专利名称：一种二氨基丁酸-2-酮戊二酸转氨酶及其应用的制作方法
技术领域：
本发明属于基因工程技术领域，具体涉及涉及一种二氨基丁酸-2-酮戊二酸转氨酶及其应用。
背景技术：
L-2,4- 二氨基丁酸(L-2，4-diaminobutyric acid,英文缩写 DABA)，也称 2，4- 丁二氨酸，是一种次生非蛋白质氨基酸，属于四碳化合物，其结构式为(NH2)CH2CH2CH(NH2) C00H，属于碱性氨基酸。它广泛存在于动物、植物和微生物体内，具有独特的生理功能，目前其研究处于起步阶段，尚未大规模应用。二氨基丁酸在农业和医药行业中具有良好的应用前景。在农业方面，研究发现在高等植物中，尤其是山黧豆属(Lathyrus)中，游离的二氨基丁酸含量较高，当外界环境恶劣时，二氨基丁酸含量上升，环境改善时，二氨基丁酸含量又下降，这可能与这种植物抗旱、耐瘠薄、耐盐碱、抗虫的特性有关，实验室研究表明如果外界提供氮源，固氮植物以硝酸盐的形式提供无机氮，则该植物体内二氨基丁酸含量上升，以储存多余的氮素，消除氨态氮对植物的毒害作用。美国农业部将植物抗逆性的研究作为一个研究方向，专门拨款研究林生山黧豆和其体内的二氨基丁酸。在我国，中国农业大学也在进行该方面的研究。除了水土保持，研究发现对于体内没有发现二氨基丁酸的植物来说，二氨基丁酸是一种竞争性的代谢抑制剂，国外研究者证实二氨基丁酸对莴苣、蚕豆的生长有抑制作用，对一些蝗虫的生长也有抑制作用。含有二氨基丁酸的植物在植物群落中生存力强， 具有竞争力，可能就是由于释放出的二氨基丁酸对其他动植物的生长起到了抑制作用。除了抑制作用，二氨基丁酸能促进豌豆根瘤菌的生长，对土壤杆菌和其他的根瘤菌的生长也有刺激作用。在医学方面，过量的二氨基丁酸对人体有毒性，但在适当的剂量下又是一种药物，研究发现二氨基丁酸能引起高渗透压，对小鼠纤维瘤细胞有毒害性，对人体恶性神经胶质瘤细胞有溶解作用，因此，二氨基丁酸能用于脑肿瘤的防治。把抗癌药物道诺霉素制成二氨基丁酸衍生物，用它治疗白血病疗效更好，更为安全。本课题组在筛选具有聚赖氨酸能力的菌株时发现一株能同时生产聚赖氨酸及聚二氨基丁酸的菌株 Sti^ptomyces albulus PD-1 (CCTCC NO :M2011043)。目前该菌株保藏于武汉中国典型培养物保藏中心(简称CCTCC)，地址武汉武汉大学，邮编430072， 登记入册的编号是CCTCC NO :M2011043，保藏日期是2011年2月21日，详见中国专利 2011100499868。二氛基丁酸 _2_ If 戊二酸转氛 Sl (diaminobutyrate-2-oxoglutarate transaminase，简称DABAT，EC 2.6. 1.76)在L-2，4-二氨基丁酸的合成中起重要作用，天冬氨酸的衍生物天冬氨酸-β -半醛和谷氨酸在该酶催化下生成L-2，4- 二氨基丁酸和α -酮戊二酸。目前L-2，4-二氨基丁酸尚未大规模生产，作为精细化工品，只能通过有机合成的方法得到，价格昂贵，价格达900元/克。山黧豆属的植物中，L-2，4-二氨基丁酸占种子干重的_3%，含量低，直接从种子中提取在技术角度、经济角度上都不可行。因此，本发明从微生物合成的角度研究如何发酵生产L-2，4- 二氨基丁酸，为L-2，4- 二氨基丁酸高产基因工程菌的构建及L-2，4_ 二氨基丁酸的生产开辟了一条新的途径。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种二氨基丁酸-2-酮戊二酸转氨酶。本发明还要解决的技术问题是提供编码上述二氨基丁酸-2-酮戊二酸转氨酶的基因序列。本发明还要解决的技术问题是提供包含上述二氨基丁酸-2-酮戊二酸转氨酶基因的表达载体及基因工程菌。本发明还要解决的另一个技术问题是提供上述基因工程菌的构建方法。本发明最后要解决的技术问题是提供上述基因工程菌在制备L-2，4_ 二氨基丁酸的应用。