专利名称：一种鸡传染性喉气管炎病毒gB基因与鸡白介素-18基因真核共表达载体的制作方法
技术领域：
本发明属动物医药生物工程技术领域，具体涉及一种鸡传染性喉气管炎病毒gB 基因与鸡白介素-18基因真核共表达载体。
背景技术：
鸡传染性喉气管炎是由鸡传染性喉气管炎病毒(ILTV)引起的鸡的一种急性上呼吸道接触性传染病，可造成鸡100%发病，死亡率为10% 40%，并且能严重影响蛋鸡的产蛋量。该病呈急性暴发和长期潜伏感染特性，分布于世界各地，是危害养禽业的重要疫症之
ο目前国内外预防鸡传染性喉气管炎病毒所用的疫苗都是弱毒疫苗，但所有的弱毒疫苗都存在以下缺点1)由于该病毒的毒力与免疫原性呈正相关，因此，现用的疫苗毒力普遍偏强，接种后反应大；2)与ILTV强毒一样，其弱毒疫苗株也能引起潜伏感染，潜伏感染的鸡将终主带毒；3)疫苗病毒可以由接种鸡传染给非接种鸡，在鸡与鸡，鸡群与鸡群之间传插过程中毒力会返强，从而成为新的感染源；4)到目前为止尚无有效方法可以鉴别强毒株和弱毒株。随着人们对疾病清除计划呼声的日渐高涨，特别是食品安全性意识的提高，研究新型安全且有效的疫苗用于ILT的防制十分必要。
发明内容
针对以上问题，本发明目的在于提供一种鸡传染性喉气管炎病毒gB基因与鸡白介素-18基因真核共表达载体。为了实现本发明目的，本发明的技术方案在于采用一种鸡传染性喉气管炎病毒gB 基因与鸡白介素-18基因真核共表达载体，该载体是由鸡传染性喉气管炎病毒(ILTV) WgB 基因和鸡白介素18(IL-18)基因分别或同时插入真核双表达载体中构建而成。所述的真核双表达载体为双顺反子质粒plRES。所述的在鸡传染性喉气管炎病毒gB基因片段插入plRES启动子下游的MCSA的酶切位点》ιοΙ与MluI之间，鸡白介素-18基因片段插入plRES启动子下游的MCSB的酶切位点SalI与NotI之间。ILTV糖蛋白gB基因与单纯疤疹病毒I型(HSV-I)病毒gB基因是同源基因，且它与HSV-I糖蛋白gB —样是一种跨膜糖蛋白，是ILTV的主要保护性抗原基因，位于基因组UL 区，包含在一个31Λ的EcoRI酶切片段内，是病毒感染所必需的，与病毒吸附及穿入细胞有关，在病毒接触和进入宿主细胞时起关键作用。它还能诱导高水平的体液免疫和细胞免疫， 由其制备的亚单位疫苗免疫鸡可100%抵抗ILTV强毒攻击而不引起发病，且对ILTV强毒复制也有抑制作用，是该病毒的主要保护性抗原基因。细胞因子作为机体内细胞之间相互作用的主要介质，在机体的免疫应答、炎症反应、造血功能、胚胎发育及机体的生长发育等各个方面都起重要作用，同时细胞因子的分泌和释放以及它们之间的相互作用对机体抵御疾病和维持正常的生理平衡具有重要意义，因此，细胞因子的研究受到高度重视。2000年首次报道鸡IL-18 (ChickenIL-18,ChIL-18),由于它具有与人和哺乳动物相似的生物学功能，因而鸡IL-18不仅在比较免疫学研究中具有重要意义，而且还有望成为一种可以应用于家禽养殖业的新型免疫佐剂和免疫治疗剂。余夏萌等用鸡白细胞介素18 构建的真核表达质粒(PCI-IL-18)与传染性法氏囊病病毒(IBDV)多聚蛋白DNA疫苗分别免疫SPF鸡，研究发现，鸡IL-18能显著促进T、B淋巴细胞的增殖反应，增强IBDV多聚蛋白 DNA疫苗诱导的中和抗体水平，第5周用IBDV标准强毒株BC6/85攻击显示，鸡IL-18能明显增强IBDV多聚蛋白DNA疫苗对强毒攻击的保护。本发明的有益效果本发明制备得到的核酸疫苗免疫机体后，表达的gB糖蛋白可刺激机体产生针对鸡传染性喉气管炎病毒的免疫保护作用，而表达的鸡白介素-18可以发挥明显的免疫调节，两者协同作用增强免疫效果，避免两种质粒共同免疫时可能存在的细胞摄取不成比例问题，提高局部抗原提成效率，增强局部免疫应答强度，缩短免疫应答潜伏期。
图1为真核共表达质粒pIRE/gB/IL-18载体的构建流程图2为ILTVgB基因和鸡IL-18基因的PCR产物的凝胶琼脂糖电泳图，1为ILTV gB基因PCR扩增后的电泳条带，3为阴性对照，m为DNA Marker DL2000, 2为鸡IL-18基因PCR 扩增后的电泳条带。图3为重组质粒pIRE/gB/IL-18经PCR鉴定及NotI和Mil双酶切鉴定电泳图， 1为经Mil单酶切后的电泳条带，2为经NotI和Mil双酶切后的电泳条带，3为以PI、P2 为引物PCR扩增后的电泳条带；
