专利名称：一种基于液体深层发酵的樟芝无性孢子的制备方法及应用的制作方法
技术领域：
本发明属于生物工程技术领域，具体涉及一种基于液体深层发酵的樟芝无性孢子的制备方法及应用。
背景技术：
樟芝(Antrodia camphorata)，俗名牛樟芝、牛樟菇，是台湾特有的一种药用真菌 (多孔菌科，非褶菌目)，具有高度的寄主专一性，只腐生于台湾特有的常绿阔叶乔木牛樟树的芯材内部。长期以来，樟芝被民间用于解酒保肝、治疗肝痛、食物中毒、腹痛、腹泻、炎症、皮肤瘙痒和肝癌等病症，具有良好疗效。现代药理研究证实樟芝子实体及发酵产物在保肝、抗氧化、治疗肝癌方面具有独特的功效。迄今为止，从樟芝的子实体和发酵产物中已经分离得到70多种化合物，包括多糖、二萜类、三萜类、留体类、苯环衍生物等，由于樟芝良好的药用功能和野生数量稀少且生长十分缓慢，使得其市场价格极高，被称为世界上最昂贵的药用真菌。目前研究学者和开发商都非常关注樟芝人工培养技术的研究。人工培养樟芝的技术主要有两种途径一是人工栽培子实体。这固然是最理想的方法，但樟芝固体栽培时间长达数月之久，难以商业化生产；二是利用无性型菌株进行菌丝体发酵，再从发酵产物中提取功能组分。这是目前较为现实，最经济环保的一条樟芝开发途径。多家研究单位已对樟芝深层培养技术进行了研究。从研究结果来看，现有的樟芝深层培养技术主要存在下述问题 1)与其它微生物相比，樟芝的发酵周期较长。樟芝菌丝体发酵阶段的时间大多需要十余天， 若加上菌种活化、发酵种子制备的时间则更久；幻发酵种子的质量不稳定容易导致樟芝发酵过程的可控性较差。传统樟芝发酵均采用斜面菌丝挖块法进行接种，该法容易造成接种不均勻，种子批次质量不稳定等问题。另外，樟芝丝状菌丝在发酵过程中易缠绕形成菌丝球，普遍存在菌球内外传质、传热、溶氧不一的情况。因此，整个樟芝发酵过程可控性较差， 最终导致樟芝发酵产物质量的不稳定；3)因为樟芝发酵时间长，当发酵完成出罐后再进行清洗、空消、配置培养基、实消、冷却以后再接种，非生产的清理时间占用过长，影响生产效率。同时由于生产周期长，工艺环节多，导致发酵过程中容易发生污染，对发酵设备要求较高，因此生产成本高，也影响发酵产物的质量。已有研究发现，野生樟芝在其生长周期内可以产生三种无性繁殖体，包括菌丝体、 节孢子和厚垣孢子。樟芝节孢子和厚垣孢子均为无性孢子。目前未见在深层液体发酵过程中樟芝大量产生无性孢子的报道。
发明内容
本发明的目的，是提供一种通过液体深层发酵大量生产樟芝无性孢子的方法及所产无性孢子的应用。本发明的目的通过以下方案实现1.将樟芝菌丝体转接至斜面培养基中，25_32°C培养168-312小时。
斜面培养基(g/L)马铃薯150-200，葡萄糖10-20，琼脂15-25，pH自然。2.将步骤1中的斜面菌种转接入装有摇瓶培养基的摇瓶中，26-30°C培养，转速 100-180rpm,培养 48-72 小时。摇瓶培养基(g/L)葡萄糖20-30，蛋白胨2-4，硫酸镁0.5-1，磷酸二氢钾1_2，麸皮 2-4，pH 4. 5。3.将步骤2中的樟芝发酵液按10% -20%的接种量转接入装有种子培养基的种子罐中，26-30°C培养，转速50-150rpm，通气量0. 5_2vvm，培养48-72小时。种子罐培养基与摇瓶培养基相同。4.将步骤3中的樟芝发酵液按10 % -20 %的接种量转接入装有发酵培养基的发酵罐中，26-30°C培养，转速50-150rpm，通气量0. 5_2vvm，培养120-192小时。显微镜检验樟芝发酵液中可观察大量的无性孢子存在。发酵培养基(g/L)葡萄糖20-40，蛋白胨2-4，硫酸镁0.5-2，磷酸二氢钾1_4， ρΗ4· 5。本发明的有益效果是采用本发明的深层液无性孢子的快速发酵工艺可，使樟芝发酵周期较原有分批发酵工艺至少能够缩短40%，发酵产物质量提高，杂菌污染机会减少， 成本降低。显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。以下通过实例形式的具体实施方式
，对本发明的上述内容再做进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。
图1深层发酵过程产生的樟芝无性孢子(放大400倍)图2不同接种方法对樟芝生长的影响
