专利名称：与棕色棉纤维色泽主效qtl连锁的分子标记及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及棉花分子标记辅助选择育种和分子生物学领域，尤其是一种与棕色棉长绒和短绒纤维色泽QTL紧密连锁的SSR标记及其应用。
背景技术：
棉花是世界性的重要经济作物，棉纤维不但是人类日常生活的必需品、纺织工业的重要原料，也是国际市场竞争的重要农产品。彩色棉作为专用棉的重要类型之一，其纤维具有天然的棕、绿等颜色。但是，目前已知天然彩色棉品种资源全部属于棕色和绿色系列， 颜色单调、纤维品质差、色牢度及色饱和度不足成为限制天然彩色棉产业发展的技术瓶颈。 这为彩色棉育种和创新提出了十分紧迫的研究课题。但育种实践证明，要解决这些问题是十分困难的，究其原因主要是对彩色棉的遗传基础了解不够，不能采用更有效的育种措施。 因此，搞清楚彩色棉的遗传规律和遗传效应，对指导育种和创新工作非常重要。张秉贤Q000)以棕色纤维种质为父本所配制的两个杂交组合，所有Fl棉株的纤维均呈灰白色，即为白色与棕色的中间色，将F:棉株按纤维有色(包括中间色和棕色)与白色分成两类进行扩检验结果表明，有色植株与白色植株之比符合3 1，因而认为，主要受一对显性基因控制，但表现为不完全显性；周雁声等(1998)用白色棉与棕色棉杂交，正反交Fl的纤维均为浅棕色，介于双亲之间，F2分离为棕色、浅棕色与白色，符合1 :2:1 的理论比例，这也说明棕色棉的纤维颜色由单基因控制，棕色表现为不完全显性；李永山 (2002)、耿军义等(1998)研究表明棕色棉的纤维颜色由单基因控制，棕色表现为不完全显性，詹少华Q008)认为除一对主效基因外，还存在一些作用较小的“微效基因”。石玉真、杜雄明等000 研究认为棕色纤维由一对主效基因控制，表现为不完全显性遗传，棕色相对白色为显性，同时，棕色纤维显性性状的表现还受控制短绒色泽的隐性基因的影响；李定国用(2004)Minoalt色差计，测定纤维的色泽，分析纤维色泽的遗传规律，结果表明，棕色纤维是由不完全显性单基因控制的质量性状。孙东磊O008)以棕色棉为母本与三个白色棉杂交，其F2棉株按长纤维棕色(深棕、棕色)与白色(棕白、白色、浅棕)分成两类，进行的 x2检验结果表明，在显著水平白色植株与有色植株之比符合孟德尔9 7的分离规律，认为棕色陆地棉纤维色泽至少受4对基因控制，长纤维和短绒棕色的有无各由1对显性基因控制，其纤维色泽类型至少还受2对微效基因控制，表现出淡棕、棕近白等不同类型。以上研究进展基本揭示了棕色棉纤维色泽的遗传规律，为我们对该性状的QTL定位打下了良好的基础。棉花QTL定位研究开始于20世纪90年代初，Reinisch等1994年建立了第一个详尽的异源四倍体棉花RFLP图谱，由此揭开了棉花分子图谱构建和QTL定位研究的序幕。 随着分子标记技术的发展，遗传图谱的饱和程度越来越高，越来越多的QTL被定位到染色体或连锁群上，为标记辅助选择及图位克隆奠定基础，这些QTL包括皮棉产量及产量构成、 纤维品质、抗虫、抗病、农艺性状等。但国内外很少见有彩色棉的农艺经济性状的QTL定位。采用多环境下的重复试验可以减少试验误差及环境误差，采用多个环境多个重复的平均数据可以更加准确的进行QTLs的定位，环境越多，结果也就越可靠(沈新莲，2004)。 为此，本本发明除了利用棕1 和库车T94-4杂交组合的F2群体对棕色棉进行QTL定位和分析外，还利用棕1 和库车T94-4杂交组合的RIL群体，在四种环境下进行了棕色棉进行 QTL定位，以便于找到与棕色棉纤维紧密相关的可靠性好、稳定性高的QTL，用于分子标记辅助育种。
发明内容
