专利名称：一种冬虫夏草菌分生孢子插片制备及产孢动态计数方法
技术领域：
本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种冬虫夏草菌分生孢子插片制备及产孢动态计数方法。
背景技术：
冬虫夏草[Ophiocordycepssinensis (Berk. ) G. H. Sung, J. M. Sung, Hywel-Jones&Spatafora ( = Cordyceps sinensis (Berk. ) Sacc.)]作为中国特有的传统名贵药用菌，在生物分类上归属于真菌界(Kingdom Fungi)、子囊菌门(Ascomycota)、肉座菌目(Hypocreales)、蛇抱虫草科(Ophiocordycipitaceae)、蛇抱虫草属[OphiocordycepsPetch ( = Cordyceps (Fr.) Link p.p.)]。现代研究表明，冬虫夏草具有免疫调节、祛痰平喘，以及对肝肾损伤的保护等多种药理作用，在抗肿瘤、治疗肾功能衰竭等方面也有较好的 应用前景。尽管已经对冬虫夏草做了大量研究工作，但迄今尚不能实现人工栽培的规模生产，还存在明显的技术难题，如冬虫夏草菌生长缓慢，侵染率低，侵染的影响因素不明等问题。这些问题不予以证实和澄清，冬虫夏草的大規模人工培植就难以实现。解决这些问题的前提是全面掌握冬虫夏草菌的生物学性状，因此，冬虫夏草菌生物学研究技术的创新，具有重要的理论和实践意义。冬虫夏草菌培养研究主要涉及固、液体培养，生长速率，分生孢子产孢能力、继代产孢稳定性和产孢动态等方面。其中，分生孢子的研究与菌剂的制备密切相关。从与冬虫夏草菌相关的白、绿僵菌等其他虫生真菌的侵染机理来看，在适宜的环境条件下，菌株的侵染能力及侵染活性主要包括体表附着能力、体壁穿透能力及抵抗昆虫宿主免疫的能力。而在适宜的基质及培养条件下，冬虫夏草菌可产生疏水性的分子孢子，疏水孢子可与疏水昆虫表面同性相吸，因而基于分生孢子的附着能力考虑，使用分生孢子制作菌剂进行其寄主幅蛾幼虫感染将具有更高的侵染力。目前，冬虫夏草菌分生孢子的研究存在困难，主要原因是其分生孢子产量少、产孢周期长，在培养观察计数上一直没有很好的解决办法，从而在高产孢菌株的筛选中也没有ー个可靠的量化指标。综上所述，冬虫夏草菌分生孢子的产孢和计数问题已逐渐成为冬虫夏草菌生物学研究的瓶颈。为了最终实现冬虫夏草的大規模人工培植，迫切需要其研究技术的创新。
发明内容
本发明的目的是提供一种计数冬虫夏草菌所产分生孢子的方法。本发明提供的方法，包括如下步骤I)将至少一个盖玻片插入接种有冬虫夏草菌液体菌种液的固体培养基中，得到插片平板，所有所述盖玻片的1/6-5/6部分均位于所述固体培养基上方；2)培养步骤I)得到的插片平板培养至长出菌落，每隔一段时间取至少3个盖玻片计数取平均值，得到冬虫夏草菌在不同时间产生的分生孢子数。出芽的分生孢子不进行计数。
将冬虫夏草菌株接入冬虫夏草菌液体菌种培养基，在18°c、黑暗条件下进行振荡(转速IOOrpm)培养14天得到液体菌种液，即为冬虫夏草菌种液。步骤I)中，所述至少ー个盖玻片为6-20个盖玻片，所有所述盖玻片的1/6、1/2或5/6部分均位于所述固体培养基上方；步骤2)中，所述每隔一段时间取至少3个盖玻片计数为每隔I天-5天取3-5个盖玻片计数。步骤I)中，所述至少ー个盖玻片为6、12或20个盖玻片，所述盖玻片为无菌盖玻片; 步骤2)中，所述每隔一段时间取至少3个盖玻片计数为每隔I天、3天或5天取3个盖玻片计数。步骤I)中，每IL所述固体培养基按照如下方法制备(20.0-50.0)克麦麸、(10. 0-20. O)克葡萄糖、(2. 0-5. O)克蛋白胨、(1.0-3. O)克酵母提取物、200克土豆、(15. 0-20. O)克琼脂和水混合，用水补至IL ；每IL所述固体培养基具体按照如下方法制备(按照(中国专利ZL200510137457. 8 [姚ー建、董彩虹、王波、谢雪钦(2005) —种冬虫夏草复合培养方法及其专用培养基。]]