专利名称：肥胖基因扩增用引物对、含有其的肥胖基因扩增用试剂及其用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及用于扩增肥胖基因β 2AR基因、β 3AR基因和UCP 1基因的引物对、含有该引物对的肥胖基因扩增用试剂及其用途。
背景技术：
与肥胖相关的基因多态性，已知有编码β -2肾上腺素受体(β 2AR)的基因(β 2AR 基因)、编码β "3肾上腺素受体(β 3AR)的基因(β 3AR基因)和编码解偶联蛋白(UCP)的基因(UCP1基因)的多态性。β 2AR主要分布在心脏、支气管平滑肌等中，此外也存在于脂肪组织中，与脂肪分解相关。编码0 2AR的0 2AR基因存在第16位氨基酸精氨酸(Arg)变成甘氨酸(Gly)的多态性(Argl6Gly)。据报道具有该多态性的受试者(日本人中16%存在该多态性)与没有上述多态性的受试者相比，其安静时的代谢量是亢进的。此外，0 3AR 存在于棕色脂肪细胞组织和白色脂肪细胞组织中，通过结合去甲肾上腺素，引起棕色脂肪细胞组织产热、白色脂肪细胞组织脂肪分解。编码它的β 3AR基因存在第64位氨基酸色氨酸(Trp)变成精氨酸(Arg)的多态性(Trp64Arg)。据报道具有该多态性的受试者(日本人中34%存在该多态性)与没有上述多态性的受试者相比，安静时的代谢量是减少的。此外，UCP 1是一种在交感神经处于兴奋状态时，发挥棕色脂肪组织中的产热中心作用的蛋白质。另外，编码它的UCPl基因存在mRNA的-3826位(基因组序列中的UCPl基因的翻译起始点的上游3826位)的腺嘌呤(A)变成鸟嘌呤(G)的多态性。据报道具有该多态性的受试者(日本肥胖女性中24%存在该多态性)与没有上述多态性的受试者相比，全身的代谢量是减少的。由于如上这种各基因的多态性和代谢量之间的关系，实际上已在进行解析这些基因的多态性，将解析结果用于受试者的肥胖治疗、预防中。另外，作为在基因水平解析所有疾病的原因、个体间的疾病易感性(易患疾病)、 个体间的药效的差异等的方法，广泛地进行点突变、所谓的单核苷酸多态性(SNP)的检测。 点突变的通常检测方法可以举出(1)利用PCR(聚合酶链反应)扩增试样的目标DNA的相当于检测对象序列的区域，再对其全基因序列进行解析的直接测序法；(2)利用PCR扩增试样的目标DNA的相当于检测对象序列的区域，通过随上述检测对象序列有无目标突变而切断作用不同的限制酶，将该扩增产物切断，进行电泳从而进行分型的RFLP解析；(3)使用目标突变位于3’末端区域的引物进行PCR，通过有无扩增来判断突变的ASP-PCR法等。但是，这些方法例如必须进行由试样提取的DNA的精制、电泳、限制酶处理等，因此需要功夫和成本。另外，进行PCR后，有必要暂时开启反应容器，因此有上述扩增产物混入到之后的反应体系内、解析精度降低的顾虑。而且，由于自动化困难，因此无法解析大量的样品。另外，上述(3)的ASP-PCR法，还存在特异性低的问题。由该问题出发，近年来作为点突变的检测方法，正在实施对由目标核酸和探针形成的双链核酸的融解温度(Tm)进行解析的方法。这种方法由于通过Tm解析或上述双链的融解曲线的解析来进行，因此称作融解曲线解析。其为如下的方法。即，首先使用与含有检测目标点突变的检测对象序列互补的探针，形成检测试样的目标单链DNA与上述探针的 杂交体(双链DNA)。接着，对该杂交产物实施加热处理，通过吸光度等信号的变动来检测随着温度上升的杂交体的解离(融解)。然后，根据该检测结果确定Tm值，从而判断有无点突变。在杂交产物的同源性越高时Tm值越高、同源性越低时Tm值越低。因此，对于含有点突变的检测对象序列和与其互补的探针形成的杂交产物，预先求得Tm值(评价标准值)，测定检测试样的目标单链DNA和上述探针的Tm值(测定值)。上述测定值与评价标准值相同时，则可以判断为匹配、即目标DNA存在点突变，测定值低于评价标准值时，则可以判断为错配、即目标DNA不存在点突变。