专利名称：单标记寡聚核苷酸荧光探针及检测核酸酶的方法
技术领域：
本发明涉及 外切酶、聚合酶、多聚核苷酸激酶、磷酸酯酶等多种核酸酶的分析检测领域，更具体地，涉及一种单标记寡聚核苷酸荧光探针，以及利用单标记寡核苷酸荧光探针分析检测核酸酶的方法。
背景技术：
DNA是生命信息传递的重要遗传物质，这种传递过程依赖各种核酸酶的特殊作用。 例如，核酸的延伸、校正、连接、磷酸化、去磷酸化、酶切等重要的生命过程无不依靠核酸酶与DNA的特异性相互作用。快速简便的核酸酶动力学分析方法对研究生物多样性和深入理解生命现象有着重要意义。核酸酶活性分析，通过研究DNA反应产物的方法有凝胶电泳、高效液相色谱、亲和力分析(filter binding)等。这些方法都是不连续性分析，操作麻烦、费时、费用高，无法快速、方便地获取分析结果，而且一般是采用放射性标记来提高灵敏度。采用增色效应紫外分析法可连续检测核酸酶反应，但是可检测底物浓度的范围较窄并且所需底物的浓度较高。酶联免疫吸附方法(ELISA)也被用于酶切反应的研究，但也是一种不连续的分析体系。 近几年来，随着荧光核酸探针的发展，出现了一些新的分析技术和方法来检测核酸酶与DNA 相互作用过程，主要是通过荧光共振能量转移对目标DNA与核酸酶反应前后体系荧光的变化进行实时的监测。其中分子信标(Molecular Beacon)核酸探针应用最为广泛。分子信标是呈发夹结构的短链DNA，一端标记荧光基团，一端标记猝灭基团。在进行核酸酶活性分析中，将分子信标设计成特异的序列与核酸酶相互作用导致分子信标的构象发生变化，从而由荧光信号实时指示核酸酶的动力学作用过程。但是有许多重要核酸酶的作用位点是在 DNA链的末端，例如聚合酶、连接酶、核酸外切酶、激酶、去磷酸化酶等等，由于分子信标的 5’-端和3’-端分别标记了荧光基团和猝灭基团，使之不能直接作为核酸酶的作用底物，这样就需要设计使用另一条与分子信标互补的序列来提供能与核酸酶反应的DNA末端。这样不仅增加了设计成本和工作量，而且额外的DNA分子增加了反应的复杂性，既要考虑分子信标与互补模板的浓度匹配，又要考虑使二者形成稳定杂交体的反应条件。诸多的因素使得分子信标方法在核酸酶的实际检测应用中受到限制。因此，迫切需要开发出简便、快速、灵敏度高、成本低、准确可靠的核酸酶实时检测方法。
发明内容
本发明的目的是提供一种可用于实时检测核酸酶活性和酶催化反应动力学的简便、快速、灵敏度高、成本低、准确可靠的分析方法，以克服现有技术中的诸多局限。本发明的技术方案是，根据光诱导电子转移猝灭原理设计单标记寡聚核苷酸荧光探针(简称单标记探针)，该探针序列既作为DNA底物与核酸酶反应，又作为指示反应进程的探针，实时检测荧光信号的变化来分析核酸酶的活性以及与DNA反应的动力学过程。
所谓光诱导电子转移猝灭原理是指1)构成DNA序列的四种脱氧核糖核苷酸对于特定的荧光基团在激发光诱导下通过电子转移机制使得荧光信号产生猝灭作用的现象；
2)这种猝灭作用 是在光引发下电子从脱氧核糖核苷酸转移到荧光基团产生的，碱基的氧化能力(给电子能力)和荧光基团的还原能力(得电子能力)大小决定了猝灭作用的强弱；
3)对于给定的荧光基团，四种碱基根据氧化电势排列猝灭作用的强弱顺序为dG>dA> dC ^ dT ；相对于分子信标，本发明的单标记探针在设计中仅标记荧光基团而不标记淬灭基团，利用上述的光诱导电子转移猝灭原理，通过鸟嘌呤脱氧核糖核苷酸(简称鸟嘌呤，dG) 来产生猝灭作用，在单标记探针与核酸酶的反应过程中鸟嘌呤的变化导致荧光信号的变化，从而指示核酸酶与DNA的反应活性。本发明的单标记寡聚核苷酸荧光探针(简称单标记探针)具有茎环结构，其中环部为单链结构，一般由5-24个核苷酸残基组成，而茎部则根据待测核酸酶的活性功能分为水解模式与合成模式两种设计(参见