为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案如下一种二氨基丁酸-2-酮戊二酸转氨酶，它具有如SEQ ID NO :2所示的氨基酸序列。 包含422个氨基酸。其来源于小白链霉菌(Sti^ptomyces albulus)PD-I (菌种保藏号 CCTCC NO :M2011043，关于上述小白链霉菌具体见中国专利2011100499868)。一种权利要求1所示二氨基丁酸-2-酮戊二酸转氨酶的编码基因，它具有如SEQ IDNO 1所示的核苷酸序列，其含有1269bp碱基。。一种表达载体，包含权利要求2所述的二氨基丁酸-2-酮戊二酸转氨酶基因。其中，所述的表达载体为pET28a(+)。一种基因工程菌，它包含权利要求3所述的表达载体。上述基因工程菌优选为包含有重组质粒pET-dabat的E. coli BL21 (DE3)。上述基因工程菌的构建方法，包含如下步骤(1) 二氨基丁酸-2-酮戊二酸转氨酶的基因dabat扩增根据GeneBank公布的Mi^ptomyces coelicolor A3 (2)的基因组序列，设计如下一对引物引物 1 :5，-CCGGAATTCATGACCATCACCCAGCCCGA-3‘
引物 2 5，-CCCAAGCTTTCAGGCGCAGTCGCGCACCG-3，在上述引物的5’端的下划线部分分别引入EcoR I和Hind III酶切位点，以小白链霉菌 PD-I (Sti^ptomyces albulus PD-I, CCTCC NO :M2011043)总 DNA 为模板，进行 PCR 扩增，PCR 反应物组成如下(25 μ 1 体系)2. 5μ 1 IOXEx Taq Buffer, 2 μ 1 dNTP,2. 5μ 1 MgCl2, 2 μ 1 DMS0，2y 1 模板，引物 1和引物2 各 2μ 1，0· 5μ 1 Ex Taq,9. 5μ 1 ddH20，PCR 反应程序为951变性51^11，然后941308，581608，721908，共30个循环，721延续10111土11。 将PCR产物克隆测序。(2)重组表达质粒pET-dabat的构建将步骤(1)得到的PCR产物纯化后用限制性内切酶EcoR I和Hind III酶切， 与经过同样双酶切的质粒pET48a(+)，在T4连接酶的作用下进行连接，得到重组质粒 pET-dabat ；(3)将该重组质粒pET-dabat转化至宿主细胞中将重组质粒pET-dabat转化至感受态大肠杆菌BL21 (DE3)中，涂布含有25 μ g/mL卡那霉素的LB固体培养基上，37°C培养18 24h得到初步阳性克隆；(4)经抗性培养基筛选得到阳性克隆分别挑取初步阳性克隆于5mL含有25 μ g/mL卡那霉素的LB液体培养基中，37°C， 200rpm培养过夜，提取质粒，经限制性内切酶EcoRI和Hind 111酶切质粒，根据电泳结果判断具有序列表SEQ ID N0:1的DNA片段的质粒为重组质粒pET-dabat，具有该质粒的菌落为阳性克隆，即为基因工程菌。对重组质粒pET-dabat进行测序，结果表明插入片段为一个含有U69bp，编码422个氨基酸组成的蛋白质。上述二氨基丁酸-2-酮戊二酸转氨酶的表达方法将包含如SEQ ID NO=I所示的核苷酸序列的基因工程菌接种于添加了 25 μ g/mL卡那霉素的LB液体培养基中，37°C摇床培养过夜；再以2 10% (ν/ν)的接种量转接到含25 μ g/mL卡那霉素的LB培养基中培养5- 后，加入异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)进行诱导，IPTG的终浓度为0. 2 lmmol/L，降温至25 30°C，继续表达12 20h后，离心收集菌体。上述基因工程菌在发酵生产L-2，4 二氨基丁酸中的应用。