而且，通过该方法还可以实现自动化。但是，对于利用此类Tm解析的检测方法而言，存在PCR中必须特异且高效地扩增含有检测目标位点的区域的问题。特别是，肥胖基因中很受重视的02AR基因、i33AR基因和UCPl基因分别存在多种同工酶，编码这些同工酶的序列也非常相似。因此，在PCR中存在除了作为目标的这些基因以外，同工酶的编码基因也被扩增的可能性。此外，如上所述地其它同工酶的编码基因也被扩增的情况，也成为例如3 2AR基因、i3 3AR基因和UCP 1基因的各多态性的解析(非专利文献1 3)中解析结果可信度降低的原因。因此，由于即使解析1个样品也要伴随极大的劳动力，存在在解析大量样品中不实用的问题。非专利文献1 =PMID :9399966J Clin Invest. 1997Dec 15 ；100(12) :3184_8·非专利文献2 =PMID 9049481 Diabetologia. 1997Feb ；40 (2) :200_4·非专利文献3 =PMID 9541178 Diabetolo gia. 1998Mar ；41 (3) :357_61·
发明内容
因此，本发明的目的在于提供一种用于通过基因扩增法特异性扩增选自由β 2AR 基因、β 3AR基因和UCPl基因所组成的组中的至少一个肥胖基因的目标区域的引物对。为了实现上述目的，本发明的引物对，其特征在于，其为用于通过基因扩增法扩增肥胖基因的引物对，上述肥胖基因是选自由32AR基因、β 3AR基因和UCPl基因所组成的组中的至少一个基因，所述引物对包含选自由下述引物对(1) (3)所组成的组中的至少一个引物对。引物对(1)包含含有下述(Fl)的寡核苷酸的正向引物和含有下述(Rl)的寡核苷酸的反向引物的一个引物对(Fl):下列寡核苷酸中的至少一个与序列号1的碱基序列中的、以第4248位的胸腺嘧啶碱基⑴作为第1碱基、向着5’方向到第18 25个碱基的区域序列相同的至少1个寡核苷酸，该寡核苷酸以上述胸腺嘧啶碱基(T)作为3’末端和与序列号1的碱基序列中的、以第4250位的胸腺嘧啶碱基⑴作为第1位碱基、 向着5’方向到第18 26个碱基的区域序列相同的至少1个寡核苷酸，该寡核苷酸以上述胸腺嘧啶碱基(T)作为3’末端(Rl):下列寡核苷酸中的至少一个与序列号1的碱基序列中的、以第4292位的腺嘌呤碱基㈧作为第1位碱基、向着3’方向到第21 31个碱基的区域互补的至少1个寡核苷酸，该寡核苷酸以与上述第4292 位的腺嘌呤碱基(A)互补的胸腺嘧啶碱基(T)作为3’末端和与序列号1的碱基序列中的、以第4301位的腺嘌呤碱基㈧作为第1位碱基、向着 3’方向到第18 27个碱基的区域互补的至少1个寡核苷酸，该寡核苷酸以与上述第4301 位的腺嘌呤碱基(A)互补的胸腺嘧啶碱基(T)作为3’末端引物对(2)包含含有下述(F2)的寡核苷酸的正向引物和含有下述(R2)的寡核苷酸的反向引物的一个引物对(F2)与序列号2的碱基序列中的、以第4110位的胞嘧啶碱基(C)作为第1位碱基、向着5’方向到第16 20个碱基的区域序列相同的至少1个寡核苷酸，该寡核苷酸以上述胞嘧啶碱基(C)作为3’末端(R2)与序列号2的碱基序列中的、以第4172位的鸟嘌呤碱基(G)作为第1位碱基、向着3’方向到第15 19个碱基的区域互补的至少1个寡核苷酸，该寡核苷酸以与上述第4172位的鸟嘌呤碱基(G)互补的胞嘧啶碱基(C)作为3’末端引物对(3)包含含有下述(F3)的寡核苷酸的正向引物和含有下述(R3)的寡核苷酸的反向引物的一个引物对(F3)与序列号3的碱基序列中的、以第280位的胞嘧啶碱基(C)作为第1位碱基、向着5’方向到第25 44个碱基的区域序列相同的至少1个寡核苷酸，该寡核苷酸以上述胞嘧啶碱基(C)作为3’末端(R3)与序列号3的碱基序列中的、以第350位的胞嘧啶碱基(C)作为第1位碱基、向着3’方向到第23 38个碱基的区域互补的至少1个寡核苷酸，该寡核苷酸以与上述第350位的胞嘧啶碱基(C)互补的鸟嘌呤碱基(G)作为3’末端此外，本发明的基因扩增用试剂，其特征在于，其为用于通过基因扩增法扩增肥胖基因的试剂，上述肥胖基因是选自由32AR基因、β 3AR基因和UCPl基因所组成的组中的至少一个基因，所述试剂包含上述本发明的肥胖基因扩增用引物对。