专利名称：一种超快速核酸检测方法
技术领域：
本发明涉及ー种核酸检测方法，具体涉及ー种超快速核酸实时荧光定量检测方法。可广泛用于疾病的核酸定量检测，尤其适合用于突发性传染病的快速检测。
背景技术：
1985年，美国PE-Cetus公司人类遗传研究室的Mullis等人发明了具有划时代意义的聚合酶链反应(Polymerase Chain Reaction, PCR),使得人们可以在体外有目的地无限扩增特定的核酸片段。其原理类似于DNA的体内复制，只是在离心管中给DNA的体外合成提供一种合适条件。经过多年的发展，这ー技术已经非常成熟，现在已是分子生物学研究和临床诊断领域中最重要和最常用的技木。PCR仪的出现则使该技术实现了自动化，使得PCR的技术应用更加广泛，例如在诊断遗传性疾患、检测临床标本中病原体的核酸、对法医标本作遗传学鉴定，以及分析激活癌基因中的突变情况等方而都得到了广泛的应用。与其同时，针对不用的应用领域，核酸检测技术也发展为很多种类型，其中依赖核酸序列的扩增和环介导等温扩增方法应用也较广泛。但是，核酸检测技术还面临着许多挑战，现有的核酸检测技术中整个扩增时间长达ー个多小吋、扩增过程也比较复杂，结果不容易重复，尤其是在突发性传染病的检测方面受到了限制。提高实时荧光定量核酸检测的反应速度，缩短整个检测时间，使其更方便地应用于临床检测，特别是突发性传染病的检测，为疾病的治疗和控制赢取宝贵的时间，则是核酸检测技术未来的ー个重要发展方向。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的缺点，提供ー种反应时间大幅度缩短、操作简单的超快速实时荧光定量核酸检测方法，可普遍用于多种类型标本中核酸的分析及临床检測。 本发明所涉及的超快速实时荧光定量核酸检测方法，其特征在于提取核酸，在特殊的缓冲液和圆盘式反应容器中用荧光标记引物在酶催化下进行扩增并实时定量检测标本中核酸模板的含量。该检测方法通过以下技术方案实现(I)核酸模板提取A、样品处理、核酸分离；C、核酸沉淀；D、核酸洗涤；E、核酸溶解；F、核酸浓度測定；G、核酸电泳检測。(2)加样将模板、引物、酶、特殊缓冲液等加入到圆盘式反应容器。(3)荧光定量核酸检测以特异性引物进行实时荧光PCR定量检测标本中核酸的含量。所述的特殊缓冲液含有l-100mg/L的甜菜碱作为扩增速度促进剂。所述的圆盘式反应容器为刻有凹槽的圆盘，圆盘直径为1-30厘米，厚度为O. 1-3毫米，圆盘上的凹槽数目为1-200个，加样的容积为1-100微升，比起以往的离心管则加热面积更大，热传导效率更高。特殊的缓冲液和圆盘式反应容器使本方法的反应时间比以往的荧光定量核酸检测方法的反应时间大大的缩短了，由原来的I小时以上缩短到现在的5-10分钟，真正实现了病原体感染的快速检测。
该技术有以下优点反应速度超快，反应时间超短，由传统的I个半小时反应时间缩短到5-10分钟，极大地提高了检测效率，赢得了宝贵的治疗时间；高度特异性，特异的引物确保反应不受其它因素的干扰，对序列高度同源的序列也可精确区分；超宽的定量线性范围和高度的检测灵敏度，从几个拷贝到几万个拷贝，定量线性范围跨越7个数量级。综上所述，本发明所涉及的核酸检测技术操作简单，反应时间短，特异性高，尤其适合用于突发性急性传染病的检测，有很高的推广价值。
图I为实施例I的核酸电泳结果；图2为实施例I的圆盘式反应容器的结构示意图。 图中所示分别为I、2-纯化RNA样品3_封盘膜4_加样孔5_圆盘位置固定孔
具体实施例方式下面结合附图I和附图2通过ー个实例进一歩描述本发明所涉及的超快速实时荧光定量核酸检测方法，但本发明所涉及的范围并不局限于本实例。实施例一人血液中hsa_miR-29a miRNA的超快速定量检测I、总 RNA 提取(I)样品处理取100 μ L 500 μ L血液标本，加ImL TRIzol试剂，反复混匀；(2)RNA分离室温放置上述样品液10分钟，加入氯仿200 μ L，剧烈振荡约I分钟，室温静置5分钟，4°C 12000g离心15分钟，小心取出样品，通过观察可以发现样品分三层，其中最上层含有RNA组份；(3) RNA沉淀小心吸取上清液约450 μ L至含有600 μ L冰冷异丙醇的新离心管中，混匀，4°C 12000g离心10分钟；(4) RNA洗涤去上清，加入500 μ L冷冻的75%こ醇，弹起沉淀，4°C 12000g离心5分钟，去上清，4°C 12000g再离心5分钟，吸去上清液； (5)RNA溶解风干约5 10分钟，加入DEPC处理水约30 μ L，溶解RNA ；(6) RNA浓度测定吸取I μ L RNA用DEPC水稀释10倍后，在微量分光光度计上测定RNA浓度，以DEPC水做空白对照，同时记录RNA浓度及其0D26(l/0D28(l，按照公式计算RNA浓度，RNA浓度=40ng/μ LXOD260 X稀释倍数；(7) RNA电泳检测Α、变性胶制备取I. 