得和Ag43嵌合的重组蛋白，比传统的提取重组蛋白方法容易，活性好。为实现上述目的，本发明的技术方案为提供一种细菌表面抗原Ag43表达系统的构建方法，包括以下步骤(1)、利用基因敲除技术将大肠杆菌JM109的Ag43基因敲除，获得了 Ag43基因敲除细菌Tanl09 ；O)、利用基因工程技术将Ag43基因第598bp以后的基因插入原核表达质粒 pET-28a多克隆位点Hind III和Xho I之间，获得重组质粒pET_Ag43，保留pET_28a多克隆位点》10 I之前所有的酶切位点；此后，将可以发出绿色荧光的FGP基因插入重组质粒pET-Ag43多克隆位点Nhe I和Hind III之间，获得了重组质粒pET_Ag43_FGP ；(3)、重组质粒pET-Ag43_FGP可以在细菌Tanl09中有效表达，并将重组嵌合蛋白 Ag43-FGP表达于细菌表面；(4)、在细菌表面表达的重组嵌合蛋白Ag43_FGP可以通过加热法从细菌表面分离获取；(5)、所获得的Ag43基因敲除细菌Tanl09和构建的重组质粒pET_Ag43 二者构成了一个基因工程原核表达系统；由于重组质粒PET-Ag43具有多个克隆位点，可以任意将外源基因取代本发明的FGP位置克隆进入该重组质粒pET-Ag43，(类似于本发明的重组质粒 pET-Ag43-FGP)，并能在细菌Tanl09中有效表达，通过加热就可获得相应的Ag43嵌合重组蛋白。本发明与现有技术相比较(1)、细菌Tanl09和重组质粒pET_Ag43可以作为一个有效的基因表达系统，可以将外源基因(本发明用绿色荧光FGP基因作模式外源基因)嵌合于细菌本身基因Ag43中进行嵌合表达，并能将嵌合表达的嵌合重组蛋白展示于细菌表面，通过加热就可获得嵌合重组蛋白，比传统的提取重组蛋白方法容易，活性也会更好。O)、所构建的重组质粒pET_Ag43具有多个克隆位点，可以任意将外源基因(取代本发明的FGP位置)克隆进入该重组质粒，获得相应的Ag43嵌合重组蛋白。(3)、由于Ag43是细菌的抗原分子，在各种动物或人体中均可诱导免疫反应，因此，利用本发明所诱导的表达的外源基因和Ag43的嵌合蛋白可能是一种有效的疫苗模式， 用来打破表达的外源基因蛋白抗原的免疫耐受，增强外源基因蛋白的免疫原性。在基因工程、重组疫苗和免疫耐机理研究方面具有良好的应用前景。
图1为本发明Ag43表达并向细胞外展示的原理(A)，本发明将外源基因和Ag43嵌合表达并展示于细胞外的原理(B)；图2为本发明基因敲除大肠杆菌JM109的Ag43基因的原理和步骤流程(A)，PCR 验证产物的引物和部位(B)以及PCR验证结果(C)；图3为本发明构建pET_Ag43的过程步骤以及酶切及基因测序验证(A为PCR扩增 Ag43基因序列，B为所用的原始质粒和插入的位点，C为酶切分析结果，D为测序分析结果， E为基因测序和基因库相应序列的比对结果)；图4为本发明将外源模式(代表)基因FGP重组于本发明构建的重组质粒 pET-Ag43后获得新的重组质粒pET-Ag43-FGP并将Ag43_FGP嵌合表达于细菌表面，以及最终通过加热法获得Ag43-FGP重组蛋白(A为FGP基因来源质粒pEFGP-Cl，B为Nhe I和 Hind III双酶切pEFGP-Cl获得GFP基因序列，C为将FGP基因插入质粒pET_Ag43后获得新的重组质粒pET-Ag43-FGP后用NheI和Hind III进行双酶切的分析结果，D表明将重组质粒pET-Ag43-FGP在Ag43基因敲除菌Tanl09中表达后可以将嵌合蛋白Ag43_FGP表达于细菌表面，E和F分别说明通过加热(60°C )后获得重组嵌合蛋白Ag43-FGP和Ag43)。
具体实施方式