本发明的扩增产物的制造方法，其特征在于，其为通过基因扩增法制造肥胖基因的扩增产物的方法，上述肥胖基因是选自由02AR基因、β 3AR基因和UCPl基因所组成的组中的至少一个基因，所述方法包含下述(I)步骤。(I)以试样中的核酸作为模板，使用本发明的肥胖基因扩增用引物对，在反应液中扩增上述选自由β 2AR基因、β 3AR基因和UCPl基因所组成的组中的至少一个基因的步骤本发明的多态性解析方法，其特征在于，其为解析肥胖基因中的检测对象位点的多态性的方法，上述肥胖基因是选自由02AR基因、β 3AR基因和UCPl基因所组成的组中的至少一个基因，所述方法包含下述(i) (iv)步骤。 (i)通过本发明的扩增产物的制造方法，在反应液中扩增上述选自由i32AR基因、 β 3AR基因和UCPl基因所组成的组中的至少1个基因中含有检测对象位点的区域的步骤(ii)准备反应液的步骤，所述反应液含有上述(i)步骤中的扩增产物和能够与上述选自由β 2AR基因、β 3AR基因和UCPl基因所组成的组中的至少1个基因的检测对象位点杂交的探针(iii)改变上述反应液的温度，测定上述扩增产物和上述探针的杂交产物显示融解状态的信号值的步骤(iv)根据伴随温度变化的上述信号值的变动，确定上述选自由β 2AR基因、β 3AR 基因和UCPl基因所组成的组中的至少1个基因中的检测对象位点的多态性的步骤根据本发明的引物，可以在反应液中特异且高效地扩增选自由i3 2AR基因、β 3AR 基因和UCPl基因所组成的组中的至少一个肥胖基因中的、含有发生检测目标多态性的位点的目标区域。因此，与上述的现有方法不同，可以减少功夫和成本。另外，由于如此特异地扩增上述肥胖基因中含有发生特定多态性的检测对象位点的区域，再通过使用例如与含有检测对象位点的检测对象序列互补的探针，可以使用上述反应液直接进行Tm解析、并进行所述多态性的分型。另外，由于可以在一个反应液中进行扩增、多态性的分型，因此还能够实现操作的自动化。而且，当使用本发明的引物对时，例如即便是含有杂质的试样(例如全血或口腔粘膜等)，也可以省略预处理、因此，能够更为迅速且简单地进行扩增反应。另夕卜，当使用本发明的引物对时，可以以优于以往的扩增效率进行扩增反应，因此还能够缩短扩增反应。因此，通过本发明的引物对、含有其的试剂以及使用它们的扩增产物的制造方法和多态性解析方法，可以迅速且简单的解析选自由32AR基因、β 3AR基因和UCPl基因所组成的组中的至少一个肥胖基因的多态性，在医疗领域是非常有效的。
图1是表示本发明的实施例1中的Tm解析结果的图。图2是表示本发明的上述实施例1中的Tm解析结果的图。图3是表示本发明的上述实施例1中的Tm解析结果的图。图4是表示本发明的实施例2中的Tm解析结果的图。图5是表示本发明的实施例3中的Tm解析结果的图。图6是表示比较例中的Tm解析结果的图。图7是表示本发明的实施例4中的Tm解析结果的图。
具体实施例方式<肥胖基因扩增用引物对>本发明的肥胖基因扩增用引物对，如上所述，其特征在于，含有选自由上述引物对 (1) (3)所组成的组中的至少1个引物对。由于含有至少任一个引物对，因此，能够特异性扩增例如选自由β 2AR基因、β 3AR基因和UCPl基因所组成的组中的至少一个肥胖基因中的特定的目标区域。本发明的肥胖基因扩增用引物对，例如可以仅含有上述引物对(1) (3)中的任意一种，也可以含有任意两种或者引物对⑴ ⑶的全部。如后所述，通过引物对⑴可特异性扩增出的目标区域是β 2AR基因中含有发生特定多态性的位点(序列号1中第4265 位)的区域，通过引物对(2)可特异性扩增出的目标区域是β 3AR基因中含有发生特定多态性的位点(序列号2中第4134位)的区域，通过引物对(3)可特异性扩增出的目标区域是UCPl基因中含有发生特定多态性的位点(序列号3中第292位)的区域。