具体方法为将基因工程菌在含有25 μ g/mL卡那霉素的LB液体培养基中30 40°C液体培养8-20h，按2 10% (ν/ν)的接种量转接至发酵培养基培养5 几后，加入终浓度为0. 2 lmmol/L的乳糖诱导，降温至25 30°C再诱导培养12 20h。其中，所述的发酵培养基包含如下组分葡萄糖10 50g/L, (NH4)2SO4 5 10g/L, NaCl 5 10g/L, KH2PO4I 3g/L，MgSO4 0. 1 lg/L，溶剂为水。有益效果本发明首次从小白链霉菌(Sti^ptomyces albulus)中提取、测序、克隆表达的了二氨基丁酸-2-酮戊二酸转氨酶基因，将该基因上传至NCBI上进行同源性比
Streptomyces coelicolor A3 (2) ψ ^ Aminotransferase SH^WMi^ 1 ] ! 86%，通过构建基因工程菌，利用基因工程菌发酵生产L-2，4-二氨基丁酸，开辟了一条新的L-2，4- 二氨基丁酸获取途径。
图1 是本发明的产L-2，4_ 二氨基丁酸的大肠杆菌基因工程菌的构建示意图。图2 是本发明重组表达质粒pET-dabat的构建示意图。图3 是重组的DABAT酶SDS-PAGE图谱，最左边泳道为标准蛋白分子量，自上向下的条带分别为(kDa) :116，66，45，35，25。其中，第1、2泳道是工程菌，3、4泳道是对照菌。
具体实施例方式根据下述实施例，可以更好地理解本发明。然而，本领域的技术人员容易理解，实施例所描述的内容仅用于说明本发明，而不应当也不会限制权利要求书中所详细描述的本发明。实施例1 小白链霉菌(Sti^ptomyces albulus)PD-I基因组DNA的提取。按照生产商提供的使用说明书，用Genomic DNA Purification Kit(Takara，大连)抽提处于对数生长期的小白链霉菌PD_l(Str印tomyces albulus PD-I, CCTCC N0: M2011043)的基因组DNA，并用8g/L琼脂糖凝胶电泳对获得的细菌基因组进行检测。实施例2，二氨基丁酸-2-酮戊二酸转氨酶的基因(dakit)的克隆和重组菌构建。
2. Idabat 的 PCR 扩增根据GeneBank公布的Mi^ptomyces coelicolor A3 (2)的基因组序列，设计如下一对引物引物 1 :5，-CCGGAATTCATGACCATCACCCAGCCCGA-3‘引物 2 5，-CCCAAGCTTTCAGGCGCAGTCGCGCACCG-3，在上述引物的5’端的下划线部分分别引入EcoR I和Hind III酶切位点，以小白链霉菌 PD-I (Sti^ptomyces albulus PD-I, CCTCC NO :M2011043)总 DNA 为模板，进行 PCR 扩增，PCR 反应物组成如下(25 μ 1 体系)2. 5μ 1 IOXEx Taq Buffer, 2 μ 1 dNTP,2. 5μ 1 MgCl2, 2 μ 1 DMS0，2y 1 模板，引物 1 和引物 2 各 2μ 1，0· 5μ 1 Ex Taq,9. 5μ 1 ddH20, PCR 反应程序为95°C变性5min，然后94°C 30s, 58°C 60s, 72°C 90s，共30个循环，72°C延续 IOmin0将扩增条带切胶后用Axygen公司柱式割胶回收试剂盒纯化回收，连接于Takara公司pMDIS-T载体上并转化大肠杆菌JM109。通过在氨苄青霉素LB平板上结合质粒单双酶切验证，鉴定出阳性克隆，并在南京金斯瑞生物科技公司进行序列测定。2. 2dabat基因的表达利用pET18a(+)质粒(Novagen)，构建表达载体，表达目的基因，进一步确认基因克隆的正确性。2. 2. 1限制性酶切反应，纯化及连接反应将PCR产物纯化，用预先设计在引物序列中酶切位点所对应的内切酶进行酶切反应，同时，将pET48a(+)质粒(Novagen)进行酶切反应。