图4为重组质粒pIRE/gB/IL-18经Xho I和MluI酶切鉴定图，1为绘Mlul单酶切后的电泳条带，2为经Bio I和MluI双酶切后的电泳条带。
具体实施例方式本发明所使用的实验材料来源如下pGEM-ChIL_18由河南省动物性食品安全重点实验室克隆并保存，真核表达质粒PlRES/购自上海捷瑞生物工程公司，pGEM-T fesy载体等购自宝生物工程(大连)有限公司，Premix Ex T^DNA聚合酶，DNA Marker λ -EcoT14
I，X-gal和IPTG，限制性内切酶炀ο I ,Mlu I、Not I.Sal I购自宝生物工程(大连)有
限公司；DNA凝胶回收试剂盒购自杭州维特洁生化技术有限公司(V-gene)；质粒快速提取试剂盒购自北京博大泰克生物基因技术有限责任公司；DNA Marker DL2000购自博大泰克； Protein K购自华美生物工程公司。实施例1 重组表达质粒pIRES/IL-18的构建
1)引物设计根据pGEM-ChIL-18设计1对引物，上、下游引物分别加入MlI和 NotI酶切位点，该对引物扩增长度为594bp，引物由上海生物工程有限公司合成，引物具体序列如下
上游引物 Pl :5，-GACGTCGACATGAGCTGTGAAGAGATC-3’，
下游引物 P2 :5，-TATGCGGCCGCTTATAGGTTGTGCCTTT-3‘；
2)PCR扩增IL-18基因以pGEM-ChIL-18质粒为模板，PU P2为引物进行PCR扩增反应，扩增体系为Premix Ex Taq DNA聚合酶25 μ L，模板质粒1 μ L，上、下游引物各1 μ L， 超纯水补足50 μ L，混勻后于PCR仪上进行扩增，另设无DNA对照，扩增程序为94°C预变性 5min ；然后进入94°C 40s, 56°C 30s, 72°C lmin，进行30个循环；最后72°C延伸IOmin后置 4°C保存，反应结束后取5 LPCR产物，进行0. 8%凝胶琼脂糖电泳观察结果；
3)酶切先将PCR产物回收纯化，然后取回收后的目的DNA进行双酶切，酶切体系目的 DNA 50 μ LUOXbuffer H 10 μ L.Sal I 5 μ L,Not I 5 μ L，灭菌水补足 100 μ L，置 37°C 水浴中消化池，酶切后的产物经凝胶琼脂糖电泳割胶回收，具体步骤参照V-gene DNA凝胶回收试剂盒说明书，纯化回收特异的DNA条带，回收后的条带再经0. 8%凝胶琼脂糖电泳观察回收情况；同时将表达质粒PlRES也进行双酶切，酶切体系为质粒pIRES 30 μ L、 IOXbuffer H 5 μ L、5 μ L、5 μ L、灭菌水补足 50 μ L，置 37°C水浴中消化 3h, 酶切后回收步骤同前；
4)连接取酶切回收的IL-18目的片段7μ L、pIRES载体IyL于200 μ L反应管中，加入IOXligation bufferl μ L、T4DNA连接酶1 μ L，混勻后置16°C连接过夜，构建重组质粒 pIRES/IL-18 ；
5)转化取连接产物10μ L转化至IOOyL E. coli DH5 α感受态细胞中，涂布于含氨苄青霉素(Amp)的LB平板上，37°C过夜培养；
6)PCR及双酶切鉴定挑取白色菌落，提取质粒，以取提取的质粒IyL做模板，PCR扩增体系和反应条件参照步骤2)，同时设以PIRES载体质粒为模板的阴性对照，上述PCR扩增产物各取5 μ L，进行0. 8%凝胶琼脂糖电泳观察结果；
再取PCR扩增初步鉴定为阳性的质粒10yL，加入200yL反应管中，同时加入 IOXbuffer H 1 μ L、SalIl μ L、NotIl μ L、灭菌水补足20 μ L，离心混合均勻，置37°C水浴消化池，凝胶琼脂糖电泳观察结果；
7)测序将PCR和酶切鉴定为阳性的重组质粒pIRES/IL-18送往宝生物工程(大连)有限公司，进行序列测定，验证其阅读框架及其连接方向。 实施例2重组表达质粒pIRES/gB的构建
1)引物设计参考GenBank发表的ILTVgB基因核苷酸序列(M64927)，应用I^rimer5. 0 基因分析软件设计1对引物，上、下游引物分别加入》ιοΙ和MluI酶切位点(下划线部分)， 该对引物扩增长度为2. 61Λ，引物由上海生物工程有限公司合成，引物具体序列如下