如上所述，已知肥胖基因β 2AR基因、β 3AR基因和UCPl基因的各自的特定的多态性都是对代谢有影响的多态性。因此，不仅要重视研究任意一种基因的多态性，研究任意2种基因或者所有3种基因的多态性都应予以重视。但是，传统方法存在无法在1个反应体系中解析多个序列的问题。如上所述，认为这是由于上述各肥胖基因存在多个同工酶， 在PCR中连上述各基因以外的同工酶的编码基因也被扩增。因此，为了研究32AR基因、 β 3AR基因和UCPl基因中2种基因的多态性或者所有3种基因的多态性，需要在各个反应体系中分别扩增含有各个多态性发生位点的区域，再各自解析所获得的扩增产物。这样一来，传统的方法很难做到仅以肥胖基因中的上述特定的基因作为模板、并仅特异性扩增各基因中分别含有上述多态性发生位点的2种或3种目标区域。因此，如上所述，解析1个样品就需要大量的劳动力，导致解析大量样品中不实用的问题。针对这一点，通过使用本发明的肥胖基因扩增用引物对，即便在含有上述引物对⑴ ⑶中的任意2种或所有3种的情况下，也可以在同一反应液中同时且特异性扩增各个目标区域。因此，与上述传统方法不同，能够降低时间和成本。此外，如上所述， 由于可以在同一反应液中特异性扩增2个或者 3个目标区域，再通过使用与各个目标区域中的检测对象序列互补的探针，则可以使用上述反应液直接进行Tm解析、对上述2种或者3种多态性分别进行分型。如上所述，由于可以在同一反应液中对β 2AR基因、β 3AR基因和UCPl基因中的2种或3种基因中的特定的多态性进行解析，因此本发明的肥胖基因扩增用引物对优选例如含有引物对⑴ ⑶中任一种，还优选含有任意2种或3种。使用这样的肥胖基因扩增用引物对，当然可以扩增1个目标区域，若同时扩增2个或者3个目标区域，则可以比目前方法更高效地对上述肥胖基因进行多态性解析。此外，以下有时将正向引物称为F引物，将反向引物称为R引物。首先，对用于扩增3 2AR基因的引物对⑴进行说明。弓丨物对⑴如上所述是包含含有下述(Fl)的寡核苷酸的正向引物和含有下述(Rl)的寡核苷酸的反向引物的一对引物对。(Fl):下列寡核苷酸中的至少一个与序列号1的碱基序列中的、以第4248位的胸腺嘧啶碱基(T)作为第1碱基、向着5’方向到第18 25个碱基的区域序列相同的至少1个寡核苷酸，该寡核苷酸以上述胸腺嘧啶碱基(T)作为3’末端和与序列号1的碱基序列中的、以第4250位的胸腺嘧啶碱基(T)作为第1位碱基、 向着5’方向到第18 26个碱基的区域序列相同的至少1个寡核苷酸，该寡核苷酸以上述胸腺嘧啶碱基(T)作为3’末端(Rl):下列寡核苷酸中的至少一个与序列号1的碱基序列中的、以第4292位的腺嘌呤碱基㈧作为第1位碱基、向着 3’方向到第21 31个碱基的区域互补的至少1个寡核苷酸，该寡核苷酸以与上述第4292 位的腺嘌呤碱基(A)互补的胸腺嘧啶碱基(T)作为3’末端和与序列号1的碱基序列中的、以第4301位的腺嘌呤碱基㈧作为第1位碱基、向着 3’方向到第18 27个碱基的区域互补的至少1个寡核苷酸，该寡核苷酸以与上述第4301位的腺嘌呤碱基(A)互补的胸腺嘧啶碱基(T)作为3’末端序列号1表示的碱基序列是编码人(Homo sapiens)源的β 2肾上腺素受体蛋白(Homo sapiens adrenergic, beta-2-, receptor, surface ；ADR β 2 ( β 2AR))的 ADR β 2 基因的全长序列，例如，NCBI登录号为No. DQ094845的序列。以下，也将该引物对(1)称为“β 2AR基因用引物对”。