专利名称：一种冬虫夏草菌分生孢子盖片制备及产孢动态计数方法
技术领域：
本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种冬虫夏草菌分生孢子盖片制备及产孢动态计数方法。
背景技术：
在微生物学研究实验中，细胞悬浮培养、分生孢子观察、绘制生长曲线等众多研究领域均需要显微计数。分生孢子显微计数是真菌生物学研究实验的一项基本技术，是了解培养菌株产孢状态，绘制产孢动态曲线，测定不同培养基配方、培养方式、生长胁迫等对菌株产孢影响的重要手段。常用的计数方法有稀释平板法、比浊 计数法、MTT比色法、血球平板计数法等。稀释平板法和比浊计数法多针对于细菌计数，MTT比色法用于细胞计数，而血球平板计数法是真菌孢子计数中最常用的方法，但这种经典计数方法也有局限性，要求孢子浓度大于I. 25X IO6个/mL，所以血球计数法不适合于产孢较少的孢子计数。冬虫夏草[Ophiocordycepssinensis (Berk. ) G. H. Sung, J. M. Sung, Hywel-Jones&Spatafora ( = Cordyceps sinensis (Berk. ) Sacc.)]作为中国特有的传统名贵药用菌，其分生孢子的研究与活性菌剂的制备密切相关。目前，冬虫夏草菌分生孢子的研究由于产孢量少、产孢周期长，往往达不到血球计数法的计数标准，故在培养观察计数上一直没有很好的解决办法。
发明内容
本发明的目的是提供一种计数冬虫夏草菌所产分生孢子的方法。本发明提供的方法，包括如下步骤I)在含有至少一个孔的固体培养基上的每个孔处接种冬虫夏草菌，得到接种孔；2)在步骤I)得到的每个接种孔上方均放置盖玻片，得到盖片平板；3)培养步骤2)得到的盖片平板培养至长出菌落，每隔一段时间取至少3个盖玻片计数取平均值，得到冬虫夏草菌在不同时间产生的分生孢子数。出芽的分生孢子不进行计数。步骤I)中，所述至少一个孔为7个、14个或20个孔；步骤2)中，所述盖玻片为无菌盖玻片；步骤3)中，所述每隔一段时间取至少3个盖玻片计数为每隔I天-5天取3-5个盖玻片计数；步骤3)中，所述每隔一段时间取至少3个盖玻片计数为每隔I天、3天或5天取3个盖玻片计数。步骤I)中，每IL所述固体培养基按照如下方法制备(20.0-50.0)克麦麸、(10. 0-20. O)克葡萄糖、(2. 0-5. O)克蛋白胨、(1.0-3. O)克酵母提取物、200克土豆、(15. 0-20. O)克琼脂和水混合，用水补至IL ；每IL所述固体培养基具体按照如下方法制备50. O克麦麸、20. O克葡萄糖、5. O克蛋白胨、3. O克酵母提取物、200克土豆、18. O克琼脂和水混合，用水补至IL(按照中国专利ZL200510137457. 8 [姚一建、董彩虹、王波、谢雪钦(2005) —种冬虫夏草复合培养方法及其专用培养基。]配制])。步骤3)中，所述培养温度为15°C _20°C，所述培养为静置暗培养，所述培养时间为8天-15天；步骤3)中，所述培养温度为15°C、18°C或20°C，所述培养时间为8天、10天或15天，所述计数采用显微镜观察计数。在步骤I)前，还包括在固体培养基上打孔的步骤；所述孔的直径为3_-5_，所述孔的直径具体为5mm。所述的方法在绘制冬虫夏草菌产分生孢子的动态曲线中的应用也是本发明保护的范围。 冬虫夏草菌(Ophio cordyceps sinensis)菌株762于2008年12月5日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCCJia :北京市朝阳区北辰西路I号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101)，保藏号为CGMCCNo. 2793，其分类命名为冬虫夏草(Cordyceps sinensis)。本发明的实验证明，本发明提供了一种冬虫夏草菌分生孢子盖片制备及动态计数方法，该计数方法有效的克服了冬虫夏草菌分生孢子产孢量少，无法洗脱计数的缺点，客观地展现了分生孢子的显微形态和产孢数量，可用来绘制菌株动态产孢曲线，筛选大量冬虫夏草菌株的分生孢子产孢能力，获得高产孢菌株。此外，本发明工作效率高，每个盖玻片都长有菌丝，可以保证都有观察计数点；实验程序简化，可定点原位观察计数，客观地反应冬虫夏草菌株产孢周期，有助于筛选高产孢菌株。同时，该方法还可获得同一微环境内，不同菌株的产孢特征及动态产孢计数曲线，为分生孢子悬液和活性菌剂的制备奠定基础。基于上述优点，本发明有较好的研究应用价值。
图I为动态产孢曲线。
