专利名称：MBD2-mTEM8融合的DNA疫苗及其制备方法与应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及构建一种融合DNA疫苗，尤其涉及一种MBD2-mTEM8融合的DNA疫苗及其制备方法与应用。
背景技术：
目前，抗肿瘤血管生成成为抗肿瘤治疗的一种有效手段，以激活细胞毒性T淋巴细胞(cytotoxic T lymphocyte, CTL)为主的主动免疫治疗策略在恶性肿瘤的综合治疗占有重要的地位，以激发主动免疫的DNA疫苗是近年来成为研究最多的疫苗形式，由于其易于扩增和修饰诸多优点越来越受到人们的重视。DNA疫苗又称核酸疫苗或基因疫苗，是编码免疫原或与免疫原相关的真核表达质粒DNA (有时也可是RNA)，它可经一定途径进入动物体内，被宿主细胞摄取后转录和翻译表达出抗原蛋白，此抗原蛋白能刺激机体产生非特异性和特异性2种免疫应答反应，从而起到免疫保护作用。目前，肿瘤DNA疫苗可以采用融合疫苗形式增强抗原呈递，采用联合及靶向疫苗不仅可以增强抗原呈递，还可以扩大免疫效应。融合疫苗，通常是利用其中一个分子与免疫识别或免疫应答密切相关，使之具有靶向呈递作用，以促进免疫抗原呈递，融合疫苗在抗原靶向呈递上具有更强的优势。肿瘤血管内皮标志物8(TEM8)因其在肿瘤中特异性表达，成为抗肿瘤血管生成的新型候选靶标之一，过去的实验研究表明TEM8所构成的单独的分子疫苗免疫原性较低，而与其他抗原结合以后可以有效的激发免疫反应，后来的学者在临床上引入DC疫苗后可以有效的提高TEM8的免疫原性，抗瘤效果明显。小鼠防御素_beta2 (MBD2)能够有效趋化iDC， 本研究中我们设计了一个MBD2与鼠的TEM8构建成融合疫苗pMBD2_mTEM8疫苗，免疫荷有 CT-26的Balb/C小鼠，能够有效的打破机体的免疫耐受，诱发机体产生针对肿瘤血管内皮细胞的免疫反应。
发明内容
本发明的目的在于是提供一种MBD2-mTEM8融合的DNA疫苗，所述疫苗包含MBD2 基因、mTEM8基因，所述MBD2基因和mTEM8基因连接于pcDNA3. 1载体上。本发明的第二个目的在于是提供一种MBD2-mTEM8融合的DNA疫苗的制备方法，其包含以下步骤1)获取 MBD2 基因、mTEM8 基因；2)将步骤1)所述MBD2基因、mTEM8基因通过SEQ ID NO 5所示的连接肽连接，形成MBD2-mTEM8融合基因；3)将步骤2)所述MBD2-mTEM8融合基因连接到pcDNA3. 1载体上，形成所述DNA融
合疫苗。本发明的第三个目的在于是提供一种MBD2_mTEM8融合蛋白表达载体，其包含 MBD2基因、mTEM8基因，所述MBD2基因和mTEM8基因连接于pcDNA3. 1载体上。所述的MBD2-mTEM8融合蛋白表达载体，MBD2基因的序列如SEQ IDNO 1所示，mTEM8基因的序列如SEQ ID NO 4所示。本发明的第四个目的是提供一种MBD2-mTEM8融合蛋白表达载体的制备方法，其包含以下步骤1)获取 MBD2 基因、mTEM8 基因；2)将步骤1)所述MBD2基因、mTEM8基因通过SEQ ID NO :5所示的连接肽连接，形成MBD2-mTEM8融合基因；3)将步骤2)所述MBD2-mTEM8融合基因连接到pcDNA3. 1载体上，形成所述融合蛋白表达载体。所述的制备方法中步骤1)所述MBD2基因的序列如SEQ ID NO 1所示，mTEM8基因的序列如SEQ ID NO 4所示。所述的制备方法中所述MBD2基因通过化学合成，所述mTEM8基因通过SEQ ID NO: 2-3所示的引物从murine cDNA library通过PCR扩增获得。所述的制备方法中步骤2)所述MBD2-mTEM8融合基因的序列如SEQ IDNO 8所示。本发明的第五个目的是提供一种MBD2-mTEM8融合蛋白表达载体在制备DNA融合疫苗中的应用。本发明的第六个目的是提供一种DNA融合疫苗在制备抗肿瘤药物中的应用。本发明提供所述MBD2-mTEM8融合的DNA融合疫苗，能够有效的打破机体对mTEM8 的免疫耐受，诱发机体产生针对血管内皮细胞的细胞免疫反应，并产生免疫记忆。本发明所述疫苗制备方法简单，且该融合DNA疫苗比传统疫苗安全，具有明显的抑制肿瘤生长的效果。本发明所述疫苗对研究其抗肿瘤血管生成的作用机制有着深刻的意义。为让本发明的上述和其它目的、特征和优点能更明显易懂，下文特举较佳实施例， 并配合附图，作详细说明如下。
图1是MBD2_mTEM8融合疫苗的阳性克隆的PCR鉴定示意图；图2是图1的阳性克隆的正向测序和MTF序列比对结果；图3是图1的阳性克隆的反向测序结果和MTF序列的比对结果；图4是MBD2-TEM8融合基因PCR产物的电泳图；图5是Western blot检测融合基因的蛋白表达；图6是DNA融合疫苗抗肿瘤效果，其中的A为皮下接种CT-26后小鼠的肿瘤体积的变化，B为皮下接种CT-26后的小鼠生存时间统计图；C为皮下接种CT-26后肿瘤的示意图；图7是肿瘤组织内血管密度检测结果；图8是51Cr释放实验结果；图9是IFN- y ELISpot检测CTL活性结果；图10是去除⑶8+T淋巴细胞亚群后对pMBD2-mTEM8疫苗抗肿 瘤作用的影响。
具体实施例方式实验材料