为了解决上述问题，本发明的目的在于提供一种与棕色棉的长绒和短绒纤维色泽主效QTL紧密连锁的分子标记及其应用。本发明的第一个目的在于提供扩增所述分子标记的引物，其序列如SEQ ID No. 1 和 SEQ ID No. 2 所示。本发明的另一个目的在于提供一种与棕色棉的长绒和短绒纤维色泽主效QTL紧密连锁的分子标记，其为用SEQ ID No. 1和SEQ IDNo. 2所示的引物扩增出的23^ρ和500bp 的扩增片段。本发明提供的分子标记，通过下述方法获得1)以棕色棉材料棕128(母)和白色棉库车T94-4(父)为亲本，分别构建其F2分离群体和重组自交系F8,其中重组自交系种植于四个不同生态环境(2008年河南省安阳、 2009年河南安阳、2009年湖北省黄梅县、2009年新疆石河子)。2)通过已知公布的7000对棉花SSR引物筛选亲本间的多样性，其方法是首先对材料DNA进行PCR扩增，然后通过聚丙烯酰胺凝胶(PAGE)电泳后染色对条带进行识别。将得到的113对多态性引物在两个群体中进行PCR扩增检测。其中在F2群体和重组自交系中均产生114个清晰可重复的多态性位点。3)通过J0inMap3. 0构建连锁图谱，F2群体83个位点共构建了 21个连锁群，覆盖 724. 86cM，每个连锁群平均4个标记，标记间平均距离8. 73cM ；重组自交系(RIL)群体中， 87个位点构建了 27个连锁群，共构建27个连锁群，覆盖481. 54cM,每个连锁群平均3. 2个标记，标记间平均距离5. 53cM。4)利用扫描仪对棉纤维长绒和短绒扫描成像，利用Photoshopg. 0获取纤维图像的RGB(R 红色；G 绿色；B 蓝色)数据，通过公式计算颜色系数P = R/(G+B)，每个图像随机在不同的位置取10个P值，求得均值。5)利用 Windows QTL Cartographer 2. 5 软件的复合区间作图法(Composite Interval Mapping, CIM)，结合纤维颜色系数和连锁图谱对纤维色泽QTL进行检测。本发明的另一个目的在于提供所述的引物或分子标记在棉花品种纤维色泽早期选择或品种鉴定中的应用。具体而言，是用SEQ IDNo. 1和SEQ ID No. 2所示的引物对棉花品种或棉花杂交后代的幼苗的DNA进行扩增，若扩增出238bp和500bp的片段，表明其纤维色泽为棕色。通过利用棕色棉棕128与白色棉库车T94-4的F2 (简称ZKF2)群体和重组自交系 (RIL)群体对棕色棉纤维的长绒和短绒色泽QTL进行多群体多环境定位分析发现，棕色棉长绒和短绒纤维色泽QTL均与SSR标记NAU1043紧密连锁，而且在多环境下均能稳定检测到。可以用于棕色棉色泽的分子标记早期选择和育种。
本发明提供的棕色棉特征标记NAU1043在深棕色、浅棕色和白色棉材料中的带型具有明显的差异，在不同纤维色泽品种或及其彩色棉后代选育中，在苗期就可以进行分子标记选择深棕色或棕色植株类型。而且，没有必要构建F2或重组自交系，进行QTL的再分析，大大提高了选择效率和准确度。
图1为本发明F2群体和重组自交系(RIL)群体部分分子标记连锁图谱以及QTL定位。图中，ASF2群体部分分子标记连锁图谱以及QTL定位；B为重组自交系(RIL)群体部分分子标记连锁图谱以及QTL定位。
具体实施例方式以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。实施例1以棕色棉材料棕128 (母)(来自中国农业科学院棉花研究所中期库)和白色棉库车T94-4 (父)(来自中国农业科学院棉花研究所中期库)为亲本，分别构建300个单株的 F2分离群体和沈0个家系的重组自交系F8,其中重组自交系种植于四个不同生态环境(2008 年河南省安阳、2009年河南安阳、2009年湖北省黄梅县、2009年新疆石河子)。实施例2通过已知公布的7000对棉花SSR引物筛选亲本间的多样性，其方法是首先对棕 128和库车T94-4两个亲本的DNA进行PCR扩增。PCR反应在PTC-100型PCR仪上进行， 反应体系 10 μ 1，包括 1 μ 110XPCR 缓冲液(含 15mmol/L Mg2+)，50ng 模板 DNA，0. 