:50. O克麦麸、20. O克葡萄糖、5. O克蛋白胨、3. O克酵母提取物、200克土豆、18. O克琼脂和水混合,用水补至1し步骤2)中，所述培养温度为15°C _20°C，所述培养为静置暗培养，所述培养时间为15天—25天；步骤2)中，所述培养温度为15°C、18°C或20°C，所述培养时间为15天、20天或25天，所述计数采用显微镜观察计数。所述的方法在绘制冬虫夏草菌产分生孢子的动态曲线中的应用也是本发明保护的范围。冬虫夏草菌(Ophio cordyceps sinensis)菌株762于2008年12月5日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCCJii :北京市朝阳区北辰西路I号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101)，保藏号为CGMCCNo. 2793，其分类命名为冬虫夏草(Cordyceps sinensis)。本发明的实验证明，本发明提供的冬虫夏草菌分生孢子计数方法，有效地克服了冬虫夏草菌分生孢子产孢量少，无法洗脱计数的缺点，为全面阐述分生孢子的特性奠定基础，适于冬虫夏草菌的生物学研究。同时，本发明方法可以用来筛选大量冬虫夏草菌菌株的分生孢子产孢能力，获得高产孢菌株，为分生孢子悬液的制备奠定基础，也使活性菌剂的制备成为可能。基于上述优点，本发明有较好的研究应用价值。
图I为动态产孢曲线。
具体实施例方式下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例I、冬虫夏草菌分生孢子计数—、冬虫夏草菌的培养冬虫夏草菌液体菌种培养基每IL培养基按照中国专利ZL200510137457. 8配制50. O克麦麸，20. O克葡萄糖，5. O克蛋白胨，3. O克大豆油，200克土豆，用水定容至1000毫升。每IL冬虫夏草菌固体专用培养基按照中国专利ZL200510137457. 8配制50. O克麦麸，20. O克葡萄糖，5. O克蛋白胨，3. O克酵母提取物，200克土豆，18. Og琼脂，用水定容至1000晕升。从天然冬虫夏草上分离纯化(方法见Dong, C.-H. and Yao, Y. -J. (2008). In vitroevaluation of antioxidant activities of aqueous extracts from natural andcultured mycelia of Cordyceps sinensis. LffT-Food Science and Technology 41(4) 669-677.)得到冬虫夏草菌(Ophio cordyceps sinensis)菌株762号，该菌株已保藏在中国普通菌种保藏管理中心(CGMCC No. 2793)。冬虫夏草菌(Ophio cordyceps sinensis)菌株762于2008年12月5日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCCJii :北京市朝阳区北辰西路I号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101)，保藏号为CGMCCNo. 2793，其分类命名为冬虫夏草(Cordyceps sinensis)。将上述分离纯化得到的冬虫夏草菌菌株762号CGMCC No. 2793，经DNA提取，扩增并测序，采用冬虫夏草专用分子数据库进行分析，经分子生物学鉴定为真正冬虫夏草菌菌株。将冬虫夏草菌(Ophiocordycepssinensis)菌株 762 号 CGMCC No. 2793 接种到冬虫夏草菌液体菌种培养基中，按中国专利ZL200510137457. 8公开的相应培养方法[姚ー建、董彩虹、王波、谢雪钦(2005) —种冬虫夏草复合培养方法及其专用培养基。]，在18°C、黑暗条件下进行振荡(转速IOOrpm)培养14天，培养得到液体菌种液(冬虫夏草菌种液)。将获得的0. 