下面结合优选实施例对本发明作进一步说明，但本发明决不限于下述实施例。一种细菌表面抗原Ag43表达系统的构建方法，包括以下步骤 (1)、利用基因敲除技术(SIGMA-ALDRICH 公司的 TargeTronTM GeneKnockout System)将大肠杆菌JM109的Ag43基因敲除，获得了 Ag43基因敲除细菌Tanl09 ；O)、利用基因工程技术将Ag43基因第598bp以后的基因插入原核表达质粒 pET-28a多克隆位点Hind III和Xho I之间，获得重组质粒pET_Ag43 (保留pET_28a多克隆位点》10 I之前所有的酶切位点)。此后，将可以发出绿色荧光的FGP基因插入重组质粒 pET-Ag43多克隆位点Nhe I和Hind III之间，获得了重组质粒pET_Ag43_FGP ；(3)、重组质粒pET-Ag43_FGP可以在细菌Tanl09中有效表达，并将重组嵌合蛋白 Ag43-FGP表达于细菌表面；(4)、在细菌表面表达的重组嵌合蛋白Ag43_FGP可以通过加热法从细菌表面分离获取。(5)、所获得的Ag43基因敲除细菌Tanl09和构建的重组质粒pET_Ag43 二者构成了一个基因工程原核表达系统；由于重组质粒PET-Ag43具有多个克隆位点，可以任意将外源基因取代本发明的FGP位置克隆进入该重组质粒pET-Ag43，(类以于本发明的重组质粒 pET-Ag43-FGP)，并能在细菌Tanl09中有效表达，通过加热就可获得相应的Ag43嵌合重组蛋白。为了证实本系统能将外源分子和Ag43嵌合表达于细菌表面，我们将绿色荧光蛋白作为报告分子，将绿色荧光蛋白和Ag43嵌合表达，通过以下方法和步骤了解是否能将绿色荧光蛋白表达于细菌表面，同时了解获取Ag43嵌合绿色荧光蛋白的加热条件。具体包括以下内容1.将绿色荧光蛋白基因插入pET_Ag43表达质粒，获得新的pET-Ag43_FGP重组质粒，进行鉴定。2.将pET-Ag43_FGP重组质粒转化本发明所获得的Ag43基因敲除细菌Tanl09，了解是否有效将Ag43和绿色荧光蛋白(Ag43-FGP)表达于细菌表面。3. 了解通过简单加热法是否有效获得表达于细菌表面的Ag43_FGP重组蛋白。步骤1 将绿色荧光蛋白基因插入pET-Ag43表达质粒，获得新的pET-Ag43_FGP重组质粒，进行鉴定。含有绿色荧光EGFP基因的质粒pEGFP-Cl (美国Clontech公司产品，由本实验室保存，附图4A)。首先将质粒pEGFP-Cl转化感受态细胞DH5a (Trans5 a Chemically Competent Cell，北京全式金生物技术有限公司产品)并在抗卡那霉素的平板上过夜培养， 第二天接种单菌落于液体培养基中再次过夜培养，第三天获取细菌提取质粒。用Nhe I和 Hind III 二个内切酶切取质粒pEGFP-Cl，得到约76^p的EGFP目的基因片段(附图4B)， 用胶回收方法(东盛公司试剂盒)回收目的基因片段。同样方法将本发明获得的pET_Ag43重组质粒用Nhe I和Hind III 二个内切酶进行酶切反应，胶回收酶切后的PET-Ag43线性片断。将EGFP目的基因片段和酶切后的 pET-Ag43线性片段经T4连接酶连接过夜，将连接后的质粒转染感受态细胞DH5ci。此后随机挑取三个菌落提取质粒用Nhe I和Hind III进行酶切鉴定。此二个酶酶切后切出 EGFP(765bp)和重组质粒pET_Ag43 (约8000bp)共二个片段。酶切后进行琼脂糖凝胶电泳，结果切出了约8000和800bp 二个条带(附图4C)，说明构建了正确的pET-Ag43-FGP重组质粒。图2为本发明基因敲除大肠杆菌JM109的Ag43基因的原理和步骤流程㈧，PCR验证产物的引物和部位⑶以及PCR验证结果(C)。图3为本发明构建pET-Ag43的过程步骤以及酶切及基因测序验证(A为PCR扩增Ag43基因序列，B为所用的原始质粒和插入的位点， C为酶切分析结果，D为测序分析结果，E为基因测序和基因库相应序列的比对结果)。步骤2 将pET-Ag43_FGP重组质粒转化本发明所获得的Ag43基因敲除细菌 Tanl09，了解是否有效将g43和绿色荧光蛋白(Ag43_FGP)表达于细菌表面将本发明所获得的Ag43基因敲除细菌Tanl09进行平板培养，挑取单克隆菌落进行液体培养，采用捷瑞生物公司的SSCS Solution高效感受态细胞制备试剂盒将Tanl09制备为感受态细胞。