上游引物 P3 :5，-GGTACTCGAGATGGCTAGCTTGAAA-3’，
下游引物 P4 :5，-TGGTACGCGTTTATTCGTCTTCGCT-3’ ；
2)PCR扩增gB全基因目的片段以pGEM-T-gB为模板，P3、P4为引物进行PCR扩增反应，扩增体系为Premix Ex Taq DNA聚合酶25 μ L、模板质粒1 μ L，上、下游引物各1 μ L，灭菌去离子水补足50μ L，混勻后于PCR仪上进行扩增，扩增程序为94°C预变性5min，然后进入94°C lmin, 56°C 30s,72°C Imin循环，进行36个循环，最后72°C延伸IOmin后置4°C保存，反应结束后取5 LPCR产物，进行0. 8%凝胶琼脂糖电泳观察结果；3)酶切先将PCR产物回收纯化，然后取回收后的目的DNA进行双酶切，酶切体系目的 DNA 50 μ LUOXbuffer H 10 μ L、Mlu I 5 μ L,Xho I 5 μ L，灭菌水补足 100 μ L，置 37°C 水浴中消化池，酶切后的产物经凝胶琼脂糖电泳割胶回收，具体步骤参照V-gene DNA凝胶回收试剂盒说明书，纯化回收特异的DNA条带，回收后的条带再经0. 8%凝胶琼脂糖电泳观察回收情况；同时将表达质粒PlRES也进行双酶切，酶切体系为质粒pIRES 30 μ L, IOXbuffer H 5 μ L, Mlu I 2. 5 μ L, Xho I 2. 5 μ L、灭菌水补足 50 μ L，置 37°C水浴中消化 3h，酶切后回收步骤同前；
4)连接取酶切回收的gB目的片段7yL、载体IyL于200yL反应管中，加入 10X Iigationbufferl μ L、T4DNA连接酶1 μ L，混勻后置16 °C连接过夜，构建重组质粒 pIRES/gB ；
5)转化取连接产物10μ L转化至IOOyL E. coli DH5 α感受态细胞中，涂布于含氨苄青霉素(Amp)的LB平板上，37°C过夜培养；
6)PCR及双酶切鉴定挑取白色菌落，提取质粒进行PCR鉴定，扩增体系为提取质粒 1 μ L,Premix Ex Taq DNA聚合酶25 μ L，上、下游引物各1 μ L，灭菌去离子水补足50 μ L，扩增程序为95°C预变性 5min ；94°C lmin, 54°C 50s, 72°C 3. 5min，共 36 个循环；最后 72°C延伸IOmin后置4°C保存，同时设以pIRES质粒为模板的阴性对照，反应结束后取5 LPCR产物，进行0. 8%凝胶琼脂糖电泳观察结果；
再取PCR扩增初步鉴定为阳性的质粒10 μ L，加入200 μ L反应管中，同时加入 IOXbuffer H 2 μ L, MluIl μ L, Xho I 1 μ L，灭菌水至20 μ L，离心混合均勻，置37°C水浴消化池，凝胶琼脂糖电泳观察结果；
7)测序将PCR和酶切鉴定为阳性的重组质粒pIRES/gB送往宝生物工程(大连)有限公司，进行序列测定，验证其阅读框架及其连接方向。 实施例3重组质粒pIRE/gB/IL-18的构建
1)pIRES/IL-18双酶切提取经测序验证正确的重组表达质粒pIRES/IL_18，酶切体系pIRES/IL-18 30 μ L,MluI 2.5 μ LJho I 2. 5 μ L、灭菌水补足 50 μ L，置 37°C 水浴中消化3h，酶切后的产物经凝胶琼脂糖电泳割胶回收pIRES/IL-18片段，具体步骤参照V-gene DNA凝胶回收试剂盒说明书，纯化回收特异的DNA条带经凝胶琼脂糖电泳观察回收情况；
2)gB目的片段与表达质粒pIRES/IL-18的连接取双酶切的质粒pIRES/IL-181 μ L, Mlu I和Xho I双酶切回收的gB目的片段7 μ L的质粒于200 μ L反应管中，加入 IOXligation buffer 1 yL、T4DNA连接酶1 μ L，混勻后置16°C连接过夜，构建重组质粒 pIRES/gB/IL-18 ；
3)转化取连接产物10μ L转化至IOOyL E.coli DH5 α感受态细胞中，涂布于含氨苄青霉素(Amp)的LB平板上，37°C过夜培养；