5mmol/ LdNTPs,0. 5U Taq酶，0. 5ymol/L 3'和5'引物。反应程序为95°C预变性3min ;94°C 45s， 55°C 45s, 72°C 45s, 30个循环；最后72°C延伸5min，4°C保存。扩增产物用8%的非变性聚丙烯酰胺凝胶检测，凝胶电泳在DYY-5型稳压稳流电泳仪上进行，恒压150V，电泳lh，银染观察并照相，筛选得到113对多态性丰富的引物。将得到的113对多态性引物在两个群体中进行PCR扩增检测(PCR体系同上)，其中在F2群体和重组自交系中均产生114个清晰可重复的多态性位点。实施例3通过J0inMap3. 0构建连锁图谱，F2群体83个位点共构建了 21个连锁群，覆盖 724. 86cM,每个连锁群平均4个标记，标记间平均距离8. 73cM ；重组自交系(RIL)群体中， 87个位点构建了 27个连锁群，共构建27个连锁群，覆盖481. 54cM,每个连锁群平均3. 2个标记，标记间平均距离5. 53cM。实施例4利用扫描仪对棉纤维长绒和短绒扫描成像，利用Ph0t0sh0p9. 0获取纤维图像的 RGB(R 红色；G 绿色；B 蓝色)数据，通过公式计算颜色系数P = R/(G+B)，每个图像随机在不同的位置取10个P值，求得均值。利用Windows QTL Cartographer 2. 5 软件的复合区间作图法(Composite Interval Mapping, CIM)，结合纤维颜色系数和连锁图谱对纤维色泽QTL进行检测。在棕128与库车T94-4组合的F2群体中检测到5个长绒色泽的QTL，4个短绒色泽的QTL，分别位于不同的连锁群上，其中长绒色泽QTL qLCF2-7-l在标记NAU1043与GH302 之间，与标记NAU1043的遗传距离为2.01，其加性效应为4.86%，显性效应为-3.12%， 解释表型变异的27. 37%。增效基因来自棕128，为长绒色泽的主效QTL。短绒色泽QTL qFCF2-7-l同样位于标记NAU1043与GH302之间，与标记NAU1043的遗传距离为2. 01，其加性效应为6. 450%，显性效应为-2. 98%，解释表型变异的47. 46% (表1)。增效基因来自棕128，为短绒色泽的主效QTL。表1复合区间作图法定位ZKF2群体纤维色泽的QTL
权利要求
1.一种与棕色棉长绒和短绒纤维色泽主效QTL连锁的分子标记的引物，其序列如SEQ ID No. 1 和 SEQ ID No. 2 所示。
2.一种与棕色棉长绒和短绒纤维色泽主效QTL连锁的分子标记，其特征在于，其为用权利要求1所述的引物扩增出的238bp和500bp的扩增片段。
3.权利要求1所述的引物或权利要求2所述的分子标记在棉花品种纤维色泽早期选择或品种鉴定中的应用。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，用权利要求1所述的引物对棉花品种或棉花的杂交后代的幼苗的DNA进行扩增，若扩增出238bp和500bp的片段，表明其纤维色泽为棕色。
全文摘要
本发明涉及一种与棕色棉长绒和短绒纤维色泽主效QTL连锁的分子标记，其为用SEQ ID No.1和SEQ ID No.2所示的引物扩增出的238bp和500bp的扩增片段。该分子标记可应用于棕色棉花品种纤维色泽早期选择或品种鉴定。本发明提供的分子标记与棕色棉长绒和短绒纤维色泽QTL均紧密连锁，而且在多环境下均能被稳定的检测到。同时，本发明的分子标记能提供更高的分子标记辅助选择的效率。
文档编号C12Q1/68GK102321619SQ20111003112
公开日2012年1月18日 申请日期2011年1月28日 优先权日2011年1月28日
发明者何守朴, 冯鸿杰, 周忠丽, 孙君灵, 孙杰, 杜雄明, 潘兆娥, 贾银华 申请人:中国农业科学院棉花研究所