具体实施例方式实施例1采用摇瓶发酵制备樟芝无性孢子1.菌种以樟芝(Antrodia camphorata)保藏号为ATCC No. 200183的菌株作为出发菌种。2.斜面培养将樟芝菌丝体转接至斜面培养基中，28°C培养观8小时。斜面培养基(g/L):马铃薯200，葡萄糖20，琼脂20，pH自然。3.种子摇瓶培养斜面菌种转接入装有IOOmL摇瓶培养基的500mL摇瓶中， 培养，转速lOOrpm，培养72小时。摇瓶培养基(g/L)葡萄糖20，蛋白胨2，硫酸镁0.75，磷酸二氢钾1.5，麸皮2，？!1 4. 5。4.发酵摇瓶培养樟芝发酵液按15%的接种量转接入装有IOOmL发酵培养基的 500mL发酵摇瓶中，28°C培养，转速lOOrpm，培养240小时。
发酵培养基(g/L)葡萄糖25，蛋白胨2，硫酸镁1，磷酸二氢钾2，pH 4. 5。发酵完成后，显微镜检验樟芝发酵液中可观察到大量的无性孢子存在(见图1)， 浓度为3X107个/mL。将发酵液用6层纱布过滤获得菌球和菌丝，滤出液进行离心(8000 转/分，20min)获得无性孢子。实施例2采用发酵罐发酵制备樟芝无性孢子1.菌种以樟芝(Antrodia camphorata)保藏号为BCRC No. 35398的菌株作为出发菌种。2.斜面培养将樟芝菌丝体转接至斜面培养基中，26°C培养312小时。斜面培养基(g/L)马铃薯180，葡萄糖18，琼脂18，pH自然。3.种子摇瓶培养将樟芝斜面菌种转接入装有IOOmL摇瓶培养基的500mL摇瓶中，26°C培养，转速lOOrpm，培养48小时。摇瓶培养基(g/L)葡萄糖20，蛋白胨2，硫酸镁0. 5，磷酸二氢钾1，麸皮2，？朋.5。4.种子罐发酵将樟芝发酵液按15%的接种量转接入装有种子培养基的种子罐中，26°C培养，转速150rpm，通气量lvvm，培养48小时。种子罐培养基与摇瓶培养基相同。5.发酵罐发酵樟芝发酵液按15%的接种量转接入装有发酵培养基的发酵罐中， 培养，转速lOOrpm，通气量lvvm，培养MO小时。发酵培养基(g/L)葡萄糖30，蛋白胨2，硫酸镁1，磷酸二氢钾2，pH 4. 5。显微镜检验樟芝发酵液中可观察大量的无性孢子存在，浓度为IXlO8个/mL。将发酵液用板框过滤机进行过滤获得菌球和菌丝，滤出液进行离心(8000转/分，20min)获得无性孢子。实施例3采用无性孢子作为接种物的樟芝发酵方法将按照实施例1或实施例2中所述方法制备的樟芝无性孢子作为发酵种子。将无性孢子以IX IO5个/mL的浓度直接接入发酵培养基，孢子在Mh内即可萌发完毕形成菌丝体，并开始进入生长对数期进行生长(图幻，发酵8天后生物量可达最高。而采用传统的斜面菌丝挖块接种法进行樟芝发酵则需要4-5d才进入生长对数期(图幻，种子液转接入发酵培养基中需要12-14天才能发酵完成获得发酵产物。因此，采用无性孢子作为深层液体发酵的接种源，能够缩短樟芝的发酵周期。另外，孢子便于计数，可以有利于控制种子的接种浓度。
权利要求
1.基于液体深层发酵的樟芝无性孢子的制备方法及其应用，其特征在于采用液体深层发酵大量产生无性孢子，该孢子可作为发酵种子接入新的发酵培养基，快速萌发后形成菌丝体。该孢子还可以用于长期保藏。
2.根据权利要求1所述的樟芝无性孢子的制备方法，其特征在于(1)将樟芝斜面菌丝体接入液体种子摇瓶在M_32°C培养48-72小时得到种子液，在发酵摇瓶中培养288-336小时；(2)液体发酵培养基主要成分为葡萄糖20-40g/L、蛋白胨l-10g/L、硫酸镁0.5-2g/L、 磷酸二氢钾 l_4g/L，pH4-7 ；(3)从发酵液中分离形成的无性孢子和菌丝体。
3.根据权利要求2所述的樟芝液体发酵培养基，其特征在于培养基组成中葡萄糖和蛋白胨的质量比为5 1 30 1。
4.根据权利要求1所述的樟芝无性孢子的应用，其特征在于作为樟芝液体深层发酵的接种物，能够缩短樟芝发酵周期、便于控制接种浓度。
全文摘要
本发明提供了一种基于液体深层发酵的樟芝无性孢子的制备方法及应用，目的是为了解决目前樟芝液体深层发酵周期较长、发酵过程和产物不稳定的情况，提供一种简便的培养出樟芝无性孢子的方法，属于生物工程领域。其特征在于以樟芝(Antrodia camphorata)为出发菌株，以葡萄糖、蛋白胨、无机盐为主要成分的液体培养基。采用该方法制备的无性孢子可作为发酵种子用于樟芝液体发酵。
文档编号C12N3/00GK102174461SQ20111005330
公开日2011年9月7日 申请日期2011年3月7日 优先权日2011年3月7日
发明者史劲松, 窦文芳, 许正宏, 许泓瑜, 钱建瑛, 陆震鸣 申请人:江南大学