本实验中，所用的酶是EcoRI 和Hind III。酶切体系为PCR产物或pET48a(+)质粒溶液50 μ L，EcoRI 3 μ L, Hind ΙΙΙ3μ L, IOX 缓冲液 10 μ L, ddH20 34 μ L，总体积 100 μ L。由于所选用的两个酶切位点在pET48a(+)空质粒上相距很近(约20bp)，因此，酶切之后的PCR产物和质粒载体只需要经过PCR清洁试剂盒即可达到纯化的目的。经酶切纯化后的PCR产物和质粒载体，可以用于连接反应。连接反应体系为酶切纯化的PCR产物4 μ L，酶切纯化的质粒4 μ L，Τ4连接酶1 μ L，10 X连接酶缓冲液1 μ L。连接后获得重组质粒pET-dabat，其主要结构如图2所示。2. 2. 2质粒制备与转化质粒抽提采用Axypr印plasmid miniprep Kit (Axygen，杭州)，参照生产商的说明书进行操作。质粒转化大肠杆菌BL21(DE!3)细胞使用热激法。2. 2. 3重组质粒pET-dabat的转化(1)取 0. 1-1 μ g 重组质粒 pET-dabat DNA 于 200 μ L 大肠杆菌 BL21 (DE3)感受态细胞中，冰浴30分钟。(2) 42 °C水浴热激90秒，快速置于冰上1_3分钟。(3)加入新鲜LB液体培养基800 μ L，于37°C振荡培养45分钟。(4)取200 μ L菌体涂布于含有25 μ g/mL卡那霉素的LB平板表面。37°C培养12-16 个小时至单菌落出现。2. 2. 4重组子的鉴定将阳性菌落接种于含有卡那霉素(25 μ g/mL)的LB液体培养基中进行培养并提取质粒，按照实施例2. 2. 1中的酶切体系和条件分别用EcoRI和Hind III对重组质粒进行单-双酶切鉴定，酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳鉴定。经电泳结果证实，该阳性克隆菌落含有DNA片段插入质粒pET-dabat，含此重组质粒pET-dabat的重组大肠杆菌，即为转化的重组工程菌E. coli BL21-pET-dabat0测序结果显示插入片段含有一个长1269bp的开放阅读框架。实施例3 二氨基丁酸-2-酮戊二酸转氨酶的诱导表达。将重组大肠杆菌BL21-pET-dabat接种于5mL添加了 25 μ g/mL卡那霉素的LB液体培养基中，37°C摇床培养过夜；再以5% (ν/ν)的接种量转接到装有IOOmL LB培养基(含 25 μ g/mL卡那霉素)的500mL摇瓶中，37 °C摇床培养至0D600约为0. 6时加入IPTG进行诱导(IPTG终浓度lmmol/L)，降温至25 30°C，继续表达12小时后，离心收集菌体。实施例4、工程菌E. coli BL21-pET-dabat中二氨基丁酸-2-酮戊二酸转氨酶的表达分析。1、SDS-PAGE 分析如实施例2. 2. 2-2. 2. 4所述步骤，将没有经过酶切的空质粒pET_28a (+)转化大肠杆菌BL21 (DE3)感受态细胞，筛选得到包含pET48a(+)的大肠杆菌BL21 (DE3)，将该菌作为对照菌，命名为E. coli BL21-pET。将重组大肠杆菌BL21-pET-dabat和对照菌E. coli BL21-pET接种于5mL添加了 25yg/mL卡那霉素的LB液体培养基中，37°C摇床培养过夜；再以5% (ν/ν)的接种量转接到装有IOOmL LB培养基(含25 μ g/mL卡那霉素)的500mL摇瓶中，37°C摇床培养至0D600 约为0. 6时加入IPTG进行诱导(IPTG终浓度lmmol/L)，降温至25 30°C，继续表达12小时后，各取样1. 5mL，离心，TE溶液(Tris-HCl IOmM, EDTA ImM)洗涤两次，再加入100 μ 1 TE溶液和20 μ 1 10mg/ml的溶菌酶(购自华美生物工程公司)处理1个小时，煮沸3min， 离心，取上清即可使用。