2g琼脂糖加75mL去离子水煮沸，冷却至70°C左右加入IOmL 10XMops和15mL甲醛及适量溴化こ锭，倒胶至插有梳子的胶板上；B、电泳缓冲液配制(IXMops):取50mL 10 XMops,用去离子水稀释至500mL,倒入电泳槽中；C、RNA样品处理取RNA样品约9μ L，65°C变性IOmin后立即冷却，加入I μ L 10XRNA上样缓冲液；D、RNA电泳把RNA胶放入电泳槽中，100V作用电泳约5min，再在点样孔中点入处理过的RNA样品，100V左右电泳至溴酚蓝至胶的1/3处，取胶观察或拍照；(8) RNA抽提结果RNA电泳图见附图I ;(9)所得总RNA可立即使用或放_80°C保存；
2、RNA的逆转录(I)在冰上按如下比例配制RNA及引物混合液上述所得总RNA2 μ L，10 μ M逆转录引物I μ L，去RNA酶超纯水7 μ L，总体积为IOyL;(2)混匀上述RNA及引物混合液，短暂离心，放65°C变性10分钟，置冰上2分钟；(3)按如下比例配制反转录反应液RNA及引物混合液10μ L，5X逆转录反应缓冲液 5 μ L，IOmM dNTPs 4 μ L，25U/ μ L RNA 酶抑制剂 I μ L, 200U/ μ L M-MLV 逆转录酶 I μ L，去RNA酶超纯水4 μ L，总体积为25 μ L ;(4)混匀上述反应混合物，短暂离心，置42°C反应60分钟，95°C 5分钟灭活处理；(5)所得产物是单链cDNA，可立即使用或放置于_20°C保存。 4、突光定量超快速检测反应(I)在冰上按如下比例配制荧光定量PCR的反应液10X荧光定量PCR缓冲液2 μ L, 20mg/L 甜菜碱 I μ L，5U/y L DNA 聚合酶(λ 5μ L，40X 荧光定量染料 O. 5 μ L，IOmMdNTPs 24し2“] 正向引物24し24]\1反向引物24し单链cDNA2 μ L，去RNA酶超纯水
8μ L,总体积为20 μ L ；(2)混匀上述荧光定量PCR的反应液，加入到圆盘式反应容器中，每个加样孔加反应液20 μ L，所有加样孔都加完后，用封盘膜盖上，密封好，按圆盘位置固定孔的分布放置到温度循环仪上，当圆盘不停转动时，完成PCR循环，并同步完成扩增产物荧光强度的检测；(3)荧光定量PCR反应使用标准的三步法进行检测，反应循环设定如下95°C预变性10分钟；95°C变性10秒钟，57°C退火20秒钟，72°C延伸10秒钟；40个循环；(4)扩增分析按照所用仪器的软件分析扩增曲线及溶解曲线，确定标本中的has-miR-29a 的量。
权利要求
1.超快速核酸检测方法，其特征在于提取核酸，在特殊的缓冲液和圆盘式反应容器中用荧光标记引物在酶催化下进行扩增并实时定量检测标本中核酸模板的含量。
2.如权利要求I所述的超快速核酸检测方法，其特征在于所述特殊的缓冲液含有l-100mg/L的甜菜碱作为扩增速度促进剂。
3.如权利要求I所述的超快速核酸检测方法，其特征在于所述圆盘式反应容器为刻有凹槽的圆盘，圆盘直径为1-30厘米，厚度为0. 1-3毫米，圆盘上的凹槽数目为1-200个，加样的容积为1-100微升。
4.如权利要求I所述的超快速核酸检测方法，其特征在于所述圆盘式反应容器，在加样后用导热性材料做的封盘膜密封。
5.上述任一项权利要求所述的内容，用于任一种核酸的分析及临床检测。
全文摘要
本发明涉及一种超快速实时核酸检测方法，通过提取核酸，在特殊的缓冲液和圆盘式反应容器中用荧光标记引物在酶催化下进行扩增并实时定量检测标本中核酸模板的含量。特殊的缓冲液和圆盘式反应容器使本方法的反应时间比以往的荧光定量核酸检测方法的反应时间大大的缩短了，由原来的1小时以上缩短到现在的5-10分钟，真正实现了病原体感染的快速检测。具有反应时间短，操作简单，特异性高，尤其适合用于突发性急性传染病的检测，有很高的推广价值。
文档编号C12Q1/68GK102676636SQ201110053340
公开日2012年9月19日 申请日期2011年3月7日 优先权日2011年3月7日
发明者冯晓程, 冯长访, 巩红铃, 康飞, 王保君, 肖乐义, 蔡颖颖, 谢侃, 陶建国 申请人:美科生物医学技术无锡有限公司