5mL液体菌种液接种在装有冬虫夏草菌专用培养基的直径为9cm培养皿中心，用玻璃涂布器涂匀，待液体充分被固体平板吸收后，插上20片无菌的10X IOmm盖玻片，保留5/6盖玻片在培养基上方，置于18°C下，黑暗条件下进行静置培养，20天后开始每隔5天，取出3片盖玻片观察其菌丝形态及动态产孢情況。其所用盖玻片为无菌盖玻片。ニ、冬虫夏草菌分生孢子的观察计数在无菌条件下取出盖玻片，置于显微镜下观察，在400倍放大倍数下，随机选取菌丝孢子密集的区域，采用数码摄像系统Axiocam MRC, Axiovision Rel. 4. 6软件拍照成像，毎次随机选取3片，每片至少获得20个视野(每个视野面积0. 22X0. 16mm)，计数统计分生孢子数量，取平均值代表该冬虫夏草菌菌株在该时期的产孢能力。采集所有时间段产孢数据，结果如下所示20天、25天、30天、35天、40天、45天、50天、55天、60天产的孢子数分别为平均O个、2. 8 个、12. O 个、37. 2 个、25. 3 个、17. 8 个、8. 3 个、4. 2 个、3. 5 个。以时间为横坐标，以不同时间点的孢子数为纵坐标，绘制出该菌株的动态产孢曲线(如图I所示)。实施例2、冬虫夏草菌分生孢子计数
—、冬虫夏草菌的培养冬虫夏草菌液体菌种培养基每IL培养基按照中国专利ZL200510137457. 8配制50. O克麦麸，20. O克葡萄糖，5. O克蛋白胨，3. O克大豆油，200克土豆，用水定容至1000毫升。每IL冬虫夏草固体专用培养基按照中国专利ZL200510137457. 8配制50. O克麦麸，20. O克葡萄糖，5. O克蛋白胨，3. O克酵母提取物，200克土豆，18. Og琼脂，用水定容至1000晕升。从天然冬虫夏草上分离纯化得到的冬虫夏草菌菌株762号CGMCC No. 2793。将上述分离纯化得到的冬虫夏草菌菌株762号，经DNA提取，扩增并测序，采用冬虫夏草专用分子数据库进行分析，经分子生物学鉴定为真正冬虫夏草菌菌株。
将冬虫夏草菌菌株762号CGMCC No. 2793接种到冬虫夏草菌液体菌种培养基中，按中国专利ZL200510137457.8公开的相应培养方法[姚ー建、董彩虹、王波、谢雪钦(2005) 一种冬虫夏草复合培养方法及其专用培养基。]在18°C，黑暗条件下进行振荡(转速IOOrpm)培养14天，培养得到液体菌种液(冬虫夏草菌种液)。将获得的O. 5mL液体菌种液接种在装有冬虫夏草菌专用培养基的直径为9cm培养皿中心，用玻璃涂布器涂匀，待液体充分被固体平板吸收后，插上6片无菌的18X 18mm盖玻片，保留1/6盖玻片在培养基上方，置于15°C下，黑暗条件下进行静置培养，25天后开始每隔3天，取出3片盖玻片观察其菌丝形态及动态产孢情況。其所用盖玻片为无菌盖玻片。ニ、冬虫夏草菌分生孢子的观察计数在无菌条件下取出盖玻片，置于显微镜下观察，在400倍放大倍数下，随机选取菌丝孢子密集的区域，采用数码摄像系统Axiocam MRC, Axiovision Rel. 4. 6软件拍照成像，毎次随机选取3片，每片至少获得20个视野(每个视野面积O. 22X0. 16mm)，计数统计分生孢子数量，取平均值代表该冬虫夏草菌菌株在该时期的产孢能力。采用所有时间段产孢数据，以时间为横坐标，以不同时间点的孢子数为纵坐标，绘制出该菌株的动态产孢曲线。其动态产孢结果与实施例I趋势一致，差异不显著。实施例3、冬虫夏草菌分生孢子计数一、冬虫夏草菌的培养冬虫夏草菌液体菌种培养基每IL培养基按照中国专利ZL200510137457. 8配制50. O克麦麸，20. O克葡萄糖，5. O克蛋白胨，3. O克大豆油，200克土豆，用水定容至1000毫升。每IL冬虫夏草菌固体专用培养基按照中国专利ZL200510137457. 8配制50. O克麦麸，20. O克葡萄糖，5. O克蛋白胨，3. O克酵母提取物，200克土豆，18. Og琼脂，用水定容至1000晕升。从天然冬虫夏草上分离纯化得到的冬虫夏草菌菌株762号CGMCC No. 2793。将上述分离纯化得到的冬虫夏草菌菌株762号，经DNA提取，扩增并测序，采用冬虫夏草专用分子数据库进行分析，经分子生物学鉴定为真正冬虫夏草菌菌株。