具体实施例方式下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。实施例I、冬虫夏草菌分生孢子计数—、冬虫夏草菌的培养每IL冬虫夏草菌固体专用培养基按照中国专利ZL200510137457. 8配制50. O克麦麸，20. O克葡萄糖，5. O克蛋白胨，3. O克酵母提取物，200克土豆，18. Og琼脂，用水定容至1000晕升。从天然冬虫夏草上分离纯化(方法见Dong, C.-H. and Yao, Y. -J. (2008). Invitroevaluation of antioxidant activities of aqueous extracts from natural andcultured mycelia ofCordyceps sinensis. LWT-Food Science and Technology 41(4)669-677.)得到冬虫夏草菌(Ophiocordyceps sinensis)菌株762号，该菌株已保藏在中国普通微生物菌种保藏管理中心(CGMCC No. 2793)，专利菌株。冬虫夏草菌(Ophio cordyceps sinensis)菌株762于2008年12月5日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCCJia :北京市朝阳区北辰西路I号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101)，保藏号为CGMCCNo. 2793，其分类命名为冬虫夏草(Co rdyceps sinensis)。将上述分离纯化得到的冬虫夏草菌菌株762号CGMCC No. 2793，经DNA提取，扩增并测序，采用冬虫夏草专用分子数据库进行分析，经分子生物学鉴定为真正冬虫夏草菌菌株。将冬虫夏草菌菌株762号CGMCC No. 2793接种在装有冬虫夏草菌固体专用培养基的培养皿中心，置于18°C，黑暗条件下培养80天，获得冬虫夏草菌菌种。在含有固态培养基的平板上，用5mm孔径打孔器打孔，共打7个孔。在上述每个孔的内缘上方接种冬虫夏草菌菌种，然后每个孔正上方盖上无菌的18X18mm盖玻片，18°C下置于黑暗条件下静置培养。培养大约10天后开始每隔5天，在无菌条件下取出3片盖玻片观察其菌丝形态及动态产孢情况。二、冬虫夏草菌分生孢子的观察计数在无菌条件下取出盖玻片，置于显微镜下观察，在400倍放大倍数下，随机选取菌丝孢子密集的区域，采用数码摄像系统Axiocam MRC, Axiovision Rel. 4. 6软件拍照成像，每次随机选取3片，每片至少获得20个视野(每个视野面积O. 22X0. 16mm)，计数统计分生孢子数量，取平均值代表该冬虫夏草菌菌株在该时期的产孢能力。采用所有时间段产孢数据，结果如下所示10天、15天、20天、25天、30天、35天、40天、45天产的孢子数平均为O个、I. O个、
4.O 个、8. 2 个、16. 6 个、26. 7 个、12. 3 个、2. 6 个。以时间为横坐标，以不同时间点的孢子数为纵坐标，绘制出该菌株的动态产孢曲线(如图I所示)。实施例2、冬虫夏草菌分生孢子计数一、冬虫夏草菌的培养每IL冬虫夏草菌固体专用培养基按照中国专利ZL200510137457. 8配制50. O克麦麸，20. O克葡萄糖，5. O克蛋白胨，3. O克酵母提取物，200克土豆，18. O克琼脂，用水定容至1000毫升。从天然冬虫夏草上分离纯化得到的冬虫夏草菌菌株762号CGMCC No. 2793。将上述分离纯化得到的冬虫夏草菌菌株762号，经DNA提取，扩增并测序，采用冬虫夏草专用分子数据库进行分析，经分子生物学鉴定为真正冬虫夏草菌菌株。将冬虫夏草菌菌株762号CGMCC No. 2793接种在装有冬虫夏草菌固体专用培养基的培养皿中心，置于18°C，黑暗条件下培养60天，获得冬虫夏草菌菌种。在含有固态培养基的平板上，用5mm孔径打孔器打孔，共打14个孔。在上述每个孔的内缘上方接种冬虫夏草菌菌种，然后每个孔正上方盖上无菌的12 X 12mm盖玻片，15°C下置于黑暗条件下静置培养。培养大约15天后开始每隔3天，在无菌条件下取出3片盖玻片观察其菌丝形态及动态产孢情况。二、冬虫夏草菌分生孢子的观察计数