SDS-PAGE凝胶制备好后点样，每个点5-15μ 1，然后电泳、染色及脱色，SDS-PAGE结果表明二氨基丁酸-2-酮戊二酸转氨酶在工程菌Ε. coli BL21-pET-dabat 中获得了可溶性表达，而对照菌Ε. coli BL21-pET则没有。2，二氨基丁酸-2-酮戊二酸转氨酶的酶活测定将重组大肠杆菌BL21-ρΕΤ-dabat接种于5mL添加了 25 μ g/mL卡那霉素的LB 液体培养基中，37°C摇床培养过夜；再以5% (ν/ν)的接种量转接到装有IOOmL LB培养基(含25 μ g/mL卡那霉素)的500mL摇瓶中，37 °C摇床培养至0D_约为0. 6时加入IPTG进行诱导(IPTG终浓度lmmol/L)，降温至25 30 °C，继续表达12小时后，各取样1.5mL，离心，TE溶液(Tris-HCl IOmM, EDTA ImM)洗涤两次，再加入100 μ 1 TE 溶液和20 μ 1 10mg/ml的溶菌酶(购自华美生物工程公司)处理1个小时，离心后去上清液作为酶液，参照Hisato Ikai等报道的方法进行二氨基丁酸_2_酮戊二酸转氨酶酶活测定(Ikai, H, and S. Yamamoto. Identification and analysis of a gene encoding L~2,4-diaminobutyrate :2~ketoglutarate 4-aminotransferase involved in thel,3-diaminopropane production pathway in Acinetobacter baumannii. J. Bacteriol. 1997(179) :5118-5125.)，重复测定酶活三次。结果显示，本发明克隆的基因工程菌的酶活为5.6U/mg，而对照菌E.coli BL21_pET几乎检测不到酶活，说明本发明克隆的二氨基丁酸-2-酮戊二酸转氨酶基因在大肠杆菌中得到了活性表达。3，本发明的基因工程菌BL21-pET-dabat的发酵性能测试
将活化好的工程菌BL21-pET_dabat接种到装有IOOmL LB培养基(含25 μ g/mL卡那霉素)的500mL摇瓶中，37°C摇床培养过夜，按5% (ν/ν)的接种量转接至装有IOOmL发酵培养基的 500mL 摇瓶中(葡萄糖 50g/L，(NH4)2SO4 8g/L，NaCl 10g/L，KH2PO4 2g/L，MgSO4 0. 5g/L，溶剂为水。)培养5- 后，加入终浓度为lmmol/L的乳糖诱导，降温至25 30°C， 继续培养12h。离心弃去菌体，收集培养液。参照沈黎明等改进的方法测定培养液中L-2， 4- 二氨基丁酸含量(沈黎明，吴显荣，林生山黧豆体内的一种特异游离氨基酸-丁二氨酸， 北京农业大学学报，1992，18 (4) :347-351)，结果表明，摇瓶培养液中L-2，4- 二氨基丁酸含量达5. 6g/L，相信经过发酵条件优化，有望实现二氨基丁酸的工业化发酵生产。
权利要求
1.一种二氨基丁酸-2-酮戊二酸转氨酶，其特征在于它具有如SEQ ID NO :2所示的氨基酸序列。
2.—种权利要求1所示二氨基丁酸-2-酮戊二酸转氨酶的编码基因，其特征在于它具有如SEQ ID NO 1所示的核苷酸序列。
3.—种表达载体，其特征在于包含权利要求2所述的二氨基丁酸-2-酮戊二酸转氨酶基因。
4.根据权利要求3所述的表达载体，其特征在于所述的表达载体为pET18a(+)。
5.一种基因工程菌，其特征在于它包含权利要求3所述的表达载体。
6.根据权利要求5所述的基因工程菌，其特征在于所述的基因工程菌为包含有重组质粒 pET-dabat 的 E.coli BL21 (DE3)。