上述32AR基因用引物对是用于扩增序列号1中的、含有第4249 4291位的区域、第4249 4300位的区域、第 4251 4291位的区域或者第4251 4300位的区域的DNA链及其互补链的引物对。已知该区域内的第4265位碱基(序列号1中的第4265位碱基)存在点突变(4265A、4265G)。 如果第4265位碱基是A，则β 2AR基因被翻译为蛋白质时，氨基酸16位是精氨酸(Arg) ’第 4265位的碱基突变为G的情况下，呈现出氨基酸16位为甘氨酸(Gly)的多态性。进而，在纯合子的情况下，这些多态性可以表示为4265A/4265A、4265G/4265G，在杂合子的情况下， 这些多态性可以表示为4265A/4265G。此外，在用氨基酸表示的情况下，4265A/4265A可以表示为 Arg-16/Arg-16，4265G/4265G 可以表示为 Gly-16/Gly-16，4265A/4265G 可以表示为 Arg-16/Gly-ie，这种用氨基酸进行的表示是目标基因β 2AR基因的多态性的常见表示。进而，在仅解析β 2AR基因的上述多态性的情况下，可以仅使用3 2AR基因用引物对。在本发明中，32AR基因用引物对的F 1弓丨物和Rl引物，只要用于决定DNA聚合酶扩增起始点的3’末端的碱基满足上述条件即可。通过如上所述固定各引物的3’末端的碱基，可以充分防止β 2AR基因用引物对与例如相似的其它同工酶的基因(例如，β IAR基因等)结合。如上所述，由于只需要固定Fl引物和Rl引物的3’末端的碱基，因此对各引物的长度本身并没有特殊的限定，可以适当调整为一般的长度。作为引物长度的一个例子，例如为13 50mer的范围，优选14 45mer，更优选15 40mer。作为具体例子，上述F 1引物优选如下与序列号1的碱基序列中的、以第4248位的胸腺嘧啶碱基(T)作为第1碱基、 向着5’方向到第18 25个碱基(优选第19 24个碱基，更优选第19 23个碱基)的区域序列相同的至少1个寡核苷酸、或者是与序列号1的碱基序列中的、以第4250位的胸腺嘧啶碱基(T)作为第1位碱基、向着5’方向到第18 26个碱基(优选第19 24个碱基，更优选第19 22个碱基)的区域序列相同的至少1个寡核苷酸。此外，上述Rl引物优选如下与序列号1的碱基序列中的、以第4292位的腺嘌呤碱基(A)作为第1位碱基、向着3’方向到第21 31个碱基(优选22 30个碱基、更优选23 28个碱基)的区域互补的至少1个寡核苷酸。进而，由于F 1引物和R 1引物的3’末端被固定，因此从引物延伸出的区域例如如上所述为序列号1中的第4249 4291位的区域、4249 4300位的区域、4251 4291位的区域或者第4251位 4300位的区域，所获得的扩增产物的全长随使用的引物的长度而变化。此外，Rl引物可以是与序列号1表示的碱基序列不完全互补的寡核苷酸，Fl引物可以是与上述碱基序列的互补链不完全互补的寡核苷酸。也就是说，各引物中除3’末端的碱基以外的部分可以与完全互补的寡核苷酸有1个 5个碱基不同。构成Rl引物的寡核苷酸中，与序列号1的碱基序列中第4298位互补的碱基可以是胞嘧啶(C)和鸟嘌呤(G)中的任意一个。更优选同时使用与第4298位互补的碱基是胞嘧啶的寡核苷酸以及与第4298位互补的碱基是鸟嘌呤的寡核苷酸两者作为Rl引物。已知序列号1的碱基序列中第4298位的碱基有多态性(4298C、4298G)，但是本发明并不以该部分中的多态性为检测目标。因此，通过使用上述两种寡核苷酸作为Rl引物，无论是4298C和 4298G中的哪一种，都可以通过上述引物进行基因扩增，可以充分避免检测目标以外的多态性对目标区域的扩增的影响。与第4298位互补的碱基是胞嘧啶的寡核苷酸和与第4298 位互补的碱基是鸟嘌呤的寡核苷酸的比例没有特别的限定，例如，优选摩尔比为1 10 10 1。