图1)1)水解模式的茎部是由一定长度的互补碱基对构成的双链结构，其中至少有3个连续G-C碱基对在茎部末端，即茎部末端的一条链是连续的C碱基，另一条链是连续的G碱基，C碱基端标记荧光基团，G碱基端既产生猝灭作用又参与待测核酸酶反应或者在进一步修饰后用作待测核酸酶的底物，在核酸酶作用下茎部的一条链水解，释放出荧光信号；2)合成模式的茎部由6-10对互补碱基构成的双链和5’ -(dC)4_8(4-8个连续的胞嘧啶脱氧核糖核苷酸)侧链组成，5’ -端标记荧光基团，3’ -端与核酸酶反应，聚合延伸产生4-8个连续的鸟嘌呤脱氧核糖核苷酸，猝灭5’-端的荧光基团，根据荧光信号的变化情况分析待测核酸酶活性。本发明中选用可被鸟嘌呤高效猝灭的荧光基团来标记探针，常用的荧光基团的中英文全称见表1。表1.单标记探针的荧光基团标记的中英文全称
权利要求
1.一种单标记寡聚核苷酸荧光探针，具有茎环结构，其环部为单链结构，茎部为双链结构，茎部末端是3个以上的连续C碱基和连续G碱基组成的G-C碱基对，C碱基端标记荧光基团，G碱基端具有荧光淬灭作用。
2.一种单标记寡聚核苷酸荧光探针，具有茎环结构，其环部为单链结构，茎部由6-10 对互补碱基构成的双链和5’ _(dC)4_8侧链组成，且5’ -端标记荧光基团。
3.如权利要求1或2所述的单标记寡聚核苷酸荧光探针，其特征在于，所述环部由5-24个核苷酸残基组成。
4.如权利要求1或2所述的单标记寡聚核苷酸荧光探针，其特征在于，所述荧光基团是6-羧基荧光素、5-四氯荧光素、5-六氯荧光素、6-羧基罗丹明χ或6-羧基四甲基罗丹明。
5.权利要求1所述的单标记寡聚核苷酸荧光探针在核酸酶检测中的应用。
6.如权利要求5所述的应用，其特征在于，所检测的核酸酶是下列所述酶i)或酶ii) i)对双链DNA的3’或5’末端或者末端附近序列具有切割活性的核酸酶； )以双链DNA的3’或5’末端为反应底物，且与i)所述的核酸酶联用能够切割双链 DNA的3’或5’末端或者末端附近序列的核酸酶；以所述单标记寡聚核苷酸荧光探针作为DNA底物与所述核酸酶反应，实时检测荧光信号的变化，从而分析核酸酶的活性以及酶与DNA反应的动力学过程。
7.如权利要求6所述的应用，其特征在于，所检测的核酸酶是下列酶中的一种作用于双链DNA的核酸外切酶、限制性内切酶、作用于双链DNA的修饰酶、具有脱嘌呤/脱嘧啶裂解酶活性的修复酶和对损伤的鸟嘌呤位点具有N-糖基化酶活性的修复酶。
8.权利要求2所述的单标记寡聚核苷酸荧光探针在核酸酶检测中的应用。
9.如权利要求8所述的应用，其特征在于，所检测的核酸酶是下列所述酶1)或酶2)1)具有聚合活性或者聚合和保真活性的DNA聚合酶；2)与1)所述DNA聚合酶联用，使得DNA的聚合延伸反应得以实现的酶。以所述单标记寡聚核苷酸荧光探针作为DNA底物与所述核酸酶反应，实时检测荧光信号的变化，从而分析核酸酶的活性以及酶与DNA反应的动力学过程。
10.如权利要求8所述的应用，其特征在于，所述酶2)是具有3’-端去磷酸化活性的激酶和磷酸酶。
全文摘要
本发明公开了一类单标记寡聚核苷酸荧光探针及检测核酸酶的方法。该单标记寡聚核苷酸荧光探针具有茎环结构，环部由5-24个核苷酸残基组成，茎部根据待测核酸酶的活性分为水解模式与合成模式两种水解模式的茎部为双链结构，且末端至少有3个连续G-C碱基对，C碱基端标记荧光基团，G碱基端产生猝灭作用，在核酸酶作用下茎部的一条链水解，释放出荧光信号；合成模式的茎部由一段双链和5’-(dC)4-8侧链组成，5’-端标记荧光基团，3’-端与核酸酶反应，聚合延伸产生4-8个连续的鸟嘌呤脱氧核糖核苷酸，猝灭5’-端的荧光基团，根据荧光信号的变化情况分析待测核酸酶活性。
文档编号C12Q1/68GK102154489SQ201110049749
公开日2011年8月17日 申请日期2011年3月1日 优先权日2011年3月1日
发明者宋晨, 张晨, 苏昕, 赵美萍 申请人:北京大学