7-8周龄雌性Balb/C小鼠，购于中国医学科学院动物所。细胞培养液DMEM，RPMI1640，购自 Gibco-Invitrogen 公司。红细胞裂解液(用KHCO3 1. 0g, NH4CL 8. 3g，EDTA :37mg，加双蒸馏水至IL配置而成)。小鼠淋巴细胞分离液(天津灏洋生物制品科技有限责任公司)。51Cr (Chromium-51，51Cr)试剂(北京同位素公司)。 Triton X-100 (FARCO CHEMICAL Supplies 公司)。Y 干扰素(interferon-γ，IFN- γ )酶联免疫斑点试验(enzyme-linked immunospot assay, ELISPOT)检测试剂(荷兰U-CyTech生物科技公司)。抗⑶8单克隆抗体购自Santa公司。mTEM8单克隆抗体购自Santa Cruz公司。净化工作台SW-CJ_IF(苏州集团苏州安泰空气技术有限公司)。二氧化碳孵箱(美国Thermo Forma公司)。FT-603型、闪烁探头和FH-461自动定标器(北京核仪器厂)。倒置显微镜(日本Nikon公司)。SDS-PAGE电泳装置和电转仪器(BI0-RAD公司)。pCDNA3. 1 载体购自 Invitrogen 公司。实施例1目的基因片段的获取1. MBD2基因通过化学合成(合成自Invitrogen公司):SEQ ID NO 1GAACTTGACCACTGCCACACCAATGGAGGGTACTGTGTCAGAGCCATTTGTCCTCCTTCTGCCAGGCGT CCTGGGAGCTGTTTCCCAGAGAAGAACCCCTGTTGCAAGTACATGAAA2. mTEM8 (AF378762)-SEQ ID NO :4 从 murine cDNA library 通过 PCR 扩增获得，引物如下SEQID NO 2-3mTEM8 正向引物 5，-GGCCGCCGCGAGGATGGG-3，； (SEQ ID NO 2)mTEM8 反向引物 5，-GCACAGCAAATAAGTGTCTTCCAC-3，. (SEQ IDNO 3)PCR反应体系采用KODplus (Toyobo)扩增体系(50 μ 1)如下
权利要求
1.一种MBD2-mTEM8融合的DNA融合疫苗，其特征在于，包含MBD2基因、mTEM8基因，所述MBD2基因和mTEM8基因连接于pcDNA3. 1载体上。
2.权利要求1所述的合疫苗的制备方法，其特征在于，包含步骤1)获取MBD2基因、mTEM8基因；2)将步骤1)所述MBD2基因、mTEM8基因通过SEQID NO 5所示的连接肽连接，形成 MBD2-mTEM8融合基因；3)将步骤2)所述MBD2-mTEM8融合基因连接到pcDNA3.1载体上，形成所述DNA融合疫田ο
3.权利要求1所述的MBD2-mTEM8融合的DNA疫苗在制备抗肿瘤药物中的应用。
4.一种MBD2-mTEM8融合蛋白表达载体，其特征在于，包含MBD2基因、mTEM8基因，所述 MBD2基因和mTEM8基因连接于pcDNA3. 1载体上。
5.根据权利要求4所述的MBD2-mTEM8融合蛋白表达载体，其特征在于，所述MBD2基因的序列如SEQ ID NO 1所示，mTEM8基因的序列如SEQ IDNO 4所示。
6.权利要求4所述的MBD2-mTEM8融合蛋白表达载体的制备方法，其特征在于，包含步骤1)获取MBD2基因、mTEM8基因；2)将步骤1)所述MBD2基因、mTEM8基因通过SEQID NO 5所示的连接肽连接，形成 MBD2-mTEM8融合基因；3)将步骤2)所述MBD2-mTEM8融合基因连接到pcDNA3.1载体上，形成所述融合蛋白表达载体。
7.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，步骤1)所述MBD2基因的序列如SEQ ID NO 1所示，mTEM8基因的序列如SEQ ID NO 4所示。
8.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，所述MBD2基因通过化学合成，所述 mTEM8基因通过SEQ ID NO :2_3所示的引物从murine cDNAlibrary通过PCR扩增获得。
9.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，步骤2)所述MBD2-mTEM8融合基因的序列如SEQ ID NO 8所示。
10.权利要求4所述的MBD2-mTEM8融合蛋白表达载体在制备DNA融合疫苗中的应用。
全文摘要
本发明涉及一种MBD2-mTEM8融合的DNA融合疫苗，其包含MBD2基因、mTEM8基因，所述MBD2基因和mTEM8基因连接于pcDNA3.1载体上。本发明提供，MBD2与mTEM的融合疫苗pMBD2-mTEM8，能够有效的打破机体对mTEM8的免疫耐受，诱发机体产生针对血管内皮细胞的细胞免疫反应，并产生免疫记忆。本发明所述疫苗制备方法简单，并且比传统疫苗更安全。本发明所述疫苗对研究其抗肿瘤血管生成的作用机制有着深刻的意义。
文档编号C12N15/85GK102178958SQ201110056429
公开日2011年9月14日 申请日期2011年3月9日 优先权日2011年3月9日
发明者刘平, 梁后杰, 潘凤, 阮志华 申请人:中国人民解放军第三军医大学第一附属医院