在无菌条件下取出盖玻片，置于显微镜下观察，在400倍放大倍数下，随机选取菌丝孢子密集的区域，采用数码摄像系统Axiocam MRC, Axiovision Rel. 4. 6软件拍照成像，每次随机选取3片，每片至少获得20个视野(每个视野面积O. 22X0. 16mm)，计数统计分生孢子数量，取平均值代表该冬虫夏草菌菌株在该时期的产孢能力。采用所有时间段产孢数据，以时间为横坐标，以不同时间点的孢子数为纵坐标，绘制出该菌株的动态产孢曲线。其动态产孢结果与实施例I趋势一致，差异不显著。实施例3、冬虫夏草菌分生孢子计数一、冬虫夏草菌的培养每IL冬虫夏草菌固体专用培养基按照中国专利ZL200510137457. 8配制50. O克 麦麸，20. O克葡萄糖，5. O克蛋白胨，3. O克酵母提取物，200克土豆，18. O克琼脂，用水定容至1000毫升。从天然冬虫夏草上分离纯化得到冬虫夏草菌菌株762号CGMCC No. 2793。将上述分离纯化得到的冬虫夏草菌菌株762号，经DNA提取，扩增并测序，采用冬虫夏草专用分子数据库进行分析，经分子生物学鉴定为真正冬虫夏草菌菌株。将冬虫夏草菌菌株762号CGMCC No. 2793接种在装有冬虫夏草菌固体专用培养基的培养皿中心，置于18°C，黑暗条件下培养90天，获得固体冬虫夏草菌菌种。在含有固态培养基的平板上，用5mm孔径打孔器打孔，共打20个孔。在上述每个孔的内缘上方接种固体冬虫夏草菌菌种，然后每个孔正上方盖上无菌的IOX IOmm盖玻片，20°C下置于黑暗条件下静置培养。培养8天后开始每隔I天，在无菌条件下取出3片盖玻片观察其菌丝形态及动态产孢情况。二、冬虫夏草菌分生孢子的观察计数在无菌条件下取出盖玻片，置于显微镜下观察，在400倍放大倍数下，随机选取菌丝孢子密集的区域，采用数码摄像系统Axiocam MRC, Axiovision Rel. 4. 6软件拍照成像，每次随机选取3片，每片至少获得20个视野(每个视野面积O. 22X0. 16mm)，计数统计分生孢子数量，取平均值代表该冬虫夏草菌菌株在该时期的产孢能力。采用所有时间段产孢数据，以时间为横坐标，以不同时间点的孢子数为纵坐标，绘 制出该菌株的动态产孢曲线。
其动态产孢结果与实施例I趋势一致，差异不显著。
权利要求
1.一种计数冬虫夏草菌所产分生孢子的方法，包括如下步骤 1)在含有至少ー个孔的固体培养基上的每个孔处接种冬虫夏草菌，得到接种孔； 2)在步骤I)得到的每个接种孔上方均放置盖玻片，得到盖片平板； 3)培养步骤2)得到的盖片平板培养至长出菌落，每隔一段时间取至少3个盖玻片计数取平均值，得到冬虫夏草菌在不同时间产生的分生孢子数。
2.根据权利要求I所述的方法，其特征在于 步骤I)中，所述至少一个孔为7个、14个或20个孔； 步骤2)中，所述盖玻片为无菌盖玻片； 步骤3)中，所述每隔一段时间取至少3个盖玻片计数为每隔I天-5天取3-5个盖玻片计数。
3.根据权利要求I或2所述的方法，其特征在于 步骤3)中，所述每隔一段时间取至少3个盖玻片计数为每隔I天、3天或5天取3个盖玻片计数。
4.根据权利要求1-3中任一所述的方法，其特征在于 步骤I)中，每IL所述固体培养基按照如下方法制备(20. 0-50. O)克麦麸、(10. 0-20. O)克葡萄糖、(2. 0-5. O)克蛋白胨、(1.0-3. O)克酵母提取物、200克土豆、(15. 0-20. O)克琼脂和水混合，用水补至IL ； 每IL所述固体培养基具体按照如下方法制备50. O克麦麸、20. O克葡萄糖、5. O克蛋白胨、3. O克酵母提取物、200克土豆、18. O克琼脂和水混合，用水补至IL ； 步骤3)中，所述培养温度为15°C -20°C，所述培养为静置暗培养，所述培养时间为8天-15天。
5.根据权利要求1-4中任一所述的方法,其特征在于 步骤3)中，所述培养温度为15°C、18°C或20°C，所述培养时间为8天、10天或15天，所述计数采用显微镜观察计数。
6.根据权利要求1-5中任一所述的方法,其特征在于 在步骤I)前，还包括在固体培养基上打孔的步骤；所述孔的直径为3_-5_，所述孔的直径具体为5mm。
7.权利要求1-6中任一所述的方法在绘制冬虫夏草产分生孢子的动态曲线中的应用。
全文摘要
本发明公开了一种冬虫夏草菌分生孢子盖片制备及产孢动态计数方法。本发明提供的方法，包括如下步骤1)在含有至少一个孔的固体培养基上的每个孔处接种冬虫夏草菌，得到接种孔；2)在步骤1)得到的每个接种孔上方均放置盖玻片，得到盖片平板；3)培养步骤2)得到的盖片平板至长出菌落，每隔一段时间取3个盖玻片计数，得到冬虫夏草菌在不同时间产生的分生孢子数。本发明的实验证明，本发明实验操作简化，通过倒置显微镜，可定点原位观察计数，客观地反应冬虫夏草菌菌株产孢周期。
文档编号C12Q1/06GK102676631SQ20111005445
公开日2012年9月19日 申请日期2011年3月8日 优先权日2011年3月8日
发明者任蜀豫, 姚一建, 王文婧 申请人:中国科学院微生物研究所