7.权利要求6所述的基因工程菌的构建方法，其特征在于它包含如下步骤(1)二氨基丁酸-2-酮戊二酸转氨酶的基因dabat扩增根据GeneBank公布的Mi^ptomyces coelicolor A3 (2)的基因组序列，设计如下一对引物引物 1 :5’ -CCGGAATTCATGACCATCACCCAGCCCGA-3‘引物 2 :5，-CCCAAGCTTTCAGGCGCAGTCGCGCACCG-3‘在上述引物的5’端的下划线部分分别引入EcoR I和Hind III酶切位点，以小白链霉菌 PD-I (Sti^ptomyces albulus PD-1, CCTCC NO :M2011043)总 DNA 为模板，进行 PCR 扩增， PCR 反应物组成如下25μ 1 体系，2. 5μ 1 IOXEx Taq Buffer, 2 μ 1 dNTP，2. 5μ1 MgCl2, 2 μ 1 DMSO, 2 μ 1 模板，引物 1 和引物 2 各 2μ 1,0. 5μ 1 Ex Taq，9. 5μ 1 ddH20, PCR 反应程序为95°C变性 5min，然后 94°C 30s, 58°C 60s, 72°C 90s，共 30 个循环，72°C延续 IOmin ；将 PCR产物克隆测序；(2)重组表达质粒pET-dabat的构建将步骤(1)得到PCR产物纯化后用限制性内切酶EcoR I和Hind III酶切，与经过同样双酶切的质粒pET48a(+)，在T4连接酶的作用下进行连接，得到重组质粒pET-dabat ；(3)将该重组质粒pET-dabat转化至宿主细胞中将重组质粒pET-dabat转化至感受态大肠杆菌BL21 (DE3)中，涂布含有25 μ g/mL卡那霉素的LB固体培养基上，37°C培养18 24h得到初步阳性克隆；(4)经抗性培养基筛选得到阳性克隆分别挑取初步阳性克隆于5mL含有25 μ g/mL卡那霉素的LB液体培养基中，37°C， 200rpm培养过夜，提取质粒，经限制性内切酶EcoRI和Hind III酶切质粒，根据电泳结果判断具有序列表SEQ ID NO :1的DNA片段的质粒为重组质粒pET-dabat，具有该质粒的菌落为阳性克隆，即为基因工程菌。
8.权利要求6所述的基因工程菌在发酵生产L-2，4二氨基丁酸中的应用。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于将基因工程菌在含有25μ g/mL卡那霉素的LB液体培养基中30 40°C液体培养8-20h，按2 10% (ν/ν)的接种量转接至发酵培养基培养5 几后，加入终浓度为0. 2 lmmol/L的乳糖诱导，降温至25 30°C再诱导培养12 20h。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于所述的发酵培养基包含如下组分葡萄糖(10 50g/L, (NH4)2SO4 5 10g/L, NaCl 5 10g/L, KH2PO4 1 3g/L, MgSO4 0. 1 lg/L, 溶剂为水。
全文摘要
本发明公开了一种二氨基丁酸-2-酮戊二酸转氨酶及其应用，它具有如SEQ ID NO2所示的氨基酸序列；本发明还公开了上述酶的编码基因，如SEQ ID NO1所示的核苷酸序列。本发明同时公开了包含上述二氨基丁酸-2-酮戊二酸转氨酶的编码基因的表达载体、基因工程菌及其构建方法。本发明首次从小白链霉菌(Streptomyces albulus)中提取、测序、克隆表达的了二氨基丁酸-2-酮戊二酸转氨酶基因，通过构建基因工程菌，利用基因工程菌发酵生产L-2，4-二氨基丁酸，开辟了一条新的L-2，4-二氨基丁酸获取途径。
文档编号C12N1/21GK102181412SQ201110056470
公开日2011年9月14日 申请日期2011年3月9日 优先权日2011年3月9日
发明者倪芳, 冯小海, 夏军, 张扬, 徐虹, 李莎, 欧阳平凯 申请人:南京工业大学