将冬虫夏草菌菌株762号CGMCC No. 2793接种到冬虫夏草菌液体菌种培养基中，按中国专利ZL200510137457.8公开的相应培养方法[姚ー建、董彩虹、王波、谢雪钦(2005) 一种冬虫夏草复合培养方法及其专用培养基。]在18°C、黑暗条件下进行振荡(转速IOOrpm)培养14天，培养得到液体菌种液(冬虫夏草菌种液)。将获得的O. 5mL液体菌种液接种在装有冬虫夏草菌专用培养基的直径为9cm培养皿中心，用玻璃涂布器涂匀，待液体充分被固体平板吸收后，插上12片无菌的12X12mm盖玻片，保留1/2盖玻片在培养基上方，置于20°C下，黑暗条件下进行静置培养，15天后开始每隔I天，取出3片盖玻片观察其菌丝形态及动态产孢情況。其所用盖玻片为无菌盖玻片。ニ、冬虫夏草菌分生孢子的观察计数在无菌条件下取出盖玻片，置于显微镜下观察，在400倍放大倍数下，随机选取菌丝孢子密集的区域，采用数码摄像系统Axiocam MRC, Axiovision Rel. 4. 6软件拍照成像，毎次随机选取3片，每片至少获得20个视野(每个视野面积O. 22X0. 16mm)，计数统计分生孢子数量，取平均值代表该冬虫夏草菌菌株在该时期的产孢能力。 采用所有时间段产孢数据，以时间为横坐标，以不同时间点的孢子数为纵坐标，绘制出该菌株的动态产孢曲线。其动态产孢结果与实施例I趋势一致，差异不显著。
权利要求
1.一种计数冬虫夏草菌所产分生孢子的方法，包括如下步骤 1)将至少一个盖玻片插入接种有冬虫夏草菌液体菌种的固体培养基中，得到插片平板，所有所述盖玻片的1/6-5/6部分均位于所述固体培养基上方； 2)培养步骤I)得到的插片平板培养至长出菌落，每隔一段时间取至少3个盖玻片计数取平均值，得到冬虫夏草菌在不同时间产生的分生孢子数。
2.根据权利要求I所述的方法，其特征在于 步骤I)中，所述至少ー个盖玻片为6-20个盖玻片，所有所述盖玻片的1/6、1/2或5/6部分均位于所述固体培养基上方； 步骤2)中，所述每隔一段时间取至少3个盖玻片计数为每隔I天-5天取3-5个盖玻片计数。
3.根据权利要求I或2所述的方法，其特征在于 步骤I)中，所述至少ー个盖玻片为6、12或20个盖玻片，所述盖玻片为无菌盖玻片；步骤2)中，所述每隔一段时间取至少3个盖玻片计数为每隔I天、3天或5天取3个盖玻片计数。
4.根据权利要求1-3中任一所述的方法，其特征在于 步骤I)中，每IL所述固体培养基按照如下方法制备(20. 0-50. O)克麦麸、(10. 0-20. O)克葡萄糖、(2. 0-5. O)克蛋白胨、(1.0-3.0)克酵母提取物、200克土豆、(15. 0-20. O)克琼脂和水混合，用水补至IL ； 每IL所述固体培养基具体按照如下方法制备50. O克麦麸、20. O克葡萄糖、5. O克蛋白胨、3. O克酵母提取物、200克土豆、18. O克琼脂和水混合，用水补至IL ； 步骤2)中，所述培养温度为15°C -20°C，所述培养为静置暗培养，所述培养时间为15天-25天。
5.根据权利要求1-4中任一所述的方法,其特征在于 步骤2)中，所述培养温度为15°C、18°C或20°C，所述培养时间为15天、20天或25天，所述计数采用显微镜观察计数。
6.权利要求1-5中任一所述的方法在绘制冬虫夏草菌产分生孢子的动态曲线中的应用。
全文摘要
本发明公开了一种冬虫夏草菌分生孢子的插片制备及产孢动态计数方法。本发明提供的方法，包括如下步骤1)将至少一个盖玻片插入接种有冬虫夏草菌液体菌种的固体培养基中，得到插片平板，所有所述盖玻片的1/6-5/6部分均位于所述固体培养基上方；2)培养步骤1)得到的插片平板培养至长出菌落，每隔一段时间取至少3个盖玻片计数取平均值，得到冬虫夏草菌在不同时间产生的分生孢子数。本发明的实验证明，本发明提供的动态计数方法，操作简单、省时省力，较客观的反应了冬虫夏草菌分生孢子的产孢动态，有效地克服了冬虫夏草菌分生孢子产孢量少，无法洗脱计数的缺点。
文档编号C12Q1/06GK102676632SQ20111005580
公开日2012年9月19日 申请日期2011年3月8日 优先权日2011年3月8日
发明者任蜀豫, 姚一建 申请人:中国科学院微生物研究所