然后将重组质粒pET-Ag43-FGP转染Tanl09感受态细胞，接着利用IPTG 进行诱导表达，收取诱导后的细菌，利用荧光显微镜(Nikon 80i)进行观察，了解目标蛋白Ag43-FGP是否有效表达于细菌表面。显微镜观察发现，我们构建的质粒能够有效的将 Ag43-FGP表达于细菌表面(附图4D)。步骤3 了解通过简单加热法是否有效获得表达于细菌表面的Ag43_FGP重组蛋白。使用SDS-PAGE方法了解加热60°C后是否能有效分离获得目标重组蛋白质。分别收集经IPTG诱导Ag43-FGP表达前后的细菌8000rpm离心2min，加100-200 μ 1生理盐水混勻细菌，置60°C水浴Ih后8000rpm离心2min，分别收集菌体和上清，进行SDS-PAGE电泳分析。同时培养Ag43没有敲除的细菌JM109进行同样的加热和SDS-PAGE分析。附图4E和 F分别为分析结果。图4E为诱导Ag43-FGP表达后进行加热后的结果，可见加热前(泳道 2)较加热后(泳道1)有一条明显的蛋白条带(白色箭头)，加热后上清中含有一条比较纯净单一的电泳条带(泳道幻，该条带对应加热前较明显(泳道幻，加热后则较模糊(泳道 1)的菌体条带。附图4F为Ag43基因没有敲除的对照细菌JM109加热前后的情况，同样可以发现加热前(泳道5和6，分别为加热后1/2和Ih采样)含有清楚的条带(白色箭头)， 而加热后该条带不明显(泳道4)，在加热后的上清中同样发现比较单一的蛋白条带(泳道 7)，该条带对应JM109细菌本身表达的Ag43蛋白。表明利用简单的加热(60°C )就可以有效获取细菌自身表达Ag43蛋白，同时也可以有效获得我们研究的Ag43外源基因表达系统所表达的Ag43-FGP重组表达蛋白。以上所揭露的仅为本发明的较佳实施例而已，当然不能以此来限定本发明之权利范围，因此依本发明权利要求所作的等同变化，仍属于本发明所涵盖的范围。
权利要求
1. 一种细菌表面抗原Ag43表达系统的构建方法，其特征在于包括以下步骤(1)、利用基因敲除技术将大肠杆菌JM109的Ag43基因敲除，获得了Ag43基因敲除细菌 Tanl09 ；(2)、利用基因工程技术将Ag43基因第598bp以后的基因插入原核表达质粒pET_28a 多克隆位点Hind III和Β ο I之间，获得重组质粒pET-Ag43，保留pET_28a多克隆位点)(ho I之前所有的酶切位点；此后，将可以发出绿色荧光的FGP基因插入重组质粒pET-Ag43多克隆位点Nhe I和Hind III之间，获得了重组质粒pET_Ag43_FGP ；(3)、重组质粒pET-Ag43-FGP可以在细菌Tan109中有效表达，并将重组嵌合蛋白 Ag43-FGP表达于细菌表面；G)、在细菌表面表达的重组嵌合蛋白Ag43-FGP可以通过加热法从细菌表面分离获取；(5)、所获得的Ag43基因敲除细菌Tanl09和构建的重组质粒pET_Ag43 二者构成了一个基因工程原核表达系统；由于重组质粒pET-Ag43具有多个克隆位点，可以任意将外源基因取代本发明的FGP位置克隆进入该重组质粒pET-Ag43，并能在细菌Tanl09中有效表达， 通过加热就可获得相应的Ag43嵌合重组蛋白。
全文摘要
本发明提供一种可以和细菌表面抗原Ag43嵌合表达的原核表达系统的构建方法。来源于大肠杆菌JM109的Ag43基因敲除细菌Tan109和重组质粒pET-Ag43作为一个有效的原核基因表达系统，可以将外源基因嵌合于Ag43的中进行共表达，并能将外源基因和Ag43嵌合表达(展示)于细菌表面，通过加热就可获得和Ag43嵌合的重组蛋白，比传统的提取重组蛋白方法容易，活性好。
文档编号C12N1/20GK102181381SQ20111002905
公开日2011年9月14日 申请日期2011年1月19日 优先权日2011年1月19日
发明者周松林, 王 华, 谭光宏, 赵焕阁, 黄用豪, 黄风迎 申请人:海南医学院