以下，示意出Fl引物和Rl引物的具体例子，但是本发明不限定于此。进而，序列号12 22的碱基序列中的“S”表示胞嘧啶(C)或者鸟嘌呤(G)，相当于与序列号1第4298 位互补的碱基。此外，对这些Fl引物和Rl引物的组合也没有任何限定，其中，特别优选包含含有序列号9或序列号109的寡核苷酸的F1’引物、以及含有序列号12或序列号18或序列号134的寡核苷酸的R1’引物的引物对(1’)。进而，含有序列号12的寡核苷酸以及含有序列号18的寡核苷酸的R1’引物，如上所述优选同时含有“S”是胞嘧啶的寡核苷酸、 和“S”是鸟嘌呤的寡核苷酸两者。下表中的“Tm(°C )”是下表的序列和与其完全互补的序列杂交的情况下的Tm(°C )，是通过MELTCALC软件(http://www. meltcalc. com)将参数设为寡核苷酸浓度0.2 μ M、钠当量(Na eq.)50mM而计算出来的(以下相同)。上述Tm值可以通过例如目前已知的MELTCALC软件(http://www. meltcalc. com)等算出来，此外，还可以通过领接法(Nearest Neighbor Method)确定(以下相同)。下表中，记载了与序列号1 的第4298位的碱基互补的碱基“S”是鸟嘌呤的Rl引物的一个例子的Tm值。[表 1]
权利要求
1.一种肥胖基因解析用探针，其特征在于，其为用于肥胖基因的多态性解析中的探针，所述肥胖基因是0 2AR基因，所述探针含有下述(Pl)所示的寡核苷酸，(Pl)下述(1-1)和下述(1-2)中的至少一种寡核苷酸，(1-1)与序列号1中的、以第42M位的胸腺嘧啶碱基⑴作为第1位碱基、向着3’方向到第21 沈个碱基的区域互补的至少1个寡核苷酸，该寡核苷酸以与所述胸腺嘧啶碱基互补的腺嘌呤碱基(A)作为3’末端，(1-2)与序列号1中的、以第4259位的胞嘧啶碱基(C)作为第1位碱基、向着3’方向到第15 19个碱基的区域序列相同的至少1个寡核苷酸，该寡核苷酸以所述胞嘧啶碱基作为5’末端。
2.根据权利要求1所述的肥胖基因解析用探针，所述探针是用于通过融解温度的解析来进行的β 2AR基因的多态性解析中的探针。
3.根据权利要求1所述的肥胖基因解析用探针，所述探针是含有下述(ΡΓ)所示的寡核苷酸的探针，(PI’ )含有序列号72的碱基序列的寡核苷酸和含有序列号114的碱基序列的寡核苷酸中的至少一种寡核苷酸。
4.根据权利要求1所述的肥胖基因解析用探针，所述探针是带有标记物的标记探针。
5.根据权利要求4所述的肥胖基因解析用探针，所述标记物是荧光物质。
6.根据权利要求5所述的肥胖基因解析用探针，所述标记探针是单独显示荧光、且由于杂交而荧光消失的探针。
7.根据权利要求4所述的肥胖基因解析用探针，所述探针是所述(1-1)的寡核苷酸的 3’末端带有所述标记物的标记探针。
8.根据权利要求4所述的肥胖基因解析用探针，所述探针是所述(1-2)的寡核苷酸的 5’末端带有所述标记物的标记探针。
9.一种肥胖基因解析用试剂，其特征在于，其为用于肥胖基因的解析的试剂，所述肥胖基因是0 2AR基因，所述试剂含有权利要求1所述的肥胖基因解析用探针。
10.根据权利要求9所述的肥胖基因解析用试剂，所述试剂是用于通过融解温度的解析来进行的肥胖基因的多态性解析中的试剂。
11.根据权利要求9所述的肥胖基因解析用试剂，其还含有用于扩增02AR基因中的、 含有多态性检测对象位点的检测对象序列的引物。
12.根据权利要求9所述的肥胖基因解析用试剂，所述肥胖基因解析用试剂是用于解析生物试样中的β 2AR基因中的检测对象位点的多态性的试剂。
13.根据权利要求9所述的肥胖基因解析用试剂，其还含有能与β3AR基因的检测对象位点杂交的探针和能与UCPl基因的检测对象位点杂交的探针中的至少一者。