4)PCR及双酶切鉴定挑取白色菌落，提取质粒为模板进行PCR鉴定，鸡IL-18基因PCR 鉴定，扩增体系及扩增程序同实施例1中步骤2);鸡传染性喉气管炎病毒gB基因PCR鉴定， 扩增体系及扩增程序同实施例2中步骤2)；
实验结果如图2所示，分别扩增出一条大约^522bp和597bp的片段，与预期两条扩增片段大小吻合；
再分别取PCR扩增初步鉴定为阳性的质粒各10 μ L，分别加入两个200 μ L反应管中，其中一管加入IOXbuffer H 2 μ L, Not IlyL, Sal I 1 μ L，加入灭菌水补足20 μ L ；另一管加入IOXbuffer H 2 μ L, Sal I 1 μ L，加入灭菌水补足20 μ L，离心混合均勻，置37°C水浴双酶切消化池，凝胶琼脂糖电泳观察结果，
实验结果如图3所示，重组质粒ρIRES/gB/IL-18经彻 I和Sal I双酶切后，出现了 2条
带，其中1条带为载体条带，位置约为6100bp，另1条为插入的目的条带，位置约为0. 6kb, 经fe/I单酶切只切出了 1条6. Ikb的条带，应用扩增鸡IL-18的特异引物，以重组质粒为模板进行PCR扩增、电泳，出现1条约0. 6kb的特异性条带，与预期结果相符；
同时分别取PCR扩增初步鉴定为阳性的质粒各10 μ L，分别加入两个200 μ L反应管中， 其中一管加入IOXbuffer H 2 μ L, MluIl μ L, Xho I 1 μ L，加入灭菌水补足20 μ L ；另一管加入IOXbuffer H 2 μ L, MluI 1 μ L，加入灭菌水补足20 μ L，离心混合均勻，置37°C水浴双酶切消化池，凝胶琼脂糖电泳观察结果，
实验结果如图4所示，重组质粒pIRES/gB/IL-18经Bio I和MluI双酶切后，得到约 2. 6kb和6. Ikb的2条带，用MluI单酶切得到1条约8. 7kb的带，与预期结果相一致；
6)测序将PCR和酶切鉴定为阳性的重组质粒pIRES/gB/IL-18送往宝生物工程(大连)有限公司，进行序列测定，验证其阅读框架及其连接方向。测序报告的ILTV gB基因核苷酸序列为2622 bp，包含一个完整的开放阅读框，(G+C) %为44. 66%，共编码874个氨基酸的多肽，相对分子质量为99000 ；鸡IL-18基因核苷酸序列为597bp，包含一个完整的开放阅读框，编码198个氨基酸，证明重组质粒重组质粒pIRES/gB/IL-18中插入了 gB基因和鸡 IL-18基因的核苷酸序列及阅读框完全正确。
权利要求
1.一种鸡传染性喉气管炎病毒gB基因与鸡白介素-18基因真核共表达载体，其特征在于所述载体是由鸡传染性喉气管炎病毒(ILTV)的gB基因和鸡白介素18 (IL-18)基因分别或同时插入真核双表达载体中构建而成。
2.根据权利要求1所述的鸡传染性喉气管炎病毒gB基因与鸡白介素-18基因真核共表达载体，其特征在于所述的真核双表达载体为双顺反子质粒P1RES。
3.根据权利要求2所述的的鸡传染性喉气管炎病毒gB基因与鸡白介素-18基因真核共表达载体，其特征在于所述的在鸡传染性喉气管炎病毒gB基因片段插入plRES启动子下游的MCSA的酶切位点BioI与MluI之间，鸡白介素-18基因片段插入plRES启动子下游的MCSB的酶切位点SalI与NotI之间。
全文摘要
本发明公开了一种鸡传染性喉气管炎病毒gB基因与鸡白介素-18基因真核共表达载体，该载体是由鸡传染性喉气管炎病毒(ILTV)的gB基因和鸡白介素18(IL-18)基因分别或同时插入真核双表达载体plRES中构建而成，其中是在启动子下游的MCSA的酶切位点XhoI与MluI之间插入鸡传染性喉气管炎病毒gB基因片段，在MCSB的酶切位点SalI与NotI之间插入鸡白介素-18基因片段，获得共表达质粒pIRES/gB/IL18，本发明制备得到的核酸疫苗免疫机体后，表达的gB糖蛋白可刺激机体产生针对鸡传染性喉气管炎病毒的免疫保护作用，而表达的鸡白介素-18可以发挥明显的免疫调节，两者协同作用增强免疫效果。
文档编号C12N15/79GK102220368SQ20111005637
公开日2011年10月19日 申请日期2011年3月9日 优先权日2010年10月13日
发明者吴红云, 李厚伟, 李建正 申请人:郑州后羿制药有限公司