14.根据权利要求13所述的肥胖基因解析用试剂，所述探针为由(Ρ2’)的寡核苷酸构成的探针和由(Ρ3’)的寡核苷酸构成的探针中的至少一者，(Ρ2’ )选自由含有序列号83的碱基序列的寡核苷酸、含有序列号120的碱基序列的寡核苷酸、和含有序列号127的碱基序列的寡核苷酸所组成的组中的至少一种寡核苷酸，(P3’)含有序列号95的碱基序列的寡核苷酸和含有序列号139的碱基序列的寡核苷酸中的至少一种寡核苷酸。
15.根据权利要求32所述的肥胖基因解析用试剂，所述生物试样是全血。
16.一种肥胖基因解析方法，其特征在于，其为解析肥胖基因的肥胖基因解析方法，所述肥胖基因是0 2AR基因，所述方法包含下述(a) (c)步骤，(a)准备反应液的步骤，所述反应液含有β2AR基因中的、含有多态性检测对象位点的检测对象序列、以及权利要求19所述的肥胖基因解析用探针，(b)改变所述反应液的温度，测定所述检测对象序列和所述探针的杂交产物显示融解状态的信号值的步骤，(c)由伴随温度变化的所述信号值的变动，确定所述杂交产物的融解温度的步骤。
17.根据权利要求16所述的肥胖基因解析方法，还包含下述(d)步骤，(d)根据所确定的融解温度，判断β2AR基因的所述检测对象位点的多态性的步骤。
18.根据权利要求16所述的肥胖基因解析方法，所述肥胖基因为i32AR基因、i3 3AR基因和UCPl基因中的至少1个基因，所述(a)步骤中，准备含有所述探针和选自由下述(P2’ )的寡核苷酸构成的探针和由 (P3’ )的寡核苷酸构成的探针中的至少一者的所述反应液，(P2’ )选自由含有序列号83的碱基序列的寡核苷酸、含有序列号120的碱基序列的寡核苷酸、和含有序列号127的碱基序列的寡核苷酸所组成的组中的至少一种寡核苷酸，(P3’)含有序列号95的碱基序列的寡核苷酸和含有序列号139的碱基序列的寡核苷酸中的至少一种寡核苷酸。
19.根据权利要求16所述的肥胖基因解析方法，所述探针是带有荧光染料的标记探针，在所述(b)步骤中，测定所述荧光染料的荧光强度作为所述信号值。
20.根据权利要求19所述的肥胖基因解析方法，所述标记探针是单独显示荧光、且由于杂交而荧光消失的探针，在所述(b)步骤中，升高所述反应液的温度，测定伴随温度上升的荧光强度的减少。
21.根据权利要求16所述的肥胖基因解析方法，还含有下述(χ)步骤，(x)以试样中的核酸作为模板，使用用于扩增β 2AR基因中的所述检测对象序列的引物，在反应液中扩增所述检测对象序列的步骤。
22.根据权利要求21所述的肥胖基因解析方法，在所述(χ)步骤中，在扩增反应前，向所述反应液中添加所述探针，将所述(χ)步骤中的扩增反应后的所述反应液作为所述(a) 步骤中的反应液使用。
23.根据权利要求21所述的肥胖基因解析方法，所述试样是生物试样。
24.根据权利要求23所述的肥胖基因解析方法，所述生物试样是全血。
25.根据权利要求M所述的肥胖基因解析方法，所述反应液中全血的添加比例是 0. 1 0. 5体积％。
26.—种多态性解析方法，其特征在于，其为通过融解温度的解析来解析肥胖基因中的检测对象位点的多态性的多态性解析方法，所述肥胖基因是0 2AR基因， 所述方法包括权利要求16所述的肥胖基因解析方法。
全文摘要
本发明提供引物对，其为用于通过基因扩增法扩增肥胖基因(β2AR基因、β3AR基因和UCP1基因)中包含检测目标位点的目标区域的引物对，其可以特异性扩增上述区域。使用3对引物对，其分别包含含有序列号9或序列号109、序列号25和序列号43的碱基序列的正向引物，和包含序列号18、序列号30和序列号63的碱基序列的反向引物。通过使用该引物对，可以在同一反应液中同时特异性扩增β2AR基因、β3AR基因和UCP1基因中包含发生检测目标多态性的位点的目标区域。
文档编号C12N15/11GK102154272SQ20111003160
公开日2011年8月17日 申请日期2007年11月30日 优先权日2006年11月30日
发明者平井光春, 间岛智史 申请人:爱科来株式会社